抗菌组合物的制作方法
本发明一般性地涉及有效预防或治疗细菌感染的水杨酰胺化合物与提高细菌细胞膜通透性的物质的组合及其组合物。
背景技术：
普遍预期多重抗药细菌的兴起会是21世纪人类面临的最大的健康问题(boucher等人(2009)clinicalinfectiousdiseases48(1)：1-12；piddock(2012)lancetinfectdis.12(3)：249-53)。临床医生已经常面对抗生素抗药性的病例，以前简单治疗的感染变得更加困难，并且在一些情况下是无法治疗的。几乎所有类别的抗生素都是在1970年之前被发现，并且在过去30年中，未开发出新的主要类别的抗生素。近期对于新的抗生素疗法的大部分进展在抗生素类别内，通过开发已知抗生素的类似物来进行。然而，抗药性机制已发展到使得现在整个类别的抗生素对某些细菌都是无效的。
为了降低抗生素抗药性率，正在采取更多的措施来限制感染的传播和发病率，连同关于正确使用抗生素的教育，以及限制其以促进感染发展的方式使用。然而，仍然需要新的抗生素，特别是针对革兰氏阴性细菌(其代表显著比例的传染病负担)有效的抗生素。
氯硝柳胺(n-(2′-氯-4′-硝基苯基)-5-氯水杨酰胺)是水杨苯胺化合物。在20世纪50年代，在针对蜗牛光滑双脐螺(biomphalariaglabrata)筛选20,000种化合物并结构优化后，水杨苯胺被鉴定为可用于杀死蜗牛(
decarvalho等人还调查了氯硝柳胺和结构类似物硝唑沙奈针对结核分枝杆菌的功效(decarvalho等人(2011)acsmedicinalchemistryletters2(11)：849-854)。他们表明氯硝柳胺和硝唑沙奈使结核分枝杆菌的膜电位解偶联，而对照利福平则不能。
在近期为鉴定在抑制耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)生长中具备活性的化合物而对可商购fda批准药物库进行的筛选中，lau等人表明氯硝柳胺是一种有效的抗mrsa药物，在所用测定条件下具有亚微摩尔最小抑制浓度(lau等人，(2015)antibiotics(basel)，4(4)：424-34)。
rajamuthiah等人也发现氯硝柳胺和相关的水杨苯胺驱肠虫药羟氯扎胺也对mrsa以及另一种革兰氏阳性细菌屎肠球菌(enterococcusfaecium)有直接毒性(rajamuthiah等人，(2015)plosone，10(4)：e0124595)。此项工作的启发来源于作者的早先发现，即另一种相关的水杨苯胺化合物氯生太尔也对mrsa有活性(rajamuthiah等人，(2014)plosone9(2)：e89189)。但是，rajamuthiah等人特别注意到，氯硝柳胺和羟氯扎胺在抑制任何受试革兰氏阴性细菌株(即肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)、鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)和产气肠杆菌(enterobacteraerogenes))的生长中均没有活性。
imperi等人最近研究了氯硝柳胺作为革兰氏阴性发病机制的间接抑制剂的潜力，他们筛选了fda批准的药物，以鉴定铜绿假单胞菌中的细菌群体感应系统的任何抑制剂(imperi等人(2013)antimicrobialagentschemotherapy57(2)：996-1005)。在所测试的药物中，氯硝柳胺显示出最高的抗细菌群体感应活性。进一步分析确定氯硝柳胺能够抑制对细菌群体感应信号的响应，而不是信号分子的合成。然而，作者并未考虑氯硝柳胺的直接毒性作用，并且他们的数据与氯硝柳胺对于铜绿假单胞菌具有任何直接地毒性作用不一致。实际上，在所报告的检测中(例如图2a)，氯硝柳胺不能够抑制铜绿假单胞菌的生长。
申请人最近发现，当氯硝柳胺和相关的水杨酰胺与外排泵抑制剂(例如tolc外排泵抑制剂联合给药时(pct/nz2015/050192；未公开)，其令人惊讶地对革兰氏阴性细菌具有直接毒性。该发现对于细菌学领域的研究人员中是未知的，并且代表着开发针对革兰氏阴性细菌的组合疗法的显著进步。
涉及利用协同作用机制治疗的组合疗法是对抗抗生素抗药性增加的最有前景的策略之一(lee等人，(2016)jpharmsci105：1501-1512)。联合疗法有两个最主要的有利特征：(1)协同效应，其中两种化合物的组合效应大于其各自效应的加和，例如，与dna合成抑制剂组合的靶向细胞膜完整性的疗法(michail等人，(2013)antimicrobialagentsandchemotherapy57：6028-6033)或靶向蛋白质合成的抗生素(rodríguez-avial等人，(2015)int.j.antimicrob.agents46：616-621)；以及(2)抗药性出现减少，即对两种药物抗药性的可能性低于在单个疗法中的抗药性(lee等人(2009)，j.clin.microbiol.47：1611-1612，khameneh等人，(2016)microb.pathog.95:32-42)。
鉴于抗生素抗药性对人类和动物健康的重大风险，需要开发新型药物/抗菌方法来治疗和预防感染。还需要减轻我们作为终极手段的现存药物的毒性。
本发明寻求通过提供包含水杨酰胺化合物与提高细菌细胞膜通透性的物质的组合物和组合产品来解决这些需求。
发明概述
本文中描述且请求保护的发明具有很多属性和实施方案，其包括但不限于在该发明概述中说明或描述或提及的那些。其不意图是包含所有的，并且本文中描述且请求保护的发明不限于或受限于该发明概述中鉴定的特征或实施方案，包含所述特征或实施方案仅为了说明的目的，而非限制。
在一个方面，本发明提供药物组合物，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含羟氯扎胺和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含硝唑沙奈和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯生太尔和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物的定义如下：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含羟氯扎胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含硝唑沙奈和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯生太尔和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在另一方面，本发明提供组合产品，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供协同组合，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在另一方面，本发明提供抗菌剂，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供组合物(包括生物组合物)，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含羟氯扎胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含硝唑沙奈和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯生太尔和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含羟氯扎胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含硝唑沙奈和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯生太尔和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供如本文中所述的药物组合物或者如本文中所述的组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物，其用于：
(i)治疗或预防人或非人动物中的细菌感染；或者
(ii)减少或消除细菌生物膜的形成
其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
在又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括给药抗菌有效量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和多粘菌素的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有羟氯扎胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有硝唑沙奈和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯生太尔和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有羟氯扎胺和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有硝唑沙奈和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯生太尔和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
本发明还涵盖药物组合物、组合产品、协同组合、抗菌剂、组合物(包括生物组合物)和制品，其不包含氯硝柳胺和黏菌素。
因此，又一方面，本发明提供药物组合物，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述药物组合物不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
又一方面，本发明提供组合产品，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述组合产品不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供协同组合，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述协同组合不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供抗菌剂，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述抗菌剂不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供组合物(包括生物组合物)，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述组合物不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
又一方面，本发明提供如本文中所述的药物组合物或者如本文中所述的组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物，其用于：
(i)治疗或预防人或非人动物中的细菌感染；或者
(ii)减少或消除细菌生物膜的形成
其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，条件是所述包装材料不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和多粘菌素的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
本发明还涵盖治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其通过向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的氯硝柳胺和黏菌素来进行，条件是导致感染或生物膜形成的所述细菌不是肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)和/或鲍氏不动杆菌(acinetobacterbaumannii)。
因此，又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，并且其中当所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺且所述提高细菌细胞膜通透性的物质是黏菌素时，所述革兰氏阴性细菌不是肺炎克雷伯菌和/或鲍氏不动杆菌。
又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的氯硝柳胺和黏菌素，条件是导致感染或生物膜形成的所述细菌不是肺炎克雷伯菌和/或鲍氏不动杆菌。
附图简要说明
图1示出针对大肠杆菌mg1655的氯硝柳胺/黏菌素协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图2示出氯硝柳胺和黏菌素对大肠杆菌mg1655的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图1中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图1中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图3示出氯硝柳胺/多粘菌素b对大肠杆菌mg1655的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明多粘菌素b和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图4示出氯硝柳胺和多粘菌素b对大肠杆菌mg1655的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图3中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图3中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图5示出氯硝柳胺/黏菌素对大肠杆菌w3110的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的大肠杆菌w3110的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用大肠杆菌w3110的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、200rpm下孵育3小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图6示出氯硝柳胺和黏菌素对大肠杆菌w3110的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图5中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图5中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图7示出氯硝柳胺/多粘菌素b对大肠杆菌w3110的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的大肠杆菌w3110的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用大肠杆菌w3110的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育3小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图8示出氯硝柳胺和多粘菌素b对大肠杆菌w3110的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图7中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图7中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图9示出氯硝柳胺/黏菌素对β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、200rpm下孵育3小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图10示出氯硝柳胺和黏菌素对β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图9中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图9中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图11示出氯硝柳胺/多粘菌素b对β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育3小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图12示出氯硝柳胺和多粘菌素b对β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图11中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图11中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图13示出氯硝柳胺/黏菌素对铜绿假单胞菌pao1的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的铜绿假单胞菌pao1的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用铜绿假单胞菌pao1的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图14示出氯硝柳胺和黏菌素对铜绿假单胞菌pao1的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图13中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图13中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图15示出氯硝柳胺/多粘菌素b对铜绿假单胞菌pao1的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的铜绿假单胞菌pao1的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用铜绿假单胞菌pao1的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图16示出氯硝柳胺和多粘菌素b对铜绿假单胞菌pao1的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图15中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图15中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图17示出氯硝柳胺/黏菌素对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育3小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图18示出氯硝柳胺和黏菌素对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图17中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图17中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图19示出氯硝柳胺/多粘菌素b对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育3小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图20示出氯硝柳胺和多粘菌素b对β-内酰胺抗性大肠杆菌(nz分离株arl06/624)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图19中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图19中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图21示出氯硝柳胺/黏菌素对肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图22示出氯硝柳胺和黏菌素对肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图21中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图21中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图23示出氯硝柳胺/多粘菌素b对肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图24示出氯硝柳胺和多粘菌素b对肺炎克雷伯菌atccbaa-1705的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图23中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图23中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图25示出氯硝柳胺/黏菌素对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育2小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图26示出氯硝柳胺和黏菌素对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图25中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图25中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图27示出氯硝柳胺/多粘菌素b对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育2小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图28示出氯硝柳胺和多粘菌素b对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图27中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图27中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图29示出氯硝柳胺/黏菌素对阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图30示出氯硝柳胺和黏菌素对阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图29中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图29中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图31示出氯硝柳胺/多粘菌素b对阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图32示出氯硝柳胺和多粘菌素b对阴沟肠杆菌阴沟亚种atcc13047的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图31中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图31中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图33示出氯硝柳胺/黏菌素对肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图34示出氯硝柳胺和黏菌素对肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图33中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图33中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图35示出氯硝柳胺/多粘菌素b对肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图36示出氯硝柳胺和多粘菌素b对肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图35中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图35中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图37示出氯硝柳胺/黏菌素对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和黏菌素修正的lb中的鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育3小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图38示出氯硝柳胺和黏菌素对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图37中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图37中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图39示出氯硝柳胺/多粘菌素b对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的协同作用的热图。此图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和多粘菌素b修正的lb中的鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值，所述两次独立平行测定各自包括两次技术性平行测定。使用鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的过夜培养物来接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育3小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的40μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和多粘菌素b的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将此板在30℃、1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图40示出氯硝柳胺和多粘菌素b对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图39中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和多粘菌素b的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图39中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图41示出氯硝柳胺/短杆菌肽对大肠杆菌w3110的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和短杆菌肽修正的lb中的大肠杆菌w3110的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值(不包括40μm氯硝柳胺行，此行数据是两次独立平行测定的平均值)。使用大肠杆菌w3310的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的30μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和短杆菌肽2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，200rpm下孵育4.5小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图42示出氯硝柳胺和短杆菌肽对大肠杆菌w3110的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图41中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和短杆菌肽的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图41中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图43示出氯硝柳胺/短杆菌肽对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的协同作用的热图。此图中示出了相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯硝柳胺和短杆菌肽修正的lb中的头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值(不包括40μm氯硝柳胺行，此行数据是两次独立平行测定的平均值)。使用头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在37℃、200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物的30μl等分样品加入到含有所指明氯硝柳胺和短杆菌肽2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在37℃，200rpm下孵育4.5小时。通过600nm下的光密度来监测培养物浊度，以计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图44示出氯硝柳胺和短杆菌肽对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格与图43中热图分析表的等价单元格相对应。右侧板示出如果氯硝柳胺和短杆菌肽的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图43中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图45示出羟氯扎胺/黏菌素针对大肠杆菌mg1655的协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，如所指明的羟氯扎胺/黏菌素修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物40μl等分样品加入到含有所指明羟氯扎胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图46示出羟氯扎胺和黏菌素针对大肠杆菌mg1655效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图45中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果羟氯扎胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图45中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图47示出羟氯扎胺/黏菌素针对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的协同作用的热图。该图显示相对于未挑战的对照物，用如所指明的羟氯扎胺/黏菌素修正的lb中的头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的生长百分比。数据是两次独立平行测定的平均值。使用头孢他啶/哌拉西林抗性抗药性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在37℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物30μl等分样品加入到含有所指明羟氯扎胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在37℃，200rpm下孵育4.5小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图48示出羟氯扎胺和黏菌素针对头孢他啶/哌拉西林抗性铜绿假单胞菌(nz分离株ar00/537)的效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图47中的热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果羟氯扎胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图47中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图49示出羟氯扎胺/黏菌素针对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的羟氯扎胺/黏菌素修正的lb中的β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的生长百分比。数据是两次平行测定的平均值。使用β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物30μl等分样品加入到含有所指明羟氯扎胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图50示出羟氯扎胺/黏菌素针对β-内酰胺抗性肺炎克雷伯菌(nz分离株nil05/26)效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图49中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果羟氯扎胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图49中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图51示出羟氯扎胺/黏菌素针对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的羟氯扎胺/黏菌素修正的lb中的鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的生长百分比。数据是两次平行测定的平均值。使用鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物30μl等分样品加入到含有所指明羟氯扎胺和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图52示出羟氯扎胺/黏菌素针对鲍氏不动杆菌(atcc型菌株19606)效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图51中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果羟氯扎胺和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图51中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图53示出硝唑沙奈/黏菌素针对大肠杆菌mg1655的协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的硝唑沙奈/黏菌素修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物40μl等分样品加入到含有所指明硝唑沙奈和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图54示出硝唑沙奈和黏菌素针对大肠杆菌mg1655效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图53中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果硝唑沙奈和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图53中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图55示出氯生太尔/黏菌素针对大肠杆菌mg1655的协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的氯生太尔/黏菌素修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物40μl等分样品加入到含有所指明氯生太尔和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图56示出氯生太尔和黏菌素针对大肠杆菌mg1655效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图55中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果氯生太尔和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图55中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图57示出2，4-二硝基苯酚/黏菌素针对大肠杆菌mg1655的协同作用的热图。该图示出相对于未挑战的对照物，用如所指明的2，4-二硝基苯酚/黏菌素修正的lb中的大肠杆菌mg1655的生长百分比。数据是四次独立平行测定的平均值。使用大肠杆菌mg1655的过夜培养物接种lb培养基的新鲜等分样品，将其在30℃，200rpm下孵育2小时。随后在384孔微量培养板中，将所述培养物40μl等分样品加入到含有所指明2，4-二硝基苯酚和黏菌素的2倍稀释系列的多重测定的各个孔中，或者加入到0μm对照物中。将该板在30℃，1200rpm下孵育4小时。通过600nm下的光密度监测培养物浊度，以便计算各菌株相对于0μm对照物的生长百分比。
图58示出2，4-二硝基苯酚和黏菌素针对大肠杆菌mg1655效应的协同作用分析。每个表中的每个单元格对应于图57中热图分析表的等价单元格。右侧板示出如果2，4-二硝基苯酚和黏菌素的效应为加和效应的情况下，平均微量培养板数据的预期浊度百分比降低值。左侧板记录了根据图57中所示数据得出的测得浊度百分比的实际降低值。左侧板中高亮示出的单元格代表其中检测到化合物协同作用(即测得的培养物浊度百分比降低值大于如果每种化合物的效应为加和效应的情况下的预期值)的浓度。
图59示出通过氧化还原敏感的gfp测量的用氯硝柳胺挑战后大肠杆菌菌株的细胞内氧化应激分析。a板描绘了用10mmh2o2或1mmdtt(为了获得完全氧化或完全还原的氧化还原信号)，或者200nm、1μm或10μm氯硝柳胺挑战后的细胞内氧化应激反应7ko：rogfp和7tl：rogfp。b和c板示出使用amnisimagestream系统在每个时间点和测试条件分析至少15,000个个体细胞所测量的响应于氯硝柳胺挑战的7koδtolc：rogfp和7ko：rogfp菌株的细菌内氧化还原电位。在氯硝柳胺孵育后的不同时间点用n-乙基马来酰亚胺固定细胞，然后通过流式细胞术系统。imagestream记录了每个单独的细胞，并自动处理了所有图像。对于每个实验获得氧化还原电位(405/480nm比率)，并且比较7ko：rogfp和7koδtolc：rogfp菌株中的氯硝柳胺响应，这些结果一起产生“氧化还原应激”时间线(b板)。c板描绘了代表性的显微镜图；在7ko：rogfp中，氯硝柳胺挑战后细胞内细菌没有经历显著的氧化还原应激(c板，“野生型”)，而在7koδtolc：rogfp(c板，“tolc”)中，在实验过程中随时间经历了增加的氧化还原应激。
图60示出通过氧化还原敏感的gfp测量的用氯硝柳胺挑战后大肠杆菌菌株的细胞内氧化应激分析。a板描绘了用10mmh2o2或1mmdtt(为了获得完全氧化或完全还原的氧化还原信号)或1μm氯硝柳胺挑战后7ko：rogfp的细胞内氧化应激反应。b板示出7ko：rogfp响应于10mmh2o2或1μm氯硝柳胺，或者25μmpaβn，或者25μmpaβn和1μm氯硝柳胺组合的细胞内氧化应激反应。c板示出7ko：rogfp响应于10mmh2o2，或者1μm氯硝柳胺，或者0.5μm黏菌素，或者0.5μm黏菌素和1μm氯硝柳胺组合的细胞内氧化应激反应。d板示出7ko：rogfp响应于10mmh2o2，或者1μm氯硝柳胺，或者0.5μm多粘菌素b(标记为“多粘菌素”)，或者0.5μm多粘菌素b和1μm氯硝柳胺组合的细胞内氧化应激反应。
选择的定义
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文中描述的那些类似或等同的任何测定、方法、装置和材料可用于本发明的实践或测试，但是现在仍描述各种测定、方法、装置和材料。
提及本文中所公开的数字范围(例如1至10)还意图并入提及该范围内的所有相关数字(例如，1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内的任何有理数的范围(例如，2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，并且因此，本文中明确公开的所有范围的所有子范围都是明确公开的。这些只是具体意图的实例，并且所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合应被认为在本申请中以类似方式进行了明确陈述。
如在本说明书中所使用的，词语“包括”、“包含”和类似词语不应以排他性或穷举性的意义来解释。换句话说，它们旨在表示“包括(含)但不限于”。
如本说明书中所用，术语“水杨酰胺化合物”包括所有水杨酰胺和水杨苯胺化合物及其衍生物和类似物。在下面进一步详细描述了合适的水杨酰胺化合物的衍生物和类似物的实例。
如本说明书中所用，术语“水杨苯胺化合物”包括水杨酸的酰胺和苯胺的酰胺的所有化合物，因此可以归类为水杨酰胺和苯胺。术语“水杨苯胺化合物”包括所有水杨苯胺化合物及其衍生物和类似物。在下面进一步详细描述合适的水杨苯胺化合物的衍生物和类似物的实例。
如本说明书中所用，术语“提高细菌细胞膜通透性的物质”包括任何能够破坏细菌细胞膜的药学或生物活性物质。本发明的提高细菌细胞膜通透性的物质的实例包括但不限于多粘菌素类，其包括多粘菌素b和多粘菌素e(即黏菌素)。
如本说明书中所用，术语“提高通透性”、“提高的通透性”等定义为相对于尚未暴露于所述物质的细胞屏障，具有能够使增加量的药物(如抗生素)穿过细胞屏障(如细胞膜或细胞连接)的性质。
发明详述
本发明基于以下令人惊讶和预料不到的发现：提高细菌细胞膜通透性的基于药物的物质的特定组合可以增强某些抗生素的效果，如(例如)水杨酰胺，其包括氯硝柳胺、硝唑沙奈、羟氯扎胺和氯生太尔，当组合时表现出抗革兰氏阴性细菌的杀菌活性。
这一发现在两个层面上是完全预料不到的。首先，水杨酰胺(包括氯硝柳胺)不是已知抗革兰氏阴性细菌的有效抗生素。第二，甚至在最近的2015年，文献报道了包含常规抗生素和膜通透性抗微生物肽的药物组合缺乏协同相互作用(he等人(2015)biochimicaetbiophysicaacta1848∶8-15)。
重要的是，申请人在此证明，治疗剂组合的给药对许多临床相关的抗药性细菌是有效的。
具体地，当与多粘菌素(例如多粘菌素b或黏菌素)一起使用时，氯硝柳胺对一系列不同的革兰氏阴性细菌提供协同的生长抑制作用，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、肺炎克雷伯菌、肠道沙门氏菌和鲍氏不动杆菌(图1-40)。有利地是，已知氯硝柳胺在人体中在高剂量下是耐受的，并且本申请人的工作还证明：在与提高细菌细胞膜通透性的物质(如黏菌素或多粘菌素b)组合施用时，其是针对革兰氏阴性细菌的有效抗生素。
由于氯硝柳胺和靶向细胞膜完整性的化合物(如黏菌素)均为fda已批准的药物，因此可以以减小的成本加快它们到临床的途径。
使用膜通透性抗生素短杆菌肽(短杆菌肽a、b、c和d的混合物；sigma-aldrich目录编号g5002)进一步证明除多粘菌素家族外的膜通透性药物使革兰氏阴性细菌对水杨酰胺药物的抗生素效应敏感的通用能力。短杆菌肽对一系列不同的革兰氏阴性细菌提供协同的生长抑制作用，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌实验室菌株w3110和铜绿假单胞菌的抗生素抗药性临床分离株(图41-44)。
羟氯扎胺(图45-52)、硝唑沙奈(图53和54)和氯生太尔(图55和56)的效应进一步表明，当与不同膜通透性抗生素(例如黏菌素)组合使用时，与氯硝柳胺相关的水杨酰胺化合物针对多种革兰氏阴性细菌表现出类似的协同作用。
图57和58表明，黏菌素和膜解偶联剂(即2，4-二硝基苯酚)的组合仅表现出弱的协同效应，并且在类似浓度下，当与黏菌素和氯硝柳胺的组合(如图1、2、5、6、9、10)，或黏菌素和羟氯扎胺的组合(图45、46)，或黏菌素和硝唑沙奈的组合(图53、54)，或黏菌素和氯生太尔的组合(图55、56)相比，对大肠杆菌没有达到相同水平的生长抑制。
不希望受到理论的束缚，申请人假设提高细菌细胞膜通透性的物质通过涉及氧化还原应激的机制起作用。例如，参见实施例2和图59和60。具体而言，当与膜透化物质(例如，多粘菌素b或黏菌素)或者抑制革兰氏阴性细菌的tolc外排泵的物质(例如paβn)联合给药时，或者当向具有受损外排机制的菌株(例如，大肠杆菌菌株7koδtolc，其具有天然tolc基因的框内缺失)给药时，氯硝柳胺引起了细胞内氧化还原应激的不可逆增加。
总的来说，这些数据提供了直接且明确的证据来证明本文中所述各种抗生素组合物的协同效应，以及它们针对多种革兰氏阴性细菌的特异性活性。
因此，本发明的一个方面提供药物组合物，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在相关实施例中，所述水杨酰胺化合物是由下式定义的任何化合物：
其中a是芳基或杂芳基环，例如，苯环，(r)n表示可任选地被一个或多个取代基取代的芳基或杂芳基环，并且x是氧或另一个杂原子(如硫)。基团-c(＝x)-nh-可以通过碳或氮原子与环a连接。
在另一相关实施例中，所述水杨酰胺化合物是水杨苯胺。
在又一相关实施例中，所述水杨酰胺化合物选自氯硝柳胺、羟氯扎胺、硝唑沙奈和氯生太尔。
在另一相关实施例中，所述水杨酰胺是氯硝柳胺，或由式i的化合物所定义的氯硝柳胺类似物：
其中rl、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。参考如下。
在另一实施例中，所述提高细菌细胞膜通透性的物质选自高渗溶液、钙离子螯合剂、表面活性剂、破坏细胞膜稳态和/或极性的阳离子肽或阴离子肽，和包括提高细菌细胞膜通透性的基于药物的物质的非受体介导/受体介导的透化剂，以及其组合。
在相关实施例中，所述提高细菌细胞膜通透性的物质是多粘菌素，包括但不限于多粘菌素b和多粘菌素e，以及其结构和/或功能类似物。根据本发明的多粘菌素e的实例是黏菌素。这两个术语在本领域中可互换使用，但是黏菌素实际上是多粘菌素e1和多粘菌素e2的混合物。
在另一相关实施例中，提高细菌细胞膜通透性的物质可包括破坏细胞膜稳态和/或极性的阳离子肽或阴离子肽。根据本发明的阳离子肽的实例是短杆菌肽。例如，参见hurdle等人(2011)nat.rev.micrabiol.9(1)：62-75和guilhelemelli等人(2013)frontmicrobiol.4∶353，所述综述通过援引加入本文。
本发明的药物组合物可含有药学上可接受的赋形剂或载体。此外，所述水杨酰胺化合物可以配制成药学上可接受的盐或前药。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和多粘菌素，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含羟氯扎胺和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含硝唑沙奈和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯生太尔和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在另一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物的定义如下：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含羟氯扎胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含硝唑沙奈和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯生太尔和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在另一方面，本发明提供组合产品，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供协同组合，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在另一方面，本发明提供抗菌剂，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供组合物(包括生物组合物)，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含羟氯扎胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含硝唑沙奈和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯生太尔和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含羟氯扎胺和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含硝唑沙奈和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
在又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯生太尔和短杆菌肽，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性。
本发明的组合和组合物，并且如本文中所述，特别可用于治疗或预防感染，特别是在人中的感染，以及用于预防、减少或消除生物膜形成等应用。
因此，在又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括给药抗菌有效量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
在相关实施例中，所述水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质如上文上所定义。
在另一实施例中，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌(包括大肠杆菌菌株mg1655)；肠杆菌属(enterobacter)种(包括但不限于阴沟肠杆菌(enterobactercloacae)阴沟亚种atcc13047；肠道沙门氏菌(salmonellaenterica)(包括肠道沙门氏菌鼠伤寒血清变型(sl1344))；假单胞菌属(pseudomonas)种(包括但不限于铜绿假单胞菌pao1和丁香假单胞菌猕猴桃溃疡菌(pseudomonassyringaepv.actinidae))，肺炎克雷伯菌(klebsiellapneumoniae)(包括肺炎克雷伯菌atccbaa-1705)和鲍氏不动杆菌(包括鲍氏不动杆菌atcc菌株19606)。在其他实施例中，所述细菌选自属于志贺菌属(shigella)、奈瑟球菌属(neisseria)、莫拉菌属(morexella)、军团病杆菌属(legionella)、沙雷菌属(serratia)、嗜血菌属(haemophilus)、耶尔森氏菌属(yersinia)、博德特氏菌属(bordetella)、布鲁杆菌属(brucella)、弯曲杆菌属(campylobacter)、弗朗西丝菌属(francisella)、螺杆菌属(helicobacter)、巴斯德菌属(pasteurella)、弧菌属(vibrio)和其他克雷伯菌属和沙门菌属的革兰氏阴性细菌。志贺菌属包括但不限于痢疾志贺菌(shigelladysenteriae)、弗氏志贺菌(shigellaflexneri)、鲍氏志贺菌(shigellaboydii)、宋氏志贺菌(shigellasonnei)。奈瑟球菌属包括但不限于淋病奈瑟球菌(neisseriagonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)。莫拉菌属包括但不限于黏膜炎莫拉菌(moraxellacatarrhalis)、结膜炎莫拉菌(moraxellalacunata)和牛莫拉菌(moraxellabovis)。军团病杆菌属包括但不限于嗜肺军团病杆菌(legionellapneumophila)。沙雷菌属包括但不限于粘质沙雷菌(serratiamarcescens)、普城沙雷菌(serratiaplymuthica)、液化沙雷菌(serratialiquefaciens)、悬钩子沙雷菌(serratiarubidaea)和serratiaodoriferae。嗜血菌属包括但不限于埃及嗜血杆菌(haemophilusaegyptius)、杜克雷嗜血杆菌(haemophilusducreyi)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、溶血性嗜血杆菌(haemophilushaemolyticus)、副流感嗜血杆菌(haemophilusparainfluenzae)和副溶血性嗜血杆菌(haemophilusparahaemolyticus)。耶尔森氏菌属包括但不限于鼠疫耶尔森氏菌(yersiniapestis)和假结核病耶尔森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)。博德特氏菌属包括但不限于支气管炎博德特氏菌(bordetellabronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)和副百日咳博德特氏菌(bordetellaparapertussis)。布鲁杆菌属包括但不限于马尔他布鲁杆菌(brucellamelitensis)和流产布鲁杆菌(brucellaabortus)。弯曲杆菌属包括但不限于空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)和结肠弯曲杆菌(campylobactercoli)。弗朗西丝菌属包括但不限于土拉热弗朗西丝菌(francisellatularensis)和新凶手弗朗西丝菌(francisellanovicida)。螺杆菌属包括但不限于幽门螺杆菌(helicobacterpylori)。巴斯德菌属包括但不限于多杀巴斯德菌(pasteurellamultocida)和溶血巴斯德菌(pasteurellahaemolytica)。弧菌属包括但不限于霍乱弧菌(vibriocholera)、创伤弧菌(vibriovulnificus)、费希尔弧菌(vibriofischeri)和副溶血性弧菌(vibrioparahaemolyticus)。除肺炎克雷伯菌外，克雷伯菌属包括但不限于肉芽肿雷伯菌(klebsiellagranulomatis)、产酸克雷伯菌(klebsiellaoxytoca)、密歇根克雷伯菌(klebsiellamichiganensis)和变栖克雷伯菌(klebsiellavariicola)。除肠道沙门氏菌外，沙门菌属包括但不限于salmonellabongori。
本发明的组合物和方法可用于动物(例如奶牛的乳腺炎)、工业和基础设施(例如水净化厂中的生物膜预防、食品包装等)或农业应用。
因此，本发明还提供包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的组合物、协同组合或抗菌剂，其用于治疗或预防动物中的乳腺炎。本发明还提供治疗或预防动物中的乳腺炎的方法，其包括给药抗菌有效量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，其中导致乳腺炎的细菌包括一种或多种革兰氏阴性细菌。
在相关实施例中，所述动物为母牛。
在另一相关实施例中，所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺。有利地，除了在提高细菌细胞膜通透性的物质存在下对革兰氏阴性细菌的令人惊奇地/预料不到的活性外，氯硝柳胺单独还表现出对革兰氏阳性细菌的杀菌活性。因此，本发明的组合物、协同组合或抗菌剂特别可用于乳腺炎应用，其中革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)和革兰氏阳性细菌(金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)和包括乳房链球菌(streptococcusuberis)的d组链球菌)的混合可能导致母牛乳房/乳头的感染。在又一相关实施例中，根据本发明的用于预防或治疗乳腺炎的协同组合或抗菌剂可以喷雾剂的形式向母牛乳房/乳头给药。
另一方面，本发明提供水杨酰胺化合物与提高细菌细胞膜通透性的物质的组合或者包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的组合物作为药物的用途。
另一方面，本发明提供水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的组合，其用于制备药物组合物。
生物膜具有引起在伤口和/或烧伤中的感染，或者引起在留置医疗装置中或在留置医疗装置上的感染的潜力。作为另外的选择，细菌生物膜的形成在食物工业的制备机器内、在由食品工业使用的包装上、在用于水或其他液体的储罐内、或在水处理厂的机器内发生，所有这些都具有提高引起人或动物接触消耗品的感染风险的潜力。此外，经由在表面例如医院病床、浴室和连接病房的门等上的生物膜形成的细菌累积也具有使人暴露于感染风险的能力。
因此，对于使用本发明的组合产品和组合物，不仅治疗或预防人(和动物)中的细菌感染的能力，而且减少或消除细菌生物膜的形成的能力，是同样重要的考虑。
在某些实施方案中，本发明的组合产品或组合物可进一步包含一种或多种杀菌剂或抑菌剂。杀菌剂的实例包括但不限于β-内酰胺类抗生素(例如青霉素衍生物、头孢菌素、单环β-内酰胺类、碳青霉烯类)、万古霉素、达托霉素、氟喹诺酮类、甲硝唑、呋喃妥因、复方新诺明或替利霉素。抑菌剂的实例包括但不限于：四环素类、大环内酯类、磺胺类、林可胺类、噁唑烷酮、替吉环素、新生霉素、呋喃妥因、大观霉素、甲氧苄啶、氯霉素、乙胺丁醇或克林霉素。
抗生素抗药性的上升对健康保健行业产生了深远的影响，而且提供替代医学来对抗细菌感染(即治疗或预防感染)的需求变得日益重要。相应地，在另一个方面，本发明提供水杨酰胺化合物与提高细菌细胞膜通透性的物质在制备药物中的用途，或者水杨酰胺化合物与提高细菌细胞膜通透性的物质的组合用于制备药物的用途。
又一方面，本发明提供水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质在制备用于治疗或预防患者中的细菌感染的药物中的用途，其中引起感染的细菌包括革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和多粘菌素的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有羟氯扎胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有硝唑沙奈和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯生太尔和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
另一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有羟氯扎胺和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有硝唑沙奈和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯生太尔和短杆菌肽的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述短杆菌肽提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
本发明还涵盖药物组合物、组合产品、协同组合、抗菌剂、组合物(包括生物组合物)和制品，其不包含氯硝柳胺和黏菌素。
因此，又一方面，本发明提供药物组合物，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述药物组合物不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供药物组合物，其包含氯硝柳胺和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供药物组合物，其包含式i的化合物和多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b或多粘菌素e，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
又一方面，本发明提供组合产品，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述组合产品不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供协同组合，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述协同组合不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供抗菌剂，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述抗菌剂不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供组合物(包括生物组合物)，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，条件是所述组合物不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含氯硝柳胺和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物(包括生物组合物)，其包含式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，并且其中所述式i的化合物如下定义：
其中r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
又一方面，本发明提供如本文中所述的药物组合物或者如本文中所述的组合产品、协同组合、抗菌剂或组合物，其用于：
(i)治疗或预防人或非人动物中的细菌感染；或者
(ii)减少或消除细菌生物膜的形成
其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，条件是所述包装材料不包含氯硝柳胺和黏菌素。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有氯硝柳胺和多粘菌素的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，条件是所述多粘菌素不是黏菌素。
又一方面，本发明提供制品，其包含含有式i的化合物和多粘菌素(包括多粘菌素b或多粘菌素e)的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述多粘菌素提高细菌细胞膜的通透性，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，
并且其中所述式i的化合物如下定义：
且r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9和r10如表1中所定义，条件是所述式i的化合物不是氯硝柳胺。
本发明还涵盖治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其通过向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的氯硝柳胺和黏菌素来进行，条件是导致感染或生物膜形成的所述细菌不是肺炎克雷伯菌和/或鲍氏不动杆菌。
因此，又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌，并且其中当所述水杨酰胺化合物是氯硝柳胺且所述提高细菌细胞膜通透性的物质是黏菌素时，所述革兰氏阴性细菌不是肺炎克雷伯菌和/或鲍氏不动杆菌。
又一方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染或者减少或消除细菌生物膜形成的方法，其包括向所述患者或所述生物膜给药抗菌有效量的氯硝柳胺和黏菌素，条件是导致感染或生物膜形成的所述细菌不是肺炎克雷伯菌和/或鲍氏不动杆菌。
水杨酰胺化合物
本领域技术人员会理解，具有抗菌活性的任何合适的水杨酰胺化合物及其衍生物或类似物都可以用于本发明的组合和组合物中。在某些实例中，所述水杨酰胺化合物显示出针对革兰氏阴性细菌的抗菌活性。用于本发明的合适的水杨酰胺化合物优选包含以下结构部分：
其中a是芳环或杂芳环，例如苯环，(r)n表明所述芳环或杂芳环可任选地被一个或多个取代基取代，并且x是氧或另一杂原子如硫。基团-c(＝x)-nh-可以经由碳或氮原子与环a连接。优选地，所述水杨酰胺化合物包含一个或多个硝基。
在某些实例中，所述水杨酰胺化合物是包含两个或更多个芳基，例如两个或更多个苯环的水杨苯胺化合物，所述芳基各自可任选地被取代，例如如下式(i)所示。作为另外的选择，所述水杨酰胺化合物可包含一个或多个杂芳基。所述水杨酰胺化合物可包含杂原子，例如硫，其代替酰胺基团的氧。术语“水杨酰胺化合物”意图包括所有这样的衍生物和类似物。
优选的水杨酰胺化合物是水杨苯胺化合物氯硝柳胺(n-(2′-氯-4′-硝基苯基)-5-氯水杨酰胺)，其结构如下所示。
氯硝柳胺的盐形式是已知的，包括乙醇胺盐和哌嗪盐。此外，氯硝柳胺的一水合物形式也是已知的。任何合适的药学上可接受的赋形剂，包括盐或水合物都可以用于本发明的组合物和组合中。
水杨酰胺化合物的其它实例包括氯硝柳胺的类似物。水杨酰胺化合物的类似物是已知的，例如通过援引加入本文的us2011/0183889中描述的那些。用于本发明的组合物和组合中的合适的氯硝柳胺类似物包括但不限于由通式(i)所述的那些，其中r1-r10如本文中所定义，包括下表1中列出的那些。用于本发明的其他合适的氯硝柳胺类似物包括经批准的氯硝柳胺的药物类似物。
表1
适用于本发明的组合和组合物中的其他水杨酰胺化合物包括但不限于羟氯扎胺(2，3，5-三氯-n-(3，5-二氯-2-羟基苯基)-6-羟基苯甲酰胺)、氯生太尔(n-[5-氯-4-[(4-氯苯基)-氰基甲基]-2-甲基苯基]-2-羟基-3，5-二碘苯甲酰胺)、雷复沙奈(n-[3-氯-4-(4-氯苯氧基)苯基]-2-羟基-3，5-二碘苯甲酰胺)、氟沙仑(3，5-二溴-2-羟基-n-[3-(三氟甲基)苯基]苯甲酰胺)、三溴沙仑(3，5-二溴-n-(4-溴苯基)-2-羟基苯甲酰胺)、二溴沙仑(5-溴-n-(4-溴苯基)-2-羟基苯甲酰胺)、雷琐太尔(n-(4-溴苯基)-2，6-二羟基苯甲酰胺)、氯碘沙奈(乙酸2-(4-氯-苯基氨基甲酰基)-4，6-二碘-苯基酯)、4′-氯-5-硝基水杨苯胺、2′-氯-5′-甲氧基-3-硝基水杨苯胺、2′-甲氧基-3，4′-二硝基水杨苯胺、2′，4′-二甲基-3-硝基水杨苯胺、4′，5′-二溴-3-硝基水杨苯胺、2′-氯-3，4′-二硝基水杨苯胺、2′-乙基-3-硝基水杨苯胺、2′-溴-3-硝基水杨苯胺。
羟氯扎胺的结构如下所示：
氯生太尔的结构如下所示：
本发明还包括其他水杨酰胺化合物，例如含有一个或多个杂芳环的那些。所述杂芳环可具有一个或多个取代基。这样的化合物的一个实例是如下所示的硝唑沙奈(2-乙酰氧基-n-(5-硝基2-噻唑基)苯甲酰胺)。
硝唑沙奈
本发明还包括其他水杨酰胺化合物，例如其中酰胺基团的氧被另一个杂原子替代的那些。这样的化合物的一个实例是如下所示的溴替尼特(3，4′-二溴-5-氯硫代水杨苯胺)。
溴替尼特
上文提及的水杨酰胺化合物中的一些是商购可得的。其他可以由本领域技术人员已知的方法容易地制备。例如，通过援引加入本文的wo2004/006906描述了制备氯硝柳胺类似物的方法。
提高细菌细胞膜通透性的物质
原核生物细胞(包括细菌)被细胞膜围绕，细胞膜主要由磷脂双层组成。当细胞膜完整时，其防止某些类别的化合物进入细胞。可容易地穿过细胞膜从而进入或离开细胞的化合物被称为膜渗透剂。膜非渗透性化合物是这样的化合物，当在细胞外部时，被完整的细胞膜排除在外，和/或当由于固有的代谢活动或者通过所给药的渗透性化合物向非渗透性化合物的细胞内转变而在细胞内部形成时，被细胞膜保留在内。
尽管细胞之间在对一些化合物的通透性方面存在差异，但是普遍认为，某些类别的化合物，包括具有至少两个正电荷的有机化合物和大多数带负电荷的有机化合物，对细菌、原生生物、真菌、植物和动物的细胞是非渗透性的。
在具有完整细胞膜的细菌和真核细胞中，细胞膜内外通常具有电位差，相对于外部，内部为负电荷5-200mv。该膜电位是由于膜内外的无机离子(其膜通透性被限制)的浓度差而产生的。如果膜出现大到足以使无机离子自由穿过的孔洞时，膜电位会降至零，如当细胞被加热或者被冷冻和融化而被杀死时可能发生；在这些情况下，所述膜对诸如碘化丙啶等染料通常变得可透过。数个类别的化合物也可改变膜电位；这些化合物包括离子载体，其携带无机离子穿过膜，或在膜中形成通道使无机离子容易穿过。
令人惊讶的是，申请人发现提高细菌细胞膜的通透性的、基于药物的物质的具体组合，其可增强某些抗生素类别(包括(例如)水杨酰胺)的作用，当将其组合时，其表现出对革兰氏阴性细菌有预料不到的杀菌活性。
本领域技术人员会理解，在本发明的组合物和组合中所用的提高细菌细胞膜通透性的物质包括所有足以破坏细胞膜的完整性的物质。通过提高的细胞膜通透性，革兰氏阴性细菌令人惊讶地变得对抗生素(包括例如本文中所述的水杨酰胺化合物)更加敏感。
如本文所用的术语“提高的通透性”的定义是，相对于尚未暴露于所述物质的细胞屏障，具有使增加量的药物(例如抗生素)穿过细胞屏障的性质。细胞屏障是指例如膜连接和/或细胞膜的细胞结构，其作用是抑制药物运动入细胞内或抑制药物在细胞之间的运动(没有这样的抑制下会通过诸如主动或被动扩散而发生)。膜连接是指相邻细胞的细胞膜的连接，例如紧密连接、桥粒和间隙连接。很明显，细胞膜是指装入诸如细胞质和细胞核等细胞的内容物的质膜。例如，由已暴露于提高细菌细胞膜通透性的物质的细菌所摄取的药物/抗生素的量可以是尚未暴露于所述物质的细菌细胞的2-20倍。
提高细胞膜的通透性的物质必须在足以提高细菌细胞膜的通透性(这进而使其对诸如抗生素或抗生素组合等特定药物较为敏感或更为敏感)的浓度下施用。伴随或在药物的给药后进行所述提高细胞膜的通透性的物质的施用，以使所述药物穿透进入细胞质并在其细胞靶点上发挥作用。许多不同类型的化合物可用作提高细胞膜的通透性的物质，而且多种器械可用于递送这些物质和/或所述药物。此外，本发明具有许多不同和潜在的临床应用。
与所述提高细胞膜的通透性的物质联合给药或者在所述提高细胞膜的通透性的物质给药后给药的药物量也可基于各个个体确定，而且基于(至少部分基于)对个体体格、具体疾病、待治疗的症状的严重程度、寻求的结果以及其他因素的考量。为了确定剂量而采用实验室动物的标准药代动力学试验操作是被本领域普通技术人员所理解的。
根据本发明的组合物、组合和方法中所用的提高细菌细胞膜通透性的物质的实例包括但不限于高渗溶液、钙离子螯合剂、表面活性剂、破坏细胞膜稳态和/或极性的阳离子肽或阴离子肽(包括短杆菌肽)，以及受体介导的透化剂(包括提高细菌细胞膜通透性的基于药物的物质)，及其组合。
可用于该目的的钙离子螯合剂的实例包括亚氨基二乙酸(ida)、次氮基三乙酸(nta)、乙二胺单乙酸(edma)、乙二胺二乙酸(edda)和乙二胺四乙酸(edta)。关于edta的使用有大量的文献，因为在许多药物组合物中其被用作赋形剂。在一个实例中，需要降低细胞内的钙离子浓度的钙离子螯合剂的浓度可为约0.01mm-1m，例如约1mm。
可用的离子表面活性剂的实例包括但不限于牛磺二氢甾酸霉素钠、水杨酸钠、癸酸钠和甘氨胆酸钠。可用的非离子表面活性剂的实例包括但不限于cholylsarcosine、肉豆蔻酸异丙酯、部分水解的甘油三酯、脂肪酸糖衍生物和油酸衍生物。这些表面活性剂可以给药的浓度范围为0.0001％-10％，更窄的范围为约0.001-1％，实例为约0.1％。尽管离子表面活性剂在液化细胞膜方面往往略微更加有效，但是它们也往往略微更加刺激。
破坏细胞膜稳态和/或极性的阳离子肽或阴离子肽的实例如hurdle等人(2011)和guihelemelli等人(2013)(同上)所述，并且包括短杆菌肽。
根据本发明的组合物、组合和方法中所用的提高细菌细胞膜的通透性的基于药物的物质的实例包括但不限于多粘菌素，所述多粘菌素包括多粘菌素b和多粘菌素e(例如黏菌素)。
具体而言，有两种多粘菌素可用于临床中的使用，即多粘菌素b和多粘菌素e(或黏菌素)；它们由具有长疏水尾的环肽组成。黏菌素和多粘菌素b均于20世纪40年代被发现并已广泛用于对抗革兰氏阴性细菌感染。然而，由于肾毒性和神经毒性的副作用，它们的使用在20世纪70年代减少(velkov等人(2013)，futuremicrobiol.8(6)：711-24)。最近，由于细菌对一线抗生素的耐药性的广泛扩散，它们作为终极手段的抗生素的使用已经增加(例如，li等人(2006)，lancetinfect.dis.6(9)：589-601)。对于许多多药耐药的肠杆菌科(enterobacteriaceae)(例如肺炎克雷伯菌和大肠杆菌)，多粘菌素抗生素是剩下的唯一治疗选择(velkov等人(2013)，同上)。
多粘菌素b的结构/功能类似物(在n末端的脂肪酰基以及在6位和7位的氨基酸残基有所不同)包括但不限于多粘菌素b1[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]、多粘菌素b1-ile[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-phe；7位＝ile]、多粘菌素b2[脂肪酰基＝6-甲基庚酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]、多粘菌素b3[脂肪酰基＝辛酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]、多粘菌素b4[脂肪酰基＝庚酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]、多粘菌素b5[脂肪酰基＝壬酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]和多粘菌素b6[脂肪酰基＝3-羟基-6-甲基辛酰基；6位＝d-phe；7位＝leu]。
多粘菌素e的结构/功能类似物(在n末端的脂肪酰基以及在6位和7位的氨基酸残基有所不同)包括但不限于多粘菌素e1[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-leu；7位＝leu]、多粘菌素e2[脂肪酰基＝6-甲基庚酰基；6位＝d-leu；7位＝leu]、多粘菌素e3[脂肪酰基＝辛酰基；6位＝d-leu；7位＝leu]、多粘菌素e4[脂肪酰基＝庚酰基；6位＝d-leu；7位＝leu]，多粘菌素e7[脂肪酰基＝7-甲基辛酰基；6位＝d-leu；7位＝leu]、多粘菌素e1-ile[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-leu；7位＝ile]、多粘菌素e1-val[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-leu；7位＝val]、多粘菌素e1-nva[脂肪酰基＝(s)-6-甲基辛酰基；6位＝d-leu；7位＝nva]、多粘菌素e2-ile[脂肪酰基＝6-甲基庚酰基；6位＝d-leu；7位＝ile]、多粘菌素e2-val[脂肪酰基＝6-甲基庚酰基；6位＝d-leu；7位＝val]和多粘菌素e8-ile[脂肪酰基＝7-甲基壬酰基(nanoyl)；6位＝d-leu；7位＝ile]。请参见表1(velkov等人(2013)，同上)。
多粘菌素e/黏菌素作用于细菌细胞膜，其与外膜中的脂多糖分子相互作用，并导致细胞通透性增加、细胞内容物外泄、细胞溶胞作用，并最终导致细菌细胞死亡(velkov等人(2013)，同上)。由于黏菌素破坏膜完整性，所以亲水性抗生素(利福平、碳青霉烯、糖肽和四环素)能协同作用。由于更为安全/毒性较小的氨基糖苷和抗假单胞菌药剂变得可用，所以黏菌素的使用从20世纪70年代至21世纪早期减少(li等人(2006)，同上)。
黏菌素是多组分多肽抗生素，其由两种环肽构成，黏菌素a和黏菌素b。多粘菌素e甲磺酸钠是黏菌素的给药形式，其在体内被转化形成黏菌素。可将黏菌素口服、局部(如耳用溶液和皮肤散剂，如硫酸黏菌素)、肌内、通过吸入、鞘内和静脉内以多粘菌素e甲磺酸钠的形式给药。黏菌素对包括肠杆菌科在内的革兰氏阴性临床分离株极具活性。非发酵的铜绿假单胞菌和不动杆菌种属对黏菌素天然敏感。黏菌素对流感嗜血菌、大肠杆菌、沙门菌属spp.、志贺菌属spp.、克雷伯菌属spp.、嗜肺军团病杆菌、气单胞菌属spp.、柠檬酸杆菌属spp.、百日咳博德特菌和弯曲杆菌种属也有效果。
制品
本发明还提供制品，其包含含有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的包装材料以及用于治疗或预防患者中的细菌感染或者用于减少或消除细菌生物膜形成的说明书，其中所述感染或生物膜包含一种或多种革兰氏阴性细菌。水杨酰胺化合物的实例(例如氯硝柳胺、羟氯扎胺、硝唑沙奈、氯生太尔)和提高细菌细胞膜通透性的物质的实例(例如，包括多粘菌素b和多粘菌素e的基于药物的物质)会在其他地方进一步详细描述。
可将所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质分开、顺序或同时给药。例如，所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质的组合可以一起配制为用于向患者给药的组合物。可替代地，所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质可以各自分开配制用于分开或顺序向所述患者给药。
所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质可以通过多种途径向患者给药，包括口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、含服、静脉内、肌内、真皮内、皮下或通过植入式储库，优选静脉内给药。待给药的各化合物的量会根据患者的性质以及待治疗的病症的性质和程度而广泛变化。对于水杨酰胺化合物以及对于所述提高细菌细胞膜通透性的物质，成人的代表性剂量将会是0.001μg/ml至100μg/ml。任何特定患者所需的具体剂量会取决于各种因素，包括患者的年龄、体重、一般健康、性别等。
对于分开、顺序或同时经口给药，所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质可以配制成固体或液体制剂，例如片剂、胶囊剂、散剂、溶液剂、混悬剂和分散体。这样的制剂是本领域公知的，如此处未列出的其他口服剂量方案一样。在片剂形式中，所述化合物可以与常规片剂基质如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，连同粘合剂、崩解剂和润滑剂一起压片。粘合剂可以是例如玉米淀粉或明胶，崩解剂可以是马铃薯淀粉或海藻酸，并且润滑剂可以是硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式的口服给药，可以采用乳糖和干玉米淀粉等稀释剂。可以添加其他组分，如着色剂、甜味剂或调味剂。
当需要水性混悬剂用于口服使用时，所述水杨酰胺化合物或者所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质可以与载体如水和乙醇组合，并且可以使用乳化剂、助悬剂和/或表面活性剂。还可以添加着色剂、甜味剂或调味剂。
所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质也可以通过在生理可接受的稀释剂如水或盐水中注射而分开、顺序或同时给药。所述稀释剂可以包含一种或多种其他成分，例如乙醇、丙二醇、油或药学上可接受的表面活性剂。在一个实例中，所述化合物通过静脉内注射分开、顺序或同时给药，其中所述稀释剂包括蔗糖、l-组氨酸和药学上可接受的表面活性剂例如吐温20的水溶液。
所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质也可以分开、顺序或同时局部给药。用于化合物的局部给药的载体包括矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。所述化合物可以作为成分存在于洗剂或乳膏中，以用于局部向皮肤或粘膜给药。这样的乳膏可以含有悬浮于或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性化合物。合适的载体包括矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质还可以借助于持续释放系统分开、顺序或同时给药。例如，可将它们掺入缓慢溶解的片剂或胶囊剂内。
对于植物中的感染的处理，例如猕猴桃属(actinidia)的猕猴桃植物中由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(psa-v)引起的细菌感染，所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质可以任选地与一种或多种载体一起配制，例如作为应用于植物的喷雾剂。可将所述化合物分开、顺序或同时施用。对于施用于植物，本发明的组合和组合物可以进一步包含一种或多种辅剂，例如适用于植物的乳化剂、分散剂、矿物油和植物油或其混合物。所述组合和组合物也可以用作野外设备(例如修枝剪)的灭菌剂，以预防在果园之间的细菌感染传播。
对于动物中感染的治疗(例如在奶牛中由革兰氏阴性细菌(包括大肠杆菌)导致的乳腺炎感染)，可将所述水杨酰胺化合物和所述提高细菌细胞膜通透性的物质任选地与一种或多种载体配制，例如以喷雾剂的形式施用于母牛乳头/乳房。可将所述化合物分开、顺序或同时施用，并可进一步包含一种或多种辅剂，诸如适于向动物施用的乳化剂、分散剂、矿物油和植物油或其混合物。
本发明还涉及用于治疗或预防细菌感染的装置和药盒。合适的药盒包含足以用于至少一种细菌感染的治疗的至少一种水杨酰胺化合物和至少一种提高细菌细胞膜通透性的物质，其用于分开、顺序或同时使用，以及进行治疗/预防的说明书。
药盒的使用和治疗/预防细菌感染的说明书可以是标签的形式，所述标签指在其制造、运输、销售或使用期间的任何时间附着或以其他方式伴随药盒的任何书面或记录的材料。例如，术语“标签”涵盖广告传单和小册子、包装材料、说明书、盒式录音磁带或录像带、计算机光盘、以及直接印刷在药盒上的书写。
本文中呈现的申请人的结果提供了细菌如何代谢某些药物(包括硝基前药抗生素，以及含有一个或多个硝基的水杨酰胺，例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)的分子基础的令人惊讶地有趣的洞察。不希望受到理论的约束，申请人提出，由于内源性硝基还原酶基因中的自发突变而已变得对用硝基前药抗生素的治疗具有抗药性的细菌随后将易受用一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物的治疗影响，这是由于损失了化合物通过硝基还原来去毒的能力。一方面，与野生型相比，内源性硝基还原酶活性的丧失或减少意味着细菌细胞对硝基前药抗生素具有抗药性，因为一旦在细菌细胞内，前药就无法被切割以产生毒性抗生素(例如用5-硝基咪唑抗生素前药替硝唑对大肠杆菌的硝基还原酶缺陷型菌株所述，prosser，g.a.，williams，e.，m.，sissons，j.，a.，walmsley，k.，e.，parker，m.，r.和ackerley，d.f.(2015).again-of-functionpositive-selectionexpressionplasmidthatenableshigh-efficiencycloning.biotechnologyletters37：383-389)。另一方面，内源性硝基还原酶活性的丧失或减少意味着细菌细胞更易受一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物(例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)的影响，因为在不存在硝基还原酶活性的情况下，细菌细胞不再能够将毒性氯硝柳胺转化为无毒的硝基还原形式。膜透化剂可以任选地与一种或多种含硝基的水杨酰胺化合物一起包含，以增强对药物的敏感性。
相应地，在又一个方面，本发明提供用于治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗具有抗药性，所述方法包括向所述患者给药足以治疗或预防感染的量的至少一种水杨酰胺化合物，其中所述水杨酰胺化合物包含一个或多个硝基。任选地，所述方法还包括给药至少一种膜透化剂。
在又一个方面，本发明提供用于减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用硝基前药抗生素治疗具有抗药性，所述方法包括给药足以减少或消除生物膜形成的量的至少一种水杨酰胺化合物，水杨酰胺化合物包含一个或多个硝基。任选地，所述方法还包括给药至少一种膜透化剂。
相反，已变得对用含一个或多个硝基的水杨酰胺化合物治疗具有抗药性的细菌可以经由内源性硝基还原酶基因中的突变来完成，所述内源性硝基还原酶基因引起硝基还原酶活性的增加。一方面，与野生型相比，内源性硝基还原酶活性的增加意味着细菌细胞对含硝基的水杨酰胺化合物具有抗药性，因为细菌细胞不再能够将毒性含硝基的水杨酰胺化合物(例如氯硝柳胺和氯硝柳胺类似物)转化为无毒形式。另一方面，内源性硝基还原酶活性的增加意味着细菌细胞更易受一个或多个硝基前药抗生素影响，因为它会激活前药以形成抗生素的活性形式。
相应地，在又一个方面，本发明提供治疗或预防患者中的细菌感染的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物和至少一种提高细菌细胞膜通透性的物质的治疗具有抗药性，其中所述水杨酰胺化合物包含一个或多个硝基，所述方法包括向所述患者给药足以治疗或预防所述感染的量的硝基前药抗生素。
在又一个方面，本发明提供减少或消除细菌生物膜形成的方法，其中所述细菌已变得对用至少一种水杨酰胺化合物或至少一种水杨酰胺化合物和至少一种所述提高细菌细胞膜通透性的物质的组合的治疗具有抗药性，其中所述水杨酰胺化合物包含一个或多个硝基，所述方法包括给药足以减少或消除生物膜形成的量的硝基前药抗生素。
制品：医疗器械
根据本发明的组合物和组合可布置在留置的医疗器械等中，以预防或治疗由革兰氏阴性细菌造成的感染。这包括细菌生物膜的形成，例如，在术后或手术操作时。在某些方面，根据本发明的组合物和组合可布置在导管、支架、医用植入物(例如，人工髋关节等)上，以抵御感染。
本领域技术人员会理解，根据本发明的组合物和组合可以优化其抗菌活性的方式来配制，(例如)作为诸如植入物、支架、医用植入物等医疗器械上的涂层。
剂型和制剂以及给药
本发明的化合物可以分离的、或者基本上、或实质上纯的形式存在。应当理解，产品可和不与所述产品的预期目的相干扰的载体或稀释剂混合，且仍被视为分离的或基本上纯的形式。本发明的产品也可以实质上或基本上纯的形式存在，优选地，包含或基本上由约80％、85％、或90％的所述化合物或制剂的干质量组成，例如，至少约95％、至少约98％或者至少约99％的所述化合物或制剂的干质量。
依据预期的给药途径，本发明的药品、药物组合物、联合制剂和药物可采用例如溶液剂、混悬剂、滴剂、持续释放制剂或散剂，且通常包括约0.1％-95％的活性成分，优选地，约0.2％-70％。其他合适的制剂包括基于注射和基于输注的制剂。其他可用的制剂包括持续释放制剂，包括例如控释、缓释或延迟释放制剂。
本发明的方面包括控释或其他的剂量、剂型、制剂、组合物和/或器械，其包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质。本发明包括例如剂量和剂型，用于至少口服给药、经皮递送、局部施用、栓剂递送、透粘膜递送、注射(包括皮下给药、真皮下给药、肌内给药、储库给药和静脉内给药，包括通过推注递送、缓慢静脉内注射和静脉滴注)、输注器械(包括主动和被动型可植入输注器械)、通过吸入或吹入给药、含服给药和舌下给药。应理解，本文中所述的任意剂型、组合物、制剂或器械(特别是用于静脉内给药的)，可在适用或需要时，以通过本文中涵盖的或常用的任意其他途径给药的剂型、组合物、制剂或器械的形式使用。例如，一个或多个剂量可使用适合于肠胃外给药的剂型进行肠胃外给药，其可以掺入适合于口服给药的剂型中所述的特征或组分，或者可将其以持续释放的剂型来递送，例如改良释放、延长释放、延迟释放、缓释或重复作用剂型。
优选地，本发明的所述水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质与药学上可接受的载体或稀释剂组合，以制备药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗盐溶液，例如磷酸盐缓冲盐水。合适的稀释剂和赋形剂还包括，例如水、盐水、葡萄糖、甘油等，及其组合。此外，如果期望，还可以存在例如润湿剂或乳化剂、稳定剂或ph缓冲剂的物质。
术语“药学上可接受的载体”是指任意可用的载体、赋形剂或稳定剂，其在应用的剂量和浓度下对暴露于其的宿主细胞或者人或非人动物无毒，并且包括不会诱导产生对接受所述组合物的个体有害的抗体的药物载体。合适的载体可以为大的、代谢缓慢的大分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸和氨基酸共聚物。通常，生理上可接受的载体是ph缓冲水溶液。生理上可接受的载体的其他实例包括缓冲剂，例如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他包括葡萄糖、甘露糖或糊精的碳水化合物；螯合剂，例如edta；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；成盐平衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如，吐温、聚乙二醇(peg)和普朗尼克。
药学上可接受的盐也能够存在，比如矿物酸盐，例如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸盐，例如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。
合适的载体材料包括常用作用于局部非要的乳膏剂、洗剂、凝胶剂、乳剂或涂剂的基质的任意载体或媒介物。实例包括乳化剂、包括烃类基质的惰性载体、乳化基质、无毒溶剂或水溶性基质。特别合适的实例包括普朗尼克、hpmc、cmc和其他基于纤维素的成分、羊毛脂、硬石蜡、液体石蜡、黄软石蜡或白软石蜡、白蜂蜡、黄蜂蜡、十六十八醇、鲸蜡醇、二甲硅油、乳化蜡、肉豆蔻酸异丙酯、微晶蜡、油醇和硬脂醇。
在本发明的制剂中还可包含助剂，例如酪蛋白、明胶、白蛋白、胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟乙基纤维素或聚乙烯醇。
可配制本发明的剂型、制剂、器械和/或组合物以优化生物利用度，并将血浆浓度维持在治疗范围内(包括延长期间)。持续递送制剂(如控制递送制剂)也优化了在作用部位的药物浓度，并使例如用药不足和用药过度的期间最小化。
为了所述水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质在体内的低剂量控释和/或低剂量长时间持续释放，可提供本发明中可用的剂型、器械和/或组合物用于周期性给药，包括每日一次给药。
适合用于口服给药的剂型的实例包括但不限于能够提供治疗有效量的所述水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的片剂、胶囊剂、锭剂或类似剂型，或者任意液体剂型，例如糖浆剂、水溶液剂、乳剂等。
适合用于经皮给药的剂型的实例包括但不限于透皮贴剂、透皮绷带等。适合用于本发明中可用的组合物和制剂的局部给药的剂型的实例为任意洗剂、棒剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂等，不论是直接施用于皮肤或是通过媒介。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的栓剂给药的剂型的实例包括插入身体孔口的任意固体剂型，特别是插入直肠、阴道和尿道的那些。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的透粘膜递送的剂型的实例包括灌肠用储库溶液剂、子宫托、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、喷雾溶液剂、散剂和类似制剂，这些制剂除了包含活性成分以外，还包含如本领域中公知的合适的载体。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的注射的剂型的实例包括通过推注的递送，例如通过静脉注射、皮下给药、真皮下给药、肌内给药或口服的单次或者多次给药。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的储库型给药的剂型的实例包括活性剂的小丸或小圆柱体或者其中活性剂被包封在可生物降解的聚合物、微乳或脂质体的基质中，或被微胶囊化的固体剂型。
用于本发明中可用的化合物和制剂的输注器械的实例包括输液泵，其包含针对所需给药次数或稳态给药所需量的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质和/或预配位化合物/药剂，并且包括可植入药泵。
用于本发明中可用的化合物和制剂的可植入输注器械的实例包含任意固体剂型，其中活性剂被包封在可生物降解的聚合物或合成物内或者分散在整个可生物降解的聚合物或合成物中，所述聚合物例如硅酮、硅酮橡胶、硅橡胶或类似聚合物。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的吸入或吹入的剂型的实例包括组合物，所述组合物包含在药学上可接受的水溶剂或有机溶剂或者其混合物中的溶液和/或悬浮液，和/或粉末。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的含服给药的剂型的实例包括锭剂、片剂等，组合物包含在药学上可接受的水溶剂或有机溶剂或者其混合物中的溶液和/或悬浮液，和/或粉末。
适合用于本发明中可用的化合物和制剂的舌下给药的剂型的实例包括锭剂、片剂等，组合物包含在药学上可接受的水溶剂或有机溶剂或者其混合物中的溶液和/或悬浮液，和/或粉末。
用于本发明中可用的化合物和制剂的递送的控释药物剂型的实例可见例如sweetman，s.c.(ed.).martindale.thecompletedrugreference，第33版，pharmaceuticalpress，chicago，2002，2483pp.；aulton，m.e.(ed.)pharmaceutics.thescienceofdosageformdesign.churchilllivingstone，edinburgh，2000，734pp.；以及ansel，h.c.，allen，l.v.和popovich，n.g.pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，7thed.，lippincott1999，676pp。药物递送系统的制备中应用的赋形剂在本领域技术人员已知的多种出版物中记载，包括例如kibbe，e.h.handbookofpharmaceuticalexcipients，3rded.，americanpharmaceuticalassociation，washington，2000，665pp。usp也提供了改良释放口服剂型的实例，包括配制为片剂或胶囊剂的那些。参见例如theunitedstatespharmacopeia23/nationalformulary18，theunitedstatespharmacopeialconvention，inc.，rockvillemd，1995(下文称作“usp”)，其也记载了用于测定延长释放和延迟释放片剂和胶囊剂的药物释放能力的具体测试。关于延长释放剂型分析的其它指导已由fda提供。参见guidanceforindustry.extendedreleaseoraldosageforms：development，evaluation，andapplicationofinvitro/invivocorrelations.rockville，md：centerfordrugevaluationandresearch，foodanddrugadministration(1997)。
本发明的方法中可用的剂型的其他实例包括但不限于改良释放(mr)剂型，包括延迟释放(dr)剂型；延长作用(pa)剂型；控释(cr)剂型；延长释放(er)剂型；定时释放(tr)剂型；以及长效(la)剂型。对于大部分情况而言，这些术语用于描述口服给药剂型，然而，这些术语也可适用于本文中所述的任意剂型、制剂、组合物和/或器械。这些实现在给药后延迟总的药物释放一段时间，和/或在给药后药物释放以小等分间歇性进行，和/或药物通过递送系统管理的控制速率缓慢释放，和/或药物以不变的恒定速率释放，和/或药物释放的时期显著长于通常制剂。
本发明的改良释放剂型包括的剂型具有以时间、疗程、和/或位置为基础的药物释放特征，这些特征设计为达到治疗或便利的目标，这些特征是常规或立即释放剂型所不具备的。参见例如bogner，r.h.u.s.pharmacist22(suppl.)：3-12(1997)；scale-upoforalextended-releasedrugdeliverysystems：parti，anoverview，pharmaceuticalmanufacturing2∶23-27(1985)。本发明的延长释放剂型包括例如如美国食品药品管理局(fda)所定义的使得给药频率相对于常规剂型(例如溶液剂或立即释放剂型)有所降低的剂型。参见例如bogner，r.h.(1997)，同上。本发明的重复作用剂型包括例如，含有两个单次剂量给药的剂型，一次是立即释放，且另一次是延迟释放。例如，双层片剂可以制成一层为用于立即释放的药物，而另一层设计为晚些时候释放的药物，以作为第二次给药或以延长释放的方式给药。本发明的靶向释放剂型包括例如便于药物释放的制剂，其用于将药物隔离或集中于身体区域、组织或部位，以用于吸收或药物作用。
本发明中还可用的是，包含水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质和/或预配位化合物/药剂的包衣的珠、颗粒或微球，其可用于通过将药物掺入包衣的珠、颗粒或微球中来实现改良释放。在这样的系统中，所述水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质分布在珠、丸、颗粒或其他微粒系统上。参见ansel，h.c.，allen，l.v.和popovich，n.g.，pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems，7thed.，lippincott1999，p.232。
多个方法可用于生成适用于向人和其他动物口服给药的、具有水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的改良释放剂型。可用于实现改良释放药物递送的两种基本机制包括改变药物和赋形剂的溶出度或扩散。在该语境内，例如，可以同时或连续使用四种工艺。这些工艺如下：(i)器械的水合作用(例如基质的溶胀)；(ii)水扩散入器械中；(iii)药物的控释溶出或延迟溶出；和(iv)器械之外的、溶解的或可溶性药物的控释扩散或延迟扩散。
为了配制一系列剂量值，可以使用细胞培养物测定和动物研究。这样的化合物的剂量优选落于对至少50％的群体治疗有效，且在该水平下表现为几乎无毒或无毒的剂量内。
本发明的方法和组合物中所用的水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质的有效剂量可能根据多个因素而变化，所述因素包括所用的特定水杨酰胺化合物和提高细菌细胞膜通透性的物质、给药方式、给药频率、治疗的病况、治疗的病况的严重程度、给药途径、待治疗的患者亚群的需求或者个体患者的需求，不同的需求可能是由于年龄、性别、体重和患者特异性相关医学病况。
合适的剂量可以是约0.001至约1，或者至约10mg/kg体重，例如约0.01至约0.5mg/kg体重。然而，合适的剂量范围也可以是约0.001至约0.1mg/kg体重，例如约0.01至约0.05mg/kg体重。剂量在约1-100、100-200、200-300、300-400和400-500毫克是合适的，剂量在约500-750微克和约750-1000微克也是合适的。其他可用的剂量包括每剂量约300至1000皮摩尔，以及每剂量约0.05至约0.2纳摩尔。其他剂量也仍然在所附的权利要求的范围内。
剂量的给药可以单次或分次实施。可将剂量一次给药，或者也可以重复施用。
本文中所述的给药途径和剂量预期仅用作指导意见，因为有经验的医生会针对任意具体患者和病况来考量最优的给药途径和剂量。
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在该申请文件中对现有技术文件的任何提及均不能被认为是承认这样的现有技术是广泛已知的或者形成本领域一般性公知常识的一部分。
参考以下实施例进一步描述本发明。应理解，如要求保护的本发明不以任何方式受这些实施例的限制。
实施例
实施例1：抗生素组合/生长测定
该操作适用于图1-图52中描述的实验。将所需的细菌菌株接种于3ml的lb中，并在30℃下孵育16小时，以250rpm震荡。使用各过夜培养物的500μl等分样品接种于50ml生物反应器试管中的20ml的lb中，并在30℃，250rpm下孵育2小时，或者按附图说明中的其他说明进行。然后将40μl的各培养物添加至含有水杨酰胺(例如氯硝柳胺、羟氯扎胺、硝唑沙奈或氯生太尔)和提高细菌细胞膜通透性的物质(例如多粘菌素b，多粘菌素e(黏菌素)、短杆菌肽)的384孔板规格的多重检测(一式四份)中。384孔板的各孔包含40μl的lb，其以所需药物组合的双倍最终预期浓度进行修正，以能够将细菌培养物进行1∶2的稀释。测量od600(t＝0)，并将培养物在30℃，1200rpm下孵育4小时，或者按附图说明中的其他说明进行。然后记录最终的od600(例如，在t＝4时)。为了计算生长抑制，将t＝0的值从最终的od600值中减去。然后计算相对于0μm的药物组合孔(其代表100％生长)的生长百分比。
该测试规格为二维384孔板测定，其中各测试菌株的平行测定培养物用横轴上的增加浓度的膜透化剂和纵轴上的增加浓度的水杨酰胺来挑战(各制备为2倍稀释系列，对于膜透化剂从右往左，对于水杨酰胺从下往上)。
结果如图1-图56中所示。
具体而言，当氯硝柳胺与多粘菌素(例如多粘菌素b或多粘菌素e(黏菌素))结合使用时，氯硝柳胺对一定范围的不同的革兰氏阴性细菌具有生长抑制的协同作用，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌的抗生素耐药菌株和实验室菌株、铜绿假单胞菌的抗生素耐药菌株和实验室菌株、肺炎克雷伯菌的抗生素耐药菌株和实验室菌株、阴沟肠杆菌、肠道沙门氏菌和鲍氏不动杆菌(图1-图40)。
采用膜透化抗生素短杆菌肽(短杆菌肽a、b、c和d的混合物；sigma-aldrich目录号g5002)，进一步证明除了敏化革兰氏阴性细菌对抗生素作用的多粘菌素家族外，膜透化药物的一般能力。短杆菌肽对一定范围的不同革兰氏阴性细菌具有生长抑制的协同作用，所述革兰氏阴性细菌包括但不限于大肠杆菌实验室菌株w3110和铜绿假单胞菌的抗生素耐药临床分离株(图41-图44)。
此外，羟氯扎胺(图45-图52)、硝唑沙奈(图53-图54)和氯生太尔(图55-图56)的作用表明，当硝唑沙奈相关水杨酰胺化合物与不同膜透化抗生素(例如黏菌素)组合使用以抵抗多种革兰氏阴性细菌时，其表现出类似的协同作用。
图57和图58表明，当与黏菌素和氯硝柳胺的组合(例如图1、2、5、6、9、10)，或黏菌素和羟氯扎胺的组合(图45、46)，或黏菌素和硝唑沙奈的组合(图53、54)，或黏菌素和氯生太尔的组合(图55、56)相比时，在类似的浓度下，黏菌素和膜解偶联剂(即2，4-二硝基酚)的组合仅表现出弱的协同作用，并且不能达到相同水平的针对大肠杆菌的生长抑制。
实施例2：细菌内氧化还原电位的体内实时测量
大肠杆菌氧化还原筛选菌株的生成
氧化还原筛选菌株通过框内缺失法采用pcr扩增破坏盒通过red重组酶法生成(datsenko&warner(2000)procnatlacadsciusa97，6640-6645)。大肠杆菌菌株7ko来源于大肠杆菌菌株w3110，通过缺失天然nfsa、nfsb、azor、nema、yief、ycak和mdab基因，如copp等人先前记载(copp等人(2014)proteineng.des.sel.27，399-403)。大肠杆菌菌株7koδtolc来源于7ko，通过缺失天然tolc基因。pfpx25-rogfp2载体(vanderheijden等人(2015)procnatlacadsciusa112，560-565)被克隆入大肠杆菌菌株7ko和7koδtolc中，以分别生成7ko：rogfp和7koδtolc：rogfp。
细菌内氧化还原电位的体内实时测量
细菌内氧化还原电位的体内分析在30℃下于synergyh1multimode读板仪(biotek)中进行，在405和480nm处测量激发，在510nm处测量发射。将7ko：rogfp或7koδtolc：rogfp的对数生长期细菌培养物以od1.0重悬于0.9％盐水中，并将100μl等分样品装载入黑色的、底部透明的96孔板的各孔中。在该相同的实验中，获得相应菌株的非荧光(即无prsetb-rogfp2)的背景信号。跟踪荧光信号160-180min，并计算所得的405/480的比值信号。在10min时，使用氯硝柳胺和/或提高细菌细胞膜通透性的物质(例如多粘菌素b或多粘菌素e(黏菌素))和/或抑制革兰氏阴性细菌的tolc外排泵的药剂(例如paβn)，挑战平行测定等分样品，96孔板规格。分别采用10mmh2o2或1mmdtt的最终浓度，获得各实验中的还原和氧化对照。将所有的数值标准化为最大氧化和完全还原的细菌培养物的所得数值。
结果如图59和图60所示。
具体而言，当氯硝柳胺与膜透化剂(例如多粘菌素b，或多粘菌素e(粘菌素))或者抑制革兰氏阴性细菌的tolc外排泵的药剂(例如paβn)组合给药时，或者当氯硝柳胺在外排机制受损的菌株(例如大肠杆菌菌株7koδtolc，其具有天然tolc基因的框内缺失)中给药时，氯硝柳胺在细菌内氧化还原应激导致不可逆的上升。
amnisimagestream和ideas/imagej分析
如之前记载，通过amnisimagestream对样品进行分析(vanderheijden等人(2015)procnatlacadsciusa112，560-565)。对于405、488、658和785nm的激光强度分别为100、120、20和3.8。采用ideas软件(版本6.0.129.0，由amnis提供)对数据文件进行进一步的分析。基于660nm处的荧光选择细菌细胞。然后，基于660nm处的荧光强度，通过程序选择感染细胞的每张图像。基于该选择，创建蒙片，其用于405/480nm比率的分析。将所得到的405/480的比率信号作直方图。获得各实验中的还原和氧化对照，并将所有的数值标准化为氧化和还原的比率数值。如之前记载，采用imagej分析生成伪色比率图像(morgan等人(2011)freeradicalbiologyandmedicine51，1943-1951)。
细菌内氧化还原电位的体内分析在30℃下于synergyh1multimode读板仪(biotek)中进行，在405和480nm处测量激发，而在510nm处测量发射。将对数生长期细菌培养物以od1.0重悬于0.9％盐水中，并将200μl等分样品装载入黑色的、底部透明的96孔板的各孔中。在该相同的实验中，获得相应菌株的非荧光的背景信号。此外，通过在实验开始时向细菌培养物分别添加10mmh2o2或1mmdtt获得完全氧化和完全还原的细菌的信号。将所有的数值标准化为最大氧化和完全还原的细菌培养物的所得数值。
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虽然已通过实施例描述了本发明，但应理解，可以作出变化和修改，而不背离如权利要求中限定的本发明的范围。此外，当存在特定特征的已知等价物时，这种等价物被并入，如同它在本说明书中具体提及一样。
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