网蛋白-1结合抗体及其用途的制作方法
本申请根据《美国法典》第35编第119(e)节要求于2016年4月8日提交的名称为“网蛋白-1结合抗体及其用途(plectin-1bindingantibodiesandusesthereof)”的美国临时专利序列号62/320,117的申请日，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
在美国，胰腺导管腺癌(pdac)是癌症死亡的第四主导原因，显示出引起死亡的快速临床进程。一旦诊断后，pdac的存活期中值为6个月，5年存活率仅为3％(li等，lancet363:1049-1057(2004))。
由于化疗和放疗仅具有适度益处，并且手术只能在20％的患者中进行，因此允许手术切除的早期检测为更长的存活期提供了最佳希望(yeo等，annsurg222:580-588(1995)；讨论588-592)。事实上，在高危患者组(例如遗传性癌症综合征、慢性胰腺炎和新发糖尿病)中检测pdac或高等级前兆，代表了癌症诊断方法中关键的尚未满足的需求(brentnall等，ann.intern.med.131:247-255(1999)；canto等，clin.gastroenterol.hepatol.2:606-621(2004))。
血清ca-19-9是一种临床上使用的生物标志物；然而，它缺乏检测早期pdac所需的灵敏度(goggins,j.clin.oncol.23:4524-4531(2005))。此外，腹部横截面成像已被证明对在高危患者中检测早期pdac来说不可靠(pelaez-luna等，amjgastroenterol102:2157-2163(2007))。
因此，在本医学领域中，鉴定生物标志物以用于开发作为诊断试剂的结合配体例如用于检测肿瘤前/早期侵入性病变的成像探针以及用于治疗，具有高优先级。
技术实现要素：
本公开的各个方面涉及下述认知，即临床上有用的基于抗体的药剂例如抗体药物偶联物(adc)的成功开发，受到所述药剂对其靶的特异性和选择性限制。网蛋白-1以一种有用的生物标志物，可用于各种不同的癌症，包括卵巢癌、食道癌和头颈鳞状细胞癌以及胰腺导管腺癌。与抗体靶例如被本妥昔单抗瑞他汀(brentuximabvedotin)靶向的cd30和被阿杜曲妥珠单抗美坦新(ado-trastuzumabemtansine)靶向的her2形成对比，网蛋白-1是特别有用的靶，因为它在某些癌细胞(例如胰腺导管腺癌细胞、卵巢癌细胞等)中专一地存在于细胞表面上，从而提供了精妙的特异性和选择性。因此，在某些实施方式中，本公开涉及特异性结合到癌细胞表面上的网蛋白-1的抗体和抗原结合片段及其使用方法。在某些实施方式中，本公开所描述的抗网蛋白-1抗体与表达网蛋白-1的细胞的结合引起所述细胞死亡(例如引发凋亡)。
在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合与seqidno：92具有至少85％同一性的氨基酸序列。在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合与seqidno：92具有至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述抗体特异性结合如seqidno：92所示的氨基酸序列。
在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合到细胞表面暴露的网蛋白-1抗原并包含6个互补决定区(cdr)：cdrh1，cdrh2，cdrh3，cdrl1，cdrl2和cdrl3，其中cdrh1包含如seqidno：18所示的序列，cdrh2包含如seqidno：20所示的序列，cdrh3包含如seqidno：22所示的序列，cdrl1包含如seqidno：40所示的序列，cdrl2包含如seqidno：42所示的序列，并且cdrl3包含如seqidno：44所示的序列；或者其中cdrh1包含如seqidno：62所示的序列，cdrh2包含如seqidno：64所示的序列，cdrh3包含如seqidno：66所示的序列，cdrl1包含如seqidno：84所示的序列，cdrl2包含如seqidno：86所示的序列，并且cdrl3包含如seqidno：88所示的序列。
在某些实施方式中，cdrh1包含如seqidno：18所示的序列，cdrh2包含如seqidno：20所示的序列，cdrh3包含如seqidno：22所示的序列，cdrl1包含如seqidno：40所示的序列，cdrl2包含如seqidno：42所示的序列，并且cdrl3包含如seqidno：44所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合到细胞表面暴露的网蛋白-1，其中所述抗体或抗原结合片段包含重链可变区，所述重链可变区包含具有如seqidno：22或seqidno：66所示的序列的互补决定区3(cdrh3)。在某些实施方式中，所述抗体还包含轻链可变区，所述轻链可变区包含具有如seqidno：44或seqidno：88所示的序列的互补决定区3(cdrl3)。
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：24的重链可变结构域序列。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：46的轻链可变结构域序列。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：24的重链可变结构域序列和seqidno：46的轻链可变结构域序列。
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段的cdrh1包含如seqidno：62所示的序列，cdrh2包含如seqidno：64所示的序列，cdrh3包含如seqidno：66所示的序列，cdrl1包含如seqidno：84所示的序列，cdrl2包含如seqidno：86所示的序列，并且cdrl3包含如seqidno：88所示的序列，
在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：68的重链可变结构域序列。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：90的轻链可变结构域序列。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段包含seqidno：68的重链可变结构域序列和seqidno：90的轻链可变结构域序列。
在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异性结合到细胞表面暴露的网蛋白-1，其中所述抗体或抗原结合片段包含具有如seqidno：24或seqidno：68所示的序列的重链可变区。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段还包含具有如seqidno：46或seqidno：90所示的序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体包含具有如seqidno：24所示的序列的重链可变区和具有如seqidno：46所示的序列的轻链可变区。
在某些实施方式中，所述抗体包含具有如seqidno：68所示的序列的重链可变区和具有如seqidno：90所示的序列的轻链可变区。
在某些方面，本公开提供了一种抗体，其包含具有与seqidno：15享有至少85％同一性的序列集的重链可变区和与seqidno：37享有至少85％同一性的轻链可变区。在某些方面，本公开提供了一种抗体，其包含具有与seqidno：15享有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列集的重链可变区和与seqidno：37享有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的轻链可变区。
在某些方面，本公开提供了一种抗体，其包含具有与seqidno：59享有至少85％同一性的序列集的重链可变区和与seqidno：81享有至少85％同一性的轻链可变区。在某些方面，本公开提供了一种抗体，其包含具有与seqidno：59享有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的序列集的重链可变区和与seqidno：81享有至少90％(例如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％)同一性的轻链可变区。
在某些实施方式中，本公开描述的抗体或抗原结合片段包含具有如seqidno：15或seqidno：59所示的序列的重链恒定结构域。
在某些实施方式中，本公开描述的抗体或抗原结合片段包含选自igg、igg1、igg2、igg2a、igg2b、igg2c、igg3、igg4、iga1、iga2、igd、igm和ige恒定结构域的重链恒定结构域。
在某些实施方式中，本公开描述的抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、双体抗体、嵌合抗体、fab片段、f(ab')2片段、亲和体或fv片段。
在某些实施方式中，本公开涉及靶向网蛋白-1的抗体-药物偶联物。在某些实施方式中，本公开描述的抗体(例如抗网蛋白-1抗体)被偶联到靶向剂。在某些实施方式中，所述靶向剂是可检测组成部分。在某些实施方式中，所述可检测组成部分选自放射性同位素、磁性化合物、x-射线吸收剂、化学化合物、生物学标签和荧光分子。
在某些实施方式中，所述靶向剂是治疗剂。在某些实施方式中，所述治疗剂是细胞毒性组成部分或免疫调节性组成部分。
在某些实施方式中，所述抗体通过连接物偶联到所述靶向剂。在某些实施方式中，所述连接物是柔性氨基酸序列。在某些实施方式中，所述连接物是光连接物。
在某些实施方式中，所述靶向剂包含生理惰性纳米粒子。在某些实施方式中，所述纳米粒子是磁性、荧光或放射性的。在某些实施方式中，所述靶向剂包含荧光染料。
在某些方面，本公开提供了一种抗体或抗原结合片段，其与本公开描述的抗体或抗原结合片段(例如抗网蛋白-1抗体)竞争或交叉竞争与如seqidno：92所示的氨基酸序列的结合。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段以所述抗体或抗原结合片段与其抗原之间低于10-6m的平衡解离常数kd竞争或交叉竞争。
在某些方面，本公开提供了一种组合物，其包含本公开所描述的抗体(例如抗网蛋白-1抗体)，任选地还包含可药用赋形剂。
在某些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码包含三个互补决定区(cdr)cdrh1、cdrh2和cdrh3的蛋白质，其中cdrh3包含如seqidno：22所示的序列。在某些实施方式中，cdrh1包含如seqidno：18所示的序列。在某些实施方式中，cdrh2包含如seqidno：20所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码包含三个互补决定区(cdr)cdrl1、cdrl2和cdrl3的蛋白质，其中cdrl3包含如seqidno：44所示的序列。在某些实施方式中，cdrl1包含如seqidno：40所示的序列。在某些实施方式中，cdrl2包含如seqidno：42所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码包含三个互补决定区(cdr)cdrh1、cdrh2和cdrh3的蛋白质，其中cdrh3包含如seqidno：66所示的序列。在某些实施方式中，cdrh1包含如seqidno：62所示的序列。在某些实施方式中，cdrh2包含如seqidno：64所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其编码包含三个互补决定区(cdr)cdrl1、cdrl2和cdrl3的蛋白质，其中cdrl3包含如seqidno：88所示的序列。在某些实施方式中，cdrl1包含如seqidno：84所示的序列。在某些实施方式中，cdrl2包含如seqidno：86所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种分离的核酸，其包含如选自seqidno：15、24、37、46、59、68、81或90的序列所示的序列。
在某些方面，本公开提供了一种分离的细胞(例如宿主细胞)，其包含本公开所描述的核酸。在某些实施方式中，所述分离的细胞是细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞。在某些实施方式中，所述细胞是杂交瘤细胞。
在某些方面，本公开提供了一种用于将药剂靶向对象中的癌细胞的方法，所述方法包括向所述对象给药偶联到靶向剂的本公开所描述的抗体或组合物(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体的组合物)，其中所述抗体结合所述对象中所述癌细胞表面上的网蛋白-1。
在某些方面，本公开提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象给药有效量的本公开所描述的抗体或组合物(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体的组合物)。
在某些方面，本公开提供了一种用于检测癌细胞的方法，所述方法包括向患有癌症的对象给药有效量的本公开所描述的抗体或组合物(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体的组合物)。
在本公开描述的方法的某些实施方式中，所述抗体或组合物以1ng/kg至100mg/kg范围内的剂量给药。
在本公开描述的方法的某些实施方式中，所述癌细胞是卵巢癌细胞、食管癌细胞、头颈部鳞状细胞癌癌细胞或胰腺癌细胞。在某些实施方式中，所述癌细胞是胰腺导管腺癌细胞。在本公开描述的方法的某些实施方式中，所述对象是哺乳动物，任选为人类。
附图说明
图1示出了不同克隆在yapc或hpde包被的平板上的体外验证。
图2示出了使用细胞杀灭测定法的所述细胞系的进一步体外验证。
图3a-3b示出了pab1在重组人网蛋白-1蛋白的c-端部分(图3a，sec8-his)和网蛋白-1阳性l3.6pl癌细胞(图3b)上的结合特异性。
图4a-4g示出了pab1在l3.6pl网蛋白-1阳性癌细胞中的内化。图4a-4b示出了l3.6pl在pab1(图4a)和igg对照(图4b)染色后与内体标志物lamp-1合并的代表性共聚焦图像。还示出了lamp-1(图4c)、pab1(图4d)和lamp-1与pab1的共定位(图4e)的染色。图4f示出的数据表明显著比例的pab1与lamp-1融合，而igg对照不是如此。图4g示出了在37℃、4℃下温浴或与过量的冷pab1组合后，在l3.6pl网蛋白-1阳性细胞和lncap网蛋白-1阴性细胞中内化的125i-pab1放射性的定量；comp.是指竞争测定法。
图5a-5d示出了在用pab1处理后由凋亡造成的癌细胞死亡的诱导。图5a示出了l3.6pl细胞的荧光减一(fluorescentminusone)(fmo)流式细胞术。图5b示出了对照igg处理72h后的l3.6pl膜联蛋白v阳性细胞。图5c示出了pab1处理72h后的l3.6pl膜联蛋白v阳性细胞。图5d示出了在pab1处理后，与对照igg相比l3.6pl癌细胞经历明显更多的凋亡(d)。*，p<0.05。
图6a-6d示出了pab1处理对yapc癌细胞的微管蛋白各向异性的影响。图6a示出了在未处理的情况下在微管蛋白染色后yapc的共聚焦显微术图像。图6b示出了在一甲基澳瑞他汀e(mmae)处理后，在微管蛋白染色10min后yapc的共聚焦显微术图像。图6c示出了在pab1处理后，在微管蛋白染色24h后yapc的共聚焦显微术图像。图6d示出了与未处理的对照相比，在用pab1处理的细胞中各向异性的降低。
图7a-7c示出了在yapc癌细胞中pab1与微管蛋白的共定位。图7a示出了在微管蛋白染色后yapc细胞的共聚焦显微术图像。图7b示出了在pab1染色后yapc细胞的共聚焦显微术图像。图7c示出了微管蛋白染色和pab1染色的共定位(箭头)。
图8a-8e示出了带有皮下yapc肿瘤的免疫受损小鼠的体内pab1剂量升级治疗。图8a示出了在治疗11天后，与对照igg小鼠相比，在给药3mg/kgpab1的小鼠中肿瘤体积明显更低。1mg/kgpab1治疗组在第14天引发肿瘤体积的显著减小。与0.3mg/kg组相比，两个较高剂量pab1的组显示出明显更低的肿瘤体积。*，p<0.05，igg相比于3mg/kgpab1；#，p<0.05，igg相比于1mg/kgpab1；°，p<0.05，0.3相比于3mg/kgpab1；·，p<0.05，0.3相比于1mg/kgpab1。图8b示出了每组动物的平均体重。注意在整个治疗持续时间内所述动物没有体重减轻。
具体实施方式
结合网蛋白-1的抗体
本公开提供了结合癌细胞表面上的网蛋白-1的抗体和抗原结合片段。本公开的单克隆抗体可以是鼠类、人源化或嵌合的，或采取其他形式。本公开的抗体以及本公开的抗体的生产和鉴定方法的详细描述被提供在本文中。
网蛋白-1是一种高分子量蛋白(500kda)，其除了将细胞骨架锚定到细胞质膜和核膜之外，还将中间纤维连接到微管和微丝(综述在sonnenberg,等，expcellres313:2189-2203(2007)中)。
通常，在正常的胰腺导管细胞中网蛋白-1的水平低，但在具有某些癌症的细胞(例如先兆胰腺上皮内瘤变(panin)、胰腺导管腺癌细胞(pdac)、卵巢癌细胞等)中它的表达被上调。网蛋白-1在正常成纤维细胞中表现出独特的细胞质和核定位，然而在具有某些癌症的细胞(例如pdac)中观察到在细胞膜上的异常表达。在自体免疫病症副肿瘤天疱疮和相关的淋巴组织增生性瘤变castleman病中，也已观察到网蛋白-1的改变的亚细胞定位(aho等，jinvestdermatol113:422-423(1999))。网蛋白-1在信号转导中也起重要作用。因此，在具有某些癌症的细胞(例如先兆胰腺上皮内瘤变(panin)、胰腺导管腺癌细胞(pdac)、卵巢癌细胞等)中，网蛋白-1可能对调控与癌发生相关的细胞迁移、极性和能量代谢的信号转导途径有影响。因此，在某些实施方式中，本公开提供了结合癌细胞表面上的网蛋白-1的抗体和抗原结合片段。
在某些实施方式中，抗体，也被称为免疫球蛋白，是由两条各约25kda的轻(l)链和两条各约50kda的重(h)链构成的四聚体糖基化蛋白质。在抗体中可以存在两种类型的轻链，被称为λ和κ。取决于重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白可以被分配到5个主要类别：a，d，e，g和m，它们中的几类可以被进一步分成亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。每条轻链通常包括n-端可变(v)结构域(vl)和恒定(c)结构域(cl)。每条重链通常包括n-端v结构域(vh)、3或4个c结构域(ch1-3)和铰链区。最靠近vh的ch结构域被命名为ch1。vh和vl结构域由被称为构架区的4个序列相对保守的区域(fr1、fr2、fr3和fr4)构成，这些构架区为3个高变序列区域(互补决定区，cdr)形成支架。cdr含有大多数负责抗体与抗原的特异性相互作用的残基。cdr被称为cdr1、cdr2和cdr3。因此，重链上的cdr组分被称为cdrh1、cdrh2和cdrh3，而轻链上的cdr组分被称为cdrl1、cdrl2和cdrl3。cdr通常是指kabatcdr，如《免疫学重要的蛋白质的序列》(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，usdepartmentofhealthandhumanservices(1991)，kabat等主编)中所述。表征抗原结合位点的另一个标准是参照如chothia所述的高变环。参见例如chothia,d.等，(1992)j.mol.biol.227:799-817；和tomlinson等，(1995)emboj.14:4628-4638。另一个标准是由oxfordmolecular的abm抗体建模软件所使用的abm定义。总的来说，参见例如“抗体可变结构域的蛋白质序列和结构分析”(proteinsequenceandstructureanalysisofantibodyvariabledomains)，在《抗体工程实验室手册》(antibodyengineeringlabmanual，duebel,s和kontermann,r.主编，springer-verlag,heidelberg)中。参照kabatcdr描述的实施方式可以可替选地使用参照chothia高变环或abm定义的环或任何这些方法的组合的类似描述的关系来进行。
在某些实施方式中，本公开的抗网蛋白-1抗体和本公开的编码所述抗体的核酸分子包括在下面的表1中示出的cdr氨基酸和核酸序列。
表1.
在某些实施方式中，本公开的抗网蛋白-1结合剂(例如抗网蛋白-1抗体)包括任何包含为表1中示出的任一抗体所提供的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2或cdrl3或其组合的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，抗网蛋白-1结合剂包含表1中示出的任一抗体的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3、本公开还包括编码为表1中示出的任一抗体所提供的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2或cdrl3的任何核酸序列。抗体重链和轻链cdr3结构域可能在抗体对抗原的结合特异性/亲和性中发挥特别重要的作用。因此，本公开的抗网蛋白-1抗体或其核酸分子可以至少包含如表1中所示或如seqidno：15、22、24、37、44、46、59、66、68、81、88或90所示的抗体的重链和/或轻链cdr3。
所述抗体的重链可变区和轻链可变区的完整氨基酸和核酸序列列于表2中。
表2.
在某些实施方式中，本公开的抗网蛋白抗体包括任何包含如表1中所示或如本公开的序列表(例如seqidno：15、24、37、46、59、68、81或90)中所描述的重链可变结构域或轻链可变结构域或两者的抗体。本公开还包括编码包含如表1中所示或如本公开的序列表(例如seqidno：4、13、26、35、48、57、70或79)中所描述的重链可变结构域或轻链可变结构域核酸序列或两者的抗体的任何核酸分子。
本公开的抗网蛋白-1抗体可以任选地包含抗体恒定区或其部分。例如，vl结构域可以在其c-端末端附连到轻链恒定结构域如cκ或cλ。同样地，vh结构域或其部分可以附连到重链如iga、igd、ige、igg和igm以及任何同种型亚类的全部或一部分。抗体可以包括适合的恒定区(参见例如kabat等，《免疫学重要的蛋白质的序列》(sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,no.91-3242，nationalinstitutesofhealthpublications,bethesda,md.(1991))。因此，在本公开范围内的抗体可以包含与本领域中已知的恒定区组合的vh和vl结构域或其抗原结合部分。在某些实施方式中，本公开的抗网蛋白-1抗体包含的重链恒定区包含由seqidno：4、14、26、36、48、58、70或80表示的序列。
在某些实施方式中，所述vh和/或vl结构域可以被恢复到种系序列，例如使用常规的分子生物学技术将这些结构域的fr突变，以匹配由种系细胞产生的fr。在其他实施方式中，所述fr序列仍然与共有种系序列不同。
在某些实施方式中，抗网蛋白-1抗体或抗原结合片段可以包括或不包括所述抗体的构架区，例如如seqidno：6、8、10、12、17、19、21、23、28、30、32、34、39、41、43、45、50、52、54、56、61、63、65、67、72、74、76、78、83或85所示的。在某些实施方式中，抗网蛋白-1抗体是鼠类抗体。在某些实施方式中，抗网蛋白-1抗体是嵌合或人源化抗体。
应该认识到，在某些实施方式中，本公开设想了所述抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸和核酸序列的变体(例如同源物)。“同源性”是指两个多核苷酸或两个多肽组成部分之间的同一性百分比。术语“实质性同源性”在指称核酸或其片段时，表明当与另一个核酸(或其互补链)最适比对并进行适当的核苷酸插入或删除时，所述比对的序列存在约90至100％的核苷酸序列同一性。例如，在某些实施方式中，享有实质性同源性的核酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性。当指称多肽或其片段时，术语“实质性同源性”表明当与另一个多肽最适比对并适当添加间隙、插入或删除时，所述比对的序列存在约90至100％的核苷酸序列同一性。术语“高度保守的”意味着至少80％的同一性，优选为至少90％的同一性，更优选为超过97％的同一性。例如，在某些实施方式中，高度保守的蛋白质享有至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同一性。在某些情况下，高度保守可以是指100％的同一性。同一性可以由本领域技术人员通过例如使用本领域技术人员已知的算法和计算机程序容易地确定。
在某些实施方式中，本公开的抗网蛋白-1抗体可以以高亲和力结合网蛋白-1，例如以低于10-7m、10-8m、10-9m、10-10m、10-11m或更低的kd。例如，抗网蛋白-1抗体或其抗原结合片段可以以5pm至500nm之间、例如50pm至100nm之间、例如500pm至50nm之间的亲和力结合到网蛋白-1。本公开还包括与本文中描述的任何抗体竞争与网蛋白-1的结合，并具有50nm或更低(例如20nm或更低、10nm或更低、500pm或更低、50pm或更低或5pm或更低)的亲和力的抗体或抗原结合片段。所述抗网蛋白-1抗体的亲和力和结合动力学可以使用本领域中已知的任何方法、包括但不限于生物传感器技术(例如octet或biacore)来测试。
当在本文中使用时，术语“抗体”通常是指免疫球蛋白。本文中也提供了其维持或具有特异性结合能力的所有衍生物。抗体制备物可以是单克隆或多克隆的。
当在本文中使用时，术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的小于全长的任何衍生物。一般来说，抗原结合片段保留全长抗体的至少显著部分的特异性结合能力。抗原结合片段的实例包括但不限于fab、fab’、f(ab')2、scfv、fv、dsfv、双体抗体、亲和体和fd片段。抗原结合片段可以通过任何适合的手段来生产。例如抗原结合片段可以通过完整抗体的片段化酶法或化学法生产，或者它可以从编码部分抗体序列的基因重组生产。可替选地，抗原结合片段可以完全或部分合成生产。抗原结合片段可以任选地是单链抗体片段。可替选地，片段可以包含通过例如二硫键连接在一起的多个链。抗原结合片段也可以任选地是多分子复合物。有功能的抗原结合片段通常包含至少约50个氨基酸，更通常地包含至少约200个氨基酸。
单链fv(scfv)是仅由通过多肽连接物彼此共价连接的可变轻链(vl)和可变重链(vh)构成的重组抗原结合片段。vl或vh任一者可以是nh2-端结构域。所述多肽连接物可以具有可变的长度和组成，只要所述两个可变结构域被桥接而没有严重的空间干扰即可。通常，所述连接物主要包含甘氨酸和丝氨酸残基的区段，并且出于溶解性原因间插有一些谷氨酸或赖氨酸残基。
双体抗体是二聚体scfv。双体抗体的组分通常具有比大多数scfv更短的肽连接物，并且它们对缔合成二聚体表现出偏好性。
fv片段是由通过非共价相互作用保持在一起的一个vh和一个vl结构域构成的抗原结合片段。术语dsfv在本文中用于指称具有工程化改造的分子间二硫键以使vh-vl对稳定的fv。
f(ab')2片段是本质上与通过在ph4.0-4.5下用胃蛋白酶消化而从免疫球蛋白(通常是igg)获得的片段等同的抗原结合片段。所述片段可以重组生产。
fab片段是本质上与通过将f(ab')2片段中联结两个重链片段的一个或多个二硫桥还原而获得的片段等同的抗原结合片段。所述fab’片段可以重组生产。
fab片段是本质上与通过用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常是igg)而获得的片段等同的抗原结合片段。所述fab片段可以重组生产。所述fab片段的重链区段是fd片段。
亲和体是一种小的蛋白质，其包含起到抗原结合分子作用(例如抗体模拟物)的三螺旋束。通常，亲和体长度约为58个氨基酸，并具有大约6kda的摩尔质量。具有独特结合性质的亲和体分子，通过将位于参与母体蛋白结构域的结合活性的两个α-螺旋中的13个氨基酸进行随机化来获得。结合所需靶蛋白的特异性亲和体分子可以从含有数十亿个不同变体的池(文库)中，使用诸如噬菌体展示的方法来分离。
结合网蛋白-1的抗体的生产
大量方法可用于获得本公开的抗体或其抗原结合片段。例如，抗体可以使用重组dna方法来生产。单克隆抗体也可以按照已知方法，通过杂交瘤的产生来生产(参见例如kohler和milstein，(1975)nature,256:495-499)。然后使用标准方法例如酶联免疫吸附测定法(elisa)和表面等离子体共振(例如octet或biacore)分析来筛选以这种方式形成的杂交瘤，以鉴定产生与特定抗原特异性结合的抗体的一个或多个杂交瘤。任何形式的特定抗原可用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段及其抗原性肽(例如作为线性表位或在支架内作为构象表位的本文中描述的任何表位)。制造抗体的一种示例性方法包括筛选表达抗体或其片段(例如scfv)的蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示被描述在例如ladner等，美国专利号5,223,409；smith(1985)science228:1315-1317；clackson等，(1991)nature,352:624-628；marks等，(1991)j.mol.biol.,222:581-597；wo92/18619；wo91/17271；wo92/20791；wo92/15679；wo93/01288；wo92/01047；wo92/09690和wo90/02809中。
除了使用展示文库之外，可以使用所述特定抗原(例如网蛋白-1)来免疫非人类动物例如啮齿动物如小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方式中，所述非人类动物是小鼠。
在另一个实施方式中，从非人类动物获得单克隆抗体，然后进行修饰，例如使用本领域中已知的重组dna技术制造成嵌合的。已描述了各种不同的用于制造嵌合抗体的方法。参见例如morrison等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.81:6851,1985；takeda等，nature314:452,1985；cabilly等，美国专利号4,816,567；boss等，美国专利号4,816,397；tanaguchi等，欧洲专利公布ep171496；欧洲专利公布0173494；英国专利gb2177096b。
抗体也可以通过本领域中已知的方法进行人源化。例如，具有所需结合特异性的单克隆抗体可以被商业化人源化(scotgene,scotland；以及oxfordmolecular,paloalto,calif.)。完全人源化的抗体，例如在转基因动物中表达的那些人源化抗体，在本发明的范围之内(参见例如green等，(1994)naturegenetics7,13；以及美国专利号5,545,806和5,569,825)。
对于其他抗体生产技术来说，参见《抗体：实验室指南》(antibodies:alaboratorymanual，第二版，edwarda.greenfield主编，dana-farbercancerinstitute,
本发明的某些方面涉及用多核苷酸或载体转化的分离的细胞(例如宿主细胞)。宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于所述宿主细胞中的多核苷酸或载体可以被整合在所述宿主细胞的基因组中，或者它可以维持在染色体外。所述宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，例如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人类细胞。在某些实施方式中，真菌细胞是例如酵母属、特别是酿酒酵母(s.cerevisiae)种的细胞。术语“原核的”包括可以用dna或rna分子转化或转染以表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可以包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如大肠埃希氏杆菌(e.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。术语“真核的”包括酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞如nso和cho细胞。取决于在重组生产程序中使用的宿主，被所述多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或者可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链也可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。
在某些实施方式中，在载体已被并入到适合的宿主中之后，可以将所述宿主维持在适合于所述核苷酸序列的高水平表达的条件下，并且如果需要，可以随后进行免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整抗体、抗原结合片段或其他免疫球蛋白形式的收集和纯化；参见beychok，《免疫球蛋白合成的细胞》(cellsofimmunoglobulinsynthesis,academicpress,n.y.,(1979))。因此，多核苷酸或载体被引入到所述细胞中，其进而生产所述抗体或抗原结合片段。此外，包含上述宿主细胞的转基因动物、优选为哺乳动物，可用于所述抗体或抗体片段的大规模生产。
所述转化的宿主细胞可以按照本领域中已知的技术在发酵罐中生长并培养，以获得最适细胞生长。在表达后，可以按照本领域的标准程序来纯化完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链、其他免疫球蛋白形式或抗原结合片段，所述技术包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等；参见scopes，《蛋白质纯化》(proteinpurification，springerverlag,n.y.(1982))。然后可以从生长培养基、细胞裂解液或细胞膜级分分离所述抗体或抗原结合片段。所述例如微生物表达的抗体或抗原结合片段的分离和纯化可以通过任何常规手段，例如制备型色谱分离和免疫分离例如涉及使用针对例如所述抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些分离。
本公开的多个方面涉及杂交瘤，其提供单克隆抗体的无限持续的来源。当在本文中使用时，“杂交瘤细胞”是指从b成淋巴细胞与骨髓瘤融合配偶体的融合衍生的永生化细胞，为了制备产生单克隆抗体的细胞(例如杂交瘤细胞)，选择抗体滴度已被确认的个体动物(例如小鼠)，并在最后一次免疫接种后2天至5天收获它的脾脏或淋巴结，并将其中包含的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，以制备产生所需单克隆抗体的杂交瘤。抗血清中的抗体滴度的测量可以例如通过将后文中所描述的标记的蛋白质与抗血清反应，然后测量结合到所述抗体的标记试剂的活性来进行。细胞融合可以按照已知方法来进行，例如由kochler和milstein描述的方法(nature256:495(1975))。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(peg)或仙台病毒(hvj)，优选地使用peg。
骨髓瘤细胞的实例包括ns-1、p3u1、sp2/0、ap-1等。待使用的抗体产生细胞(脾细胞)的数目与杂交瘤细胞的数目的比例优选为约1:1至约20:1。peg(优选为peg1000-peg6000)优选地以约10％至约80％的浓度添加。细胞融合可以通过将两种细胞的混合物在约20℃至约40℃、优选地约30℃至约37℃下温浴约1分钟至10分钟，高效地进行。
各种不同的方法可用于筛选产生抗体(例如针对本发明的肿瘤抗原或自体抗体)的杂交瘤。例如，将所述杂交瘤的上清液添加到抗体直接或与载体一起吸附到其上的固相(例如微孔板)，然后添加用放射性物质或酶标记的抗免疫球蛋白抗体(如果在细胞融合中使用小鼠细胞，则使用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白a，以检测针对结合到固相的蛋白质的单克隆抗体。或者，将所述杂交瘤的上清液添加到吸附有抗免疫球蛋白抗体或蛋白a的固相，然后添加用放射性物质或酶标记的蛋白质，以检测针对结合到所述固相的蛋白质的单克隆抗体。
所述单克隆抗体的选择可以按照任何已知方法或其改良方法来进行。通常，使用添加有hat(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶)的用于动物细胞的培养基。可以使用任何选择和生长培养基，只要所述杂交瘤可以生长即可。例如，可以使用含有1％至20％、优选地10％至20％胎牛血清的rpmi1640培养基、含有1％至10％胎牛血清的git培养基、用于杂交瘤培养的无血清培养基(sfm-101，nissuiseiyaku)等。通常，所述培养在约5％co2气体下，在20℃至40℃、优选地37℃下进行约5天至3周，优选地1周至2周。杂交瘤培养物的上清液的抗体滴度可以按照与上文对于抗血清中抗蛋白质抗体的抗体滴度所描述的相同的方式来测量。
作为直接从杂交瘤培养物获得免疫球蛋白的可替选方案，可以使用永生化杂交瘤细胞作为重排的重链和轻链基因座的来源，用于后续的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适合的mrna反转录以产生cdna。如果需要，可以将所述重链恒定区与不同同种型的重链恒定区交换或整个消除。可以连接所述可变区以编码单链fv区。可以连接多个fv区以提供对于超过一种靶的结合活性，或者可以使用嵌合的重链和轻链组合。可以使用任何适合的方法来克隆抗体可变区并产生重组抗体。
在某些实施方式中，获得编码重链和/或轻链的可变区的适合的核酸，并将其插入到可以转染到标准重组宿主细胞中的表达载体中。可以使用各种不同的这些宿主细胞。在某些实施方式中，哺乳动物宿主细胞对于高效加工和生产来说可以是有利的。可用于此目的的典型的哺乳动物细胞系包括cho细胞、293细胞或nso细胞。所述抗体或抗原结合片段的生产可以通过将修饰的重组宿主在适合于所述宿主细胞生长和所述编码序列的表达的培养条件下培养来进行。所述抗体或抗原结合片段可以通过从所述培养物分离它们来回收。所述表达系统可以被设计成包括信号肽，以便得到的抗体被分泌到培养基中；然而，细胞内生产也是可能的。
本公开还包括至少编码本文中描述的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。在某些实施方式中，由所述多核苷酸编码的可变区包含通过任一上述杂交瘤生产的抗体的可变区的vh和/或vl的至少一个互补决定区(cdr)。
编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以是例如dna、cdna、rna或合成生产的dna或rna或包含单独或组合的任何那些多核苷酸的重组生产的嵌合核酸分子。在某些实施方式中，多核苷酸是载体的一部分。这些载体可以包含其他基因，例如允许在适合的宿主细胞中并在适合条件下选择所述载体的标志物基因。
在某些实施方式中，多核苷酸被可操作连接到允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。所述多核苷酸的表达包含所述多核苷酸转录成可翻译的mrna。确保在真核细胞、优选为哺乳动物细胞中表达的调控元件对于本领域技术人员来说是公知的。它们可以包括促进转录起始的调控序列和任选地促进转录终止和稳定转录本的poly-a信号。其他调控元件可以包括转录以及翻译增强子和/或天然伴随的或异源的启动子区。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的pl、lac、trp或tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的aox1或gal1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的cmv启动子、sv40启动子、rsv启动子(劳斯肉瘤病毒)、cmv增强子、sv40增强子或球蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，这些调控元件还可以在所述多核苷酸的下游包括转录终止信号例如sv40-poly-a位点或tk-poly-a位点。此外，取决于所使用的表达系统，能够将所述多核苷酸导向细胞区室或将它分泌到培养基中的前导序列，可以被添加到所述多核苷酸的编码序列，并且在本领域中是公知的。所述前导序列在适合的阶段与翻译、起始和终止序列组装，并且优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其一部分分泌到例如细胞外培养基中。任选地，可以使用异源多核苷酸序列，其编码包括c-或n-端鉴定肽的融合蛋白，以提供所需特征例如使表达的重组蛋白稳定或简化其纯化。
在某些实施方式中，至少编码轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸，可以编码仅仅一条或两条免疫球蛋白链的所述可变结构域。同样地，多核苷酸可以在同一启动子的控制之下，或者可以被分别控制以备表达。此外，某些方面涉及在遗传工程中常规使用的载体、特别是质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸，并任选地与编码所述抗体的另一条免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸组合。
在某些实施方式中，在能够转化或转染真核宿主细胞的载体中，表达控制序列被提供为真核启动子系统，但用于原核宿主的控制序列也可以使用。源自于病毒例如反转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体，可用于将所述多核苷酸或载体递送到靶细胞群体中(以例如工程化改造细胞以表达抗体或抗原结合片段)。可以使用各种不同的适合的方法来构建重组病毒载体。在某些实施方式中，多核苷酸和载体可以被重构到脂质体中，用于递送到靶细胞。含有所述多核苷酸(例如所述免疫球蛋白链的重链和/或轻链可变结构域的编码序列和表达控制序列)的载体可以通过适合的方法转染到所述宿主细胞中，所述方法随着细胞宿主的类型而变化。
修饰
本公开的某些方面涉及靶向网蛋白-1的抗体-药物偶联物。当在本文中使用时，“抗体-药物偶联物”是指包含连接到靶向分子(例如生物活性分子如治疗性分子和/或可检测标记物)的抗体或其抗原结合片段的分子。因此，在某些实施方式中，本公开的抗体或抗原结合片段可以用可检测标记物修饰，包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属、无放射性顺磁性金属离子和用于检测和分离网蛋白-1的亲和标记物。所述可检测物质可以使用本领域中已知的技术直接地或通过中间体(例如本领域中已知的连接物)间接地耦合或偶联到本公开的多肽。适合的酶的非限制性实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合物的非限制性实例包括链亲和素/生物素和亲和素/生物素；适合的荧光材料的非限制性实例包括生物素、伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的非限制性实例包括萤光素酶、萤光素和水母蛋白；适合的放射性材料的实例包括放射性金属离子例如α-发射体或其他放射性同位素例如碘(131i、125i、123i、121i)、碳(14c)、硫(35s)、氚(3h)、铟(115min、113min、112in、111in)和锝(99tc、99mtc)、铊(201ti)、镓(68ga、67ga)、钯(103pd)、钼(99mo)、氙(133xe)、氟(18f)、153sm、lu、159gd、149pm、140la、175yb、166ho、90y、47sc、86r、188re、142pr、105rh、97ru、68ge、57co、65zn、85sr、32p、153gd、169yb、51cr、54mn、75se和锡(113sn、117sn)。所述可检测物质可以使用本领域中已知的技术直接地或通过中间体(例如本领域中已知的连接物)间接地耦合或偶联到本公开的抗网蛋白-1抗体。偶联到可检测物质的抗网蛋白-1抗体可用于本文中所描述的诊断测定法。
在某些实施方式中，本公开的抗体或抗原结合片段可以用治疗性组成部分(例如治疗剂)修饰。当在本文中使用时，术语“治疗剂”是指能够抑制细胞功能、抑制细胞复制或杀死哺乳动物细胞、优选为人类细胞的化学品或药物或蛋白质。治疗剂的实例包括但不限于细胞毒性组成部分、放射性同位素、植物、真菌或细菌来源的分子(例如植物来源的毒素(例如次级代谢物)、糖苷、抗微生物化合物(例如链霉素、青霉素等))、生物蛋白质(例如蛋白质毒素)、粒子(例如重组病毒粒子，例如通过病毒外壳蛋白)或其混合物。所述治疗剂可以是细胞内活性药物或其他药剂，例如短程辐射发射体，包括例如短程高能α-发射体(例如131i)。
在某些实施方式中，所述治疗剂是免疫调节性组成部分(例如免疫调节剂)。当在本文中使用时，“免疫调节剂”是指提高或降低对所述药剂做出响应的对象的免疫应答的化合物或分子。例如，免疫调节剂可以增强对象对肿瘤的免疫应答，例如提高炎性细胞因子例如白介素-1(il-1)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α)的水平。提高对象的免疫应答的免疫调节剂的实例包括粒细胞集落刺激因子(g-csf)、干扰素、咪喹莫特、来自于细菌的细胞膜级分、某些白介素和细胞因子(例如il-1β、il-6和tnf-α)和免疫检查点抑制剂(例如pd-1抑制剂、pd1-l抑制剂等)。在某些实施方式中，免疫调节剂可以降低对象的免疫应答(例如介导或实现免疫抑制)。免疫抑制性免疫调节剂的实例包括但不限于免疫抑制性药物(例如糖皮质激素、细胞抑制剂、抗炎性单克隆抗体(例如抗il-2受体抗体)和靶向亲免蛋白的药物(例如环孢素、西罗莫司等)。
在某些实施方式中，所述抗体通过连接物偶联到所述靶向剂。当在本文中使用时，术语“连接物”是指作为桥梁将一个分子或序列附连到另一个分子或序列的分子或序列，例如氨基酸序列。“连接”、“偶联”或“耦合”意味着通过共价键或非共价键或其他键例如范德华力附连或结合。本公开所描述的抗体可以被直接连接到所述靶向剂(例如治疗性组成部分或可检测组成部分)，例如作为与可检测的蛋白质或肽组成部分一起的融合蛋白(具有或不具有任选的连接序列例如柔性连接物序列)，或者通过化学偶联组成部分连接。大量的这种偶联组成部分在本领域中是已知的，例如肽连接物或化学连接物，例如在国际专利申请公布号wo2009/036092中所描述的。在某些实施方式中，所述连接物是柔性氨基酸序列。柔性氨基酸序列的实例包括富含甘氨酸和丝氨酸的连接物，其包含两个或更多个甘氨酸残基的区段(例如gggs；seqidno：93)。在某些实施方式中，所述连接物是光连接物。光连接物的实例包括羰自由基反应性二苯甲酮(bp)、蒽醌(aq)、氮烯反应性硝基苯基叠氮化物(npa)和碳烯反应性苯基-(三氟甲基)二氮杂环丙烯(ptd)。
在某些实施方式中，所述靶向剂包含生理惰性纳米粒子。被开发并用于成像癌细胞的纳米粒子的实例包括磁性纳米粒子和它们的磁性荧光类似物(参见例如weissleder等，nat.biotechnol.,19:316-317(2001)；mccarthy等，nanomedicine,2:153-167(2007)；hogemann等，bioconjug.chem.,11:941-946(2000)；以及josephson等，bioconjug.chem.,10:186-191(1999))，其被设想与分离的肽配体和噬菌体展示的肽一起使用。在同一分子内掺有磁性和荧光分子两者的多峰纳米粒子是已知的，并被用于荧光显微术(其检测这种非常小的粒子的荧光部分)和mri(其检测它的磁性部分)。在某些实施方式中，所述纳米粒子是磁性、荧光或放射性的。在某些实施方式中，所述靶向剂包含荧光染料。
药物组合物
在某些方面，本公开涉及包含抗网蛋白-1抗体的药物组合物。在某些实施方式中，所述组合物包含抗网蛋白-1抗体和可药用载体。当在本文中使用时，术语“可药用载体”旨在包括与药物给药相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。任何常规的介质或试剂，除非与所述活性化合物不相容，否则都考虑其在所述组合物中的使用。补充活性化合物也可以并入在所述组合物中。药物组合物可以如下所述来制备。所述活性成分可以与任何常规的可药用载体或赋形剂混合或复合。所述组合物可以是无菌的。
通常，药物组合物被配制用于递送有效量的药剂(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体和靶向剂的抗体-药物偶联物)。一般来说，活性剂的“有效量”是指足以引发所需生物响应(例如癌细胞的杀死或肿瘤生长的抑制)的量。药剂的有效量可以随着多种因素而变，所述因素例如所需的生物学终点、所述化合物的药物动力学、待治疗的疾病(例如以网蛋白-1的表面表达为特征的某些癌症)、给药方式和患者。
如果组合物的给药可以被受体患者耐受，则它被称为是“可药用载体”。无菌磷酸盐缓冲盐水是可药用载体的一个实例。其他适合的载体在本领域中是公知的。参见例如《remington药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences，第18版，(1990))。
本领域技术人员应该理解，任何常规使用并且相对于活性剂来说是惰性的给药方式、介质或载体，都可用于制备和给药本公开的药物组合物。这些方法、介质和载体的说明描述在例如《remington药物科学》(remington'spharmaceuticalsciences，第4版，(1970))中，其公开内容通过引用并入本文。本领域技术人员在接触到本发明的原理后，将可毫无困难地确定适合和恰当的介质、赋形剂和载体或将所述活性成分与它们复合以形成本公开的药物组合物。
化合物(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体和靶向剂的抗体-药物偶联物)的有效量，也被称为治疗有效量，是足以改善与癌症相关的至少一种不良反应(例如肿瘤生长、转移)的量。包含在药物组合物中的治疗有效量在每种情况下取决于几种因素，例如待治疗患者的类型、大小(size)和状况、目标给药方式、所述患者吸收目标剂型的能力等。通常，包含在每一剂型中的活性剂的量提供约0.1至约250mg/kg，优选地约0.1至约100mg/kg。本领域技术人员能够凭经验确定适合的治疗有效量。
与本文中提供的教导结合，通过在各种不同的活性化合物中选择和对多种因素例如效能、相对生物可利用性、患者体重、不良副作用的严重性和所选的给药方式进行衡量，可以计划不造成实质性毒性并仍对治疗所述特定对象完全有效的有效预防性或治疗性治疗方案。对于任何特定应用来说的有效量可以随着多种因素而变，例如待治疗的疾病或病症、待给药的具体治疗剂、所述对象的大小(size)或所述疾病或病症的严重性。本领域普通技术人员可以不需过多实验，凭经验确定特定核酸和/或其他治疗剂的有效量。
在某些情况下，本公开的化合物被制备在胶体分散系中。胶体分散系包括基于脂类的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在某些实施方式中，本公开的胶体系统是脂质体。脂质体是在体内或体外可用作递送载体的人造膜容器。已显示，尺寸在0.2-4.0μm范围内的大单层囊泡(luv)可以包封大型大分子。
通过将脂质体偶联到特定配体例如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白质，可以将所述脂质体靶向特定组织。可用于将脂质体靶向例如平滑肌细胞的配体，包括但不限于：与平滑肌细胞特异性受体相互作用的完整分子或其片段，例如与癌细胞的细胞表面标志物相互作用的抗体。这些配体可以通过本领域技术人员公知的结合测定法容易地鉴定。在其他实施方式中，通过将脂质体偶联到本领域中已知的抗体，可以将它靶向到组织。
本公开描述的化合物可以单独地(例如在盐水或缓冲液中)或使用本领域中已知的任何递送介质给药。例如，下述递送介质已被描述：螺旋体；乳脂体；iscom；脂质体；活细菌载体(例如沙门氏菌、大肠埃希氏杆菌、卡介苗、志贺氏菌、乳杆菌)；活病毒载体(例如痘苗病毒、腺病毒、单纯性疱疹病毒)；微球；核酸疫苗；聚合物(例如羧甲基纤维素、壳聚糖)；聚合物环；蛋白体；氟化钠；转基因植物；病毒体；以及病毒样粒子。
本公开的制剂在可药用溶液中给药，所述可药用溶液可以常规地含有可药用浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容性载体、佐剂和任选地其他治疗性成分。
术语可药用载体意味着适合于给药到人类或其他脊椎动物的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质。术语载体是指所述活性成分与其组合以便于施用的天然或合成的有机或无机成分。所述药物组合物的组分也可以与本公开的化合物以及彼此之间混合，使得不存在实质性损害所需药物效率的相互作用。
糖衣丸核心被提供有适合的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡伯波凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、清漆溶液和适合的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖衣丸包衣添加染料或颜料，用于识别或表征活性化合物药剂的不同组合。
除了本文中描述的制剂之外，所述化合物也可以被配制成储库型制剂。这些长效制剂可以用适合的聚合或疏水材料(例如作为可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或配制成难溶衍生物例如难溶盐。
所述药物组合物也可包含适合的固相或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种不同的糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚合物例如聚乙二醇。
适合的液体或固体药物制剂形式是例如用于吸入的水性或盐水溶液，微包胶、成壳、包衣在微型金粒子，包含在脂质体中，雾化，气溶胶，用于植入到皮肤中的球粒或在将要刮擦到皮肤中的尖锐物体上干燥。所述药物合物还包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆、乳液、悬液、霜剂、滴剂或具有活性化合物的延长释放的制剂，在所述制剂中按惯例使用如上所述的赋形剂和添加剂和/或辅助剂例如崩解剂、粘合剂、包衣剂、膨胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂。所述药物组合物适用于各种不同的药物递送系统中。对于药物递送方法的简要综述，参见langerr(1990)science249:1527-1533，其通过引用并入本文。
所述化合物可以以自身(纯净)给药或采取可药用盐的形式给药。当在医学中使用时，所述盐应该是可药用的，但不可药用的盐可以方便地用于制备其可药用盐。这些盐包括但不限于从下述酸制备的盐：盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，马来酸，乙酸，水杨酸，对甲苯磺酸，酒石酸，柠檬酸，甲磺酸，甲酸，丙二酸，琥珀酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。这些盐也可以被制备成碱金属或碱土金属盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。
适合的缓冲剂包括：乙酸及其盐(1-2％w/v)；柠檬酸及其盐(1-3％w/v)；硼酸及其盐(0.5-2.5％w/v)；和磷酸及其盐(0.8-2％w/v)。适合的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03％w/v)、氯丁醇(0.3-0.9％w/v)、对羟基苯甲酸酯(0.01-0.25％w/v)和硫柳汞(0.004-0.02％w/v)。
所述组合物可以方便地以单元剂型呈现，并且可以通过药学领域中公知的任何方法来制备。所述方法都包括使所述化合物与构成一种或多种辅助成分的载体发生缔合的步骤。一般来说，所述组合物通过使所述化合物与液体载体、细分固体载体或两者发生均匀和密切的缔合，然后如有必要将所述产物成型来制备。液体药剂单元是小瓶或安瓿。固体药剂单元是片剂、胶囊和栓剂。
治疗方法
本公开的多个方面涉及特异性结合到某些癌细胞表面上的网蛋白-1的抗体的发现。在某些实施方式中，本公开所描述的抗网蛋白-1抗体与某些癌细胞的结合引起所述细胞死亡(例如启动凋亡)。不希望受到任何特定理论限制，本公开描述的抗体在某些实施方式中可用于治疗以网蛋白-1的表面表达为特征的癌症。当在本文中使用时，“治疗癌症”是指减少患者中癌细胞的数目，减缓患者中癌细胞的生长，减少癌细胞在患者中的转移，并包括关于缓解癌症症状或提高患者寿命的任何类型的响应。
以网蛋白-1的表面表达为特征的癌症的实例包括但不限于卵巢癌细胞、食管癌细胞、头颈部鳞状细胞癌癌细胞或胰腺癌细胞(例如胰腺导管腺癌(pdac))。然而，应该认识到，其他癌症(例如肺癌、膀胱癌、乳腺癌、食管癌、口腔癌、舌癌、牙龈癌、皮肤癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、卡波斯肉瘤等)、肌肉癌、心脏癌、肝癌、支气管癌、软骨癌、骨癌、胃癌、前列腺癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫癌、结肠癌、结肠直肠癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、淋巴瘤、脾癌、胸腺癌、甲状腺癌、脑癌、神经元癌、间皮瘤、胆囊癌、眼癌(例如角膜癌、葡萄膜癌、脉络膜癌、黄斑癌、玻璃体液癌等)、关节癌(例如滑膜癌)、成胶质细胞瘤、白细胞癌(例如淋巴瘤、白血病等)、遗传性非息肉性癌(hnpc)、结肠炎相关癌症等)，可以使用本公开描述的抗网蛋白-1抗体来治疗。癌症的其他实例是肉瘤(例如骨肉瘤和卡波斯肉瘤)。
在某些方面，本公开提供了一种用于治疗癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的对象给药有效量的本公开所描述的抗体或组合物(例如抗网蛋白-1抗体或包含抗网蛋白-1抗体的组合物)。在某些实施方式中，所述对象是哺乳动物。在某些实施方式中，所述对象是人类。
通常，本公开的抗体和药物组合物优选地含有可药用载体或赋形剂，其适用于使所述化合物或混合物可以作为片剂、胶囊或丸剂口服给药，或者可以肠胃外、静脉内、真皮内、肌肉内或皮下或透皮给药。
所述含有抗网蛋白-1抗体和/或其他化合物的药物组合物可以通过用于药物给药的任何适合的途径给药。各种不同的给药途径是可用的。所选的具体模式当然将取决于所选的具体药剂、待治疗的具体病症和治疗效果所需的剂量。本公开的方法一般来说可以使用医学上可接受的任何给药模式来实践，这意味着产生疗效而不引起临床上不可接受的不良反应的任何方式。在本文中讨论了各种不同的给药模式。对于在疗法中的使用来说，可以将有效量的所述抗网蛋白-1抗体和/或其他治疗剂通过将所述药剂递送到所需表面的任何模式，例如粘膜、系统递送，给药到对象。
本公开的药物组合物的给药可以通过专业技术人员已知的任何手段来实现。给药途径包括但不限于口服、肠胃外、静脉内、肌肉内、腹膜内、鼻内、舌下、鞘内、吸入、皮下、眼、阴道和直肠。系统途径包括口服和肠胃外。几种类型的装置经常被用于通过吸入给药。这些类型的装置包括定量吸入器(mdi)、呼吸驱动型mdi、干粉吸入器(dpi)、与mdi组合的隔离室/保持室以及雾化器。
对于口服给药来说，可以通过将所述活性化合物与本领域中公知的可药用载体合并，容易地配制所述化合物。这些载体能够使本公开的化合物被配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬液等，用于被待治疗的对象口服摄入。用于口服使用的药物制剂可以作为固体赋形剂获得，任选地研磨得到的混合物，并且如有需要，在添加适合的辅助剂后加工颗粒混合物，以获得片剂或糖衣丸核心。适合的赋形剂具体来说是填充剂例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨糖醇，纤维素制备物例如玉米淀粉、小麦淀粉、水稻淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可以添加崩解剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或藻酸或其盐例如藻酸钠。任选地，所述口服制剂也可以在盐水或缓冲液中配制，用于中和内部的酸性条件，或者可以不使用任何载体进行给药。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合胶囊，以及由明胶和增塑剂例如甘油或山梨糖醇制成的密封软胶囊。所述推入配合胶囊可以含有与填充剂例如乳糖、粘合剂例如淀粉和/或润滑剂例如滑石或硬脂酸镁以及任选的稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，可以将所述活性化合物溶解或悬浮在适合的液体例如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。也可以使用被配制用于口服给药的微球。这些微球在本领域中已被很好地定义。用于口服给药的所有制剂都应该采取适合于这种给药的剂量。对于颊给药来说，所述组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入的给药来说，按照本公开使用的化合物可以方便地以来自于加压包或雾化器的气溶胶喷雾表现形式递送，并使用适合的推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯一氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他适合的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀门来确定，以递送计量过的量。在吸入器或吹入器中使用的例如明胶胶囊和药筒，可以被配制成含有所述化合物与适合的粉剂基料例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
所述化合物在希望系统性递送时，可以被配制成用于通过注射例如通过快速浓注或连续输注进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以以单位剂型形式呈现，例如在安瓿中或多药剂容器中，并添加有防腐剂。所述组合物可以采取诸如在油性或水性介质中的悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有配制剂例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外给药的药物制剂包括采取水溶性形式的所述活性化合物的水性溶液。此外，所述活性化合物的悬液可以被制备成适合的油性注射悬液。适合的亲脂性溶剂或介质包括脂肪油例如芝麻油或合成的脂肪酸酯例如油酸乙酯或甘油三酯或脂质体。水性注射悬液可以含有提高所述悬液的粘度的物质，例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或右旋糖酐。任选地，所述悬液也可以含有适合的稳定剂或提高所述化合物的溶解性的试剂以允许制备高度浓缩的溶液。
可选地，所述活性化合物可以采取粉末形式，用于在使用之前用适合的介质例如无菌无热原水重构。
所述化合物也可以被配制成直肠或阴道组合物例如栓剂或保留灌肠剂，其含有例如常规的栓剂基料例如可可脂或其他甘油酯。
其他递送系统可以包括定时释放、延迟释放或持续释放递送系统。这些系统可以避免所述化合物的重复给药，提高所述对象和医师的方便性。许多类型的释放递送系统是可用的，并且为本领域普通技术人员所知。它们包括聚合物基础系统例如聚(乳酸-乙醇酸)交酯、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酸酐。上述含有药物的聚合物的微胶囊描述在例如美国专利号5,075,109中。递送系统也包括非聚合物系统，它们是：脂类，包括甾醇类例如胆甾醇、胆甾醇酯和脂肪酸或中性脂肪例如甘油单酯、二酯和三酯；水凝胶释放系统；硅橡胶系统；基于肽的系统；蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压缩片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀系统，其中本公开的药剂以在基质内的形式被包含，例如在美国专利号4,452,775、4,675,189和5,736,152中所描述的那些；以及(b)扩散系统，其中活性组分以受控的速率从聚合物渗透，例如在美国专利号3,854,480、5,133,974和5,407,686中所描述的。此外，可以使用基于泵的硬件递送系统，它们中的一些被改造以适合于植入。
本公开所描述的抗网蛋白-1抗体和组合物可以多次给药到对象(例如患有癌症的对象)。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物被递送到对象的次数在2至10次的范围内(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10次)。在某些实施方式中，异源核酸被递送到对象超过10次。
在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每日历天(即24小时时长)一次地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每2、3、4、5、6或7个日历天一次地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每日历周(例如7个日历天)一次地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每两周(即在两个日历周时长内一次)地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每日历月一次(例如在30个日历天中一次)地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每6个日历月一次地给药到对象。在某些实施方式中，本公开的抗体或组合物的药剂被不超过每日历年(例如365天或在闰年中366天)一次地给药到对象。
免疫测定法
在某些实施方式中，本公开涉及一种用于在原位或体外检测细胞例如癌细胞表面上的网蛋白-1的方法。在某些实施方式中，本公开涉及一种用于在从对象获得的样品中检测细胞表面上的网蛋白-1的方法。所述样品可以从对象，例如通过从对象提取肿瘤或其一部分来获得。在某些实施方式中，可以从所述肿瘤分离细胞。然而，在某些实施方式中，可以在分离的肿瘤的背景下检查细胞。
在某些实施方式中，用于原位检测网蛋白-1的方法包括在网蛋白-1抗体或抗原结合片段能够与所述对象中的细胞例如癌细胞上的网蛋白-1的可接近的表位形成结合复合物的条件下，向对象递送偶联到标记物(例如放射性标记物)的所述网蛋白-1抗体或抗原结合片段；以及检测所述对象中的所述标记物(例如使用放射自显影或其他核医学检测技术，包括单光子发射计算机断层扫描(spect)、正电子发射断层扫描(pet)和闪烁扫描术)。
在某些实施方式中，用于在从对象获得的肿瘤样品中检测网蛋白-1的方法包括(a)将所述样品与所述抗体或抗原结合片段在适合于所述抗体或抗原结合片段与所述抗原的结合的条件下接触，如果所述抗原存在于所述样品中，则由此形成结合复合物；并且(b)确定例如在所述肿瘤的细胞表面处结合到所述抗原的所述抗体或抗原结合片段的水平(例如确定所述结合复合物的水平)。
当在本文中使用时，结合复合物是指结合到抗原(例如网蛋白-1蛋白)的抗体或抗原结合片段的生物分子复合物。结合复合物可以含有具有单一特异性的抗体或抗原结合片段或具有不同特异性的两个或多个抗体或抗原结合片段。在一个实施方式中，结合复合物包含识别同一抗原上的不同抗原性位点的两种或更多种抗体。在某些情况下，抗体或抗原结合片段可以被结合到抗原，其已结合有其他生物分子例如rna、dna、多糖或蛋白质。在一个实施方式中，结合复合物包含识别不同抗原的两种或更多种抗体。在某些实施方式中，结合复合物中的抗体或抗原结合片段(例如结合到抗原的固定化的抗体或抗原结合片段)自身可以作为抗原被结合到抗体或抗原结合片段(例如可检测标记的抗体或抗原结合片段)。因此，在某些情况下，结合复合物可以包含多种抗原和多种抗体或抗原结合片段。结合复合物中存在的抗原可以采取或不采取它们的本源原位构象。在某些实施方式中，结合复合物在抗体或抗原结合片段与纯化的蛋白质抗原或包含抗原的分离的蛋白质之间形成，其中所述抗原不采取其本源原位构象。在某些实施方式中，结合复合物在抗体或抗原结合片段与纯化的蛋白质抗原之间形成，其中所述抗原不采取其本源原位构象，并被固定化在固相支持物(例如pvdf膜)上。在某些实施方式中，结合复合物使用抗体或抗原结合片段和例如以原位本源构象存在(例如在细胞的表面上)的细胞表面蛋白来形成。结合复合物中的抗体或抗原结合片段可以被或可以不被可检测标记。在某些实施方式中，结合复合物包含可检测标记的抗体或抗原结合片段和未标记的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，结合复合物包含可检测标记的抗原。在某些实施方式中，结合复合物中的抗体或抗原结合片段被固定化到一个或多个固相支持物。在某些实施方式中，结合复合物中的抗原被固定化到一个或多个固相支持物。示例性的固相支持物在本文中公开，并且对本领域普通技术人员来说是显而易见的。上述结合复合物的实例不是旨在构成限制。结合复合物的其他实例对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
在任何所述检测、诊断和监测方法中，所述抗体或抗原结合片段或抗原可以被直接或间接偶联到固相支持物表面。用于偶联到固相支持物的方法是标准的，并且可以通过共价和非共价相互作用来实现。偶联方法的非限制性实例包括吸附、交联、蛋白a/g-抗体相互作用和链亲和素-生物素相互作用。其他偶联方法对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
在某些方面，上述检测、诊断和监测方法包括将结合到所述抗原的抗体或抗原结合片段(例如结合复合物)的水平与一种或多种参比标准品进行比较。所述参比标准品可以是例如患有或不患有先兆子痫的对象中相应的网蛋白-1水平。在一个实施方式中，所述参比标准品是在不含网蛋白-1的样品中检测到的网蛋白-1水平(例如背景水平)。或者，背景水平可以从含有特定网蛋白-1的样品，通过将所述样品与非特异性抗体(例如从非免疫血清获得的抗体)接触来确定。同样地，所述参比标准品可以是在含有网蛋白-1的样品中检测到的网蛋白-1水平(例如阳性对照)。在某些情况下，所述参比标准品可以是与样品中不同浓度的网蛋白-1相关的一系列水平，并可用于定量测试样品中网蛋白-1的浓度。上述参比标准品的实例不是限制性的，并且其他适合的参比标准品对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
另一个实施方式涉及一种诊断组合物，其包含上文描述的抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞中的任一者和任选地用于检测的适合手段。所述抗体或抗原结合片段例如适合用于免疫测定法中，在所述免疫测定法中它们可以在在液相中使用或结合到固相载体。可以利用所述抗体或抗原结合片段的免疫测定法的实例是采取直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定法。这些免疫测定法的实例是酶联免疫测定法(elisa)、放射免疫测定法(ria)、夹心(免疫测定法)、流式细胞术、以及蛋白质印迹测定法、免疫沉淀测定法、免疫组织化学、免疫显微术、横向流免疫层析测定法和蛋白质组阵列。所述抗原和抗体或抗原结合片段可以结合到许多不同的固相支持物(例如载体、膜、柱、蛋白质组阵列等)。固相支持物材料的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、右旋糖酐、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素例如硝酸纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。所述支持物的本质可以是固定的或悬浮在溶液中(例如珠子)。
作为另一个实施方式，本文中提供的抗体和抗原结合片段也可以使用在用于评估在对象中的网蛋白-1表达的方法中，所述方法包括从所述对象获得生物样品，其可以是血液样品、任何其他适合的体液样品(例如淋巴液)或组织样品(例如胰腺组织、卵巢组织、来自于对象头颈部的组织、乳腺组织、肺组织等)。所述程序可以包括将所述样品(例如胰腺组织)或从其分离的蛋白质样品与抗体或抗原结合片段在能够在抗体或抗原结合片段与抗原之间形成结合复合物的条件下接触。然后可以通过本领域中已知的方法来确定这些结合复合物的水平。
在某些实施方式中，将所述生物样品与所述抗体或抗原结合片段在适合于所述抗体或抗原结合片段与网蛋白-1蛋白结合的条件下接触，如果在所述样品中存在所述抗原，则由结合到所述抗原的抗体或抗原结合片段组成的结合复合物形成。这个接触步骤通常在反应区室例如试管、板孔、膜槽、细胞培养皿、显微镜载片等中进行。在某些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段被固定化在固相支持物上。在某些实施方式中，所述抗原被固定化在固相支持物上。在某些实施方式中，所述固相支持物是所述反应区室的表面。在某些实施方式中，所述固相支持物是聚合物膜(例如硝酸纤维素条、聚偏二氟乙烯(pvdf)膜等)。可以使用其他适合的固相支持物。
在某些实施方式中，所述抗体和抗原结合片段在与所述抗原接触之前被固定化在所述固相支持物上。在其他实施方式中，所述抗体和抗原结合片段的固定化在结合复合物形成之后进行。在又其他实施方式中，将抗原在结合复合物形成之前固定化在固相支持物上。在某些实施方式中，向所述反应区室添加检测试剂以检测固定化的结合复合物。在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对所述抗原的可检测标记的第二抗体。在某些实施方式中，所述第一抗体或抗原结合片段本身被可检测标记，并因此是检测试剂。
一方面，检测方法包括下述步骤：将抗体或抗原结合片段固定化到固相支持物；将样品(例如生物样品或分离的蛋白质样品)在如果所述样品中存在抗原的话允许所述抗原与所述抗体或抗原结合片段结合的条件下施加到所述固相支持物；从所述固相支持物除去过量的样品；在允许可检测标记的抗体或抗原结合片段与结合有抗原的固定化的抗体或抗原结合片段结合的条件下施加所述可检测标记的抗体或抗原结合片段；清洗所述固相支持物并检测所述固相支持物上标记物的存在。
在某些实施方式中，在与反应区室(例如膜槽)中的所述抗体和抗原结合片段接触之前，将所述抗原固定化在所述固相支持物例如pvdf膜上。向所述反应区室添加检测试剂，以检测固定化的结合复合物。在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对所述抗原的可检测标记的第二抗体。在某些实施方式中，所述检测试剂包含针对所述第一抗体或抗原结合片段的可检测标记的第二抗体。正如本文中公开的，所述可检测标记物可以是例如放射性同位素、荧光团、发光分子、酶、生物素组成部分、表位标签或染料分子。在某些实施方式中，所述第一抗体或抗原结合片段本身被可检测标记，并因此是检测试剂。适合的可检测标记物在本文中有所描述，并且对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
因此，提供了适合于家庭或临床使用(护理服务现场)的诊断试剂盒，其包含(a)可检测标记的和/或未标记的抗体或抗原结合片段作为抗原结合试剂(例如网蛋白-1结合试剂)；(b)检测试剂；和任选地(c)使用所述试剂检测样品中的抗原的完整说明书。在某些实施方式中，所述诊断试剂盒包括固定化在固相支持物上的所述抗体或抗原结合片段和/或网蛋白-1。本文中描述的任何固相支持物都适合于并入到所述诊断试剂盒中。在优选实施方式中，所述固相支持物是板孔的反应区室的表面。通常，所述板孔在多孔板中，其具有选自6、12、24、96、384和1536的孔数，但不限于此。在其他实施方式中，所述诊断试剂盒提供了可检测标记的抗体或抗原结合片段。诊断试剂盒不限于这些实施方式，并且试剂盒组成的其他变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
本公开通过下述实施例进一步说明，所述实施例绝不应该被解释为进一步限制。在整个本申请中引用的所有参考资料(包括参考文献、已发表的专利、已公布的专利申请和共同待决的专利申请)的全部内容，明确地通过引用并入本文。
实施例
人类网蛋白-1在大肠埃希氏杆菌中的表达和纯化
将可随时表达的构建物即带有his标签的载体(15mg/l，seqidno：2)和带有gst标签的载体(30mg/l，seqidno：3)两者用于产生单克隆抗体。为了评估表达，将所述质粒转化到大肠埃希氏杆菌b菌株中。试验在4ml试管中进行，并检查下述变量：温度，表达时间和异丙基β-d-1-硫代半乳吡喃糖苷(iptg)的浓度。
通过离心收获细胞。将细胞沉淀物通过超声裂解，并使用镍柱通过一步纯化获得靶蛋白。将级分合并和针对储存缓冲液透析。使用不同的储存缓冲液以确定哪种缓冲液产生浓度超过0.4mg/ml的最稳定的蛋白质。蛋白质使用标准流程通过sds-page和蛋白质印迹进行分析，以获得分子量和纯度测量值。蛋白质的浓度使用bradford蛋白质测定法来确定，使用牛血清白蛋白(bsa)作为标准品。
抗人类网蛋白-1蛋白的单克隆开发
开发了一组特定的识别靶蛋白(在seqidno：1中下划线，如seqidno：92所示)的抗人类网蛋白-1蛋白单克隆抗体。
首先，将5只balb/c小鼠用genscript’smonoexpress免疫方案免疫并观察两周。
使用电融合进行两次融合。使用这种方法的平均融合效率为1个杂交瘤/5000个b细胞左右。杂交瘤克隆的预期得率为2x104，并将所述融合的细胞铺于96孔板中。进行elisa以筛选所述融合蛋白的阳性克隆。然后通过elisa将来自于所述阳性克隆的上清液针对所述靶蛋白进行进一步筛选。使用带有10*his标签的蛋白质作为反向筛选。所选的克隆对所述靶蛋白阳性并且对所述带有10*his标签的蛋白质阴性。将所述阳性克隆在用人类重组sec8(网蛋白-1区段8)包被的24孔板中扩增，并收集每个克隆的2ml上清液，然后将细胞冷冻保存。表3示出了在包被有人类重组网蛋白-1区段8的板上生长的细胞系的od450nm。
表3：实验细胞系的od450结果
将来自于两个融合体的阳性原代克隆通过有限稀释法进行亚克隆，以确保所述亚克隆源自于单一亲代细胞。将所述克隆生长三代。将所述亚克隆通过elisa进一步筛选。在所述elisa结果的基础上，将每个原代克隆的两个稳定的亚克隆细胞系冷冻保存。
克隆pab1和pab2表现出最高的特异性网蛋白结合潜力(图1)。克隆pab3、pab4和pab5也被证实具有杀死癌细胞的能力(图2)。
使用滚瓶以大约15mg/l的浓度生产所述抗体。所述抗体蛋白使用蛋白a/g亲和柱层析进一步纯化，并在pbs缓冲液中透析以备储存。对于质量控制来说，所述抗体经历通过sds-page进行的纯度试验，通过od280nm处的吸收值进行的浓度确定和通过elisa进行的抗原反应性试验。
对所选抗体进行标准的全长抗体测序。所述抗体经历总rna提取、rt-pcr和5’race和3’racepcr。将所述可变区和恒定区的靶pcr片段进行凝胶纯化并克隆在测序载体中。对每条链的至少5个独立的阳性克隆进行测序，以便推演共有序列。
pab1和pab2的单克隆抗体测序
pab1和pab2使用下述程序进行测序。使用
最后，将具有正确的vh、vl、ch、cl插入片段尺寸的5个单菌落送去测序。发现5个不同克隆的vh、vl、ch、cl基因是几乎一致的。在下面的序列部分中列出的pab1和pab2的共有序列，代表了pab1和pab2抗体的序列。
使用pab1的体外测定法
进行了体外结合测定。图3a示出了pab1特异性结合到重组人类网蛋白-1蛋白的c-端部分。数据表明，pab1以高亲和性(例如kd<1nm)选择性结合到重组人类sec8-his蛋白。图3b示出了pab1对网蛋白-1阳性l3.6pl癌细胞的结合特异性；pab1不结合到网蛋白-1阴性的lncap细胞。
图4a-4g示出了pab1在l3.6pl网蛋白-1阳性癌细胞中的内化。示出了代表性的共聚焦显微术图像，所述共聚焦显微术图像显示了l3.6pl细胞与pab1(图4a)或igg对照(图4b)一起的染色，并与内体标志物lamp-1重合。观察到了pab1和lamp-1的共定位(图4c-4e)。定量测定法表明显著比例的pab1与lamp-1重合，而igg对照不是如此。在37℃、4℃下温浴或与冷pab1组合后，l3.6pl细胞中内化的125i-pab1放射性的测量表明在4℃下与37℃下相比，在两种细胞系中放射性都降低，而在与冷pab1竞争期间(comp.)，只有l3.6pl细胞中内化活性降低，如图4g中所示。
图5a-5d示出了在用pab1处理后与诱导的通过凋亡进行的癌细胞死亡相关的数据。图5a示出了通过流式细胞术进行的l3.6pl细胞的荧光减一对照实验。图5b示出了在用igg对照处理后72小时的l3.6pl膜联蛋白v阳性细胞。图5c示出了在用pab1处理72小时后的l3.6pl膜联蛋白v阳性细胞。数据表明pab1处理的l3.6pl细胞与igg处理的对照细胞相比经历明显更多的凋亡(正如通过膜联蛋白v所评估的)(图5d)。
在用pab1或igg对照处理后72小时，测量了癌细胞类型和健康细胞类型的存活率。ec50通过逻辑非线性回归来计算，并报告为使细胞存活性降低50％的mab浓度(nm)。数据示出在表4中(下表)。
表4
通过共聚焦显微术研究了pab1处理对yapc癌细胞的微管蛋白各向异性的影响。图6a示出了没有用pab1处理的yapc细胞中的微管蛋白染色。图6b示出了在一甲基澳瑞他汀e(mmae)处理后10分钟的微管蛋白染色；mmae阻断微管蛋白聚合。图6c示出了在pab1处理后24小时的微管蛋白染色。数据表明与未处理的对照细胞相比，在用pab1处理的细胞中各向异性降低(图6d)。
也研究了yapc癌细胞中pab1与微管蛋白的共定位。示出了在微管蛋白染色(图7a)和pab1染色(图7b)后yapc的代表性的共聚焦显微术图像。数据表明，微管蛋白和pab1共定位在染色细胞的表面上(图7c；箭头)。在几个细胞上也观察到了pab1染色的增加。
使用pab1的体外测定法
将带有皮下yapc肿瘤的免疫受损小鼠给药pab1或igg对照。数据表明，在11天后，用3mg/kgpab1治疗的小鼠与用igg对照治疗的小鼠相比具有明显更小的肿瘤体积(图8a)。数据还表明，1mg/kgpab1小鼠在第14天引发肿瘤体积的显著减小。与用0.3mg/kgpab1治疗的小鼠相比，两种较高的pab1剂量(1mg/kg和3mg/kg)引起明显更低的肿瘤体积(图8a)，指示了剂量依赖性效应。数据还表明，用pab1治疗的动物在整个治疗的持续时间内没有体重减轻(图8b)。还示出了用3mg/kgpab1治疗的小鼠在第0天、第14天和第25天的照片(图8c-8e)。
序列
>seqidno:1–网蛋白(半桥粒蛋白1),智人；下划线的靶蛋白
mvagmlmprdqlraiyevlfregvmvakkdrrprslhphvpgvtnlqvmramaslrarglvretfawchfywyltnegiahlrqylhlppeivpaslqrvrrpvamvmparrtphvqavqgplgsppkrgplpteeqrvyrrkeleevspetpvvpattqrtlarpgpepapatderdrvqkktftkwvnkhlikaqrhisdlyedlrdghnlisllevlsgdslprekgrmrfhklqnvqialdylrhrqvklvnirnddiadgnpkltlgliwtiilhfqisdiqvsgqsedmtakeklllwsqrmvegyqglrcdnftsswrdgrlfnaiihrhkpllidmnkvyrqtnlenldqafsvaerdlgvtrlldpedvdvpqpdeksiityvsslydamprvpdvqdgvranelqlrwqeyrelvllllqwmrhhtaafeerrfpssfeeieilwsqflkfkemelpakeadknrskgiyqslegavqagqlkvppgyhpldvekewgklhvailerekqlrseferleclqrivtklqmeaglceeqlnqadallqsdvrllaagkvpqrageverdldkadsmirllfndvqtlkdgrhpqgeqmyrrvyrlherlvairteynlrlkagvaapatqvaqvtlqsvqrrpeledstlrylqdllawveenqhrvdgaewgvdlpsveaqlgshrglhqsieefrakierarsdegqlspatrgayrdclgrldlqyakllnsskarlrsleslhsfvaaatkelmwlnekeeeevgfdwsdrntnmtakkesysalmrelelkekkikelqnagdrllredhparptvesfqaalqtqwswmlqlcccieahlkenaayfqffsdvreaegqlqklqealrrkyscdrsatvtrledllqdaqdekeqlneykghlsglakrakavvqlkprhpahpmrgrlpllavcdykqvevtvhkgdecqlvgpaqpshwkvlsssgseaavpsvcflvpppnqeaqeavtrleaqhqalvtlwhqlhvdmksllawqslrrdvqlirswslatfrtlkpeeqrqalhslelhyqaflrdsqdaggfgpedrlmaereygscshhyqqllqsleqgaqeesrcqrciselkdirlqleacetrtvhrlrlpldkeparecaqriaeqqkaqaeveglgkgvarlsaeaekvlalpepspaaptlrseleltlgkleqvrslsaiyleklktislvirgtqgaeevlraheeqlkeaqavpatlpeleatkaslkklraqaeaqqptfdalrdelrgaqevgerlqqrhgerdveverwrervaqllerwqavlaqtdvrqreleqlgrqlryyresadplgawlqdarrrqeqiqampladsqavreqlrqeqalleeierhgekveecqrfakqyinaikdyelqlvtykaqlepvaspakkpkvqsgsesviqeyvdlrthyselttltsqyikfisetlrrmeeeerlaeqqraeererlaeveaalekqrqlaeahaqakaqaereakelqqrmqeevvrreeaavdaqqqkrsiqeelqqlrqsseaeiqakarqaeaaersrlrieeeirvvrlqleaterqrggaegelqalraraeeaeaqkrqaqeeaerlrrqvqdesqrkrqaevelasrvkaeaeaarekqralqaleelrlqaeeaerrlrqaeverarqvqvaletaqrsaeaelqskrasfaektaqlerslqeehvavaqlreeaerraqqqaeaerareeaerelerwqlkanealrlrlqaeevaqqkslaqaeaekqkeeaerearrrgkaeeqavrqrelaeqelekqrqlaegtaqqrlaaeqelirlraeteqgeqqrqlleeelarlqreaaaatqkrqeleaelakvraemevllaskaraeeesrstsekskqrleaeagrfrelaeeaarlralaeeakrqrqlaeedaarqraeaervlaeklaaigeatrlkteaeialkekeaenerlrrlaedeafqrrrleeqaaqhkadieerlaqlrkasdselerqkglvedtlrqrrqveeeilalkasfekaaagkaelelelgrirsnaedtlrskeqaeleaarqrqlaaeeerrrreaeervqkslaaeeeaarqrkaaleeverlkakveearrlreraeqesarqlqlaqeaaqkrlqaeekahafavqqkeqelqqtlqqeqsvldqlrgeaeaarraaeeaeearvqaereaaqsrrqveeaerlkqsaeeqaqaraqaqaaaeklrkeaeqeaarraqaeqaalrqkqaadaemekhkkfaeqtlrqkaqveqelttlrlqleetdhqknlldeelqrlkaeateaarqrsqveeelfsvrvqmeelsklkarieaenralilrdkdntqrflqeeaekmkqvaeeaarlsvaaqeaarlrqlaeedlaqqralaekmlkekmqavqeatrlkaeaellqqqkelaqeqarrlqedkeqmaqqlaeetqgfqrtleaerqrqlemsaeaerlklrvaemsraqaraeedaqrfrkqaeeigeklhrtelatqekvtlvqtleiqrqqsdhdaerlreaiaelerekeklqqeakllqlkseemqtvqqeqllqetqalqqsflsekdsllqrerfieqekakleqlfqdevakaqqlreeqqrqqqqmeqerqrlvasmeearrrqheaeegvrrkqeelqqleqqrrqqeellaeenqrlreqlqlleeqhraalahseevtasqvaatktlpngrdaldgpaaeaepehsfdglrrkvsaqrlqeagilsaeelqrlaqghttvdelarredvrhylqgrssiaglllkatneklsvyaalqrqllspgtalilleaqaasgflldpvrnrrltvneavkegvvgpelhhkllsaeravtgykdpytgqqislfqamqkglivrehgirlleaqiatggvidpvhshrvpvdvayrrgyfdeemnrvladpsddtkgffdpnthenltylqllercvedpetglcllpltdkaakggelvytdseardvfekatvsapfgkfqgktvtiweiinseyftaeqrrdllrqfrtgritvekiikiiitvveeqeqkgrlcfeglrslvpaaellesrvidrelyqqlqrgersvrdvaevdtvrralrganviagvwleeagqklsiynalkkdllpsdmavalleaqagtghiidpatsarltvdeavraglvgpefhekllsaekavtgyrdpytgqsvslfqalkkglipreqglrlldaqlstggivdpskshrvpldvacargcldeetsralsapradakaysdpstgepatygelqqrcrpdqltglsllplsekaararqeelyselqaretfektpvevpvggfkgrtvtvwelisseyftaeqrqellrqfrtgkvtvekvikilitiveevetlrqerlsfsglrapvpasellasgvlsraqfeqlkdgkttvkdlselgsvrtllqgsgclagiyledtkekvsiyeamrrgllrattaallleaqaatgflvdpvrnqrlyvheavkagvvgpelheqllsaekavtgyrdpysgstislfqamqkglvlrqhgirlleaqiatggiidpvhshrvpvdvayqrgyfseemnrvladpsddtkgffdpnthenltyrqllercvedpetglrllplkgaekaevvettqvyteeetrrafeetqidipgggshggstmslwevmqsdlipeeqraqlmadfqagrvtkermiiiiieiiekteiirqqglasydyvrrrltaedlfeariisletynllregtrslrealeaesawcylygtgsvagvylpgsrqtlsiyqalkkgllsaevarllleaqaatgflldpvkgerltvdeavrkglvgpelhdrllsaeravtgyrdpyteqtislfqamkkelipteealrlldaqlatggivdprlgfhlplevayqrgylnkdthdqlsepsevrsyvdpstderlsytqllrrcrrddgtgqlllplsdarkltfrglrkqitmeelvrsqvmdeatalqlregltsieevtknlqkflegtsciagvfvdatkerlsvyqamkkgiirpgtafelleaqaatgyvidpikglkltveeavrmgivgpefkdkllsaeravtgykdpysgklislfqamkkglilkdhgirlleaqiatggiidpeeshrlpvevaykrglfdeemneiltdpsddtkgffdpnteenltylqlmercitdpqtglcllplkekkrerktsskssvrkrrvvivdpetgkemsvyeayrkglidhqtylelseqeceweeitisssdgvvksmiidrrsgrqydiddaiaknlidrsaldqyragtlsitefadmlsgnaggfrsrsssvgssssypispavsrtqlaswsdpteetgpvagildtetlekvsiteamhrnlvdnitgqrlleaqactggiidpstgerfpvtdavnkglvdkimvdrinlaqkafcgfedprtktkmsaaqalkkgwlyyeagqrflevqyltggliepdtpgrvpldealqrgtvdartaqklrdvgayskyltcpktklkisykdaldrsmveegtglrlleaaaqstkgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgssaslggpesava
>seqidno:2–pet-10nc-pleccterm:his标签-ek切割位点-人类网蛋白1(区段8)-终止密码子(344氨基酸；mw＝36959.2；预测pi＝8.80)
mrshhhhhhhhhhrsgtgddddkamadigsefelrrqacgfrsrsssvgssssypispavsrtqlaswsdpteetgpvagildtetlekvsiteamhrnlvdnitgqrlleaqactggiidpstgerfpvtdavnkglvdkimvdrinlaqkafcgfedprtktkmsaaqalkkgwlyyeagqrflevqyltggliepdtpgrvpldealqrgtvdartaqklrdvgayskyltcpktklkisykdaldrsmveegtglrlleaaaqstkgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgssslggpesava.
>seqidno:3–pgex2t-区段8:gst标签凝血酶切割位点-人类网蛋白1(区段8)-终止密码子(540氨基酸；mw＝59809.3；预测pi＝8.15)
mspilgywkikglvqptrllleyleekyeehlyerdegdkwrnkkfelglefpnlpyyidgdvkltqsmaiiryiadkhnmlggcpkeraeismlegavldirygvsriayskdfetlkvdflsklpemlkmfedrlchktylngdhvthpdfmlydaldvvlymdpmcldafpklvcfkkrieaipqidkylksskyiawplqgwqatfgggdhppksdlvprgsefelrrqacgfrsrsssvgssssypispavsrtqlaswsdpteetgpvagildtetlekvsiteamhrnlvdnitgqrlleaqactggiidpstgerfpvtdavnkglvdkimvdrinlaqkafcgfedprtktkmsaaqalkkgwlyyeagqrflevqyltggliepdtpgrvpldealqrgtvdartaqklrdvgayskyltcpktklkisykdaldrsmveegtglrlleaaaqstkgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgssslggpesava.
pab2序列
pab1序列
>seqidno:92–网蛋白(半桥粒蛋白1),智人；下划线的靶蛋白
sssdgvvksmiidrrsgrqydiddaiaknlidrsaldqyragtlsitefadmlsgnaggfrsrsssvgssssypispavsrtqlaswsdpteetgpvagildtetlekvsiteamhrnlvdnitgqrlleaqactggiidpstgerfpvtdavnkglvdkimvdrinlaqkafcgfedprtktkmsaaqalkkgwlyyeagqrflevqyltggliepdtpgrvpldealqrgtvdartaqklrdvgayskyltcpktklkisykdaldrsmveegtglrlleaaaqstkgyyspysvsgsgstagsrtgsrtgsragsrrgsfdatgsgfsmtfssssysssgygrryasgssaslggpesava
序列表
<110>埃缇健康公司(itihealth,inc.)
<120>网蛋白-1结合抗体及其用途
<130>i0447.70002wo00
<140>notyetassigned
<141>2017-04-07
<150>us62/320,117
<151>2016-04-08
<160>93
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>4684
<212>prt
<213>智人（homosapiens）
<400>1
metvalalaglymetleumetproargaspglnleuargalailetyr
151015
gluvalleuphearggluglyvalmetvalalalyslysaspargarg
202530
proargserleuhisprohisvalproglyvalthrasnleuglnval
354045
metargalametalaserleuargalaargglyleuvalarggluthr
505560
phealatrpcyshisphetyrtrptyrleuthrasngluglyileala
65707580
hisleuargglntyrleuhisleuproprogluilevalproalaser
859095
leuglnargvalargargprovalalametvalmetproalaargarg
100105110
thrprohisvalglnalavalglnglyproleuglyserproprolys
115120125
argglyproleuprothrglugluglnargvaltyrargarglysglu
130135140
leuglugluvalserprogluthrprovalvalproalathrthrgln
145150155160
argthrleualaargproglyprogluproalaproalathraspglu
165170175
argaspargvalglnlyslysthrphethrlystrpvalasnlyshis
180185190
leuilelysalaglnarghisileseraspleutyrgluaspleuarg
195200205
aspglyhisasnleuileserleuleugluvalleuserglyaspser
210215220
leuproargglulysglyargmetargphehislysleuglnasnval
225230235240
glnilealaleuasptyrleuarghisargglnvallysleuvalasn
245250255
ileargasnaspaspilealaaspglyasnprolysleuthrleugly
260265270
leuiletrpthrileileleuhispheglnileseraspileglnval
275280285
serglyglnsergluaspmetthralalysglulysleuleuleutrp
290295300
serglnargmetvalgluglytyrglnglyleuargcysaspasnphe
305310315320
thrsersertrpargaspglyargleupheasnalaileilehisarg
325330335
hislysproleuleuileaspmetasnlysvaltyrargglnthrasn
340345350
leugluasnleuaspglnalapheservalalagluargaspleugly
355360365
valthrargleuleuaspprogluaspvalaspvalproglnproasp
370375380
glulysserileilethrtyrvalserserleutyraspalametpro
385390395400
argvalproaspvalglnaspglyvalargalaasngluleuglnleu
405410415
argtrpglnglutyrarggluleuvalleuleuleuleuglntrpmet
420425430
arghishisthralaalapheglugluargargpheproserserphe
435440445
glugluilegluileleutrpserglnpheleulysphelysglumet
450455460
gluleuproalalysglualaasplysasnargserlysglyiletyr
465470475480
glnserleugluglyalavalglnalaglyglnleulysvalpropro
485490495
glytyrhisproleuaspvalglulysglutrpglylysleuhisval
500505510
alaileleugluargglulysglnleuargsergluphegluargleu
515520525
glucysleuglnargilevalthrlysleuglnmetglualaglyleu
530535540
cysglugluglnleuasnglnalaaspalaleuleuglnseraspval
545550555560
argleuleualaalaglylysvalproglnargalaglygluvalglu
565570575
argaspleuasplysalaaspsermetileargleuleupheasnasp
580585590
valglnthrleulysaspglyarghisproglnglygluglnmettyr
595600605
argargvaltyrargleuhisgluargleuvalalaileargthrglu
610615620
tyrasnleuargleulysalaglyvalalaalaproalathrglnval
625630635640
alaglnvalthrleuglnservalglnargargprogluleugluasp
645650655
serthrleuargtyrleuglnaspleuleualatrpvalglugluasn
660665670
glnhisargvalaspglyalaglutrpglyvalaspleuproserval
675680685
glualaglnleuglyserhisargglyleuhisglnserilegluglu
690695700
pheargalalysilegluargalaargseraspgluglyglnleuser
705710715720
proalathrargglyalatyrargaspcysleuglyargleuaspleu
725730735
glntyralalysleuleuasnserserlysalaargleuargserleu
740745750
gluserleuhisserphevalalaalaalathrlysgluleumettrp
755760765
leuasnglulysglugluglugluvalglypheasptrpserasparg
770775780
asnthrasnmetthralalyslysglusertyrseralaleumetarg
785790795800
gluleugluleulysglulyslysilelysgluleuglnasnalagly
805810815
aspargleuleuarggluasphisproalaargprothrvalgluser
820825830
pheglnalaalaleuglnthrglntrpsertrpmetleuglnleucys
835840845
cyscysileglualahisleulysgluasnalaalatyrpheglnphe
850855860
pheseraspvalargglualagluglyglnleuglnlysleuglnglu
865870875880
alaleuargarglystyrsercysaspargseralathrvalthrarg
885890895
leugluaspleuleuglnaspalaglnaspglulysgluglnleuasn
900905910
glutyrlysglyhisleuserglyleualalysargalalysalaval
915920925
valglnleulysproarghisproalahisprometargglyargleu
930935940
proleuleualavalcysasptyrlysglnvalgluvalthrvalhis
945950955960
lysglyaspglucysglnleuvalglyproalaglnproserhistrp
965970975
lysvalleuserserserglyserglualaalavalproservalcys
980985990
pheleuvalproproproasnglnglualaglnglualavalthrarg
99510001005
leuglualaglnhisglnalaleuvalthrleutrphisglnleu
101010151020
hisvalaspmetlysserleuleualatrpglnserleuargarg
102510301035
aspvalglnleuileargsertrpserleualathrpheargthr
104010451050
leulysproglugluglnargglnalaleuhisserleugluleu
105510601065
histyrglnalapheleuargaspserglnaspalaglyglyphe
107010751080
glyprogluaspargleumetalagluargglutyrglysercys
108510901095
serhishistyrglnglnleuleuglnserleugluglnglyala
110011051110
glnglugluserargcysglnargcysilesergluleulysasp
111511201125
ileargleuglnleuglualacysgluthrargthrvalhisarg
113011351140
leuargleuproleuasplysgluproalaargglucysalagln
114511501155
argilealagluglnglnlysalaglnalagluvalgluglyleu
116011651170
glylysglyvalalaargleuseralaglualaglulysvalleu
117511801185
alaleuprogluproserproalaalaprothrleuargserglu
119011951200
leugluleuthrleuglylysleugluglnvalargserleuser
120512101215
alailetyrleuglulysleulysthrileserleuvalilearg
122012251230
glythrglnglyalaglugluvalleuargalahisgluglugln
123512401245
leulysglualaglnalavalproalathrleuprogluleuglu
125012551260
alathrlysalaserleulyslysleuargalaglnalagluala
126512701275
glnglnprothrpheaspalaleuargaspgluleuargglyala
128012851290
glngluvalglygluargleuglnglnarghisglygluargasp
129513001305
valgluvalgluargtrparggluargvalalaglnleuleuglu
131013151320
argtrpglnalavalleualaglnthraspvalargglnargglu
132513301335
leugluglnleuglyargglnleuargtyrtyrarggluserala
134013451350
aspproleuglyalatrpleuglnaspalaargargargglnglu
135513601365
glnileglnalametproleualaaspserglnalavalargglu
137013751380
glnleuargglngluglnalaleuleuglugluilegluarghis
138513901395
glyglulysvalgluglucysglnargphealalysglntyrile
140014051410
asnalailelysasptyrgluleuglnleuvalthrtyrlysala
141514201425
glnleugluprovalalaserproalalyslysprolysvalgln
143014351440
serglysergluservalileglnglutyrvalaspleuargthr
144514501455
histyrsergluleuthrthrleuthrserglntyrilelysphe
146014651470
ilesergluthrleuargargmetglugluglugluargleuala
147514801485
gluglnglnargalaglugluarggluargleualagluvalglu
149014951500
alaalaleuglulysglnargglnleualaglualahisalagln
150515101515
alalysalaglnalagluargglualalysgluleuglnglnarg
152015251530
metglnglugluvalvalargarggluglualaalavalaspala
153515401545
glnglnglnlysargserileglnglugluleuglnglnleuarg
155015551560
glnserserglualagluileglnalalysalaargglnalaglu
156515701575
alaalagluargserargleuargilegluglugluileargval
158015851590
valargleuglnleuglualathrgluargglnargglyglyala
159516001605
gluglygluleuglnalaleuargalaargalagluglualaglu
161016151620
alaglnlysargglnalaglngluglualagluargleuargarg
162516301635
glnvalglnaspgluserglnarglysargglnalagluvalglu
164016451650
leualaserargvallysalaglualaglualaalaargglulys
165516601665
glnargalaleuglnalaleuglugluleuargleuglnalaglu
167016751680
glualagluargargleuargglnalagluvalgluargalaarg
168516901695
glnvalglnvalalaleugluthralaglnargseralagluala
170017051710
gluleuglnserlysargalaserphealaglulysthralagln
171517201725
leugluargserleuglnglugluhisvalalavalalaglnleu
173017351740
arggluglualagluargargalaglnglnglnalaglualaglu
174517501755
argalaarggluglualagluarggluleugluargtrpglnleu
176017651770
lysalaasnglualaleuargleuargleuglnalaglugluval
177517801785
alaglnglnlysserleualaglnalaglualaglulysglnlys
179017951800
gluglualagluargglualaargargargglylysalagluglu
180518101815
glnalavalargglnarggluleualagluglngluleuglulys
182018251830
glnargglnleualagluglythralaglnglnargleualaala
183518401845
gluglngluleuileargleuargalagluthrgluglnglyglu
185018551860
glnglnargglnleuleugluglugluleualaargleuglnarg
186518701875
glualaalaalaalathrglnlysargglngluleuglualaglu
188018851890
leualalysvalargalaglumetgluvalleuleualaserlys
189519001905
alaargalagluglugluserargserthrserglulysserlys
191019151920
glnargleuglualaglualaglyargphearggluleualaglu
192519301935
glualaalaargleuargalaleualagluglualalysarggln
194019451950
argglnleualaglugluaspalaalaargglnargalagluala
195519601965
gluargvalleualaglulysleualaalaileglyglualathr
197019751980
argleulysthrglualagluilealaleulysglulysgluala
198519901995
gluasngluargleuargargleualagluaspglualaphegln
200020052010
argargargleuglugluglnalaalaglnhislysalaaspile
201520202025
glugluargleualaglnleuarglysalaseraspsergluleu
203020352040
gluargglnlysglyleuvalgluaspthrleuargglnargarg
204520502055
glnvalgluglugluileleualaleulysalaserpheglulys
206020652070
alaalaalaglylysalagluleugluleugluleuglyargile
207520802085
argserasnalagluaspthrleuargserlysgluglnalaglu
209020952100
leuglualaalaargglnargglnleualaalagluglugluarg
210521102115
argargargglualaglugluargvalglnlysserleualaala
212021252130
glugluglualaalaargglnarglysalaalaleuglugluval
213521402145
gluargleulysalalysvalgluglualaargargleuargglu
215021552160
argalagluglngluseralaargglnleuglnleualaglnglu
216521702175
alaalaglnlysargleuglnalagluglulysalahisalaphe
218021852190
alavalglnglnlysgluglngluleuglnglnthrleuglngln
219522002205
gluglnservalleuaspglnleuargglyglualaglualaala
221022152220
argargalaalagluglualagluglualaargvalglnalaglu
222522302235
argglualaalaglnserargargglnvalgluglualagluarg
224022452250
leulysglnseralaglugluglnalaglnalaargalaglnala
225522602265
glnalaalaalaglulysleuarglysglualagluglngluala
227022752280
alaargargalaglnalagluglnalaalaleuargglnlysgln
228522902295
alaalaaspalaglumetglulyshislyslysphealaglugln
230023052310
thrleuargglnlysalaglnvalgluglngluleuthrthrleu
231523202325
argleuglnleuglugluthrasphisglnlysasnleuleuasp
233023352340
glugluleuglnargleulysalaglualathrglualaalaarg
234523502355
glnargserglnvalgluglugluleupheservalargvalgln
236023652370
metglugluleuserlysleulysalaargileglualagluasn
237523802385
argalaleuileleuargasplysaspasnthrglnargpheleu
239023952400
glngluglualaglulysmetlysglnvalalagluglualaala
240524102415
argleuservalalaalaglnglualaalaargleuargglnleu
242024252430
alaglugluaspleualaglnglnargalaleualaglulysmet
243524402445
leulysglulysmetglnalavalglnglualathrargleulys
245024552460
alaglualagluleuleuglnglnglnlysgluleualaglnglu
246524702475
glnalaargargleuglngluasplysgluglnmetalaglngln
248024852490
leualaglugluthrglnglypheglnargthrleuglualaglu
249525002505
argglnargglnleuglumetseralaglualagluargleulys
251025152520
leuargvalalaglumetserargalaglnalaargalagluglu
252525302535
aspalaglnargphearglysglnalaglugluileglyglulys
254025452550
leuhisargthrgluleualathrglnglulysvalthrleuval
255525602565
glnthrleugluileglnargglnglnserasphisaspalaglu
257025752580
argleuargglualailealagluleugluargglulysglulys
258525902595
leuglnglnglualalysleuleuglnleulyssergluglumet
260026052610
glnthrvalglnglngluglnleuleuglngluthrglnalaleu
261526202625
glnglnserpheleuserglulysaspserleuleuglnargglu
263026352640
argpheilegluglnglulysalalysleugluglnleuphegln
264526502655
aspgluvalalalysalaglnglnleuargglugluglnglnarg
266026652670
glnglnglnglnmetgluglngluargglnargleuvalalaser
267526802685
metgluglualaargargargglnhisglualaglugluglyval
269026952700
argarglysglnglugluleuglnglnleugluglnglnargarg
270527102715
glnglnglugluleuleualaglugluasnglnargleuargglu
272027252730
glnleuglnleuleuglugluglnhisargalaalaleualahis
273527402745
serglugluvalthralaserglnvalalaalathrlysthrleu
275027552760
proasnglyargaspalaleuaspglyproalaalaglualaglu
276527702775
progluhisserpheaspglyleuargarglysvalseralagln
278027852790
argleuglnglualaglyileleuseralaglugluleuglnarg
279528002805
leualaglnglyhisthrthrvalaspgluleualaargargglu
281028152820
aspvalarghistyrleuglnglyargserserilealaglyleu
282528302835
leuleulysalathrasnglulysleuservaltyralaalaleu
284028452850
glnargglnleuleuserproglythralaleuileleuleuglu
285528602865
alaglnalaalaserglypheleuleuaspprovalargasnarg
287028752880
argleuthrvalasnglualavallysgluglyvalvalglypro
288528902895
gluleuhishislysleuleuseralagluargalavalthrgly
290029052910
tyrlysaspprotyrthrglyglnglnileserleupheglnala
291529202925
metglnlysglyleuilevalarggluhisglyileargleuleu
293029352940
glualaglnilealathrglyglyvalileaspprovalhisser
294529502955
hisargvalprovalaspvalalatyrargargglytyrpheasp
296029652970
gluglumetasnargvalleualaaspproseraspaspthrlys
297529802985
glyphepheaspproasnthrhisgluasnleuthrtyrleugln
299029953000
leuleugluargcysvalgluaspprogluthrglyleucysleu
300530103015
leuproleuthrasplysalaalalysglyglygluleuvaltyr
302030253030
thraspserglualaargaspvalpheglulysalathrvalser
303530403045
alapropheglylyspheglnglylysthrvalthriletrpglu
305030553060
ileileasnserglutyrphethralagluglnargargaspleu
306530703075
leuargglnpheargthrglyargilethrvalglulysileile
308030853090
lysileileilethrvalvalglugluglngluglnlysglyarg
309531003105
leucysphegluglyleuargserleuvalproalaalagluleu
311031153120
leugluserargvalileasparggluleutyrglnglnleugln
312531303135
argglygluargservalargaspvalalagluvalaspthrval
314031453150
argargalaleuargglyalaasnvalilealaglyvaltrpleu
315531603165
gluglualaglyglnlysleuseriletyrasnalaleulyslys
317031753180
aspleuleuproseraspmetalavalalaleuleuglualagln
318531903195
alaglythrglyhisileileaspproalathrseralaargleu
320032053210
thrvalaspglualavalargalaglyleuvalglyprogluphe
321532203225
hisglulysleuleuseralaglulysalavalthrglytyrarg
323032353240
aspprotyrthrglyglnservalserleupheglnalaleulys
324532503255
lysglyleuileproarggluglnglyleuargleuleuaspala
326032653270
glnleuserthrglyglyilevalaspproserlysserhisarg
327532803285
valproleuaspvalalacysalaargglycysleuaspgluglu
329032953300
thrserargalaleuseralaproargalaaspalalysalatyr
330533103315
seraspproserthrglygluproalathrtyrglygluleugln
332033253330
glnargcysargproaspglnleuthrglyleuserleuleupro
333533403345
leuserglulysalaalaargalaargglnglugluleutyrser
335033553360
gluleuglnalaarggluthrpheglulysthrprovalgluval
336533703375
provalglyglyphelysglyargthrvalthrvaltrpgluleu
338033853390
ileserserglutyrphethralagluglnargglngluleuleu
339534003405
argglnpheargthrglylysvalthrvalglulysvalilelys
341034153420
ileleuilethrilevalglugluvalgluthrleuargglnglu
342534303435
argleuserpheserglyleuargalaprovalproalaserglu
344034453450
leuleualaserglyvalleuserargalaglnphegluglnleu
345534603465
lysaspglylysthrthrvallysaspleusergluleuglyser
347034753480
valargthrleuleuglnglyserglycysleualaglyiletyr
348534903495
leugluaspthrlysglulysvalseriletyrglualametarg
350035053510
argglyleuleuargalathrthralaalaleuleuleugluala
351535203525
glnalaalathrglypheleuvalaspprovalargasnglnarg
353035353540
leutyrvalhisglualavallysalaglyvalvalglyproglu
354535503555
leuhisgluglnleuleuseralaglulysalavalthrglytyr
356035653570
argaspprotyrserglyserthrileserleupheglnalamet
357535803585
glnlysglyleuvalleuargglnhisglyileargleuleuglu
359035953600
alaglnilealathrglyglyileileaspprovalhisserhis
360536103615
argvalprovalaspvalalatyrglnargglytyrpheserglu
362036253630
glumetasnargvalleualaaspproseraspaspthrlysgly
363536403645
phepheaspproasnthrhisgluasnleuthrtyrargglnleu
365036553660
leugluargcysvalgluaspprogluthrglyleuargleuleu
366536703675
proleulysglyalaglulysalagluvalvalgluthrthrgln
368036853690
valtyrthrgluglugluthrargargalapheglugluthrgln
369537003705
ileaspileproglyglyglyserhisglyglyserthrmetser
371037153720
leutrpgluvalmetglnseraspleuileproglugluglnarg
372537303735
alaglnleumetalaasppheglnalaglyargvalthrlysglu
374037453750
argmetileileileileilegluileileglulysthrgluile
375537603765
ileargglnglnglyleualasertyrasptyrvalargargarg
377037753780
leuthralagluaspleupheglualaargileileserleuglu
378537903795
thrtyrasnleuleuarggluglythrargserleuarggluala
380038053810
leuglualagluseralatrpcystyrleutyrglythrglyser
381538203825
valalaglyvaltyrleuproglyserargglnthrleuserile
383038353840
tyrglnalaleulyslysglyleuleuseralagluvalalaarg
384538503855
leuleuleuglualaglnalaalathrglypheleuleuasppro
386038653870
vallysglygluargleuthrvalaspglualavalarglysgly
387538803885
leuvalglyprogluleuhisaspargleuleuseralagluarg
389038953900
alavalthrglytyrargaspprotyrthrgluglnthrileser
390539103915
leupheglnalametlyslysgluleuileprothrglugluala
392039253930
leuargleuleuaspalaglnleualathrglyglyilevalasp
393539403945
proargleuglyphehisleuproleugluvalalatyrglnarg
395039553960
glytyrleuasnlysaspthrhisaspglnleusergluproser
396539703975
gluvalargsertyrvalaspproserthraspgluargleuser
398039853990
tyrthrglnleuleuargargcysargargaspaspglythrgly
399540004005
glnleuleuleuproleuseraspalaarglysleuthrphearg
401040154020
glyleuarglysglnilethrmetglugluleuvalargsergln
402540304035
valmetaspglualathralaleuglnleuarggluglyleuthr
404040454050
serileglugluvalthrlysasnleuglnlyspheleuglugly
405540604065
thrsercysilealaglyvalphevalaspalathrlysgluarg
407040754080
leuservaltyrglnalametlyslysglyileileargprogly
408540904095
thralaphegluleuleuglualaglnalaalathrglytyrval
410041054110
ileaspproilelysglyleulysleuthrvalgluglualaval
411541204125
argmetglyilevalglyprogluphelysasplysleuleuser
413041354140
alagluargalavalthrglytyrlysaspprotyrserglylys
414541504155
leuileserleupheglnalametlyslysglyleuileleulys
416041654170
asphisglyileargleuleuglualaglnilealathrglygly
417541804185
ileileaspproglugluserhisargleuprovalgluvalala
419041954200
tyrlysargglyleupheaspgluglumetasngluileleuthr
420542104215
aspproseraspaspthrlysglyphepheaspproasnthrglu
422042254230
gluasnleuthrtyrleuglnleumetgluargcysilethrasp
423542404245
proglnthrglyleucysleuleuproleulysglulyslysarg
425042554260
gluarglysthrserserlysserservalarglysargargval
426542704275
valilevalaspprogluthrglylysglumetservaltyrglu
428042854290
alatyrarglysglyleuileasphisglnthrtyrleugluleu
429543004305
sergluglnglucysglutrpglugluilethrileserserser
431043154320
aspglyvalvallyssermetileileaspargargserglyarg
432543304335
glntyraspileaspaspalailealalysasnleuileasparg
434043454350
seralaleuaspglntyrargalaglythrleuserilethrglu
435543604365
phealaaspmetleuserglyasnalaglyglypheargserarg
437043754380
serserservalglysersersersertyrproileserproala
438543904395
valserargthrglnleualasertrpseraspprothrgluglu
440044054410
thrglyprovalalaglyileleuaspthrgluthrleuglulys
441544204425
valserilethrglualamethisargasnleuvalaspasnile
443044354440
thrglyglnargleuleuglualaglnalacysthrglyglyile
444544504455
ileaspproserthrglygluargpheprovalthraspalaval
446044654470
asnlysglyleuvalasplysilemetvalaspargileasnleu
447544804485
alaglnlysalaphecysglyphegluaspproargthrlysthr
449044954500
lysmetseralaalaglnalaleulyslysglytrpleutyrtyr
450545104515
glualaglyglnargpheleugluvalglntyrleuthrglygly
452045254530
leuilegluproaspthrproglyargvalproleuaspgluala
453545404545
leuglnargglythrvalaspalaargthralaglnlysleuarg
455045554560
aspvalglyalatyrserlystyrleuthrcysprolysthrlys
456545704575
leulysilesertyrlysaspalaleuaspargsermetvalglu
458045854590
gluglythrglyleuargleuleuglualaalaalaglnserthr
459546004605
lysglytyrtyrserprotyrservalserglyserglyserthr
461046154620
alaglyserargthrglyserargthrglyserargalaglyser
462546304635
argargglyserpheaspalathrglyserglyphesermetthr
464046454650
phesersersersertyrserserserglytyrglyargargtyr
465546604665
alaserglyserseralaserleuglyglyprogluseralaval
467046754680
ala
<210>2
<211>344
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>2
metargserhishishishishishishishishishisargsergly
151015
thrglyaspaspaspasplysalametalaaspileglysergluphe
202530
gluleuargargglnalacysglypheargserargserserserval
354045
glysersersersertyrproileserproalavalserargthrgln
505560
leualasertrpseraspprothrglugluthrglyprovalalagly
65707580
ileleuaspthrgluthrleuglulysvalserilethrglualamet
859095
hisargasnleuvalaspasnilethrglyglnargleuleugluala
100105110
glnalacysthrglyglyileileaspproserthrglygluargphe
115120125
provalthraspalavalasnlysglyleuvalasplysilemetval
130135140
aspargileasnleualaglnlysalaphecysglyphegluasppro
145150155160
argthrlysthrlysmetseralaalaglnalaleulyslysglytrp
165170175
leutyrtyrglualaglyglnargpheleugluvalglntyrleuthr
180185190
glyglyleuilegluproaspthrproglyargvalproleuaspglu
195200205
alaleuglnargglythrvalaspalaargthralaglnlysleuarg
210215220
aspvalglyalatyrserlystyrleuthrcysprolysthrlysleu
225230235240
lysilesertyrlysaspalaleuaspargsermetvalgluglugly
245250255
thrglyleuargleuleuglualaalaalaglnserthrlysglytyr
260265270
tyrserprotyrservalserglyserglyserthralaglyserarg
275280285
thrglyserargthrglyserargalaglyserargargglyserphe
290295300
aspalathrglyserglyphesermetthrphesersersersertyr
305310315320
serserserglytyrglyargargtyralaserglyserserserleu
325330335
glyglyprogluseralavalala
340
<210>3
<211>540
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>3
metserproileleuglytyrtrplysilelysglyleuvalglnpro
151015
thrargleuleuleuglutyrleugluglulystyrglugluhisleu
202530
tyrgluargaspgluglyasplystrpargasnlyslysphegluleu
354045
glyleuglupheproasnleuprotyrtyrileaspglyaspvallys
505560
leuthrglnsermetalaileileargtyrilealaasplyshisasn
65707580
metleuglyglycysprolysgluargalagluilesermetleuglu
859095
glyalavalleuaspileargtyrglyvalserargilealatyrser
100105110
lysaspphegluthrleulysvalasppheleuserlysleuproglu
115120125
metleulysmetphegluaspargleucyshislysthrtyrleuasn
130135140
glyasphisvalthrhisproaspphemetleutyraspalaleuasp
145150155160
valvalleutyrmetaspprometcysleuaspalapheprolysleu
165170175
valcysphelyslysargileglualaileproglnileasplystyr
180185190
leulysserserlystyrilealatrpproleuglnglytrpglnala
195200205
thrpheglyglyglyasphisproprolysseraspleuvalproarg
210215220
glysergluphegluleuargargglnalacysglypheargserarg
225230235240
serserservalglysersersersertyrproileserproalaval
245250255
serargthrglnleualasertrpseraspprothrglugluthrgly
260265270
provalalaglyileleuaspthrgluthrleuglulysvalserile
275280285
thrglualamethisargasnleuvalaspasnilethrglyglnarg
290295300
leuleuglualaglnalacysthrglyglyileileaspproserthr
305310315320
glygluargpheprovalthraspalavalasnlysglyleuvalasp
325330335
lysilemetvalaspargileasnleualaglnlysalaphecysgly
340345350
phegluaspproargthrlysthrlysmetseralaalaglnalaleu
355360365
lyslysglytrpleutyrtyrglualaglyglnargpheleugluval
370375380
glntyrleuthrglyglyleuilegluproaspthrproglyargval
385390395400
proleuaspglualaleuglnargglythrvalaspalaargthrala
405410415
glnlysleuargaspvalglyalatyrserlystyrleuthrcyspro
420425430
lysthrlysleulysilesertyrlysaspalaleuaspargsermet
435440445
valglugluglythrglyleuargleuleuglualaalaalaglnser
450455460
thrlysglytyrtyrserprotyrservalserglyserglyserthr
465470475480
alaglyserargthrglyserargthrglyserargalaglyserarg
485490495
argglyserpheaspalathrglyserglyphesermetthrpheser
500505510
sersersertyrserserserglytyrglyargargtyralasergly
515520525
serserserleuglyglyprogluseralavalala
530535540
<210>4
<211>1398
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>4
atgaacttcgggctcagcttgattttccttgccctcattttaaaaggtgtccagtgtgag60
gtgcagctggtggagtctgggggagacttggtgaagcctggagggtccctgaaactctcc120
tgtgcagcctctggattcactttcagtaggtatggcatgtcttgggttcgccagactcca180
gacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtattggtggtacttacacctactatcca240
gacagtatgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctg300
caaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagacgggggtat360
ggtaactactcttactatggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcc420
tcagccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaact480
aactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtg540
acctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtct600
gacctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagacc660
gtcacctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgccc720
agggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatc780
ttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgtt840
gtggtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtg900
gaggtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctca960
gtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagg1020
gtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcaga1080
ccgaaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaa1140
gtcagtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcag1200
tggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggc1260
tcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatact1320
ttcacctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcc1380
cactctcctggtaaatga1398
<210>5
<211>57
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>5
atgaacttcgggctcagcttgattttccttgccctcattttaaaaggtgtccagtgt57
<210>6
<211>90
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>6
gaggtgcagctggtggagtctgggggagacttggtgaagcctggagggtccctgaaactc60
tcctgtgcagcctctggattcactttcagt90
<210>7
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>7
aggtatggcatgtct15
<210>8
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>8
tgggttcgccagactccagacaagaggctggagtgggtcgca42
<210>9
<211>51
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>9
accattagtattggtggtacttacacctactatccagacagtatgaagggg51
<210>10
<211>96
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>10
cgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtacctgcaaatgagcagtctg60
aagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaaga96
<210>11
<211>39
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>11
cgggggtatggtaactactcttactatggtatggactac39
<210>12
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>12
tggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctca33
<210>13
<211>366
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>13
gaggtgcagctggtggagtctgggggagacttggtgaagcctggagggtccctgaaactc60
tcctgtgcagcctctggattcactttcagtaggtatggcatgtcttgggttcgccagact120
ccagacaagaggctggagtgggtcgcaaccattagtattggtggtacttacacctactat180
ccagacagtatgaaggggcgattcaccatctccagagacaatgccaagaacaccctgtac240
ctgcaaatgagcagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgcaagacggggg300
tatggtaactactcttactatggtatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtc360
tcctca366
<210>14
<211>972
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>14
gccaaaacgacacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaactaac60
tccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgagccagtgacagtgacc120
tggaactctggatccctgtccagcggtgtgcacaccttcccagctgtcctgcagtctgac180
ctctacactctgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtc240
acctgcaacgttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgcccagg300
gattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatcatctgtcttcatcttc360
cccccaaagcccaaggatgtgctcaccattactctgactcctaaggtcacgtgtgttgtg420
gtagacatcagcaaggatgatcccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggag480
gtgcacacagctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctcagtc540
agtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggagttcaaatgcagggtc600
aacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaaggcagaccg660
aaggctccacaggtgtacaccattccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtc720
agtctgacctgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcagtgg780
aatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatggacacagatggctct840
tacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaagagcaactgggaggcaggaaatactttc900
acctgctctgtgttacatgagggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccac960
tctcctggtaaa972
<210>15
<211>201
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>15
metasnpheglyleuserleuilepheleualaleuileleulysgly
151015
valglncysgluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallys
202530
proglyglyserleulysleusercysalaalaserglyphethrphe
354045
serargtyrglymetsertrpvalargglnthrproasplysargleu
505560
glutrpvalalathrileserileglyglythrtyrthrtyrtyrpro
65707580
aspsermetlysglyargphethrileserargaspasnalalysasn
859095
thrleutyrleuglnmetserserleulyssergluaspthralamet
100105110
tyrtyrcysalaargargglytyrglyasntyrsertyrtyrglymet
115120125
asptyrtrpglyglnglythrservalthrvalserseralalysthr
130135140
thrproproservaltyrproleualaproglyseralaalaglnthr
145150155160
asnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyrpheproglu
165170175
provalthrvalthrtrpasnserglyserleuserserglyvalhis
180185190
thrpheproalavalleuglnserasp
195200
<210>16
<211>19
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>16
metasnpheglyleuserleuilepheleualaleuileleulysgly
151015
valglncys
<210>17
<211>30
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>17
gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly
151015
serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheser
202530
<210>18
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>18
argtyrglymetser
15
<210>19
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>19
trpvalargglnthrproasplysargleuglutrpvalala
1510
<210>20
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>20
thrileserileglyglythrtyrthrtyrtyrproaspsermetlys
151015
gly
<210>21
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>21
argphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyrleugln
151015
metserserleulyssergluaspthralamettyrtyrcysalaarg
202530
<210>22
<211>13
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>22
argglytyrglyasntyrsertyrtyrglymetasptyr
1510
<210>23
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>23
trpglyglnglythrservalthrvalserser
1510
<210>24
<211>122
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>24
gluvalglnleuvalgluserglyglyaspleuvallysproglygly
151015
serleulysleusercysalaalaserglyphethrpheserargtyr
202530
glymetsertrpvalargglnthrproasplysargleuglutrpval
354045
alathrileserileglyglythrtyrthrtyrtyrproaspsermet
505560
lysglyargphethrileserargaspasnalalysasnthrleutyr
65707580
leuglnmetserserleulyssergluaspthralamettyrtyrcys
859095
alaargargglytyrglyasntyrsertyrtyrglymetasptyrtrp
100105110
glyglnglythrservalthrvalserser
115120
<210>25
<211>324
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>25
alalysthrthrproproservaltyrproleualaproglyserala
151015
alaglnthrasnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyr
202530
pheprogluprovalthrvalthrtrpasnserglyserleuserser
354045
glyvalhisthrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleu
505560
serserservalthrvalproserserthrtrpprosergluthrval
65707580
thrcysasnvalalahisproalaserserthrlysvalasplyslys
859095
ilevalproargaspcysglycyslysprocysilecysthrvalpro
100105110
gluvalserservalpheilepheproprolysprolysaspvalleu
115120125
thrilethrleuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspileser
130135140
lysaspaspprogluvalglnphesertrpphevalaspaspvalglu
145150155160
valhisthralaglnthrglnproargglugluglnpheasnserthr
165170175
pheargservalsergluleuproilemethisglnasptrpleuasn
180185190
glylysgluphelyscysargvalasnseralaalapheproalapro
195200205
ileglulysthrileserlysthrlysglyargprolysalaprogln
210215220
valtyrthrileproproprolysgluglnmetalalysasplysval
225230235240
serleuthrcysmetilethraspphepheprogluaspilethrval
245250255
glutrpglntrpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthrgln
260265270
proilemetaspthraspglysertyrphevaltyrserlysleuasn
275280285
valglnlysserasntrpglualaglyasnthrphethrcysserval
290295300
leuhisgluglyleuhisasnhishisthrglulysserleuserhis
305310315320
serproglylys
<210>26
<211>720
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>26
atgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgca60
gatattgtgatgacgcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttcc120
atctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattgg180
tatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcc240
tcaggagtcccagacaggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatc300
agcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctcaaaatctagaacttccg360
ctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgta420
tccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttc480
ttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacga540
caaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatg600
agcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgag660
gccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag720
<210>27
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>27
atgaggttctctgctcagcttctggggctgcttgtgctctggatccctggatccactgca60
<210>28
<211>69
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>28
gatattgtgatgacgcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttcc60
atctcctgc69
<210>29
<211>48
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>29
aggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtat48
<210>30
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>30
tggtatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttat45
<210>31
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>31
cagatgtccaaccttgcctca21
<210>32
<211>96
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>32
ggagtcccagacaggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatcagc60
agagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgt96
<210>33
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>33
gctcaaaatctagaacttccgctcacg27
<210>34
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>34
ttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa30
<210>35
<211>336
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>35
gatattgtgatgacgcaggctgcattctccaatccagtcactcttggaacatcagcttcc60
atctcctgcaggtctagtaagagtctcctacatagtaatggcatcacttatttgtattgg120
tatctgcagaagccaggccagtctcctcagctcctgatttatcagatgtccaaccttgcc180
tcaggagtcccagacaggttcagtagcagtgggtcaggaactgatttcacactgagaatc240
agcagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtgctcaaaatctagaacttccg300
ctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa336
<210>36
<211>382
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>36
ctgtgctcaaaatctagaacttccgctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaa60
acgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatc120
tggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaa180
gtggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcagga240
cagcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatga300
acgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaa360
gagcttcaacaggaatgagtgt382
<210>37
<211>239
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>37
metargpheseralaglnleuleuglyleuleuvalleutrpilepro
151015
glyserthralaaspilevalmetthrglnalaalapheserasnpro
202530
valthrleuglythrseralaserilesercysargserserlysser
354045
leuleuhisserasnglyilethrtyrleutyrtrptyrleuglnlys
505560
proglyglnserproglnleuleuiletyrglnmetserasnleuala
65707580
serglyvalproaspargpheserserserglyserglythraspphe
859095
thrleuargileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyr
100105110
cysalaglnasnleugluleuproleuthrpheglyalaglythrlys
115120125
leugluleulysargalaaspalaalaprothrvalserilephepro
130135140
prosersergluglnleuthrserglyglyalaservalvalcysphe
145150155160
leuasnasnphetyrprolysaspileasnvallystrplysileasp
165170175
glysergluargglnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnasp
180185190
serlysaspserthrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlys
195200205
aspglutyrgluarghisasnsertyrthrcysglualathrhislys
210215220
thrserthrserproilevallysserpheasnargasnglucys
225230235
<210>38
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>38
metargpheseralaglnleuleuglyleuleuvalleutrpilepro
151015
glyserthrala
20
<210>39
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>39
aspilevalmetthrglnalaalapheserasnprovalthrleugly
151015
thrseralaserilesercys
20
<210>40
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>40
argserserlysserleuleuhisserasnglyilethrtyrleutyr
151015
<210>41
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>41
trptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyr
151015
<210>42
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>42
glnmetserasnleualaser
15
<210>43
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>43
glyvalproaspargpheserserserglyserglythraspphethr
151015
leuargileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys
202530
<210>44
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>44
alaglnasnleugluleuproleuthr
15
<210>45
<211>10
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>45
pheglyalaglythrlysleugluleulys
1510
<210>46
<211>112
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>46
aspilevalmetthrglnalaalapheserasnprovalthrleugly
151015
thrseralaserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyilethrtyrleutyrtrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrglnmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserserserglyserglythraspphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysalaglnasn
859095
leugluleuproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulys
100105110
<210>47
<211>107
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>47
argalaaspalaalaprothrvalserilepheproproserserglu
151015
glnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphe
202530
tyrprolysaspileasnvallystrplysileaspglysergluarg
354045
glnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspser
505560
thrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrglu
65707580
arghisasnsertyrthrcysglualathrhislysthrserthrser
859095
proilevallysserpheasnargasnglucys
100105
<210>48
<211>1410
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>48
atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtatccaagcacag60
atccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatctcc120
tgcaaggcttctggttataccttcacagactattcaatgcactgggtgaagcaggctcca180
ggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacactgagactggtgagccaacatatgca240
gatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttg300
cagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcccccggagggttt360
gcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgcagccaaaacaacacccccatca420
gtctatccactggcccctgggtgtggagatacaactggttcctccgtgactctgggatgc480
ctggtcaagggctacttccctgagtcagtgactgtgacttggaactctggatccctgtcc540
agcagtgtgcacaccttcccagctctcctgcagtctggactctacactatgagcagctca600
gtgactgtcccctccagcacctggccaagtcagaccgtcacctgcagcgttgctcaccca660
gccagcagcaccacggtggacaaaaaacttgagcccagcgggcccatttcaacaatcaac720
ccctgtcctccatgcaaggagtgtcacaaatgcccagctcctaacctcgagggtggacca780
tccgtcttcatcttccctccaaatatcaaggatgtactcatgatctccctgacacccaag840
gtcacgtgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagacgtccagatcagctggttt900
gtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagaggattacaacagt960
actatccgggtggtcagcaccctccccatccagcaccaggactggatgagtggcaaggag1020
ttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccatcacccatcgagagaaccatctcaaaa1080
attaaagggctagtcagagctccacaagtatacatcttgccgccaccagcagagcagttg1140
tccaggaaagatgtcagtctcacttgcctggtcgtgggcttcaaccctggagacatcagt1200
gtggagtggaccagcaatgggcatacagaggagaactacaaggacaccgcaccagtcctg1260
gactctgacggttcttacttcatatatagcaagctcaatatgaaaacaagcaagtgggag1320
aaaacagattccttctcatgcaacgtgagacacgagggtctgaaaaattactacctgaag1380
aagaccatctcccggtctccgggtaaatga1410
<210>49
<211>57
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>49
atggcttgggtgtggaccttgctattcctgatggcagctgcccaaagtatccaagca57
<210>50
<211>90
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>50
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatc60
tcctgcaaggcttctggttataccttcaca90
<210>51
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>51
gactattcaatgcac15
<210>52
<211>42
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>52
tgggtgaagcaggctccaggaaagggtttaaagtggatgggc42
<210>53
<211>51
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>53
tggataaacactgagactggtgagccaacatatgcagatgacttcaaggga51
<210>54
<211>96
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>54
cggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctatttgcagatcaacaacctc60
aaaaatgaggacacggctacatatttctgtgccccc96
<210>55
<211>15
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>55
ggagggtttgcttac15
<210>56
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>56
tggggccaagggactctggtcactgtctctgca33
<210>57
<211>342
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>57
cagatccagttggtgcagtctggacctgagctgaagaagcctggagagacagtcaagatc60
tcctgcaaggcttctggttataccttcacagactattcaatgcactgggtgaagcaggct120
ccaggaaagggtttaaagtggatgggctggataaacactgagactggtgagccaacatat180
gcagatgacttcaagggacggtttgccttctctttggaaacctctgccagcactgcctat240
ttgcagatcaacaacctcaaaaatgaggacacggctacatatttctgtgcccccggaggg300
tttgcttactggggccaagggactctggtcactgtctctgca342
<210>58
<211>1008
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>58
gccaaaacaacacccccatcagtctatccactggcccctgggtgtggagatacaactggt60
tcctccgtgactctgggatgcctggtcaagggctacttccctgagtcagtgactgtgact120
tggaactctggatccctgtccagcagtgtgcacaccttcccagctctcctgcagtctgga180
ctctacactatgagcagctcagtgactgtcccctccagcacctggccaagtcagaccgtc240
acctgcagcgttgctcacccagccagcagcaccacggtggacaaaaaacttgagcccagc300
gggcccatttcaacaatcaacccctgtcctccatgcaaggagtgtcacaaatgcccagct360
cctaacctcgagggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaatatcaaggatgtactc420
atgatctccctgacacccaaggtcacgtgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgaccca480
gacgtccagatcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacc540
catagagaggattacaacagtactatccgggtggtcagcaccctccccatccagcaccag600
gactggatgagtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctcccatcaccc660
atcgagagaaccatctcaaaaattaaagggctagtcagagctccacaagtatacatcttg720
ccgccaccagcagagcagttgtccaggaaagatgtcagtctcacttgcctggtcgtgggc780
ttcaaccctggagacatcagtgtggagtggaccagcaatgggcatacagaggagaactac840
aaggacaccgcaccagtcctggactctgacggttcttacttcatatatagcaagctcaat900
atgaaaacaagcaagtgggagaaaacagattccttctcatgcaacgtgagacacgagggt960
ctgaaaaattactacctgaagaagaccatctcccggtctccgggtaaa1008
<210>59
<211>469
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>59
metalatrpvaltrpthrleuleupheleumetalaalaalaglnser
151015
ileglnalaglnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslys
202530
proglygluthrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphe
354045
thrasptyrsermethistrpvallysglnalaproglylysglyleu
505560
lystrpmetglytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyrala
65707580
aspaspphelysglyargphealapheserleugluthrseralaser
859095
thralatyrleuglnileasnasnleulysasngluaspthralathr
100105110
tyrphecysalaproglyglyphealatyrtrpglyglnglythrleu
115120125
valthrvalseralaalalysthrthrproproservaltyrproleu
130135140
alaproglycysglyaspthrthrglyserservalthrleuglycys
145150155160
leuvallysglytyrpheprogluservalthrvalthrtrpasnser
165170175
glyserleuserserservalhisthrpheproalaleuleuglnser
180185190
glyleutyrthrmetserserservalthrvalproserserthrtrp
195200205
proserglnthrvalthrcysservalalahisproalaserserthr
210215220
thrvalasplyslysleugluproserglyproileserthrileasn
225230235240
procysproprocyslysglucyshislyscysproalaproasnleu
245250255
gluglyglyproservalpheilepheproproasnilelysaspval
260265270
leumetileserleuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspval
275280285
sergluaspaspproaspvalglnilesertrpphevalasnasnval
290295300
gluvalhisthralaglnthrglnthrhisarggluasptyrasnser
305310315320
thrileargvalvalserthrleuproileglnhisglnasptrpmet
325330335
serglylysgluphelyscyslysvalasnasnlysaspleuproser
340345350
proilegluargthrileserlysilelysglyleuvalargalapro
355360365
glnvaltyrileleuproproproalagluglnleuserarglysasp
370375380
valserleuthrcysleuvalvalglypheasnproglyaspileser
385390395400
valglutrpthrserasnglyhisthrglugluasntyrlysaspthr
405410415
alaprovalleuaspseraspglysertyrpheiletyrserlysleu
420425430
asnmetlysthrserlystrpglulysthraspserphesercysasn
435440445
valarghisgluglyleulysasntyrtyrleulyslysthrileser
450455460
argserproglylys
465
<210>60
<211>19
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>60
metalatrpvaltrpthrleuleupheleumetalaalaalaglnser
151015
ileglnala
<210>61
<211>30
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>61
glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu
151015
thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethr
202530
<210>62
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>62
asptyrsermethis
15
<210>63
<211>14
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>63
trpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmetgly
1510
<210>64
<211>17
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>64
trpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphelys
151015
gly
<210>65
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>65
argphealapheserleugluthrseralaserthralatyrleugln
151015
ileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecysalapro
202530
<210>66
<211>5
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>66
glyglyphealatyr
15
<210>67
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>67
trpglyglnglythrleuvalthrvalserala
1510
<210>68
<211>114
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>68
glnileglnleuvalglnserglyprogluleulyslysproglyglu
151015
thrvallysilesercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr
202530
sermethistrpvallysglnalaproglylysglyleulystrpmet
354045
glytrpileasnthrgluthrglygluprothrtyralaaspaspphe
505560
lysglyargphealapheserleugluthrseralaserthralatyr
65707580
leuglnileasnasnleulysasngluaspthralathrtyrphecys
859095
alaproglyglyphealatyrtrpglyglnglythrleuvalthrval
100105110
serala
<210>69
<211>336
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>69
alalysthrthrproproservaltyrproleualaproglycysgly
151015
aspthrthrglyserservalthrleuglycysleuvallysglytyr
202530
pheprogluservalthrvalthrtrpasnserglyserleuserser
354045
servalhisthrpheproalaleuleuglnserglyleutyrthrmet
505560
serserservalthrvalproserserthrtrpproserglnthrval
65707580
thrcysservalalahisproalaserserthrthrvalasplyslys
859095
leugluproserglyproileserthrileasnprocysproprocys
100105110
lysglucyshislyscysproalaproasnleugluglyglyproser
115120125
valpheilepheproproasnilelysaspvalleumetileserleu
130135140
thrprolysvalthrcysvalvalvalaspvalsergluaspasppro
145150155160
aspvalglnilesertrpphevalasnasnvalgluvalhisthrala
165170175
glnthrglnthrhisarggluasptyrasnserthrileargvalval
180185190
serthrleuproileglnhisglnasptrpmetserglylysgluphe
195200205
lyscyslysvalasnasnlysaspleuproserproilegluargthr
210215220
ileserlysilelysglyleuvalargalaproglnvaltyrileleu
225230235240
proproproalagluglnleuserarglysaspvalserleuthrcys
245250255
leuvalvalglypheasnproglyaspileservalglutrpthrser
260265270
asnglyhisthrglugluasntyrlysaspthralaprovalleuasp
275280285
seraspglysertyrpheiletyrserlysleuasnmetlysthrser
290295300
lystrpglulysthraspserphesercysasnvalarghisglugly
305310315320
leulysasntyrtyrleulyslysthrileserargserproglylys
325330335
<210>70
<211>720
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>70
atgaggtgcctagctgagttcctggggctgcttgtgctctggatccctggagccattggg60
gatattgtgatgactcaggctgcaccctctgtacctgtcactcctggagagtcagtatcc120
atctcctgcaggtctagtaagagtctcctgcatagtaatggcaacacttacttgtattgg180
ttcctgcagaggccaggccagtctcctcagctcctgatatatcggatgtccaaccttgcc240
tcaggagtcccagacaggttcagtggcagtgggtcaggaactgctttcacactgagaatc300
agtagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtatgcaacatctagaatatccg360
ctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaacgggctgatgctgcaccaactgta420
tccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttc480
ttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggcagtgaacga540
caaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagcaaagacagcacctacagcatg600
agcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaacgacataacagctatacctgtgag660
gccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgttag720
<210>71
<211>60
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>71
atgaggtgcctagctgagttcctggggctgcttgtgctctggatccctggagccattggg60
<210>72
<211>69
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>72
gatattgtgatgactcaggctgcaccctctgtacctgtcactcctggagagtcagtatcc60
atctcctgc69
<210>73
<211>48
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>73
aggtctagtaagagtctcctgcatagtaatggcaacacttacttgtat48
<210>74
<211>45
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>74
tggttcctgcagaggccaggccagtctcctcagctcctgatatat45
<210>75
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>75
cggatgtccaaccttgcctca21
<210>76
<211>96
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>76
ggagtcccagacaggttcagtggcagtgggtcaggaactgctttcacactgagaatcagt60
agagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgt96
<210>77
<211>27
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>77
atgcaacatctagaatatccgctcacg27
<210>78
<211>30
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>78
ttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa30
<210>79
<211>336
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>79
gatattgtgatgactcaggctgcaccctctgtacctgtcactcctggagagtcagtatcc60
atctcctgcaggtctagtaagagtctcctgcatagtaatggcaacacttacttgtattgg120
ttcctgcagaggccaggccagtctcctcagctcctgatatatcggatgtccaaccttgcc180
tcaggagtcccagacaggttcagtggcagtgggtcaggaactgctttcacactgagaatc240
agtagagtggaggctgaggatgtgggtgtttattactgtatgcaacatctagaatatccg300
ctcacgttcggtgctgggaccaagctggagctgaaa336
<210>80
<211>321
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多核苷酸
<400>80
cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatct60
ggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaag120
tggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggac180
agcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaa240
cgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaag300
agcttcaacaggaatgagtgt321
<210>81
<211>239
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>81
metargcysleualaglupheleuglyleuleuvalleutrpilepro
151015
glyalaileglyaspilevalmetthrglnalaalaproservalpro
202530
valthrproglygluservalserilesercysargserserlysser
354045
leuleuhisserasnglyasnthrtyrleutyrtrppheleuglnarg
505560
proglyglnserproglnleuleuiletyrargmetserasnleuala
65707580
serglyvalproaspargpheserglyserglyserglythralaphe
859095
thrleuargileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyr
100105110
cysmetglnhisleuglutyrproleuthrpheglyalaglythrlys
115120125
leugluleulysargalaaspalaalaprothrvalserilephepro
130135140
prosersergluglnleuthrserglyglyalaservalvalcysphe
145150155160
leuasnasnphetyrprolysaspileasnvallystrplysileasp
165170175
glysergluargglnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnasp
180185190
serlysaspserthrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlys
195200205
aspglutyrgluarghisasnsertyrthrcysglualathrhislys
210215220
thrserthrserproilevallysserpheasnargasnglucys
225230235
<210>82
<211>20
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>82
metargcysleualaglupheleuglyleuleuvalleutrpilepro
151015
glyalailegly
20
<210>83
<211>23
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>83
aspilevalmetthrglnalaalaproservalprovalthrprogly
151015
gluservalserilesercys
20
<210>84
<211>16
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>84
argserserlysserleuleuhisserasnglyasnthrtyrleutyr
151015
<210>85
<211>15
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>85
trppheleuglnargproglyglnserproglnleuleuiletyr
151015
<210>86
<211>7
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>86
argmetserasnleualaser
15
<210>87
<211>32
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>87
glyvalproaspargpheserglyserglyserglythralaphethr
151015
leuargileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcys
202530
<210>88
<211>9
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>88
metglnhisleuglutyrproleuthr
15
<210>89
<211>11
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>89
pheglyalaglythrlysleugluleulysarg
1510
<210>90
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>90
aspilevalmetthrglnalaalaproservalprovalthrprogly
151015
gluservalserilesercysargserserlysserleuleuhisser
202530
asnglyasnthrtyrleutyrtrppheleuglnargproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrargmetserasnleualaserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythralaphethrleuargile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcysmetglnhis
859095
leuglutyrproleuthrpheglyalaglythrlysleugluleulys
100105110
arg
<210>91
<211>106
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>91
alaaspalaalaprothrvalserilepheproproserserglugln
151015
leuthrserglyglyalaservalvalcyspheleuasnasnphetyr
202530
prolysaspileasnvallystrplysileaspglysergluarggln
354045
asnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspserlysaspserthr
505560
tyrsermetserserthrleuthrleuthrlysaspglutyrgluarg
65707580
hisasnsertyrthrcysglualathrhislysthrserthrserpro
859095
ilevallysserpheasnargasnglucys
100105
<210>92
<211>364
<212>prt
<213>智人（homosapiens）
<400>92
serserseraspglyvalvallyssermetileileaspargargser
151015
glyargglntyraspileaspaspalailealalysasnleuileasp
202530
argseralaleuaspglntyrargalaglythrleuserilethrglu
354045
phealaaspmetleuserglyasnalaglyglypheargserargser
505560
serservalglysersersersertyrproileserproalavalser
65707580
argthrglnleualasertrpseraspprothrglugluthrglypro
859095
valalaglyileleuaspthrgluthrleuglulysvalserilethr
100105110
glualamethisargasnleuvalaspasnilethrglyglnargleu
115120125
leuglualaglnalacysthrglyglyileileaspproserthrgly
130135140
gluargpheprovalthraspalavalasnlysglyleuvalasplys
145150155160
ilemetvalaspargileasnleualaglnlysalaphecysglyphe
165170175
gluaspproargthrlysthrlysmetseralaalaglnalaleulys
180185190
lysglytrpleutyrtyrglualaglyglnargpheleugluvalgln
195200205
tyrleuthrglyglyleuilegluproaspthrproglyargvalpro
210215220
leuaspglualaleuglnargglythrvalaspalaargthralagln
225230235240
lysleuargaspvalglyalatyrserlystyrleuthrcysprolys
245250255
thrlysleulysilesertyrlysaspalaleuaspargsermetval
260265270
glugluglythrglyleuargleuleuglualaalaalaglnserthr
275280285
lysglytyrtyrserprotyrservalserglyserglyserthrala
290295300
glyserargthrglyserargthrglyserargalaglyserargarg
305310315320
glyserpheaspalathrglyserglyphesermetthrpheserser
325330335
sersertyrserserserglytyrglyargargtyralaserglyser
340345350
seralaserleuglyglyprogluseralavalala
355360
<210>93
<211>4
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成的多肽
<400>93
glyglyglyser
1
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！