合成包封病毒的制作方法

本发明是在美国国立卫生研究院颁发的批准号ca140215的政府支持下进行的。政府对本发明具有一定权利。

相关申请的交叉引用

本申请要求于2016年03月25日提交的美国临时专利申请序列号62/313,270的权益，其公开内容通过引用并入本文。

背景技术：

提供以下信息以帮助读者理解下面公开的技术和通常可以使用此技术的环境。无意于将本文使用的术语限制至任何特别窄的解释，除非在本文件中另外清楚地指明。本文提到的参考文献可以有助于理解技术或其背景。本文引用的全部参考文献的公开内容通过引用并入。

病毒治疗或病毒疗法是通过对病毒进行重编程而将生物技术用于使病毒转化成治疗剂以治疗疾病的治疗方案。目前，病毒治疗主要有三个分支，包括抗癌或溶瘤病毒、病毒免疫疗法以及用于基因疗法的病毒载体。

25年前首次在临床上检测了合理设计和工程化的溶瘤病毒(ov)疗法。然而，仅在过去5年中，临床应答才开始接近在临床前模型中显示出希望。在随机临床试验中使用包括talimogenelaherparepvec(t-vec)、pexastimogenedevacirepvec(pexa-vec)和柯萨奇病毒a21(cva21)在内的若干载体观察到应答和/或存活增加的证据，表明美国食品和药物管理局(fda)可能会批准将一种或多种载体用于不同适应症。例如，最近美国fda已批准了用于转移性黑素瘤的t-vec施用。然而，所有这些试验都依赖于直接瘤内注射。疾病扩散是癌症相关死亡的主要原因，并且无法通过瘤内注射对其进行充分治疗。此外，因为初始轮治疗引起对治疗本身的免疫应答，随后的周期或治疗实现全身递送的能力进一步受限。尽管在临床上已经证实了全身ov递送的可能性，甚至其可以导致扩散性疾病的缓解，但是这样的病例报告仅仅是为了突显该领域未来的潜力，即是否能够实现可靠的和可重复的全身递送。

已经提出了多种不同的方法来试图通过ov或其他病毒载体克服全身治疗的局限性。已经基本上放弃了涉及免疫抑制癌症患者的方法，因为已经清楚ov载体的免疫治疗作用是其肿瘤杀伤潜力的重要组成部分。顺序使用相关但血清学上不同的载体以及使用预先感染的细胞作为递送载剂已经取得了一些治疗成功，但是增加了治疗的复杂性和成本。在一些有限的背景下，可以使用瘤内或局部区域递送，但通常不能治疗广泛转移性疾病。即使ov疗法能够提高靶向肿瘤抗原的适应性免疫应答，但是转移瘤通常与原发性肿瘤具有不同的抗原性。

涉及对病毒颗粒本身进行化学修饰的方法显示出理论上的希望。这样的修饰涉及将大的惰性分子(如peg)与病毒颗粒直接化学连接，或者在颗粒周围添加脂质包封或基于聚合物的包覆。尽管很多此类方法已证实能够保护病毒颗粒和/或使病毒脱靶(detarget)天然的靶组织(特别是肝脏)，但是此类方法通常会破坏病毒进入细胞的演变途径，并因此限制了病毒感染肿瘤细胞的能力。使用ph敏感性阳离子聚合物可减轻这种限制，但是却产生了毒性问题。尽管非常需要对病毒颗粒进行修饰的技术，但是迄今为止还没有进入临床环境的先例。

技术实现要素：

在一个方面中，提供了一种修饰病毒用于体内递送至感兴趣区域的方法，其包括形成包封组合物，以及将所述病毒与所述包封组合物结合以将所述病毒包围在所述结构中，所述包封组合物包含通过将至少一种脂质与至少一种亲水性化合物经由连接(linkage)缀合而形成的脂质缀合物，所述连接在所述感兴趣区域的条件下是可裂解的。例如，所述包封组合物可以形成脂质双层以包围/包封所述病毒。

在许多实施方式中，所述至少一种脂质选自：n-二十二烷酸、花生酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、维生素e、蒽贝素(embelin)、1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇，或具有下式的化合物：

其中r1是法呢基、香叶基或香叶基-香叶基，x是o、s、so、so2、nh或se，z是c-r2或n，r2是h、cn、co2r7、so3r7、conr7r8或so2nr7r8，其中r7和r8各自独立地为h、烷基、烯基、co2m或so3m，其中m是阳离子，且r3、r4和r5独立地为h、羧基、烷基、烯基、氨基烷基、硝基烷基、硝基、卤原子、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、巯基、巯基烷基、叠氮基或氰硫基，或其衍生物。在许多实施方式中，所述至少一种脂质具有下式：

例如，所述至少一种脂质可选自：s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸酰胺(fts-酰胺)、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸甲基酰胺(fts-ma)和s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸二甲基酰胺(fts-dma)。在许多实施方式中，所述至少一种脂质是法呢基硫代水杨酸或法呢基硫代水杨酸酰胺。

在许多实施方式中，所述病毒的科选自：痘病毒科(poxvidrae)、腺病毒科(denoviridae)、疱疹病毒科、小核糖核酸病毒科、弹状病毒科、副粘病毒科，逆转录病毒科、披膜病毒科或呼肠孤病毒科。例如，所述病毒可以选自：痘苗病毒、粘液瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒(hsv)、柯萨奇病毒、水疱性口炎病毒(vsv)、新城疫病毒(ndv)、腺相关病毒(aav)、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、逆转录病毒、呼肠孤病毒或辛德毕斯病毒。在许多实施方式中，所述病毒的科是痘病毒科。例如，所述病毒可以是痘苗病毒。例如，所述病毒可以是成熟痘苗病毒。

在许多实施方式中，感兴趣区域包含肿瘤，且所述病毒被修饰以治疗所述肿瘤。

在许多实施方式中，所述至少一种亲水性化合物包括至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性聚合物。亲水性低聚物或亲水性聚合物可以例如选自：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉、多糖和多肽。在许多实施方式中，所述至少一种亲水性化合物是聚环氧烷。所述聚环氧烷可以是例如聚乙二醇。聚乙二醇或其他亲水性聚合物可以例如具有至少1kda的分子量。

在许多实施方式中，所述连接对ph敏感。所述连接可以例如包括肼基。

所述包封组合物可以包含至少一种共脂质(co-lipid)。所述至少一种共脂质例如可以是磷脂。所述方法还可包括在包封组合物中提供添加剂。所述添加剂可以例如增加或减小所述包封组合物的稳定性。例如，可以包含胆固醇作为添加剂。dope(1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺)是一种融合脂质，其可用于降低脂质稳定性和促进病毒释放。

在另一个方面中，提供了一种制剂(例如，用于体内至感兴趣区域)，所述制剂包含病毒、合成包封组合物(如上所述)，所述合成包封组合物包围所述病毒并包含通过将至少一种脂质与至少一种亲水性化合物经由连接缀合而形成的脂质缀合物，所述连接在所述感兴趣区域的条件下是可裂解的。如上所述，所述包封组合物可以是包围所述病毒的脂质双层。

在另一个方面中，提供了一种体内递送病毒至感兴趣区域的方法，其包括注射如上所述的制剂。

在另一个方面中，提供了一种修饰病毒用于体内递送至感兴趣区域的方法，其包括形成包含具有下式的脂质的包封组合物：

其中r1是法呢基、香叶基或香叶基-香叶基，x是o、s、so、so2、nh或se，z是c-r2或n，r2是h、cn、co2r7、so3r7、conr7r8或so2nr7r8，其中r7和r8各自独立地为h、烷基、烯基、co2m或so3m，其中m是阳离子，且r3、r4和r5独立地为h、羧基、烷基、烯基、氨基烷基、硝基烷基、硝基、卤原子、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、巯基、巯基烷基、叠氮基或氰硫基，或其衍生物，以及将所述病毒与所述包封组合物结合以包围所述病毒。所述包封组合物可形成脂质双层。所述脂质例如可以选自：s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸酰胺(fts-酰胺)、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸甲基酰胺(fts-ma)和s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸二甲基酰胺(fts-dma)。

所述包封组合物形成脂质双层。在许多实施方式中，所述脂质选自：s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸酰胺(fts-酰胺)、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸甲基酰胺(fts-ma)和s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸二甲基酰胺(fts-dma)。

所述包封组合物例如可以包含至少一种共脂质。所述至少一种共脂质例如可以是磷脂。所述方法还可包括在所述包封组合物中提供添加剂。所述添加剂可以例如增加或减小所述包封组合物的稳定性。例如，可以包含胆固醇作为添加剂。

在进一步的方面中，实施方式的制剂(例如，用于体内递送至感兴趣区域)包含病毒、合成包封组合物，所述合成包封组合物包围所述病毒且包含具有下式的脂质：

其中r1是法呢基、香叶基或香叶基-香叶基，x是o、s、so、so2、nh或se，z是c-r2或n，r2是h、cn、co2r7、so3r7、conr7r8或so2nr7r8，其中r7和r8各自独立地为h、烷基、烯基、co2m或so3m，其中m是阳离子，且r3、r4和r5独立地为h、羧基、烷基、烯基、氨基烷基、硝基烷基、硝基、卤原子、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、巯基、巯基烷基、叠氮基或氰硫基，或其衍生物。可以对如上所述的包封组合物进行进一步表征。

在又一个方面中，组合物是通过将至少一种脂质与至少一种亲水性化合物经由ph敏感性肼连接缀合而形成，所述连接在感兴趣区域的条件下是可裂解的。所述组合物可例如形成脂质双层。所述至少一种脂质可例如选自：n-二十二烷酸、花生酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸、月桂酸、油酸、维生素e、蒽贝素、1-苯基-2-棕榈酰氨基-3-吗啉代-1-丙醇，或具有下式的化合物：

其中r1是法呢基、香叶基或香叶基-香叶基，x是o、s、so、so2、nh或se，z是c-r2或n，r2是h、cn、co2r7、so3r7、conr7r8或so2nr7r8，其中r7和r8各自独立地为h、烷基、烯基、co2m或so3m，其中m是阳离子，且r3、r4和r5独立地为h、羧基、烷基、烯基、氨基烷基、硝基烷基、硝基、卤原子、氨基、单烷基氨基、二烷基氨基、巯基、巯基烷基、叠氮基或氰硫基，或其衍生物。在许多实施方式中，所述至少一种脂质具有下式：

所述至少一种脂质可以例如选自：s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸酰胺(fts-酰胺)、s-反式，反式-法呢基硫代水杨酸甲基酰胺(fts-ma)和s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸二甲基酰胺(fts-dma)。在许多实施方式中，所述至少一种脂质是法呢基硫代水杨酸或法呢基硫代水杨酸酰胺(或其生物活性衍生物)。

所述至少一种亲水性化合物可例如包括至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性聚合物。所述亲水性低聚物或所述亲水性聚合物可例如选自：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉、多糖和多肽。在许多实施方式中，所述至少一种亲水性化合物是聚环氧烷。所述聚环氧烷可例如是聚乙二醇。所述聚乙二醇或其他亲水性聚合物可例如具有至少1kda的分子量。在许多实施方式中，所述连接对ph敏感。

合成的脂质衍生的脂质体包封或其包封组合物形成了具有显著改善的治疗潜力和新性质的包封病毒。与非包封病毒相比，合成包封病毒保留(并且在一些情况下甚至增加)了病毒的感染性。相对于非包封病毒，合成包封病毒可增加体内靶组织(肿瘤)中的绝对感染(如通过病毒基因表达所确定)。

通过静脉内途径将合成包封病毒递送至肿瘤可能由于其通过网状内皮系统(res)的快速清除而效率低下。但是，通过使用可以在特定环境条件(如低ph、redox电位、存在蛋白酶等)下裂解的键共价连接可为例如惰性的亲水性化学结构(如聚乙二醇)与脂质包封可以解决这个问题。如本文所用，术语“惰性”是指亲水性化学结构(例如，聚合物)，其除了预期的屏蔽作用以外不具有显著的生物学作用。以这种方式，还可使病毒载体在循环中进一步脱靶和受保护。可在靶微环境(如肿瘤中通常可见的低ph，炎症中可见的氧化应激增加等)下有条件地自亲水性外壳释放合成包封病毒。将其他靶向因子加入合成包封病毒还可用于将病毒靶向某些细胞类型。

本文的合成包封病毒不需要特定蛋白-蛋白相互作用或共价键以保持外包封。因此，合成包封是稳定的，但保留了在感染步骤期间脱落的能力。这与例如加至mv病毒以形成ev形式的天然脂质包封是不同的。在这种情况下，外膜需要特定蛋白相互作用，并且仍是高度不稳定的。在这一点上，传统上不可能纯化和储存ev形式的痘苗，因为外包封过于不稳定。使用本文的合成包封，可以将组合物存储至少一段时间(冻/融等)。未优化的研究表明，组合物可以采用一个冻/融循环储存至少一个月。

根据下面的详细说明并结合附图可以最好地领会和理解本发明的装置、系统、方法和组合物，以及其属性和伴随的优点。

附图说明

图1a示出了包封病毒的代表性实施方式的形成的理想化的示意图，其中包封是脂质双层。

图1b示出了用于本文的包封中的可裂解基团的代表性实例。

图1c示出了用于本文的包封中的的脂质的代表性实例。

图1d示出了在空白或经免疫接种的小鼠中静脉内递送后的病毒基因表达和抗肿瘤作用，其中对balb/c小鼠进行或不进行免疫接种(ip注射1e6个噬斑形成单位或pfu的野生型痘苗株wr)，并在28天后皮下植入4t1肿瘤。

图1e示出了在空白或经免疫接种的小鼠中瘤内递送后的病毒基因表达和抗肿瘤作用，其中对balb/c小鼠进行或不进行免疫接种(腹腔内或ip注射1e6pfu的野生型痘苗westernreserve株或wr)，并在28天后皮下植入4t1肿瘤。

图1f示出了在空白或经免疫接种的小鼠中静脉内递送后随时间变化的肿瘤体积。

图1g示出了在空白或经免疫接种的小鼠中瘤内递送后随时间变化的肿瘤体积。

图2a示出了确认病毒包封的电子显微镜显微照片，其中病毒(wr.tk-luc+)被包含peg-fts-h，ph敏感性脂质的脂质双层所包封，且包封通过电子显微镜(em)和zetasizer得到证实。

图2b示出了确认采用不具有ph敏感性的脂质包封病毒的另一电子显微镜显微照片。

图2c示出了包封前病毒以强度计的尺寸分布图。

图2d示出了采用包含peg-fts-h脂质的脂质层包封的病毒(wr.tk-luc+)以强度计的尺寸分布图。

图3示出了不同包覆制剂的体外比较，其中使用含peg-fts或dspe-peg的脂质层包覆病毒(wr.tk-luc+)或不包覆病毒。

图4a示出了裸病毒和包封病毒的体内递送，其中将hct116肿瘤植入无胸腺nu/nu小鼠，且一旦肿瘤明显，则通过ip注射递送高剂量牛痘免疫球蛋白或vig，24h后iv递送裸wr.tk-luc+或包封wr.tk-luc+(1e8pfu/小鼠，n＝4只/组)，并在24h后以生物发光测量病毒基因表达。

图4b示出了体内递送裸病毒和包封病毒的以生物发光计的病毒表达。

图5a示出了在完全免疫接种的小鼠中以生物发光计的肿瘤生长24h后测量的病毒基因表达，其中对c57/bl6小鼠进行(或不进行)免疫接种，28天后植入mc38肿瘤细胞；以及其中一旦肿瘤明显，则如上文所示采用iv注射裸露的或包封的wr.tk-luc+来处理小鼠。

图5b示出了在图5a的研究中利用肿瘤体积(通过卡尺测量)随时间变化而测量的抗肿瘤作用。

图6a示出了在荷瘤小鼠中重复递送对肿瘤体积(通过卡尺测量)的影响，其中采用iv剂量的wr.tk-.gfp+，然后是wr.tk-luc+处理小鼠(皮下荷有renca肿瘤的小鼠)，处理之间间隔三天。

图6b示出了在荷瘤小鼠中重复递送对肿瘤体积(通过卡尺测量)的影响，其中采用iv剂量的wr.tk-.gfp+，然后是wr.tk-luc+处理小鼠(皮下荷有renca肿瘤的小鼠)，处理之间间隔17天。

图7示出了与不具有本文包封的若干病毒类型相比，在本文的方法下包封或封装的此类病毒的感染率百分数。

图8示出了多种本文ph敏感性缀合物的结构。

具体实施方式

将会容易理解的是，如在本文的附图中普遍描述和阐明的实施方式的组分可以在除了所描述的代表性实施方式以外的各种不同配置中进行布置和设计。因此，以下如附图中所示的代表性实施方式的更为详细的说明无意于限制请求保护的实施方式的范围，而仅仅是对代表性实施方式的说明。

贯穿本说明书的对于“一个实施方式”或“实施方式”(等)的提及意指所描述的与实施方式有关的具体特征、结构或特性包括在至少一个实施方式中。因此，短语“在一个实施方式中”或“在实施方式中”等在本说明书的不同地方的出现并不必然都是指相同的实施方式。

而且，所描述的特征、结构或特性可以以任何合适的方式在一个或多个实施方式中组合。在下面的说明中，提供了众多具体的细节以给出对实施方式的全面理解。然而相关领域的技术人员会认识到各种实施方式可以在没有一个或多个具体细节，或采用其他方法、组分、材料等的情况下实施。在其他情况下，为了避免混淆，未详细显示或描述众所周知的结构、材料或操作。

如本文和所附权利要求中所用的单数形式“一(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括了复数指代，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一个病毒”包括了多个此类病毒以及本领域技术人员已知的其等价物等，而提及“所述病毒”是指一个或多个此类病毒和本领域技术人员已知的其等价物等。本文对数值范围的描述仅仅意在作为分别针对落在范围内的每个单独值的速记方法。除非本文另有指出,否则每个单独的值以及中间范围被并入说明书，如同其在本文中被单独描述。本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序进行，除非本文另有指出或或者另与上下文明确禁忌。

术语“病毒”、“病毒体”和“病毒颗粒”在本文中可互换使用。通常，统一使用术语“病毒”。病毒是无法在宿主以外生长或繁殖的亚微观感染源。病毒包含在已知为衣壳的保护性蛋白外壳内的遗传物质(dna或rna)。衣壳的形状自简单的螺旋形和二十面体(多面体或近球形)形式至具有尾部或包膜的更复杂结构而变化。在本文的系统、方法和组合物中使用的病毒可以是天然病毒或工程化/修饰的病毒。

如本文所用，术语“聚合物”是指由多个小分子或单体制成的化学化合物，所述小分子或单体以重复结构排列以形成更大的分子。聚合物可以是天然存在的或合成形成的。术语“聚合物”的使用包括均聚物以及共聚物。在本文中使用的术语“共聚物”包括具有两种或更多种不同单体的任何聚合物。共聚物可以例如包括交替共聚物、周期共聚物、统计共聚物、随机共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物等。聚合物的实例包括例如聚环氧烷。

如本文所用，术语“脂质”是指一组分子，其包括例如脂肪、脂肪酸、蜡、甾醇、脂溶性维生素(如维生素a、d、e和k)、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂等。脂质的关联在于其在非极性有机溶剂中是可溶的而在水中通常是不溶性的。磷脂是例如形成所有细胞膜的主要成分的一类脂质。由于其两亲性特性，磷脂可形成脂质双层。磷脂分子可例如包含通过甘油分子连接在一起的两条疏水性脂肪酸“尾”和一个亲水性“头”。

使用脂质包封或聚合物包衣保护溶瘤病毒的努力可以使病毒载体成功从正常组织(如肝脏)脱靶，并且甚至在某种程度上逃避抗病毒免疫。然而，这种获益在传统上是以显著丧失肿瘤的病毒感染性(通常病毒的约5％回收率)为代价的。尽管与其他包封材料相比，阳离子聚合物可显示出更好的病毒感染性保留，但阳离子聚合物表现出毒性问题。本文的病毒包封策略克服了与现有方法相关的许多局限，并且即使面对已有的抗病毒免疫，也可以提供将病毒递送至肿瘤靶标的有力手段。将结合溶瘤病毒的代表性实例讨论本文的病毒包封系统、方法和组合物。然而，本领域技术人员将会意识到，可将这样的病毒包封系统、方法和组合物应用于任何病毒疗法中。

如上所述，本文的病毒包封策略克服了与现有方法相关的许多局限，并且即使面对已有的抗病毒免疫，也可以提供将病毒递送至肿瘤靶标的有力手段。在许多实施方式中，将病毒、病毒体或病毒颗粒(统称为病毒)包封或封装在由含有疏水性/脂质结构域和与所述疏水性/脂质结构域连接的亲水性结构域的组合物形成的合成包封中。亲水性结构域可以例如在靶区域或感兴趣区域(即，治疗靶向的区域)的生理条件下与疏水性/脂质结构域是可分离的。在整个机体中可能存在不只一个感兴趣区域(例如，在播散性癌性肿瘤的情况下)。在许多实施方式中，合成包封病毒是天然存在和感染性包膜病毒形式的病毒的合成版本。在此类实施方式中，例如，可以对靶细胞的感染进行优化。

本文的合成包封可例如包含合成脂质缀合物，所述合成脂质缀合物包含与亲水性结构域(例如，亲水性聚合物结构域，其包括例如聚环氧烷如聚乙二醇)经由接头(linker)而连接或缀合的疏水性/脂质结构域，所述接头在感兴趣区域的生理条件下是不稳定的或可裂解的。在许多实施方式中，接头是ph敏感性接头。此类经修饰的病毒在血液中是稳定的，并且能够逃避抗病毒抗体，从而能够使其全身递送至例如酸性肿瘤环境。一旦在肿瘤中，亲水性结构域通过ph敏感性接头的裂解而脱去，失稳化所述合成病毒包封并导致感染性的合成包封病毒的释放。在本文的许多代表性研究中，这样的合成包封病毒在小鼠模型中显示出增强的全身递送和治疗作用，甚至是在面对已存在的抗病毒免疫的情况下或在重复的全身递送期间。

图1a示出了包围病毒的本文合成脂质包封的代表性实施方式的理想化的示意图。在所示实施方式中，包封形成封闭的脂质双层。双层是脂质在水溶液中优选的结构。在本文多个实施方式中，本文的合成脂质缀合物与一种或多种共脂质结合以形成合成包封。例如，共脂质可以形成包封/双层的主要脂质成分。在许多实施方式中，磷脂形式的共脂质是包封/脂质双层的主要成分。合成脂质缀合物的量的增加有助于降低与血液成分之间的相互作用以及自循环的快速清除。然而，掺入过多此类脂质缀合物可能会损害脂质双层的稳定性。在本文的很多实施方式中，掺入不超过20％摩尔％的亲水性化合物-脂质缀合物。亲水性化合物-脂质缀合物可以例如以5至20摩尔％的范围存在。共脂质可以例如以40至95摩尔％的范围存在。添加剂(如dope或胆固醇)可以例如以0至40或者10至40摩尔％的范围存在。可将各种磷脂用作本文的共脂质，其包括但不限于天然和合成磷脂酰胆碱或pc(例如，l-α-磷脂酰胆碱)、磷脂酰乙醇胺或pe(例如，l-α-磷脂酰乙醇胺)和磷脂酰肌醇或pi(例如，l-α-磷脂酰肌醇)。天然磷脂酰胆碱包括例如卵pc、心pc、大豆pc、脑pc和肝pc。合成磷脂酰胆碱包括例如1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dlpc)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dmpc)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dspc)。天然磷脂酰乙醇胺包括例如卵pe、心pe、大豆pe、脑pe、肝pe。合成磷脂酰乙醇胺包括例如1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dlpe)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dmpe)、1,2-二十六碳酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dppe)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(dspe)。天然磷脂酰肌醇包括例如肝pi、大豆pi、脑pi。合成磷脂酰肌醇包括例如1,2-二十六碳酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)(dppi)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)(dopi)和1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸-(1'-肌醇)(dspi)。例如，可以容易地通过针对特定包封、病毒和/或应用对包封/双层的脂质组分进行优化以进一步调整包封病毒的效力。

本文的合成包封可以例如包含一种或多种另外的取代物，通常将其称作图1a中的添加剂。这样的添加剂可以例如具有调节合成包封稳定性的功能。例如，胆固醇可以有助于稳定脂质双层。另一方面，1,2-二油酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺(dope)是一种融合脂质。包含dope可在胞内递送后降低脂质稳定性并促进病毒自内体释放。类似地，可将各种其他添加剂用于调节或调整本文组合物或制剂的性质。

还可针对特定包封、病毒和/或应用通过已知活性和/或常规实验对各种添加剂的性质和浓度进行优化。在稳定组分(如胆固醇)的情况下，例如，尽管稳定的脂质双层可能是所需的，但是过于稳定的双层可能会对内化进入细胞后病毒的脱包覆造成不利影响。

如上文所讨论的，合成脂质包封(包括本文的合成脂质缀合物)有助于阻止病毒与血清蛋白之间的非特异性相互作用，这对于延长血液中的循环时间以及有效靶向肿瘤是重要的。此外，在本文的合成脂质缀合物中的不稳定或可裂解接头提供了合成包封的受控脱落。

在多项研究中，使用本文的合成包封封装或包封代表性的痘苗病毒。可以作为多种临床载体骨架的痘苗病毒可以以覆盖病毒核心的脂质包封数有别的不同感染性形式存在。这些形式包括最基本的感染形式(胞内成熟病毒，imv或成熟病毒，mv)以及具有附加宿主细胞衍生脂质包封的imv版本(包封病毒，ev)。将人工或合成疏水性/脂质包封应用于imv形式的病毒形成了ev形式的合成版本或模拟物，其具有天然演变的多种细胞进入途径。与多种人工包封或包覆的病毒不同，合成ev可以保持更强大的感染肿瘤细胞的能力。在多个代表性实施方式中，使用ph敏感性接头将亲水性结构域与疏水性/脂质包封连接以在循环中保护病毒颗粒，但是一旦在酸性肿瘤环境中或在进入内体途径之后，其自包围病毒颗粒的包封裂解。在酸性肿瘤环境以外的靶区域或感兴趣区域的情况下，可裂解的键可对感兴趣区域内存在的其他微环境(例如，还原/氧化电位、缺氧和基质金属蛋白酶-9)具有应答性或敏感性(代表性实例参见图1c)。在本文的许多实施方式中存在合成模拟天然存在病毒形式与引进先进脂质技术的结合。然而，本文的系统、方法和组合物通常适用于病毒疗法且无需模拟天然存在的包封病毒形式。

如上所述，在本文的多个实施方式中，引入痘苗骨架使得能够将合成脂质包封加至病毒形式(imv)，这导致产生天然演变形式病毒(ev)的合成版本或模拟物。以这种方式，形成天然存在病毒的合成版本且不破坏病毒的天然细胞进入途径。实际上，即使当使用“标准”脂质包封(即，不包括本文的合成脂质缀合物的脂质包封)时，痘苗病毒的回收率也比在此前模型中报道的好10倍。

用于形成本文的合成脂质缀合物的亲水性结构域的亲水性化合物可以例如包括至少一种亲水性低聚物或至少一种亲水性聚合物。亲水性低聚物或亲水性聚合物可以例如选自：聚环氧烷、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚噁唑啉、多糖和多肽。在许多实施方式中，至少一种亲水性化合物是聚环氧烷。在本文的多个代表性实施方式中，聚环氧烷是聚乙二醇(peg)。在许多实施方式中，亲水性化合物(例如，peg)具有至少1kda(例如，在约1kda至10kda的范围内)的分子量。在许多实施方式中，亲水性结构域具有在约1kda至5kda范围内的分子量。本文的合成脂质缀合物的亲水性结构域例如包含单链或多链。

可在本文的合成脂质缀合物的疏水性结构域中使用多种不同的疏水性化合物。此类疏水性化合物的代表性实例提供在图1b中。本文的合成脂质缀合物的疏水性结构域例如包含单链或多链。

在多个代表性的实施方式中，用于形成包封的合成脂质缀合物组合物包括法呢基硫代水杨酸(fts)或采用ph敏感性和可调节肼接头与peg缀合的法呢基硫代水杨酸的衍生物。此类物质的使用提供了若干优点。fts或fts衍生物可以例如是法呢基硫代水杨酸的生物活性衍生物，包括例如s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸酰胺、s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸甲基酰胺(fts-ma)或s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸二甲基酰胺(fts-dma)。其他生物活性法呢基硫代水杨酸衍生物也适用于本文。在这一点上，fts本身具有抗肿瘤活性(作为ras抑制剂)，可以将其与通过病毒负载所带来的不同机制的抗肿瘤活性相组合。此外，可以通过例如选择不同长度的碳链或者靠近腙接头的适宜吸电子/供电子基团而容易地精细调节响应于ph变化的peg-fts-h的裂解。这种方法学为将包封病毒递送至肿瘤组织后peg的脱离速率提供了控制。

如下所示的s-反式,反式-法呢基硫代水杨酸(fts)

是一种合成的法呢基半胱氨酸模拟物，可作为一种有效且特别是无毒的ras拮抗剂。由原癌基因ras家族中的突变产生的具有组成性活性的ras存在于三分之一的人类癌症中，在胰腺癌(90％)和结肠癌(50％)中检测到ras突变活化的发生率最高。ras还通过其他机制在癌细胞中活化。特别地，表皮生长因子受体(egfr)酪氨酸激酶活性的过度活化导致ras和ras介导信号转导的持续活化。ras的活化形式组成性激活其下游效应物，这有助于细胞转化。fts能够抑制致癌性活化的ras和生长因子受体介导的ras激活二者，这导致了对ras依赖性肿瘤生长的抑制。fts能够抑制ras转化活性并逆转ras转化成纤维细胞的转化表型。在广泛的已确立癌症模型中，已经证实了fts显著降低ras水平，并在动物中抑制肿瘤生长而不具有不利的毒性。一个主要机制涉及通过与ras竞争结合于ras护卫蛋白而影响ras的膜相互作用，促进其降解，并因此破坏ras蛋白在质膜中传递信号。除了其抗肿瘤活性以外，fts还显示出抗炎活性。fts或具有例如下式的fts衍生物：

其中r1、r2、r3、r4、r5、x和z如上文所定义，与一种或多种亲水性化合物(例如，亲水性低聚物或聚合物，如聚乙二醇或peg)的缀合可提供抗肿瘤或ras拮抗剂活性，其不依赖于病毒疗法且与病毒疗法具有协同作用。

在本文的多个代表性实施方式中，通过采用可裂解的肼接头将亲水性peg区段与一个或多个疏水性fts-酰肼或fts-h区段缀合而形成ph-敏感性组合物。在脂质包封上使用代表性的peg-(fts-h)2(ph敏感性peg接头)导致在组织培养物中100％回收感染性痘苗病毒，这是此前采用其他包封技术未曾实现的。包封还提供了针对中和抗体的保护，这确认包封是有活性的，且如同预期具有保护病毒的功能。

此外，在小鼠肿瘤模型中的体内应用表明，本文的包封痘苗病毒的使用不仅降低了在非肿瘤组织中的病毒摄取，实际上还导致了向肿瘤递送的改善/增加(相对于在空白小鼠中的裸病毒)。这是发明人首次意识到包封技术实际上增强了递送至肿瘤。

在面对抗病毒免疫的情况下，当病毒载体被包封时唯一可能将活性病毒递送至肿瘤或其它所关注区域。在本文的很多实施方式中，与在空白(未免疫)小鼠中递送的裸病毒相比，在完全免疫小鼠中全身递送的包封病毒实际上显示出来自肿瘤的病毒基因表达增加。这是对任何先前已报道方法的显著改进。

本文包封病毒的递送增强还表现为其自身治疗活性以若干方式增强。在这一点上，当在空白动物中全身递送时，相对于裸病毒，包封病毒显示出增加的治疗作用。实际上，当在完全免疫小鼠中全身递送包封病毒时所达到的治疗获益甚至优于在空白、非免疫小鼠中的裸病毒(而裸病毒在免疫小鼠中不具有治疗作用)。此外，当将重复的疗程应用于空白的荷瘤动物时，对于裸病毒而言，附加的疗程不会产生附加的治疗获益，但是当使用包封病毒时则提供了显著的进一步获益。这样的数据表明本文的系统、方法和组合物与其他已报道的方法相比提供了显著的进步。

在多个代表性的实验中，探索了通过不同途径递送后以及具有或不具有预先存在的免疫的情况下裸病毒的递送能力(通过肿瘤内的荧光素酶转基因表达而确定)和治疗结果。对balb/c小鼠进行或不进行免疫接种(ip注射1e6pfu野生型痘苗株wr)，并在28天后皮下植入4t1肿瘤。一旦形成大的肿瘤(即具有约300-400mm³体积的肿瘤)，则采用静脉内(尾静脉)或瘤内注射模型溶瘤痘苗株(1e8pfu胸苷激酶tk基因缺失且表达荧光素酶作为报告蛋白的病毒株wr；目前进行临床检测的全部三种痘苗株均含有tk基因缺失)而对小鼠进行处理。随后的肿瘤体积和来自肿瘤内的病毒基因表达如图1d至1g中所示。

对于空白小鼠，静脉内和瘤内递送之间的抗肿瘤作用没有显著差异。尽管静脉内递送后病毒基因表达似乎略有降低，但这是非显著的(p＝0.1)。在此前已免疫的小鼠中，静脉内递送导致在肿瘤中几乎没有病毒基因表达(在1e4ph/sec/肿瘤下确定生物发光的背景水平)。不出所料，这与不具有治疗获益相关联。在此前已免疫的小鼠中，瘤内递送确实产生了来自肿瘤的可检测的病毒基因表达，但这仍比在空白小鼠中的病毒基因表达低>50倍。不受任何机制的限制，降低可能主要是由于靶向经感染肿瘤细胞的基于抗病毒t细胞免疫所导致的，因为是在递送后24h以及子代病毒扩散之前进行的成像。尽管病毒基因表达显著降低，但是实际上治疗作用显著增加。治疗作用的增加可能例如由ov疗法的免疫治疗作用所介导(因为溶瘤作用降低)。这些结果均强化了这样的假设，即最有效的ov疗法主要作为免疫疗法，但是也强调了在预先免疫的患者中成功向肿瘤递送ov的潜在重要作用。

可将脂质-亲水性聚合物缀合物或组合物(如脂质-环氧烷缀合物)用于形成作为用于递送小分子化疗剂至肿瘤靶点的载体的胶束。将诸如还原敏感性(例如，二硫化物)连接的附加不稳定连接引入脂质-亲水性聚合物缀合物(如5kdapeg和两个法呢基硫代水杨酸基团的缀合物(peg5k-fts2))导致肿瘤生长抑制作用增加以及其在体外和体内递送例如紫杉醇(ptx)至肿瘤细胞的性能的进一步改善。参见，例如，美国专利申请公开号2015/0306034和2015/0231271，其公开内容通过引用并入本文。其合成技术可适用于合成本文的脂质-亲水性缀合物。

如上所述，在本文很多代表性的实施方式中，通过采用可裂解接头(如肼接头)将亲水性peg区段与一个或多个疏水性fts-h区段缀合而形成ph敏感性组合物。再次，可以通过选择不同碳链长度或者肼接头周围的适宜吸电子/供电子基团而容易地调节肼接头的稳定性。因此，可以开发出一种当暴露于例如在肿瘤微环境中可见的酸性ph时被裂解的接头。

在代表性的方法中，将含有比例为2:1:0.1的dmpc：胆固醇：peg5k-fts-h2的脂质薄膜与成熟病毒(溶瘤痘苗wr.tk-.luc+的mv形式)在pbs缓冲液中混合并超声以形成脂质包封的病毒颗粒。该病毒制备方法产生含有>98％mv的病毒，其含有单一外包封(与包封病毒不同，具有附加的脂质包封的ev形式)。通过em对合成包封mv进行检测以确认接近100％的病毒颗粒被包封，并且病毒颗粒作为单一颗粒被包封(不成团或成对)(参见图2a和2b)。此外，使用电子显微镜以确认包封的完整性。图2c和2d分别示出了包封前的病毒和采用包含peg-fts-h脂质的脂质层包封后的病毒(wr.tk-luc+)以强度计的尺寸分布。

在多个初始体外实验中，再次采用含有peg5k-fts-h2的包封封装mv痘苗病毒。将实验结果与裸病毒和更标准的脂质包封技术(即，不同于包括本文的合成脂质缀合物的那些的脂质包封技术，并且因此不包含可裂解的亲水性结构域)比例为2:1:0.1m的dmpc:胆固醇:dspe-peg2k)进行比较，这样可以探索包封痘苗mv形式以及使用本文的ph敏感性包封封装的优势。

将裸病毒、peg-fts和dspe-peg包封病毒与高剂量vig(牛痘免疫球蛋白)或pbs混合30分钟，随后加入(hela细胞的)新鲜细胞层。在加入细胞层之前，另外在中性或较低ph下处理peg-fts包封病毒组。

图3示出了不同包覆制剂的体外比较，其中采用含有peg-fts或dspe-peg的脂质层包封病毒(wr.tk-luc+)，或不对其进行包覆。然后将病毒与高剂量vig混合30分钟，或不加抗体放置。然后，另外向peg-fts包封病毒中加入hcl以降低ph。然后将病毒加至hela细胞层，放置24h用于发生感染和基因表达，之后读取生物发光。从图3中确定，使用dspe-peg包封(无vig)导致相对于裸病毒约50％的回收率。该结果相比采用其他病毒骨架的任何类似的经报道技术(其中通常的回收率为1-5％)是显著的进步。这样的结果可证明包封mv形式的痘苗以形成ev的合成版本是有利的，这样保留了天然的病毒感染途径。

然而，当引入peg-fts作为病毒包封时，相对于裸病毒实现了100％的回收率(在暴露于较低ph以脱去peg后)。因此，很显然，将用于包封的痘苗mv与ph敏感性peg脱去技术组合导致了病毒的完全回收。尽管暴露于vig将裸病毒完全中和，但peg-fts包覆的病毒受到保护并且约50％的感染性病毒被回收。即使在细胞层上层化颗粒(加上vig)以用于感染步骤之前脱去peg(通过降低ph)，也获得了该结果。

在随后一系列代表性实验中，将裸病毒或peg-fts包覆病毒静脉内(尾静脉，1e8pfu/小鼠，每组n＝4)递送至皮下移植hct116肿瘤的无胸腺裸小鼠(参见图4a和4b)。在一些组中，动物已先前接受腹腔内vig注射。以这种方式，使得在面对中和抗体且不处理因靶向经感染肿瘤细胞的ctl应答所导致的肿瘤信号丧失的情况下检查递送成为可能。

出乎意料的是，在不存在vig的情况下，当将本文的合成包封病毒(evv)与裸病毒(vv)进行比较时，包封病毒显示出显著增强(p＝0.009)的来自肿瘤的病毒基因表达，指示更有效的递送。当对小鼠身体上部圈出的感兴趣区域(包括天然病毒靶点，如肝、脾和肺，但不包括肿瘤)进行类似比较时，evv显示出来自正常组织信号的5倍减少。这种减少是病毒颗粒成功脱靶的典型结果，但是其通常出现在损害肿瘤靶点感染的情况下。在本文的包封病毒的情况下，实际上可见肿瘤内的感染增加。

当存在vig时，裸病毒不产生来自肿瘤的可检测信号。然而，包封病毒仍能够产生高水平的肿瘤信号(尽管其相对于在空白小鼠中的包封病毒递送减少了约3倍)。

在另一组代表性实验中，在空白和完全免疫小鼠中对递送和抗肿瘤作用进行了比较。初始采用野生型痘苗(wr株，ip1e6pfu)接种免疫活性动物，并将未进行接种的动物作为对照。将接种的动物留置28天，以确保病毒被清除以及适应性应答进入记忆期，以便不影响肿瘤植入。然后，小鼠皮下植入mc38肿瘤。一旦肿瘤变得明显，则采用单次静脉内注射1e8pfuwr.tk-或包封wr.tk-来处理小鼠(参见图5a和5b)。

如采用裸鼠模型所观察到的，可以看到，相对于裸病毒，在空白小鼠中全身递送后，包封病毒在感染肿瘤方面实际上更有效。如同预期，在之前已免疫的动物中全身递送后，在肿瘤中未检测到病毒基因表达。值得注意的是，与裸病毒在递送至空白小鼠后所能达到的情况相比，包封病毒在免疫小鼠中递送后在肿瘤中产生更高的病毒基因表达，尽管在肿瘤中感染细胞后ctl应答具有预期的抗病毒作用。

本文包封病毒增强的病毒基因表达还转化为增强的治疗活性。尽管裸病毒在空白小鼠的该模型中对肿瘤生长产生了适度的延迟，但是当将其递送至之前已免疫的小鼠中时是无效的。无论是在空白的还是免疫前的小鼠中递送，本文的包封病毒均产生了显著增强的治疗作用(相对于在空白小鼠中的裸病毒)。相对于在空白小鼠中递送的裸病毒，本文的包封病毒实际上可增强抗肿瘤作用，即使在完全免疫动物中全身递送本文的包封病毒时也是如此。

为了更加准确地模拟临床情况，即其中患者可能之前未暴露于病毒，或者可能在数十年前接种而仅剩下有限的免疫力，进行向荷瘤小鼠重复递送包封病毒或裸病毒的实验。由于大多数同系肿瘤具有高度侵袭性，并且在肿瘤变得明显及至需要处死动物之间的时间范围仅为2-3周(这与产生强烈的抗体应答所需的时间大致相同)，因此这样的实验是复杂的。

在许多实验中，balb/c小鼠皮下植入renca肿瘤，一旦肿瘤变得明显，则通过尾静脉采用1e8pfu的裸病毒或包封病毒处理小鼠。在间隔3天或14天后，递送第二轮相同的治疗。随时间变化确定肿瘤负荷。在图6a和6b中可见，尽管相对于单次静脉内注射(当在第17天进行成像时，单次注射的肿瘤体积为1720mm³)，重复注射裸病毒未提供附加的治疗获益，但是重复循环全身递送后包封病毒产生了显著的附加治疗获益。

图7示出了与作为对照的不具有本文包封的若干病毒类型相比，在本文方法下包封或封装的此类病毒的感染率百分数。对于诸如腺病毒(ad)和hsv的代表性病毒获得了改善的结果。这些结果表明可将其他病毒骨架(包括脂质和蛋白包封病毒)封装在如本文所述的合成脂质包封中而保留其感染能力。保留的感染能力大于之前描述技术(包括，将peg附接在病毒表面以增强全身循环和/或将病毒自非靶组织(如肝脏)中摄取脱靶的方法)所报道的感染能力。为天然不以具有不同数量脂质层的不同形式存在的病毒(如腺病毒或hsv)加入合成包封后，其感染能力相对于具有该能力的那些病毒(如痘苗病毒)可能是降低的。

hsv和腺病毒通常作为基因疗法或溶瘤病毒疗法的骨架。尽管采用这些病毒有一些感染性损失，但与之前描述的方法相比，其相对较小。

实验

细胞系和病毒载体：包括4t1(小鼠乳腺癌)、renca(小鼠肾癌)、hct116(人结肠直肠癌)和hela(人宫颈癌)在内的肿瘤细胞系获得自atcc。mc38(小鼠结肠直肠癌)获得自匹兹堡大学的davidbartlett。按照推荐方案培养细胞。牛痘免疫球蛋白(vig)由cdc惠赠。

痘苗株wr.tk-luc+含有在病毒胸苷激酶(tk)基因中的插入突变，其含有在pse/l启动子控制下的荧光素酶转基因，并且之前已有描述。在hela细胞中扩增病毒，通过冻/融对其进行裂解并通过超速离心条带和切向流纯化。

小鼠和小鼠模型。小鼠(无胸腺nu-/nu-，balb/c和c57/bl6)获得自charlesriver，并且在自由摄食和饮水条件下饲养。通过皮下植入1e6个小鼠肿瘤细胞或1e7个人肿瘤细胞形成肿瘤。除非另有说明，否则一旦肿瘤变得明显(50-100mm³)，则通过尾静脉注射采用1e8pfu的病毒或包封病毒处理动物。随后通过卡尺测量确定肿瘤体积并通过生物发光成像(ip递送d-荧光素底物(goldbio)后，在ivis200，perkinelmer上进行)确定病毒基因表达。

代表性ph敏感性或响应性缀合物的合成。进行了适于形成脂质病毒包封的若干代表性ph敏感性或响应性缀合物的合成。图8中示出了含有通过腙接头与一分子peg偶联的两分子fts-h的一系列ph敏感性缀合物。研究了具有增加的碳链长度或接近腙接头的吸电子/供电子基团的缀合物，以证明其可调的ph敏感性(参见图8)。图8的四种缀合物的合成是直接的，使用peg化分子上的酮基团与fts-h反应，其通常在2小时内完成。通过对缀合物进行¹hnmr谱和maldi-tof确认成功合成。

病毒包封。材料：二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、胆固醇(chol)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](dspe-peg2k)、具有肼接头的peg5k-fts-酰肼(peg5k-fts-h2)。

方案：在玻璃管中，以2:1:0.1的摩尔比将二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(dmpc)、胆固醇和mpeg-fts溶解在氯仿中。通过氮气流进一步除去有机溶剂以形成薄膜。真空干燥薄膜1h以除去残余溶剂。采用pbs稀释病毒，然后将其加至管中以水化薄膜。将具有水化膜的管置于超声水浴(输出控制设定4，sonifer250)中30分钟。在室温下稳定3小时后，即获得包封病毒。

目前，之前的说明书和附图阐明了多个代表性实施方式。在不背离本文范围的情况下，根据之前教导的各种修饰、增加和替换设计对本领域的技术人员而言自然会是显而易见的，这被随后的权利要求而非之前的说明书所指示。落入权利要求的含义和等价范围内的所有的改变和变化均包含在其范围内。