用于治疗分泌性疾病的方法和组合物与流程

本申请要求2016年5月25日提交的美国临时申请第62/341,591号的权益，该临时申请通过引用整体并入本文。

政府权益声明

本发明是在国立卫生研究院授予的批准号r01dk067158的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权益。

序列表的纳入

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发明领域

本发明一般涉及用于治疗分泌性疾病的治疗剂。更具体地，本发明涉及提供不会不利地诱导蛋白质合成的促分泌素，以及使用这些化合物的治疗方法。

背景技术：

用于治疗分泌性疾病(包括外分泌胰腺功能不全(epi)和唾液流动病症)的现有疗法不能预防或逆转这些疾病的进展。分泌性疾病通常由其他疾病状态引起或与其共患，其他疾病状态包括囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯、狼疮，或与外科手术相关。在某些情况下，分泌性疾病，例如由囊性纤维化引起的胰腺炎，可能是致命的。在其他情况下，例如由酒精中毒引起的epi，患者经历标准住院治疗，有时需要在重症监护病房，直到他们的疼痛和血液分布正常化。

虽然已知促分泌素如胆囊收缩素(cck)，但这些化合物会增加蛋白质合成并导致蛋白质毒性，从而加剧分泌性疾病的症状。因此需要促分泌素，其不会导致蛋白质毒性或内质网(er)应激的增加。

技术实现要素：

在一个方面，本发明提供治疗个体的分泌性疾病的方法，包括向所述个体施用治疗足量的成纤维细胞生长因子21(fgf21)或fgf21的衍生物。在某些实施方案中，分泌性疾病是外分泌胰腺功能不全(epi)，例如与选自下组的疾病共患的epi：囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯和狼疮。在其他实施方案中，epi由外科手术引起，例如内窥镜逆行胰胆管造影术(ercp)。在其他实施方案中，分泌性疾病是唾液流动病症，例如与选自下组的疾病共患的唾液流动病症：类风湿性关节炎、狼疮和癌症，例如sjorgen综合征。

在某些实施方案中，施用治疗足量的fgf21包括局部、区域、全身或连续施用。在一些实施方案中，施用包括提供单一剂量。根据提供的方法施用还包括口服、静脉内或肌肉内施用。在一些实施方案中，fgf21或fgf21的衍生物以0.1mg至300mg的剂量施用，例如以1mg至200mg的剂量施用。在其他实施方案中，fgf21的衍生物是fgf21的长效衍生物。根据本发明的实施方案施用包括提供包含fgf21或fgf21衍生物的药物组合物，其分散在药学上可接受的载体、缓冲剂或稀释剂中。

在其他实施方案中，本发明提供的方法包括与第二疗法一起提供fgf21，例如其中在施用fgf21或fgf21的衍生物之前提供第二疗法，或者其中在施用fgf21或fgf21的衍生物之后提供第二疗法，或其中第二疗法与fgf21或fgf21的衍生物同时提供。

在某些实施方案中，本发明提供治疗个体的分泌性疾病的方法，其中所述个体是人。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1显示了用于产生klb-t小鼠的crispr/cas9介导的敲入策略。具有靶向klb外显子5的3'utr的序列的单引导rna(其含有前间区序列邻近基序(pam))用于诱导含有tdtomato的hdr模板(供体dna)的重组。hdr具有同源性的2kb左臂(ha-l)和3kb右臂(ha-r)。

图2表明fgf21调节消化酶水平。(a，b)胰腺的h&e染色以20x放大倍数成像，对在过夜禁食和2小时再喂食期之后的野生型(wt)和fgf21敲除(ko)小鼠中的嗜酸性面积分数(a)定量和淀粉酶和脂肪酶水平(b)蛋白质印迹定量。(c，d)胰腺的h&e染色以20x放大倍数成像，对用媒介或1mg/kg重组体fgf21每天两次连续两天处理的wt和fgf2l-ko小鼠中的嗜酸性面积分数(c)定量和淀粉酶和脂肪酶水平(d)蛋白质印迹定量。(e-g)在过夜禁食和2小时再喂食期后，wt小鼠中的胰腺fgf21mrna(e)、胰腺fgf21蛋白(f)和血浆fgf21(g)水平。(h)在施用ad-lib的wt小鼠的cck处理之前(基线)或15分钟后胰液和血浆中的fgf21蛋白水平。结果表示为平均值±s.e.m。对于所有实验，n＝3-6只小鼠/组。*，p<0.05；**，p<0.01；**，p<0.001；****，p<0.0001。

图3显示fgf21作用于腺泡细胞以诱导胰腺消化酶分泌而不影响蛋白质合成。(a和b)用媒介、1mg/kgfgf21或5mg/kgcck处理2小时(a)或15分钟(b)的小鼠中胰蛋白的³h-苯丙氨酸掺入(a)和胰腺磷酸(p)-eif4e-bp1和p-erk1/2(b)的蛋白质印迹定量。(c-f)用媒介或1mg/kgfgf21连续处理2天的wt小鼠(c和d)或杂合(het)对照或β-klotho敲除(ko)小鼠(e和f)的胰液中的胰液流速和淀粉酶水平。(g和h)用媒介、1μg/mlfgf21、10pmcck(原代腺泡细胞)、100pm(ar42j细胞)cck处理或用1μg/mlfgf21和10pmcck(原代腺泡细胞)两者处理30分钟的小鼠原代腺泡细胞(g)和ar42j细胞(h)的淀粉酶分泌。(i和j)用媒介或1mg/kgfgf21连续处理2天的klb^fl/fl和klb^cela1-/-小鼠的胰液中的淀粉酶水平(i)和胰液流速(j)。结果表示为平均值±sem；对于所有实验，n＝4-6只小鼠/组。原代腺泡细胞实验一式三份进行，并且在三个独立实验中获得了类似的结果。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图4表明fgf21通过fgfr-plc-ip3r途径触发细胞内钙释放。(a-e)ar42j细胞中的钙释放通过钙指示剂fluo4-am信号减去背景荧光并归一化至基线荧光(δf/f0)在10x放大倍数下测量2分钟。将细胞成像10秒，然后用1μg/mlfgf21(左图)或100pmcck(右图)处理。黑色箭头表示处理的开始。在(b-e)中，在用1μmpd173074(b)、10μml-364,718(c)、10μmu73122(d)或100μm2-apb(e)成像之前30分钟和成像期间处理细胞。钙瞬变表示为50-200个细胞簇/组的平均钙释放，每个簇含有5-20个细胞。在2个独立实验中获得了类似的结果。(f)来自用1mg/kgfgf21或5μg/kgcck(ip)处理15分钟的wt小鼠的胰腺总(t)和磷酸(p)plcγ1和plcβ3和p-erk1/2的蛋白印迹图像和定量。hsp90是加载对照。结果表示为平均值±sem，n＝4只小鼠/组。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。(g)fgf21对腺泡细胞作用以刺激消化酶分泌的模型。

图5表明ar42j细胞的钙释放的刺激。钙通过从fluo4-am信号中减去背景荧光并归一化至基线荧光(δf/f0)在10x放大倍数下测量2分钟。在成像之前30分钟用1μmpd173074、10μml-364,718、10μmu73122或100μm2-apb处理细胞，然后用媒介处理(黑色箭头)。钙瞬变表示为50-200个细胞簇/组的平均钙释放，每个簇含有5-20个细胞。在2个独立实验中获得了类似的结果。

图6显示fgf21减弱了雨蛙肽诱导的胰腺炎期间的er应激。(a，b)在用雨蛙肽处理以诱导胰腺炎(cip)的野生型(wt)和fgf21敲除(ko)小鼠(a)或wt和fgf2l-转基因(tg)小鼠(b)中通过qpcr分析p-eif2a蛋白和atf4、chop、bip和xbplsmrna的定量。结果表示为平均值+s.e.m。对于所有实验，n＝3-6只小鼠/组。*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

具体实施方式

外分泌胰腺功能不全(epi)是外分泌胰腺不能分泌和递送消化酶到小肠，在那里在消化过程中它们分解营养物质以吸收它们。几种不同的疾病，包括酒精中毒和囊性纤维化，可以引起epi，如果不治疗，患有这种疾病的患者会陷入营养不良状态。

用于治疗epi的现有疗法不能预防或逆转疾病的进展。这部分是因为针对增加外分泌胰腺分泌的已知治疗也起到增加蛋白质合成的作用，导致蛋白质毒性。因此，在囊性纤维化病例中发展的epi通常是致命的，而患有急性或慢性epi的其他原因的患者则需要住院治疗，有时在重症监护病房中。epi不能直接治疗的事实可能导致胰腺癌，现有的疗法无法阻止这种进展。

本发明人惊奇地发现成纤维细胞生长因子21(fgf21)能够增加外分泌胰腺分泌而不会不利地增加蛋白质合成。因此，fgf21能够独特地诱导分泌和胰液流动而不会引起蛋白毒性。虽然先前认为fgf21通过抗炎机制起作用(fisher等，annurevphysiol78：223-241,2016；johnson等，gastroenterology137(5)：1795-1804,2009)，但本公开内容首次表明fgf21通过分泌机制起作用。令人惊讶的是，与包括胆囊收缩素(cck)的经典餐后促分泌素不同，fgf21通过诱导分泌而无蛋白质合成来减轻胰腺内质网(er)应激(蛋白毒性)，这减轻了epi常见的过量蛋白质负荷。本发明还提供了使用fgf21治疗分泌性疾病如epi的新方法。

因此，本发明首次显示fgf21疗法具有预防慢性胰腺炎发展为胰腺癌的潜力。进一步显示fgf21可用于其他分泌性疾病或病症，例如口干症(sjorgen综合征)，其中唾液腺不能产生唾液。还提供了治疗与囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯或狼疮共患或者由外科手术引起的外分泌胰腺功能不全的方法。

i.成纤维细胞生长因子21(fgf21)

成纤维细胞生长因子21(fgf21)是一种激素，其合成和分泌由不同的代谢和细胞应激触发，范围从饥饿到线粒体和er应激。fgf21通过细胞表面受体起作用，所述细胞表面受体由具有酪氨酸激酶活性的常规fgf受体(fgfr)组成，常规fgf受体与β-klotho(一种单通道跨膜蛋白)复合。fgf21、β-klotho和fgfr在外分泌胰腺中共表达，表明胰腺腺泡细胞是体内fgf21作用的位点。因此，在从禁食状态到进食状态的转变期间在整个胰腺中以及在毒胡萝卜素处理后分离的腺泡细胞中诱导fgf21mrna水平，其诱导er应激。虽然fgf21的药理施用减弱了遗传和药理学诱导的小鼠模型中的腺泡细胞损伤，但fgf21在外分泌胰腺中的生物学功能尚不清楚。

本发明人已发现fgf21在外分泌胰腺中起促分泌素的作用，以诱导分泌和胰液流动。在本公开中进一步显示fgf21靶向不同于其他促分泌素的受体，因此不增加蛋白质合成，导致减轻蛋白毒性应激的能力。这种分泌过程受到损害的危及生命的胰腺炎病症包括囊性纤维化和酒精中毒，并且fgf21促进胰腺分泌和汁液流动的能力将缓解这些病症。fgf21还可用于具有分泌能力的其他组织，在其中表达fgf21受体复合物fgfr1/13-klotho，包括唾液腺。因此，fgf21在本公开中首次显示为对分泌性和流动性疾病患者有效的疗法。

ii.fgf21的治疗用途

本公开中显示的可用于fgf21疗法治疗的分泌性和流动性病症包括例如由囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯或狼疮引起或与其共患的外分泌胰腺功能不全。适合于fgf21治疗的其他分泌性疾病包括唾液流动病症，包括sjorgen综合征，以及由外科手术引起的分泌性疾病，包括由内窥镜逆行胰胆管造影术(ercp)产生的epi。根据本文提供的方法，患有这些病症的个体可以用fgf21或fgf21的衍生物治疗以减轻病症的症状。

基于本公开提供的体外和体内fgf21生物活性，本发明的fgf21制剂可以单独使用或与其他治疗剂组合用于治疗以下病症：

外分泌胰腺功能不全(epi)

本文所述的fgf21制剂还可用于治疗epi，例如由囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯或狼疮引起或与之共患。epi是外分泌胰腺不能分泌和递送消化酶到小肠，在那里它们促进营养物质的消化和吸收。因此，患有epi的患者将经历营养不良。epi可以来自其他胰腺疾病，例如胰腺炎和囊性纤维化。用于这些病症的现有疗法仅限于改善症状，并且没有已知的疗法直接解决该病症或预防epi的进展。本文提供的fgf21组合物和衍生物刺激消化酶分泌和胰液流动，并且可以治疗性地用于在患有epi的患者中重建消化酶分泌和流动。本发明的fgf21制剂和疗法可以单独使用或与其他药剂组合使用以治疗或预防epi。

唾液流动病症

如本文所述，fgf21或其衍生物充当促分泌素以增加分泌而不增加蛋白质毒性。因此，fgf21及其衍生物可用于治疗唾液流动病症，包括sjorgen病(口干病)。本发明的fgf21制剂和疗法可以单独使用或与其他药剂组合使用以治疗或预防唾液流动疾病。

内窥镜逆行胰胆管造影术

内窥镜逆行胰胆管造影术(ercp)是一种用于临床研究胆管、胰管和胆囊的技术。该技术包括通过患者口腔引入内窥镜，穿过食道和胃以进入管道排出的十二指肠。内窥镜用于递送无线电造影剂，有助于管道的可视化。这种手术后常见的并发症之一是接受该手术的约10％患者的胰腺炎。

本公开证明用fgf21或其衍生物治疗可减轻胰腺炎。fgf21已被批准用于其他临床适应症，并在人类个体中测试其安全性和功效。因此，用本文提供的fgf21制剂治疗可用于预防或减轻ercp引起的胰腺炎。在某些实施方案中，fgf21治疗可以是预防性的，并且可以包括在可以引发胰腺炎的外科手术之前施用fgf21或其衍生物。

急性或慢性胰腺炎

在美国，急性和慢性胰腺炎的发病率显著增加，其中每100,000人中约有50人会经历胰腺炎。目前的慢性和急性胰腺炎的护理标准仅限于住院治疗，只要患者经历这种疾病的一些并发症，例如腹痛、呕吐和恶心。本文提供的fgf21制剂和衍生物可用于预防和治疗急性和慢性胰腺炎。本文显示fgf21及其衍生物在胰腺炎的啮齿动物模型中有效降低炎症和胰腺损伤。

如本文所述，fgf21或其衍生物充当促分泌素以增加分泌而不增加蛋白质毒性。因此，fgf21及其衍生物可用于治疗急性或慢性胰腺炎，例如由囊性纤维化、酒精中毒、胰腺炎、胰腺癌、胆结石、乳糜泻、高甘油三酯或狼疮引起或与之共患。本发明的fgf21制剂和疗法可以单独使用或与其他药剂组合使用以治疗或预防急性或慢性胰腺炎。

癌症

本文所述的fgf21制剂还可用于治疗癌症或癌前病症，例如由epi进展引起的胰腺癌。现有疗法针对症状，并不治疗epi的根本原因或预防发展为胰腺癌。本发明的fgf21制剂和疗法可以单独使用或与其他药剂组合使用以治疗或预防癌症或癌前病症。

iii.外分泌胰腺功能不全和蛋白质毒性

epi是外分泌胰腺不能分泌和递送消化酶到小肠，在那里它们在消化过程中分解营养物质以吸收它们。结果，如果不治疗，患有epi的患者会陷入营养不良状态。几种不同的疾病，如酒精中毒和囊性纤维化可以引起epi。本文提供的fgf21或fgf21衍生物制剂通过诱导胰腺分泌和流动起到预防或治疗epi的作用。fgf21通过与经典的餐前促分泌素(例如cck)的不同受体起作用，并且该受体在慢性胰腺炎或囊性纤维化期间不受影响。这允许重建正常的胰腺分泌。

在epi的情况下，唯一可用的治疗是胰酶替代疗法(pert)。pert仅改善epi患者的营养不良状态，但不能解决胰腺功能不全病症。胰腺炎不能用现有疗法直接治疗的事实可能导致胰腺癌。

胰腺腺泡细胞合成并分泌比任何其他成体细胞类型更多的蛋白质，这意味着它们必须具有最小化蛋白质错误折叠和相关的内质网(er)应激的机制。此外，用作分泌性疾病疗法的经典胰腺促分泌素诱导蛋白质合成，导致蛋白质毒性。本发明人在本公开中首次显示fgf21或其衍生物可用于诱导外分泌胰腺中的分泌，而没有有害的蛋白毒性。

iv.药物组合物

可以施用本发明的fgf21或fgf21衍生物以治疗分泌性疾病，包括epi、唾液流动疾病或由本文所述的外科手术引起的epi。它们可以通过可用于与药物联合使用的任何常规方法施用，或作为单独的治疗活性成分使用或与治疗活性成分组合使用。它们可以单独施用，但通常与基于所选施用途径和标准药学实践选择的药学上可接受的载体一起施用。

本发明的含水组合物将具有有效量的fgf21或fgf21衍生物以起到促分泌素的作用，而不会引起蛋白质毒性。通常将这些组合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。

短语“药学上可接受的”或“药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。这些介质和药剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则考虑其在治疗组合物中的用途。补充的活性成分，例如其他抗高血压剂、抗炎剂或抗生长剂，也可以掺入组合物中。

除配制用于肠胃外施用如静脉内或肌内注射的化合物外，其他药学上可接受的形式包括例如用于口服施用的片剂或其他固体；时间释放胶囊；和目前使用的任何其他形式，包括乳膏、乳液、漱口水、吸入剂、脂质载体、脂质体等。

口服施用

在某些实施方案中，本发明的活性化合物可以口服施用。对于通常对消化酶的蛋白水解具有抗性或已经具有抗性的试剂，可以考虑这种方法。预期这些化合物包括所有那些化合物或药物(其可从制造商以片剂形式获得)及其衍生物和类似物。

对于口服施用，本发明的活性化合物可以与例如惰性稀释剂或可同化的食用载体施用，或者它们可以包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或压制成片剂，或直接掺入饮食的食物。对于口服治疗施用，活性化合物可与赋形剂混合并以可摄入的片剂、口腔片、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆、晶片等形式使用。此类组合物和制剂应含有至少0.1％的活性化合物。当然，组合物和制剂的百分比可以变化，并且可以方便地为单位重量的约2％-约60％。在这种治疗上有用的组合物中活性化合物的量使得可以获得合适的剂量。

片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有下列物质：粘合剂、黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料外，它还可以含有液体载体。各种其他材料可以作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包衣。酏剂糖浆可含有活性化合物，蔗糖作为甜味剂，对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯作为防腐剂，染料和调味剂，如樱桃或橙子调味剂。当然，用于制备任何剂量单位形式的任何材料应该是药学上纯的并且在使用的量上基本上无毒。此外，活性化合物可以掺入缓释制剂和配制剂中。

在配制时，本发明的fgf21或fgf21衍生物将以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型施用，例如下面在具体实施例中描述的那些。

肠胃外施用

本发明的活性化合物也可配制用于肠胃外施用，例如配制用于通过静脉内、肌肉内、皮下或甚至腹膜内途径注射。根据本公开内容，本领域技术人员已知含有本发明的fgf21或fgf21衍生物作为活性成分的含水组合物的制备。通常，这种组合物可以制成注射剂，可以是液体溶液或悬浮液；也可制备在注射前加入液体后适于制备溶液或悬浮液的固体形式；并且也可以乳化该制剂。

作为游离碱或药理学上可接受的盐的活性化合物的溶液可以在适当地与表面活性剂如羟丙基纤维素混合的水中制备。分散体也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在通常的储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物的生长。

在一些形式中，希望以盐的形式配制本发明的化合物，通常是为了改善溶解度和生物利用度，并提供更容易被同化的活性药物形式。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指在具有合适的生理学耐受的酸的溶液中酸化fgf21或其衍生物形成的化合物。合适的生理学耐受的酸是有机酸和无机酸，例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、草酸、丙二酸、水杨酸、马来酸、甲磺酸、异硫酸、乳酸、葡萄糖酸、葡糖醛酸、氨基磺酸、苯甲酸、酒石酸和巴莫(pamoaic)酸。通常，在使用前提供或混合这种盐形式的活性化合物。

适于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液；包括芝麻油、花生油或丙二醇水溶液的制剂；和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的并且必须是流动的，以便存在轻易可注射性。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止微生物如细菌和真菌的污染作用。

可以将活性化合物配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐，其由无机酸例如盐酸或磷酸或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成。

本发明化合物还可以配制成包含脂质体或任何其他脂质载体的组合物。脂质体包括多囊脂质体、多层脂质体和单层脂质体。

载体也可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用涂层如卵磷脂，在分散的情况下通过维持所需的粒度和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。

通过将所需量的活性化合物与适当的溶剂与上面列举的各种其他成分(如果需要)混合，然后过滤灭菌，制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介中来制备分散体，所述无菌媒介含有基础分散介质和来自上面列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。

在配制时，溶液将以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。制剂易于以多种剂型例如上述可注射溶液的类型施用，甚至可以使用药物释放胶囊等。

例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如果需要，溶液应适当缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适用于静脉内，肌肉内，皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开，可以使用的无菌含水介质对于本领域技术人员而言是已知的。例如，可以将一个剂量溶解在1ml等渗nacl溶液中，并且或将其添加到1000ml的皮下注射液中或者在建议的输注部位注射(参见例如，“remington'spharmaceuticalsciences”第15版，第1035-1038页和第1570-1580页)。取决于所治疗的个体的病症，剂量的一些变化必然发生。在任何情况下，负责施用的人员将确定个别个体的适当剂量。

v.疗法

实现这一目标的一种方法是将新药与传统疗法相结合。在本发明的上下文中，预期本发明提供的fgf21或其衍生物可以与新的或现有的药剂、手术、化学疗法、放射疗法和/或基因疗法联合使用。

“有效量”或“治疗上足够的量”是足以产生治疗益处的化合物的量(例如，有效地起到抗高血压和/或抗炎和/或抗生长剂的作用)。在治疗个体中的上下文，有效量足以产生治疗益处。如本文所用的术语“治疗益处”是指在个体疾病的医学治疗方面促进或增强个体健康的任何事物。治疗益处的非穷举性列表包括延长患者任何时间段的生命；减少或延迟疾病的发展；高血压减少；炎症减少；细胞生长或增殖减少；和/或对可归因于患者病情的个体的疼痛减轻。

术语“约”用于指示值，其包括用于确定值的设备或方法的误差的标准偏差。权利要求中术语“或”的使用用于表示“和/或”，除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开支持仅涉及替代方案和“和/或的定义。“当与权利要求中的“包括”或其他开放语言一起使用时，除非特别指出，否则词语“一”和“一个”表示“一个或多个”。术语“包含”、“具有”和“包括”是开放式连接动词。这些动词中的一个或多个的任何形式或时态，例如“包括”、“包含”、“具有”、“有”、“包括”和“包括”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅拥有那些一个或多个步骤，且还包括其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一种或多种性状的任何植物不限于仅拥有那些一种或多种性状并涵盖其他未列出的性状。

当在权利要求和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变化包括任何可测量的减少或完全抑制以实现期望的结果。

在说明书和/或权利要求中使用的术语“有效”意味着足以实现期望的、预料的或预期的结果。

从下面提供的详细描述和实施例中，本发明的其他目的、特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，当指出本发明的具体实施方案时，提供的详细描述和任何具体实例仅以说明的方式给出，因为在本发明的精神和范围内的各种改变和修改可由本领域技术人员从本详细描述可以显而易见地得到。

实施例

实施例1.fgf21-敲除小鼠和fgf21-转基因小鼠

小鼠研究

将fgf21-敲除(ko)小鼠(potthoff,etal.,procnatlacadsciusa106,10853-10858,2009)、fgf21-转基因(tg)小鼠(inagaki,etal.,cellmetab5,415-425,2007)、klb-t和wt同窝出生小鼠维持在c57b1/6j背景上。将β-klotho-ko和杂合同窝出生小鼠保持在混合的c57bl/6j；129/sv背景上(ding,etal.,cellmetab16,387-393,2012)。将所有小鼠圈养在无病原体的设施中并喂食标准饲料(harlanteklad2916)。对于禁食再喂食实验，将小鼠禁食过夜，然后用标准食物饲料再喂食2小时。通过施用50μg/kg的雨蛙肽(sigma)进行7小时腹膜内注射诱导急性胰腺炎，而对照组中的小鼠注射盐水。使用小鼠fgf21elisa试剂盒(biovendor)测量血浆中的fgf21。所有实验使用雄性小鼠。

使用如所述的crispr/cas9敲入法(yang,etal.,cell154,1370-1379,2013)产生β-klotho-tdtomato(klb-t)报告小鼠。tdtomato基因的编码区与klb基因的最后编码外显子(外显子5)的3'末端框内融合。将具有seqidno：1序列的单个引导rna(靶向klb外显子5的3'utr)与cas9mrna(trilinkbio)和环状同源定向修复(hdr)模板一起显微注射到c57b1/6j受精卵中，环状同源定向修复(hdr)模板含有与由同源序列的左(2kb)和右(3kb)臂结合的tdtomato融合的klb外显子5(图1)。将注射的受精卵植入假孕雌性c57b1/6j小鼠中。通过pcr从尾部dna筛选出来自这些显微注射的小鼠以验证hdr模板插入，并且在用wtc57b1/6j小鼠进行的第二代育种中证实种系传递以消除任何潜在的镶嵌性。对于该研究，使用雄性纯合klb-t和它们的wt同窝出生仔。

胰液收集

用媒介(10mmna2hpo4,2％[w/v]甘油，ph7.6)或1mg/kg人重组fgf21(novonordisk)皮下注射小鼠，每天两次，连续两天。将小鼠禁食6小时，收集胰液15分钟。在收集胰液前1小时给予媒介或fgf21的最终注射。

胰蛋白合成的测量

通过使用³h-苯丙氨酸的大剂量方法测量胰蛋白质合成(sans,etal.,americanjournalofphysiology287,g667-675,2004)。

实时定量pcr

使用rna-stat60(isotexdiagnostics)提取来自胰腺的rna。使用高容量cdna逆转录试剂盒(lifetechnologies)从rna(2μg)产生cdna。qpcr通过所述的sybrgreen方法进行(bookout,etal.currentprotocolsinmolecularbiology/ed.ausubel,chapter15,unit15-18,2006)。

组织学

将小鼠胰腺在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜，然后石蜡包埋，切片并苏木精和伊红染色。对于新鲜冷冻组织学，快速解剖胰腺，在冷却的异戊烷中快速冷冻并切片为14-16μm。然后将切片在10％中性缓冲福尔马林中于4℃固定15分钟，在1xpbs中洗涤3次并用含有dapi(vectorlaboratories)的vectashield封固剂固定。用zeissaxioscanz1载玻片扫描仪以20x放大率获得图像。使用imagej.进行嗜酸性区域的定量。

免疫印迹法

使用fastprep-24裂解基质珠管(mpbiomedicals)在1xripa缓冲液(cellsignalingtechnology)中匀浆胰腺，所述缓冲液补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(roche)的混合物。使用dc蛋白质测定法(biorad)测量蛋白质裂解物浓度。加载相等的蛋白质量并在420％sds-聚丙烯酰胺凝胶(biorad)中电泳，并转移到硝酸纤维素膜(biorad)上。用tbst中的5％bsa封闭膜1小时。用抗fgf21、淀粉酶和脂肪酶(santacruz)、β-肌动蛋白(abcam)、p-eif2a、p-erk1/2和p-eif4e-bp1(cellsignalingtechnology)的抗体在4℃下探测膜过夜。然后将膜与抗一抗的宿主物种的hrp缀合的二抗(cellsignalingtechnology)一起温育1小时。使用supersignalwest化学发光试剂盒(thermo)显影膜，并用imagequantlas4000发光成像仪(generalelectric)检测信号。使用imagej.进行定量。

统计分析

使用学生t检验进行两组分析。使用newman-keuls事后校正(graphpadprism)的单向和双向anova进行多组分析。数据表示为平均值±sem；p<0.05被认为是显著的。

实施例2.fgf21-敲除小鼠的胰腺表型

检查fgf21敲除(ko)小鼠以确定它们是否表现出胰腺表型。h&e染色的胰腺切片的组织学分析揭示，禁食和喂养小鼠的fgf21-ko胰腺中的嗜酸性染色显著增加，表明酶原颗粒密度增加(图2a)。为了支持这一观察结果，在禁食和再喂食期间，fgf21-ko胰腺中的淀粉酶和脂肪酶水平更高(图2b)。外源性fgf21的施用使fgf21-ko小鼠中的胰嗜酸性面积分数降低至野生型(wt)水平(图2c)。免疫印迹分析证实fgf21处理后fgf21-ko小鼠的胰腺消化酶水平相应降低(图2d)。再喂食期间在胰腺中诱导fgf21mrna和蛋白质水平(图2e和2f)。然而值得注意的是，再喂食降低了血浆中的fgf21浓度(图2g)，证明fgf21不是从外分泌胰腺分泌到血液中。相反，与ad-lib喂养的小鼠wt小鼠的血浆相比，在胰液中观察到200倍更高水平的fgf21(图2h)。此外，用已知显著增加胰酶合成的cck处理导致胰液中fgf21浓度进一步增加3倍而血液中没有任何变化(图2h)。因此，响应于生理和药理学应激，fgf21以自分泌或旁分泌方式起作用以调节胰腺消化酶水平。

实施例3.fgf21对胰蛋白合成的影响

fgf21可通过或抑制蛋白质合成或增加其分泌来降低胰腺腺泡细胞中的消化酶浓度。检测了与cck相比fgf21对胰蛋白合成的影响。如所预期的，cck施用显著增加了掺入胰蛋白中的³h-苯丙氨酸(图3a)。相反，fgf21施用对胰蛋白合成没有显著影响(图3a)。与该蛋白质合成谱一致，cck增加真核翻译起始因子4e结合蛋白1(eif4e-bp1)的磷酸化，而fgf21没有作用(图3b)。fgf21和cck均诱导胰腺中的erk1/2的磷酸化(图3b)，证明它们都在胰腺中发出信号。因此，fgf21不会通过抑制蛋白质合成来降低胰腺中的消化酶水平。此外，与cck不同，fgf21不刺激胰蛋白合成。

在我们的研究中使用的fgf21化合物是来自novonordisk的人重组fgf21。虽然这种化合物是人fgf21的天然形式，但其他fgf21类似物和模拟物是可用的；所有这些都靶向fgfr/β-klotho受体复合物。这些fgf21衍生物中的一些包括但不限于：ly2405319(lillyresearchlaboratories)、fgf21-模拟单克隆抗体mimabl(amgen)、pf-05231023(pfizer)、fgf21-模拟激动性抗fgfr1(fgf受体1)抗体rimabs(genentech)。

实施例4.fgf21对胰腺蛋白分泌的影响

小鼠原代腺泡细胞的制备

通过修改公开的方案(williams,etal.,theamericanjournalofphysiology235,517-524,1978)制备原代腺泡细胞。简而言之，通过断头处死小鼠，然后解剖并在1xpbs中洗涤胰腺。用30g注射器将胰腺消化培养基(0.75mg/mlxi-s型胶原酶[sigma]、0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂[sigma]、dmem中的1％bsa)注入胰腺实质中。然后将胰腺在消化培养基中温育20-40分钟，同时使用直径逐渐减小的血清移液管进行恒定混合。将细胞通过100μm过滤器过滤，并用温育培养基(0.1mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、dmem中的1％bsa)洗涤3次，每次洗涤以50xg离心3分钟。将细胞铺板并使其在37℃的温育培养基中恢复2小时。

细胞分泌测定

用媒介、fgf21(对于原代腺泡细胞和ar42j均为1μg/ml)或cck(对于原代腺泡细胞为10pm，对于ar42j细胞为100pm[phoenixpharmaceuticals])在37℃下处理原代腺泡和ar42j细胞30分钟。使用淀粉酶测定试剂盒(abcam)分析细胞培养基和细胞中的淀粉酶水平。

钙成像

ar42j细胞在37℃下预加载1μm的钙指示剂fluo4-am(lifetechnologies)30分钟。在指示的情况下，在fluo4-am预加载期间向成像培养基(dmem，不含酚红)中加入1μmpd173074(sigma)、10μml-364,718(tocrisbioscience)、10μmu73122(tocrisbioscience)或100μm2-apb(tocrisbioscience)。细胞在具有10x物镜的bdpathway855生物成像仪上成像。通过自动流体递送机制在基线荧光采集后10秒递送媒介、fgf21(1μg/ml)和cck(100pm)，并成像总共2分钟。使用imagej作为δf/f0计算钙释放，其中δf是来自细胞的原始荧光信号(f)减去它们的背景荧光(从其中没有预期细胞和荧光信号的区域计算)，并且f0是添加化合物前的前6帧的平均值。样品大小(n)对应于用含有5-20个细胞的每个细胞簇测量的细胞簇数。

为了探究fgf21是否也在体内直接作用于胰腺腺泡细胞，我们产生了可诱导的腺泡细胞特异性β-klotho(klb)敲低小鼠模型，其中cre重组酶表达处于修饰的雌激素受体和弹性蛋白酶启动子的控制之下。在携带cre等位基因的floxedklb小鼠(klb^cela1-/-)中证实了他莫昔芬施用后klb表达的有效敲低。在禁食条件下，klb^cela1-/-小鼠的血浆fgf21浓度没有变化。与fgf21ko小鼠类似，klb^cela1-/-小鼠具有增加的酶原颗粒密度和胰腺消化酶浓度。为了测试fgf21是否直接作用于胰腺腺泡细胞以刺激分泌，用媒介或fgf21处理klb^fl/fl和klb^cela1-/-小鼠并收集胰液15分钟。在klb^cela1-/-小鼠中不存在fgf21对消化酶分泌的影响(图3i)，并且对胰液流速的影响显著降低但未消除(图3j)。关于后一结果，我们没有使用表达β-klotho和tdtomato融合的敲入小鼠检测胰腺导管上皮细胞中的β-klotho表达(图s3)，表明fgf21不直接作用于导管细胞。此外，fgf21不会增加促胰液素的血液浓度，促胰液素是一种作用于胰管细胞以诱导胰液流动的小肠激素。因此，需要进一步研究fgf21对胰液流速的剩余影响的基础。然而，数据表明fgf21直接作用于胰腺腺泡细胞以刺激汁液流动和消化酶分泌。

实施例5.fgf21信号传导

cck通过激活磷脂酶c(plc)-肌醇三磷酸受体(ip3r)信号传导级联来刺激外分泌胰腺的分泌，所述信号级联诱导细胞内钙从er释放。在外分泌胰腺中表达的fgf21共受体fgfr1也激活plc，表明fgf21可能通过类似的机制发挥作用。为了支持这一点，用fgf21或cck处理ar42j细胞引发细胞内钙释放(图4a)。有趣的是，与cck相比，用fgf21处理后钙释放曲线在动态和时间上是不同的：而cck处理后30秒内钙水平达到峰值，fgf21的作用更持久，处理后1-2分钟钙水平达到峰值(图4a)。由fgf21引发的钙释放被fgf受体拮抗剂pd173074阻断，但不被cck-a受体拮抗剂l-364,718阻断；相反，cck介导的钙释放被l-364,718而不是pd173074阻断(图4b和c)。用plc抑制剂u73122或ip3r抑制剂2-apb处理ar42j细胞阻断了fgf21和cck引起的钙释放(图4d和e)。没有一种抑制剂可以自行影响钙释放(图5)。总之，这些数据表明fgf21和cck通过不同的细胞表面受体起作用以参与下游plc-ip3r途径并在胰腺腺泡细胞中引发钙释放。

cck-a受体的活化导致plc的b同种型的磷酸化、钙释放和随后的分泌。相反，fgf受体激活γ同种型。为了探究fgf21和cck是否具有针对plc同种型的不同激活曲线，我们用媒介、fgf21或cck处理wt小鼠15分钟。正如预期的那样，cck诱导了plcβ的磷酸化(图4f)。相反，fgf21诱导了plcγ的磷酸化(图4f)。fgf21和cck均诱导erk1/2磷酸化，证明在施用cck或fgf21后15分钟信号传导在胰腺中是有活性的(图4f)。总之，这些数据显示fgf21和cck通过不同的细胞表面受体和plc同种型起作用以参与下游ip3r介导的胰腺腺泡细胞中的钙释放。

实施例6.fgf21在药理学诱导的胰腺炎中的作用

fgf21保护小鼠免受强效cck类似物雨蛙肽诱导的胰腺炎。然而，这种有益效果背后的机制尚不清楚。研究了fgf21是否通过刺激胰腺分泌来防止雨蛙肽诱导的胰腺炎(cip)，从而减轻er应激和组织损伤。在wt和fgf21-ko小鼠中诱导cip并测量er应激的标志物，包括真核翻译起始因子2(eif2)亚基的磷酸化和活化转录因子4(atf4)、ccaat-增强子结合蛋白同源蛋白质(chop)和免疫球蛋白-重链结合蛋白(bip)的诱导。cip在wt和fgf21-ko小鼠的胰腺中引起强烈的er应激反应(图6a)。然而，在fgf21-ko小鼠中，er应激加剧，正如磷酸化eif2和atf4、chop和bipmrna的水平显著增加所证明的那样(图6a)。相反，使用肝特异性转基因(其将循环fgf21升高至超生理水平)慢性施用fgf21，抑制响应于cip的这些er应激参数(图6b)。这些数据表明fgf21减轻药理学诱导的胰腺er应激，从而恢复腺泡细胞的蛋白质稳定。

本发明首次表明fgf21通过胰腺腺泡细胞上的自分泌或旁分泌信号传导机制起作用，以刺激酶原分泌和胰液流动。与典型的胰腺促分泌素cck一样，fgf21通过激活plc/ip3r信号传导和钙释放诱导分泌。然而，重要的是，fgf21通过不同于cck的受体复合物起作用，并且不伴随诱导蛋白质合成。因此，与cck不同，fgf21减轻了在生理条件下的胰腺中可能发生的er应激，例如禁食/再喂食或诸如胰腺炎的病理状况。

实施例7.内窥镜逆行胰胆管造影术

为了评估fgf21是否赋予抗ercp诱导的胰腺炎的有益作用，在建立的ercp啮齿动物模型(在ercp后24小时发展为胰腺炎)中进行了临床前研究。雌性swisswebster小鼠用以下方式皮下注射媒介或1mg/kgfgf21进行治疗：ercp前1天注射1次，ercp手术当天注射2次，ercp后1天注射1次。对小鼠进行ercp手术，该手术由通过胰管的高压输注放射性造影剂组成。小鼠胰腺的组织学分级揭示，fgf21降低ercp后的水肿和炎症。

将根据本发明的fgf21或其衍生物施用于ercp后患有epi的个体，导致分泌增加而不增加蛋白质合成，从而治疗epi的根本原因并起到解决er应激的作用。

fgf21或fgf21衍生物可以预防性地(在ercp之前)、在手术期间或在手术之后通过口服、静脉内或肌内注射施用。典型的剂量可以在0.1-300mg之间，这取决于各个fgf21类似物的药代动力学。例如，根据要使用的fgf21类似物，剂量可以在1-200mg、10-150mg或50-100mg之间。

实施例8.胰腺炎

将根据本发明的fgf21或其衍生物施用于患有胰腺炎的个体，导致分泌增加而不增加蛋白质合成，从而治疗胰腺炎的根本原因并起到解决er应激的作用。

fgf21或fgf21衍生物将通过口服、静脉内或肌内注射施用。典型的剂量可以在0.1-300mg之间，这取决于各个fgf21类似物的药代动力学。例如，根据要使用的fgf21类似物，剂量可以在1-200mg、10-150mg或50-100mg之间。

实施例9.外分泌胰腺功能不全

将根据本发明的fgf21或其衍生物施用于患有epi的个体，导致分泌增加而不增加蛋白质合成，从而治疗epi的根本原因并起到解决er应激的作用。

fgf21或fgf21衍生物将通过口服、静脉内或肌内注射施用。典型的剂量可以在0.1-300mg之间，这取决于各个fgf21类似物的药代动力学。例如，根据要使用的fgf21类似物，剂量可以在1-200mg、10-150mg或50-100mg之间。