转移性癌症的诊断和治疗方法与流程

本发明一般是针对癌症诊断和治疗。更具体地说，本发明是针对受试者转移性癌症的诊断和治疗方法。

背景技术：

肿瘤转移性传播是与癌症相关的死亡的主要原因(mehlen和puisieux,自然癌症综述6:449-458,2006)。虽然手术切除原发性肿瘤与全身化疗联用已经在成功应用于治疗局部癌症，但转移性癌症已被证明显著抵抗现代靶向疗法，使得这些癌症无法治愈。事实上，为了减轻进一步转移的风险，许多患者都接受针对高度病变的、会对生活质量产生负面影响的治疗方案(lauer等，专家意见药物发现10:81-90,2015)。从表面上看，专门针对肿瘤细胞转移性传播限速步骤的治疗，可以通过消除系统性疾病的威胁，显著改善癌症治疗，并减少我们对全身治疗的依赖性和全身治疗的有害的副作用(steeg,自然癌症综述16:201-218,2016；li和kang,药理学和治疗学161:79-96,2016；zijlstra等,癌症细胞13:221-234,2008；mehlen和puisieux,自然癌症综述6:449-458,2006)。

转移的过程取决于肿瘤细胞渗入血流，传播到远处的位点，逃避免疫检测，存活，增殖然后定殖在新的微环境的能力(valastyan和weinberg,细胞147:275-292,2011)。之前的研究已经证明，肿瘤细胞的渗入率高度依赖于体内肿瘤细胞的运动能力，并且当使用靶向四跨膜蛋白cd151的转移阻断抗体抑制肿瘤细胞的运动能力时，癌细胞的内渗和远处转移都被阻断(zijlstra等,癌症细胞13:221-234,2008；palmer等,癌症研究74:173-187,2014)。考虑到驱动体内肿瘤细胞运动能力和渗入血管的基因和信号传导网络，与有效形成原发性肿瘤所需的基因和信号传导网络不同，鉴定和干扰这些基因可能会阻止肿瘤细胞渗入血管和转移。此外，用于检测早期转移性疾病的改良测试可以在肿瘤转移完全显现出来之前提供治疗机会，并且潜在地改善癌症晚期患者的整体存活率。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防受试者癌症转移的方法。此方法包括，向受试者给药以下中的至少一种的调节物的有效剂量：kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122。在一个实施方案中，向受试者给药以下中的至少一种的抑制剂的有效剂量：kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b。在另一个实施方案中，向受试者给药有效剂量的mirna122或能够上调mirna122表达的化合物。

根据本发明更深层次的一个方面，本发明提供了检测患者体内kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122的方法。此方法包括：从人类患者获得生物样本；通过使样本与kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b、mirna122抗体，或与kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b、mirna122mrna互补的核酸接触，检测kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b、mirna122是否存在于样本中，以及检测kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b、mirna122和抗体的结合，或检测与kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b、mirna122mrna互补核酸的杂交。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种诊断和治疗患者癌症转移的方法。该方法包括：从人类患者身上获得生物样本；检测至少一种kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b是否存在于生物样本中，和/或mirna122不存在于生物样本中；当在生物样本中检测到kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b的存在，和/或未检测到mirna122的存在时，诊断患者的转移性癌症或转移性癌症的发展；向诊断的患者给药以下中的至少一种的抑制剂的有效剂量：kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b，和/或有效剂量的mirna122，或能够上调mirna122表达的化合物。

根据本发明更深层次的一个方面，本发明提供了kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122中的至少一种用于诊断受试者体内转移性癌症的用途。

根据本发明的另一方面，本发明提供了以下中的至少一种的抑制剂：kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b和/或有效剂量的mirna122，或能够上调mirna122表达的化合物用于预防受试者体内癌症转移的用途。

在一个实施方案中，抑制剂是基因沉默核酸分子或小分子。例如，基因沉默核酸分子是短干扰rna，反义寡核苷酸，短发夹rna，microrna，核酶或其他rna干扰分子。小分子是肽，类肽，氨基酸，氨基酸类似物，有机化合物或无机化合物。

在更深层的实施方案中，人类患者患有癌症。

在又一个实施方案中，生物样本是肿瘤活组织切片。

附图说明

本发明的这些以及其他特征、方面、优点见以下说明及附图，便于大家理解，其中：

图1是筛选鉴定出来的癌细胞在体内浸润所需要的基因的图示。a)靶向kif3b、srpk1或nr2f1的scrambleshrna或shrna转导的hep3细胞产生的转移集落。插图显示在转移集落内代表性细胞轨迹。b)左图显示靶向kif3b、srpk1或nr2f1的scrambleshrna或shrna转导的hep3细胞产生原发性肿瘤浸润的前缘。浸润前缘的代表性细胞轨迹见插图。右图显示左图中红色虚线方框的浸润性细胞。有颜色的箭头指向由单个的、相应颜色(c1-c3)标记的细胞形成的细胞突起。c)从(a)中控制和突变的细胞系的单独的细胞转移速率。d)从(a)中控制和突变的细胞系的单独的细胞转移位移速率(生产率)。e)从(b)中控制和突变的细胞系的单独的细胞转移速率。d)从(b)中控制和突变的细胞系的单独的细胞转移位移速率(生产率)。g)每个从(b)中转移出原发性肿瘤细胞系区域的浸润性细胞数量。h)从(b)中控制和突变的细胞系的每个细胞的细胞突起数量。

图2是在体内以筛选鉴定出来的基因为靶点阻断自发性肿瘤细胞转移的图示。a)皮下注射对照组(scramble)shrna转导的hep3细胞，或稳定表达shrna(靶向kif3b,srpk1和nr2f1)的hep3细胞的裸鼠肺的立体荧光图；b)用人aluq-pcr精确定量转移到肺的hep3癌细胞。数据是相对转移负荷百分比，和当用标准曲线估算的检测到的癌细胞总数(有颜色的数字)；c)对照组的原发性肿瘤重量和实验中采用的敲减细胞系诱导肿瘤的重量。

图3是通过再注射对筛选鉴定出来的克隆进行定量验证的图示。a)筛选鉴定出来的单独的紧密集落形成的克隆代表性图像。插图显示了按克隆的丰度排序，克隆的复合c.i.得分和shrna。还显示了由原始的(wt)和scrambleshrna转导的hep3细胞形成的代表性集落。选择用于进一步分析的shrna用红色高亮显示；b)筛选鉴定出来的克隆的线性指数分布；c)筛选鉴定出来的克隆的密度指数分布；和d)筛选鉴定出来的克隆的面积指数分布。

图4是筛选鉴定出来的基因表达敲减突变细胞系的生殖的图示。a)kif3b突变体和对照细胞系(hep3，mda-mb-231和pc3)的蛋白质印迹分析。b)srpk1突变体和对照细胞系(hep3，mda-mb-231和pc3)的蛋白质印迹分析。c)nr2f1突变体和对照细胞系(hep3和mda-mb-231)的蛋白质印迹分析。d)tmem229b突变体和对照细胞系(hep3,野生型hep3的表达设为100％)的q-pcr分析。e)c14orf142突变体和对照细胞系(hep3,野生型hep3的表达设为100％)的q-pcr分析。(d)和(e)中的插图显示了由tmem229b和c14orf142的第二个独立shrna诱导的集落的代表性图像。

图5是在体外kif3b和srpk1表达敲减对癌细胞转移的影响的图示。使用磁性附着板改进的细胞划痕测定，磁性附着板被用作参考标准，a)对照组和突变kif3b细胞系的mats(磁性附着板)体外转移测定。b)对照组和突变srpk1细胞系的mats(磁性附着板)体外转移测定。每个细胞系的野生型的平均值设定为100％。

图6是提高筛选鉴定出来的基因的表达与人类主要类型的癌症中的癌细胞转移行为相关的图示。a)在皮肤癌，前列腺癌，头颈癌，肺癌，卵巢癌和结肠癌(oncomine)中的转移病灶与原发性肿瘤中选择的筛选采集点的表达。b)皮肤癌(黑色素瘤)中的nr2f1，c14orf142和kif3b表达的免疫组化分析。c)在前列腺癌中srpk1和kif3b表达的免疫组化分析。d)在头颈癌(鳞状细胞癌)中kif3b表达的免疫组化分析。e)在肺癌中srpk1表达和tmem229b表达的免疫组化分析。f)在卵巢癌中nr2f1表达的免疫组化分析。g)在结肠癌中nr2f1表达的免疫组化分析。红色箭头指向浸润肿瘤的前缘。

图7是相对于阳性(抗cd151)和阴性(scrambleshrna)对照的筛选采集点的复合紧凑度指数(c.i.)分布的图示。筛选采集点比用绿色表示的阴性对照有更显著的紧凑度。图中包含以粗体表示的单个shrna物种的克隆。对于包含多个shrna的克隆，只显示两个最主要的shrna。采用单因素方差分析和fisher'slsd检验(*p<0.05,**p,0.01,***p<0.001)确定显著性差异。

图8是提高筛选鉴定的mirna的表达阻断浸润转移病灶的形成的图示。a)表达对照组，mir122，mir374b或抗mirna-130b构建体组的癌细胞形成的转移病灶。b)表达对照组，mir122，mir374b或抗mirna-130b构建体的癌细胞形成的转移病灶的癌细胞-血管接触长度的定量。c)表达对照组，mir122，mir374b或抗mirna-130b构建体的癌细胞形成的转移病灶的接触血管的癌细胞百分比的定量。

图9是提高筛选鉴定出来的mirna的表达阻断癌细胞浸润的图示。a)由表达对照组(红色)或mir122(绿色)过表达的癌细胞形成的转移病灶。b)表达对照组(红色)或mir122(绿色)过表达的癌细胞的细胞转移轨迹。c)表达对照组(红色)或mir122过表达构建体的癌细胞位移速率的定量。d)表达对照组(红色)或mir122过表达(绿色)的癌细胞的转移负荷(自发转移)的定量。

图10是提高筛选鉴定出来的mirna的表达阻断癌细胞沿着血管系统浸润的图示。a)scramble对照组(红色)或mir122(绿色)过表达的癌细胞紧挨着血管壁。b)癌细胞与血管接触的长度或mir122过表达细胞(两种独立构建体)。c-d)用颜色代表对照组和mir122过表达的癌细胞沿血管系统的突起。e)对照组和mir122过表达癌细胞的癌细胞突起-血管壁角度的定量。f)对照组和mir122过表达的癌细胞与血管定向胶原纤维(shg)相互作用的图像。

图11是提高筛选鉴定出来的mirna的表达阻止癌细胞侵入胶原基质的图示。a)scramble对照组的癌细胞，mir122过表达的癌细胞或mt1-mmp抑制剂(phenantrione，ph)处理过的细胞侵入3d胶原基质(鼠尾胶原凝胶)中。b-c)癌细胞侵入胶原基质和胶原降解的定量。d)来自(a)的代表性光学切片显示由对照组的癌细胞或mir122过表达的细胞造成的胶原降解。e)鸡cam胶原基质(shg)中对照组癌细胞和mir122过表达癌细胞的2d和3d代表性图像。要注意到mir122过表达的癌细胞不能侵入胶原蛋白并在表面上生长(下图)。f)癌细胞注射后第1-5天，对照组的癌细胞和mir122过表达的癌细胞转移集落深度的定量。g)癌细胞注射后第1-5天，对照组的癌细胞和mir122过表达的癌细胞的胶原束的定量。

图12是提高筛选鉴定出来的mirna的表达阻断正常mt1-mmp运输和定殖的图示。a)mt1-mmp囊泡定殖和对照组的癌细胞和mir122过表达癌细胞的轨迹的代表性图像。b)对照组的癌细胞和mir122过表达的癌细胞中mt1-mmp囊泡轨迹长度的定量。c)鸡cam胶原基质(shg)中对照组的癌细胞和mir122过表达的癌细胞的代表性图像。要注意到，mir122过表达细胞不能将mt1-mmp适当地定殖到胶原接触突起中。d)对照组的癌细胞和mir122过表达癌细胞血管接触鸡cam中细胞的代表性图像。要注意到，mir122过表达的细胞不能将mt1-mmp正确定殖于癌细胞-血管壁接触区域。f)在(d)中沿虚线进行的信号强度线扫描图像。红色箭头指向癌细胞-血管壁接触区域。g)对照组的癌细胞和mir122过表达癌细胞的突起中mt1-mmp信号强度的定量。

图13是提高筛选鉴定出来的mirna的表达阻断癌细胞外渗的图示。a)对照组的癌细胞(红色)和mir122过表达的癌细胞(绿色)渗出鸡cam血管的代表性图像。b)对照组的癌细胞(红色)和mir122过表达的癌细胞(绿色)外渗的定量。c)对照组的癌细胞和mir122过表达的癌细胞(mt1-mmp过表达，红色)在鸡cam血管中外渗的代表性图像。要注意到，mir122过表达细胞不能将mt1-mmp正确地定殖到血管壁接触突起中。d)对照组的癌细胞和mir122过表达癌细胞的突起中mt1-mmp信号强度的定量。

具体实施方式

以下描述仅以举例的方式描述一个具体的实施方案，但不限于实现本发明所必需的组合。

根据一个实施方案，这里提供了一种用于预防患有癌症的受试者癌症转移的方法。该方法包括在癌性肿瘤中调节驱动蛋白样蛋白3b(kif3b)，丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1(srpk1)，跨膜蛋白229b(tmem229b)，染色体14开放阅读框142(c14orf142)，核受体亚家族2，f组，成员1(nr2f1)，mirna130b，mirna374b或mirna122的至少一种。在一些实施方案中，该方法包括在癌性肿瘤中减少，预防或“沉默”kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b和mirna374b122的至少一种的表达。在其他实施方案中，该方法包括在癌症肿瘤中增加mirna122的表达。

采用本文所述方法，发现kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122的表达与癌症运动能力有关，通过调控这些基因的表达，可以防止癌症从病灶扩散。

出于本发明讨论的目的，当与细胞中基础表达水平相比时，术语“调节”可以表示基因表达的上调或下调。

可以这样理解，基因表达可以是指从基因的核酸序列中产生多肽。基因表达可包括转录和翻译过程，因此基因表达可指生成核酸序列，例如mrna(即转录)，蛋白质的产生(即翻译)或这两者。举个例子，一个载体(病毒、质粒或其他)包含一个或多个特定基因的拷贝，每个拷贝由一个合适的启动子序列(例如，一个基本的或诱导型的启动子)驱动，可能可以通过转染、电穿孔法、或病毒感染或其他合适的本领域所熟知的方法引入细胞中。将特定基因导入细胞合适的表达载体技术是本领域熟知的。(参见，例如，分子克隆:实验手册(4thed.),2012,冷泉港实验室出版社).

如本领域技术人员所知，表达特定基因的核苷酸序列可以编码或包含如文中所述的一个或多个合适的特征，比如，“genesvii”,lewin,b.oxforduniversitypress(2000)或“分子克隆:实验手册”,sambrook等,coldspringharborlaboratory,第3版(2001)。编码多肽或蛋白质的核苷酸序列可以成为合适的载体或表达盒中的一部分，例如市售的载体或表达盒。如sambrook等所述，载体也可以用标准分子生物学技术单独构建或修饰(coldspringharborlaboratory,第3版(2001))。本领域技术人员将认识到，载体可包括编码(可与编码多肽或蛋白质的核苷酸序列有效连接的)元件的核苷酸序列。编码所需元件的这些核苷酸序列可包括合适的转录启动子、转录增强子、转录终止子、翻译启动子、翻译终止子、核糖体结合位点、5'-非翻译区、3'-非翻译区、帽结构、polya尾和/或复制的起点。选择合适载体可取决于若干因素，包括待掺入载体的核酸的大小、所需的转录和翻译控制元件的类型、所需的表达水平、所需的拷贝数、是否需要染色体整合、所需的选择过程的类型、或者需要转化的宿主细胞或宿主范围。

本发明包括核酸载体，通常是表达载体，其含有对应于mirna122基因的核苷酸序列(geneid：406906)或与对应于kif3b的核酸互补或至少部分互补的核苷酸序列9371),srpk1(geneid:6732),tmem229b(geneid:161145),c14orf142(geneid:84520),kb-1460a1.5,actc1(geneid:70),nr2f1(geneid:7025),kiaa0922(geneid:422400),kdelr3(geneid:11015),apba2(geneid:321),mirna130b(geneid:406920),或mirna374b(geneid:100126317)基因。载体是一种能够转运另一种与之相连的核酸的核酸分子，包括质粒、粘粒或病毒载体。载体能够自主复制，或者可以整合到宿主dna中。病毒载体可能包括复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等。

本领域技术人员将意识到，可以用多种已知的任何一种方法来减少，预防或“沉默”细胞内特定基因的表达。在非限制性实例中，可以使用基因沉默核酸，例如sirna(短干扰rna)、反义寡核苷酸(aon)、短发夹rna(shrna)、microrna(mirna)或其他rna干扰(rnai)、反义基因沉默触发器等等(例如，参见gaynor等chem.soc.第39版:4196-4184,2010；bennett等,药理学和毒理学年度综述50:259-293,2010)。采用本领域已知的其他转录前或转录后基因沉默技术可以降低基因表达。给定一个特定的基因序列，本领域技术人员能够设计靶向所述基因序列的基因沉默寡核苷酸，从而降低基因的表达。可用于设计靶向特定基因的sirna或aon的各种软件工具，包括从whiteheadinstitute获得的软件工具或从sirna的商业服务供应商获得的软件工具。例如，可以制备与基因表达的mrna序列的区域完全或基本上互补的sirna反义链或反义寡核苷酸，并通过触发risc或rna酶h-介导的mrna降解来沉默靶标基因。基因沉默核酸可以像当前核酸化学的研究方法(wiley出版社出版)描述的那样进行制备。

sirna或rnai是形成双链rna的核酸，并且当sirna被递送至或与基因或靶标基因相同的细胞中表达时，它能够降低或抑制基因或靶基因表达。sirna是由互补链形成的短双链rna。杂交形成双链分子的sirna的互补部分通常与目标分子序列具有基本的或完全的序列同一性。在一个实施方案中，sirna是与靶标基因具有基本的或完全的序列同一性的核酸，并形成双链sirna。

在设计sirna分子时，通常是从给定的dna序列起始密码子下游50到100个核苷酸中选择的靶向区域。起初，假设utr结合蛋白和/或翻译起始复合物可能干扰sirnp或risc内切酶复合物的结合，我们避开了5'或3'utrs和起始密码子附近的区域。有时会选择长度符合序列基序aa(n19)tt(n，一种核苷酸)的23个核苷酸区域，和g/c含量约为30％-70％(通常约为50％g/c含量)的区域。如果没有找到合适的序列，通常使用基序na(n21)进行延伸搜索。正义sirna的序列有时分别对应于(n19)tt或(23-nt基序的3-23位)n21。在后一种情况中，正义sirna的3'末端通常转换为tt。该序列转换的基本原理是产生关于正义和反义3'突出端的序列组成的对称双链体。合成反义sirna，作为23-nt基序的1-21位互补序列。因为反义sirna序列不能特异性识别23-nt基序的1位，所以可以有意地选择反义sirna，反义sirna的3'末端核苷酸残基。然而，反义sirna的倒数第二个核苷酸(与23-nt基序的2位互补)通常与靶向序列互补。为了简化化学合成，合成中通常使用tt。通常选择对应于靶基序nar(n17)ynn、r是嘌呤(a，g)、y是嘧啶(c，u)的sirna。单独的21个核苷酸的正义和反义sirna通常从嘌呤核苷酸开始，并且也可以从poliii表达载体表达而不改变靶向位点。当第一个转录的核苷酸为嘌呤时，poliii启动子rna的表达更有效率。

sirna的序列可以与靶基因全长或其子序列对应。通常，sirna的长度约为15-50个核苷酸(例如，双链sirna的每个互补序列长度为15-50个核苷酸，双链sirna长度约为15-50个碱基对，有时约为20-30个碱基对，或约为20-25个核苷酸，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。有时sirna的长度约21个核苷酸。使用sirna的方法在本领域中是已知的，并且特定的sirna分子可以从许多公司(包括dharmaconresearch,inc在内)购买。

引入双链rna(dsrna)(诱导强有力的和特异性的基因沉默)可以抑制基因表达，这种现象称为rna干扰或rnai。例如，参见fire等，美国专利号6,506,559；tuschl等,pct国际公布号wo01/75164；kay等,pct国际公布号wo03/010180a1。将双链rna减小到20-24个碱基对(以产生小干扰rna或sirna)，在哺乳动物细胞中关闭基因而不引发急性期反应(导致细胞死亡宿主防御机制)，来改善这一过程。越来越多的证据表明rna干扰(rnai)后转录基因沉默，在人类细胞中、在mrna水平上，抑制哺乳动物细胞的靶向表达。另有证据表明，有可以抑制人类患者肿瘤细胞的增殖和转移，抑制转移性癌症的有效方法。

在另一个实施方案中，基因沉默核酸是核酶。对靶核苷酸序列有特异性的核酶包括与这种核苷酸序列互补的一个或多个序列，和具有负责mrna切割的已知催化区域的序列(例如，参见专利号为5,093,246的美国专利)。例如，有时使用四膜虫l-19ivsrna的衍生物，其中核苷酸序列的活性位点与mrna中待切割的核苷酸序列互补(例如，参见,cech等,专利号为4,987,071的美国专利；以及cech等,专利号为5,116,742的美国专利)。此外，可用靶标mrna序列从rna分子库中选择具有特异性核糖核酸酶活性的催化性rna。

改变基因沉默核酸分子，例如反义、核酶、rnai和sirna核酸，来形成修饰的核酸分子。在碱基基团，糖基团或磷酸骨架基团改变核酸，来改善分子的稳定性、杂交或溶解性。例如，修饰核酸分子的脱氧核糖磷酸骨架来产生肽核酸(参见hyrup等,生物有机化学与医药化学4(1):5-23,1996)。肽核酸或pna是指核酸仿制品，例如dna仿制品，其中类肽骨架取代了脱氧核糖磷酸骨架，仅保留了四个天然核碱基。在低离子强度的条件下，pna的中性骨架可以与dna和rna特异性杂交。可以使用标准多肽固相合成方案合成pna寡聚体，例如，如hyrup等人所述。

pna核酸可用于本文所述的预后、诊断和治疗。例如，pna可用作基因表达(例如，诱导转录或翻译停止或抑制复制)的序列特异性调节的反义或抗基因试剂。pna核酸分子也可用于分析基因中的snp(例如，pna指导的钳制pcr)；当与其它酶组合使用时(例如，s1核酸酶(hyrup等，同上)，pna核酸分子可作为人工限制酶；或作为用于dna测序或杂交的探针或引物(hyrup等，同上)。

在一些实施方案中，与癌性肿瘤中的基础水平相比，目的基因(例如mirna122)过表达，来最小化癌症转移的可能性。可以用多种不同方式使基因过表达，例如用过表达目的基因的基因构建体转染细胞/组织但不限于这些。另外，用影响基因/细胞的转录或翻译机制的基因构建体转染细胞/组织，也可用于使目的基因过表达。此外，可以开发导致目的基因在癌细胞中表达增加的小分子。

在将核酸序列插入细胞的背景下，引入基因是指“转染”、“转化”或“转导”，并且包括将核酸序列插入或引入真核细胞中，其中核酸序列可以自由地插入细胞的基因组中，或瞬时表达(例如，转染的mrna)。通过将蛋白质或酶本身递送到细胞中，或通过在细胞内表达编码蛋白质或酶的mrna并使其翻译，将蛋白质或酶引入细胞中。

基因沉默核酸分子可以用许多已知的方法中的任何一种引入细胞。表达载体(病毒、质粒或其他)可以以转染、电穿孔或以其他方式被导入细胞，然后这些细胞可能表达基因沉默核苷酸。或者，基因沉默核苷酸本身可以直接引入细胞，例如通过转染或电穿孔(即使用转染试剂，例如但不限于lipofectamine^tm、oligofectamine、或本领域已知的其它任何合适的递送试剂)，或通过靶向本领域已知的基因或核酸递送载体。许多递送载体和(或)试剂在这一领域是众所周知的，其中一些可在商业上使用。例如，基因沉默核酸的递送方案在以下中进行了描述：yuan等,expertopin.drugdeliv.8:521-536,2011；juliano等,acc.chem.res.45:1067-1076,2012；以及rettig等,mol.ther.20:483-512,2012。转染的实例在如以下中进行描述：ausubel等,(1994)分子生物学实验指南，johnwiley&sons，纽约。例如在以下中描述了表达载体的实例：克隆载体:实验室指南(pouwels等,1985,supp.1987)。

本领域技术人员将这样理解，可以产生靶向本文所述的一种或多种氨基酸、核酸、蛋白质或酶(单克隆抗体、多克隆抗体或fab片段)的抗体或抗体片段，可用使用标准实验室技术生产靶向特定氨基酸、核酸、蛋白质或酶的靶标，从而使基因沉默。在非限制性实例中，可以使用杂交瘤细胞技术制备针对特定靶标的单克隆抗体(参见，例如harlow等,抗体:实验手册,(coldspringharborpress,第2版1988)；hammerling等,单克隆抗体和t细胞杂交瘤563-681页(elsevier,n.y.,1981))。本领域的技术人员知道针对特定氨基酸、蛋白质、核酸或酶靶标的抗体制备方法和技术。这种抗体可用于结合氨基酸、蛋白质、核酸或酶靶标，使其不能发挥正常功能，导致和基因沉默相同的氨基酸、核酸、蛋白质或酶产生相似的结果。因此，在某些实施方案中，用抗体代替基因沉默核酸，来靶向或“沉默”特定基因。

抑制kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b或mirna374b活性的化合物，包括小分子，可应用于本发明中。小分子包括肽，模拟肽(例如类肽)，氨基酸，氨基酸类似物，分子量约小于10,000g/mol的有机化合物或无机化合物(即包括杂有机或有机金属化合物))，分子量约小于5,000g/mol的有机化合物或无机化合物，分子量约小于1,000g/mol的有机化合物或无机化合物，分子量约小于500g/mol的有机化合物或无机化合物，和这些化合物的盐，酯和其他可药用的形式，但不限于这些。

应当这样理解，可以使用包含一种或多种如本文所述的核酸和/或多肽，或由一种或多种如本文所述的核酸和/或多肽组成的化合物和/或组合物。另外，组合物包含一种或多种可药用的稀释剂，载体，赋形剂或缓冲剂。组合物可用于在体外或体内向细胞给药一种或多种核酸和/或多肽。

当用作治疗剂时，基因沉默核酸分子通常(例如通过在组织部位直接注射)向受试者给药，或在原来的位置产生，使之与编码多肽(例如，kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、或mirna374b)的细胞mrna和/或基因组dna杂交或结合，从而抑制多肽的表达(例如通过抑制转录和/或翻译)。或者，修饰基因沉默核酸分子来靶向选定的细胞，然后全身给药。全身给药，是指修饰基因沉默核酸分子，使得它们特异性结合在选定细胞表面上表达的受体或抗原，例如，通过将基因沉默核酸分子与结合细胞表面受体或抗原的多肽或抗体连接。也可以用载体将基因沉默核酸分子递送至细胞。在载体构建体中插入强启动子，例如polii或poliii启动子，可以获得足够的细胞内浓度的基因沉默核酸分子。

如本文所述，治疗有效剂量的蛋白质或多肽(即，有效剂量)的范围为约0.001-30mg/kg，有时约0.01-25mg/kg，通常约0.1-20mg/kg，通常约1-10mg/kg、2-9mg/kg、3-8mg/kg、4-7mg/kg、或5-6mg/kg(kg是指体重)。蛋白质或多肽可以每周给药一次，持续约1-10周，有时2-8周，通常约3-7周，更经常的是持续约4、5或6周。技术人员将理解，可能影响有效治疗受试者所需的剂量和时间的某些因素，包括疾病或病症的严重程度，早前的治疗，受试者的一般健康状况和/或年龄，以及其他疾病，但不限于这些。此外，用治疗有效剂量的蛋白质，多肽或抗体治疗受试者，包括单次治疗，或者包括系列治疗。

通常使用0.1mg/kg的抗体剂量(通常10mg/kg-20mg/kg)。如果抗体在脑中起作用，抗体剂量通常是50mg/kg-100mg/kg。一般来说，部分人源抗体和完全人源抗体在人体中的半衰期比其他抗体要长。因此，更低的剂量和更小频率地给药往往是可能的。可用脂化等修饰方法稳定抗体，增强吸收和组织渗透(如进入大脑)。cruikshank等人描述了一种抗体的脂化方法(cruikshank等,1997)。

抗体偶联物可用于修改给定的生物反应，药物的部分不仅限于经典的化疗药物。例如，药物部分可能是具有所需生物活性的蛋白质或多肽。例如，这些蛋白质包括，毒素如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白a、假单胞菌外毒素或白喉毒素；多肽如肿瘤坏死因子、α-干扰素、β-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物；或者，生物反应调节剂，例如淋巴因子、白细胞介素-1(“il-1”)、白细胞介素-2(“il-2”)、白细胞介素-6(“il-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“gm-csf”)、粒细胞集落刺激因子(“g-csf”)或其他生长因子。或者，可以将抗体与第二种抗体缀合形成抗体复共轭对配合物，如segal在美国专利号4,676,980中所述。

化合物的典型剂量，包括毫克或微克/千克受试者或样品重量，例如，约1mg/kg-500mg/kg，约100mg/kg-5mg/kg，或约1mg/kg-50mg/kg。据了解，小分子的适当剂量取决于小分子相对于需要调节的表达或活性的效力。当将一种或多种这些小分子向动物(例如人)给药，来调节本文所述的多肽或核酸的表达或活性时，例如，医生，兽医或研究人员开处方时，首先采用相对低的剂量，随后增加剂量直至得到适当的反应。此外，应当这样理解，任何特定动物受试者的具体剂量水平将取决于多种因素，包括所用特定化合物的活性、受试者的年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率、任何药物联用以及待调节的表达或活性程度。

核酸制剂可以通过例如静脉注射，局部给药(例如，参见专利号为5,328,470的美国专利)或立体定向注射(chen等,1994)将基因治疗载体递送至受试者体内。基因治疗载体的药物制剂包括，在可药用的稀释剂中的基因治疗载体，或其中嵌入基因递送载体的缓释基质。或者，当完整的基因递送载体可以从重组细胞(例如，逆转录病毒载体)完整产生时，药物制剂可以包括一种或多种产生基因递送系统的细胞。本发明描述了基因递送载体的实例。

在另一个实施方案中，使用kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122的表达中的至少一种来检测癌症是否能够转移。在这个实施方案中，从癌症患者获取生物样本，并分析该样本，检测kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b或mirna374b的水平是否比高于正常基础水平，或者mirna122在生物样本中是否低于正常基础水平。从来自受试者的生物样本中分离核酸来确定mrna水平。例如，核酸可以从血液、唾液、痰、尿液、细胞碎片和活检组织中分离出来。可以用标准技术将核酸样本从生物样本中分离出来。可以从受试者中分离核酸样本，然后直接用于方法中，或者，可以分离样本，随后在分析之前将样本储存(例如冷冻)一段时间。

应当理解，诊断方法可以包括使用任何合适的方法确定kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122的表达水平中的至少一种，包括但不限于聚合酶链式反应(pcr)(例如，参见专利号为4,683,195、4,683,202和6,040,166的美国专利、“pcr方案：方法和应用指南”、innis等(eds.)，1990，学术出版社：纽约)、逆转录酶pcr(rt-pct)、锚定pcr、竞争性pcr(例如，参见美国专利cdna末端快速扩增(race)(例如，参见“基因克隆与分析：当前的创新”，1997，99-115页)、连接酶链式反应(例如，参见ep01320308)、单边pcr(ohara等，美国科学院院报1989，86：5673-5677)、原位杂交、基于taqman的实验(holland等，美国科学院院报，1991,88：7276-7280)、差异显示技术(例如，参见liang等,核酸研究，1993，21：3269-3275)和其他rna指纹技术、基于核酸序列的扩增(nasba)和其他基于转录的扩增系统(例如，参见编号为5,409,818和5,554,527的美国专利)、qbeta复制酶法、链置换扩增术(sda)、修复链反应(rcr)、核酸酶保护测定、基于减法运算的方法、rapid-scan^tm等。

在其他实例中，可以采用多种技术(包括但不限于免疫印迹、免疫沉淀和酶联免疫吸附测定(elisa))，在蛋白质水平上检测kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122的表达。因此，来自受试者的核苷酸序列编码的多肽或蛋白质与特异性结合kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122相关表位的抗体接触，可用于确定个体是否患有或易患转移性肿瘤。可以从患者的血液、尿液、唾液、组织活检和尸检材料中获得适用于诊断的细胞。

在另一个实施方案中，实施该方法所需的组分用作为试剂盒的一部分。特别的是，该试剂盒包含一个与kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b、mirna374b或mirna122结合的分子，以及进行该测定所需的缓冲物。该分子是一种下调kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c14orf142、kb-1460a1.5、actc1、nr2f1、kiaa0922、kdelr3、apba2、mirna130b或mirna374b的表达或功能的基因沉默核酸分子、小分子或生物制剂，和/或能够上调mirna122表达的小分子或基因构建体。试剂盒可包括一套在测定中有关分子使用的说明书。然而，设想该说明书不是一套纸质说明书，而是可以通过url地址或qr码提供的说明书。

应该理解，本领域技术人员可以对其进行修改。因此，上述描述和附图应是对本发明的说明，而不是限制性本发明。进一步理解到，本发明的目的在于涵盖按照本发明原理进行的任何变化、用途或改编，和在本发明所属领域内的公知常识或通常实践范围内对本发明所做的偏离，并且可能应用于本文前述所述的基本特征，并且在所附的权利要求的范围内。

下述实例用于帮助本领域技术人员说明本发明。应当理解，这些实施例是非限制性的，并且本领域技术人员可按照本发明的论述进行变更和修改。

实例

以前，由于观察转移病灶的形成存在困难，因而用于体内细胞运动分析所需的基因鉴定受到了一定的限制(sahai，自然癌症综述7:737-749，2007；kishimoto等，自然医学12:1213-1219，2006)。为了解决这一问题，在无壳、无卵禽类胚胎中应用活体成像方法进行shrna筛选，来筛选体内调控肿瘤细胞运动的基因产物。在静脉注射癌细胞后，癌细胞在胚胎血管中广泛传播。这些肿瘤细胞中有相当一部分以单个细胞的形式在绒毛尿囊膜(cam)内停滞，它们在血管外基质中渗出并增殖为浸润转移性集落。每一个这些集落都来自单个癌细胞，在4天内可以长到约1mm²(每个集落50-100个细胞)，通过活体镜检法很容易观察到。因为可以在单个胚胎的cam中同时观察到数千个单独的转移集落，所以使用这种方法筛选大型基因库是可行的。识别运动表型是很简单的。当注射高度运动的癌细胞如人头颈部hep3细胞系时，所得的集落采用“扩散”的转移表型，在这种表型中，增殖细胞已经从外渗点转移了相当大的距离。当肿瘤细胞的体内运动性减弱时，例如当使用cd151特异性转移阻断抗体时能够观察到，转移性集落表现出高度紧密的形态，这很容易和高度运动的表型区分开。这些紧密的转移性病灶由紧密排列的癌细胞组成，可以很容易地从周围组织中切除并进一步分析。如先前已经看到的cd151的靶标，抑制体内细胞运动能力所需的基因，会导致致密集落表型，从而可以利用这种方法筛选细胞运动能力的治疗靶点，而这些靶点反过来又会影响细胞内渗和转移。

为了进行筛选，用天然mir-30初级转录物构建的人shrnagipzmicrorna改造的shrna慢病毒库(openbiosystems)转导hep3细胞，使其能够通过内源rnai途径进行加工。该文库包含79,805个已验证序列的shrna，shrna靶向7个基因库中的30,728个人体基因，和turbogfp一起监测成功的转导。根据泊松分布，每个基因库在moi(0.2)的培养条件下被用来转染hep3细胞，每个癌细胞倾向于单个shrna整合。当向禽类胚胎中静脉注射25,000个肿瘤细胞时，大约10％的细胞在易于接近和可见的cam器官中停滞并渗出，形成单独的转移集落。为了确保99％置信度的79805shrna克隆的3倍覆盖率，在100个胚胎中进行筛选。在胚胎发育第10天，将转导的表达gfp的细胞静脉注射到卵外培养的胚胎中。在胚胎发育第15天，用活体镜检法检查这100个胚胎的cam中的200,000多个集落。其中，鉴定并切除了67个形态紧密的转移病灶。对这些集落进行分离和选择培养，并在培养物中成功扩增到50个克隆。

为了鉴定整合的shrna，用常见的侧翼引物通过pcr扩增每个克隆的插入物，并通过illumina平台上的深度测序确定所得的cdna序列。对原始序列阅读框进行严格的筛选算法，以鉴定侧翼mirna序列，并排除具有不一致的环序列和茎碱基对错配的阅读框。然后对筛选出来的序列进行针对文库和人类核苷酸(nt)数据库的blast分析，并根据它们的丰度进行分类。50个单独的克隆中有17个含有单个shrna，而其余33个克隆含有不止一个shrna。

然后根据它们致密集落表型的程度，基于它们对体内生产性细胞转移的影响，优先排序基因靶标。这是通过一种实验性转移方法来实现的，其中每个克隆的表型在静脉注射到鸡的卵外胚胎中后被验证，并且使用活体成像捕获所得转移集落的图像。这里开发了一个基于matlab的定制程序，使用三种互补算法分析每个转移集落的图像。在体外采集的克隆的增殖速率未检测到显著差异，然而，观察到几个克隆在体内以不同速度生长(图3a)。因此，为了减轻单个集落之间增殖差异的影响，并获得体内癌细胞运动性的准确评估，设计算法来分析两个不同的参数：a)癌细胞远离集落中心(线性指数)；b)转移集落区域内癌细胞的密度(密度指数)和；c)每个转移集落所占的总面积(面积指数，图3b-d)。简单来说，第一种算法使用gfp信号创建掩模以描绘癌细胞，并使用360°线性扫描穿过图心来构建适合于高斯分布的平均线图。由单个克隆形成的集落之间的高斯径向线扫描强度分布相对于对照shrna集落的偏差，产生集落线性指数。第二种和第三种算法用荧光掩模测量各个转移集落区域(面积指数)和计算每个区域内的荧光密度(密度指数)。针对从原始筛选获得的每个克隆，分析10个单独集落，然后基于它们的线性和面积指数值进行分类。虽然每个指数产生了与筛选中鉴定的集落相似的排序，但是通过单独的一种或另一种方法很难鉴定出几个视觉上靠近的克隆(图3b-d)。出于这个原因，将三种算法组合起来创建整体集落紧凑度指数(ci)，紧凑度指数用于与阳性对照(注射转移阻断抗体的胚胎中的集落)和阴性对照相比较(表达scrambledshrna的hep3克隆，图3a-d)，对采集的克隆的表型进行分层。ci由每个指数的z得分(实验-对照/sd对照)计算，其中c.i.＝z(密度指数)–z(线性指数)–z(面积指数)。

与用阴性对照(表达scrambleshrna的细胞)(阴性对照，8.515e-009±1.68)产生的高侵袭性转移集落相比，用cd151靶向的转移阻断抗体(阳性对照)处理后产生的阳性对照集落的形态，导致ci(17.1±1.68)增加最显著(图3a)。ci指数的统计分析显示27个具有转移集落表型的克隆的ci指数与阴性对照的ci有显著差异(p≤0.05)(图7)。这27个克隆中，有11个含有单个shrna(kif3b、actb、srpk1、tmem229b、c140rf142、kb-1460a1.5、actc1、kdelr3、apba2、kiaa0922和nr2f1)。选择含有单个shrna和ci≥5.0的克隆用于下游分析(参见表1)。

表1

为了确认观察到的体内癌细胞运动能力受抑制是由于shrna介导的靶基因耗尽而非脱靶效应，使用独立的shrna构建体创建新的为kif3b(ci＝12.4)、srpk1(ci＝11.2)、tmem229b(ci＝9.7)、nr2f1(ci＝5.9)和c14orf142(ci＝8.8)的hep3克隆(图4a-e)。对原始采集的克隆和新衍生克隆中每种靶蛋白的基因和蛋白质表达进行分析，证实了靶蛋白被特异性敲减(图4a-e)。随后使用体内转移集落形成测定法验证带有单个shrna的克隆，并且所有候选基因再产生ci值与初级筛选采集的克隆的ci值相似的致密集落表型(图4f)。

基于治疗相关性和开发特异性抑制剂的潜力，更进一步的研究将集中在kif3b、nr2f1和srpk1基因。为了更深入地了解敲除这些基因产生的转移表型，与对照(scrambled)shrna转导的hep3细胞相比较，对单独的转移集落和来自每个克隆的原发性肿瘤的浸润前缘，进行了高分辨率的体内时间推移成像。抑制这些shrna介导的靶标，降低了癌细胞迁移的速度和方向性(图1a-f)。来自每个shkif3b、shnr2f1和shsrpk1克隆的癌细胞在转移病灶(图1a、c-d)和原发性肿瘤的浸润前缘(图1b、e-f)中显示运动能力缺陷或非生产性转移模式。尽管与肿瘤转移相比，浸润性肿瘤前缘癌细胞的平均速度更快，但与对照相比，shkif3b、shnr2f1和shsrpk1克隆中癌细胞从肿瘤中逃逸的数量显著减少(图1g)。对浸润前缘的对照或采集克隆的活体成像显示，虽然对照hep3细胞倾向于在运动方向上形成单个显性突起，但shkif3b、shnr2f1和shsrpk1克隆倾向于以一种不协调的方式，在所有方向上延伸形成多个突出(图1b、h)。总之，该筛选方法主要鉴定了协调体内细胞定向转移所需的基因。

为了测试体内细胞运动和定向细胞转移所需的基因是否也需要用于内渗入血管和转移，在肿瘤自发转移到肺的鼠模型中评估采集的克隆。为了此目的，用亲本的scrambledshrna对照或表达shkif3b、shnr2f1和shsrpk1的肿瘤细胞在裸鼠的侧腹制造皮下hep3肿瘤。当原发肿瘤达到1.5cm³时，使用整体荧光立体显微镜检查是否存在肺部转移，然后使用人类alu特异性q-pcr定量检测肺部转移(图2a、b)。在携带shrnascramble对照hep3肿瘤的动物(n＝23)中，通过荧光成像检测到肺存在显著转移(图2a)。相反，在携带kif3bsh/sh2、srpk1sh/sh2和nr2f1sh/sh2肿瘤的动物的肺中很少观察到转移病灶，并且这些病变的尺寸非常小(图2a)。为了准确量化鼠肺中转移性hep3癌细胞的负担，我们提取了基因组dna进行了人类特异性aluq-pcr检测。随后通过将该数据与由hep3细胞生成的标准曲线比较，确定肺中转移细胞的精确数量。scrambleshrna对照组中，每个肺平均有240万个扩散性癌细胞。相反地，携带kif3bsh/sh2、srpk1sh/sh2和nr2f1sh/sh2肿瘤的动物有显著地抑制转移性扩散的作用，携带kif3bsh和sh2肿瘤的动物的肺转移分别减少99.55％和99.67％，携带srpk1sh和sh2肿瘤的动物的肺转移分别减少99.98％和99.66％，携带nr2f1sh和sh2肿瘤的动物的肺转移分别减少99.71％和99.81％(图2b)。在处死时，对照和采集shrna克隆肿瘤的原发性肿瘤重量没有显著差异(图2c)。这些结果证实kif3b、nr2f1和shsrpk1各自都需要体内癌细胞运动能力和成功自发转移，因此他们代表了非常有希望的转移治疗靶标。

考虑到所观察到的运动表型可能对高转移性人类表皮样癌细胞系hep3具有特异性，采集的kif3b、srpk1和nr2f1在代表两种不同类型的人类上皮癌症(乳腺癌和前列腺癌)的另外两种细胞系(mda-mb-231和pc3)中沉默。沉默kif3b表达有效地阻断了所有癌细胞系中的体外细胞转移(图5a)。有趣的是，沉默srpk1显著抑制hep3和pc3细胞体外运动能力，但对mda-mb-231的体外运动能力没有影响(图5b)。最后，沉默nr2f1在体外抑制hep3转移，但对mda-mb-231没有影响。在pc3细胞中未检测到nr2f1表达(图5c)。这可以解释为什么在先前的体外筛选中未检测到这些基因。实际上，如果用mda-mb-231细胞进行筛选，则不会检测到srpk1和nr2f1。

通过独立的mirna构建体验证mirna130b和mirna122克隆，证实了它们的非侵入性表型(图8a)。值得注目的是，经过工程改造来过表达mirna-122或mirna-130b抑制剂的ht1080细胞形成紧密的转移集落，集落与鸡cam血管系统的接触较为不显著(图8b、c)。

进行活体成像实验进一步了解筛选中鉴定的mirna在体内阻断癌细胞侵袭性转移的机制，主要关注mirna122过表达对癌细胞侵袭和转移的影响。对照组细胞(rfp)强有力地侵入cam组织内，优先沿着预先存在的血管侵入(图9a-c和图2a-c)。此外，对照组，scramble载体转导细胞在鸡cam卵内转移模型中主动转移，而过表达mirna122的细胞不能主动转移(图9f)。对共注射差异标记的对照组，scramble载体表达细胞(rfp)和mirna122过表达细胞(gfp)，进行高分辨率活体成像，发现对照组细胞优先形成突起并沿着血管侵入，与血管周围胶原纤维形成明显的接触，同时mirna122过表达细胞突起并不依赖于血管侵入，且不与血管周围胶原形成接触(图10a-f)。鸡cam表示富含胶原蛋白的、被血管贯穿的膜。转移性癌细胞通过a)沿已经存在的胶原纤维束移动，和b)局部降解和重组胶原基质，形成直线的胶原蛋白束(后来用于定向癌细胞的浸润)，侵入富含胶原蛋白的基质。事实上，mir122过表达细胞不能侵入人工3d胶原基质。mmp抑制剂菲咯啉阻断了3d胶原蛋白浸润，证实了该过程需要依赖于蛋白酶(图11a、b)。与对照组细胞，mirna122过表达细胞侵入和降解胶原基质显著减少，如3d胶原基质内几乎完全没有胶原降解区域(图11c、d)。当scramble转导细胞静脉注射到鸡cam中时，保留在胶原基质内，在附近活跃地产生定向胶原束(图11e-g)。相反，mirna122细胞不能保留在胶原基质深处，实际上mirna122细胞在cam表面上生长且很少或没有胶原重组(图11e-g)。富含胶原的基质的浸润和重组需要癌细胞相关蛋白酶局部蛋白降解。mt1-mmp是一种关键的基质降解酶，它的活性和定殖已被证明对癌细胞有效浸润很重要。因此，本发明研究了在对照组细胞，scramble组细胞和mir122过表达的ht1080细胞中，mt1-mmp的转移和定殖。首先，体外培养mirna122过表达细胞，mt1-mmp阳性囊泡增大(明显转移轨迹更短)，则表示mt1-mmp转运受损(图12a、b)。高分辨率体内成像显示，在对照组ht1080细胞中，mt1-mmp定殖于癌细胞突起-胶原纤维接触的位点，而在mirna122过表达细胞中，mt1-mmp主要定殖于细胞质(图12c)。此外，在血管周围对照组细胞中，mt1-mmp定殖于癌细胞-血管壁接触，而在mirna122过表达细胞mt1-mmp未显示特异性定殖(图12d-g)。接着，本发明研究了mirna122介导的mt1-mmp转移是否是癌细胞外渗过程所必需的。结果发现mirna122过表达细胞的渗出效率明显低于对照组，和scramble转染的ht1080细胞(图13a、b)。重要的是，在对照组细胞中，mt1-mmp在血管壁突起(侵袭性突起)明显定殖，在mirna122过表达细胞中mt1-mmp从突起中消耗(图13c、d)。

本发明鉴定了癌细胞系中几种有希望的治疗转移性肿瘤的靶标，并研究了这些基因与人类癌症进展和转移的潜在相关性。为了达到这个目的，本发明查询了人类癌症基因表达数据库的oncomine集合(rhodes等，肿瘤形成9:166-180，2007)，以确定它们的表达是否与转移或不良临床结果相关。事实上，该分析表明筛选中鉴定的最高采集的基因在几种实体癌类型(黑色素瘤(nr2f1、c14orf142和kif3b)、前列腺(srpk1和kif3b)、头颈部(kif3b)、肺(srpk1和tmem229b)、卵巢(nr2f1)和结肠(nr2f1))的转移病灶中显著上调(图6a)。此外，一项人类蛋白质atlas数据库中人类癌症免疫组织化学染色的详细调查显示，如癌症病理学家所描绘的，srpk1、kif3b、nr2f1、c14orf142和tmem229b均在这些癌症原发性肿瘤浸润区的表达显著增加(图6b-g)。

总之，使用能够发现抗肿瘤转移的治疗靶点的体内定量方法。该测定的快速和定量特性能够过滤大量初始候选基因，并发现几种新的抗转移靶点。使用该筛选方法鉴定的抗转移靶点对体外癌细胞转移的能力没有影响或影响很小。