用于逆转和预防由糖尿病和其他退行性慢性复杂疾病产生的由慢性损伤加速的细胞衰老的代谢生物能和营养后生的调节剂与在常规和纳米技术组合中的营养化合物的组合的制作方法

本发明关注于药物组合物的定义以及所提出的用于治疗代谢综合征、糖尿病和衰老的方法。在说明书中公开了天然来源的化合物和组合物。更具体地说，本发明涉及一种治疗疾病的方法，该方法基于使用在细胞系统和哺乳动物有机体(动物和人)中产生的反应，例如代谢控制和细胞生长，其中药学上可接受剂量的化合物是制剂i的一部分。

背景技术：

代谢综合征，以前称为x综合征，是正常代谢和2型糖尿病之间的中间状态。这是一种新兴的流行病，被定义为一系列代谢危险因素，使人易患心脏病、冠心病和慢性肾功能衰竭等疾病。代谢综合征与腹部肥胖、致动脉粥样硬化性血脂异常、高血压、促炎症和促血栓形成状态有关，其具有或没有葡萄糖损伤，即糖尿病。症状与高甘油三酯水平、较低的高密度脂蛋白水平、血压升高或高血压、以及血糖水平升高以及炎症症状有关。这些特征中的每一个都是血管功能障碍和心血管、肾脏和肝脏疾病发展的重要风险因素(eckelr.h等人，lancet，2005,365：1415)。代谢综合征增加了过早死亡的风险，因此，有助于减少心脏代谢改变因素和控制综合征的有效和负担得起的策略是使处于高风险中的大量人口受益的重要目标。

目前治疗代谢综合征患者的主要方法是：减少潜在病因，治疗高血压和其他心血管危险因素，并控制胰岛素抗性。代谢综合征的治疗包括改变生活方式，伴随药物治疗。除了实施饮食指南和适当的身体活动治疗代谢综合征以解决代谢综合征的许多潜在机制以外，已经开发了一系列药物，旨在控制与疾病状态的表现相关的代谢物水平的改变，包括了旨在实现同一目标的各种生物活性营养化合物。营养影响的功能性知识，尤其是饮食中不同分子靶点上的氨基酸和多酚，使得可以开发出天然存在的化合物的组合物来治疗肥胖症、代谢综合征、糖尿病和衰老。下面描述与本发明主题相关的一些概念和专利。

lodder和cassis(lodderra和cassisla在美国专利2015/90609622015年6月23日)的专利药物组合物包含d-塔格糖，其具有或不具有芪或芪类化合物或其衍生物，以预防或治疗动脉粥样硬化、代谢综合征、肥胖症或糖尿病。在对病原体攻击或其他损伤的反应期间施用芪类化合物如白藜芦醇(3,5,4-三羟基-反式-均二苯乙烯)，其是一种植物中产生的天然酚和植物抗毒素。大量的白藜芦醇可以在不同类型的浆果、葡萄、蔓越莓等中找到(fremont，lifesci，2000,66：663)。在该专利之前，baur等人(j.a.baur等人，nature，2006,444(7117).337)和do等人(dogm等人，biochembiophysrescommun，2008,374(1).55)报道了白藜芦醇对改善高热量饮食小鼠的健康和生存、控制胆固醇水平改变等的影响。另一种与白藜芦醇化学相关的化合物(即已知为3,5-二甲氧基-4'-羟基均二苯乙烯的紫檀芪)的特征在于显示出与白藜芦醇相似的效果。

去乙酰化酶(sirtuin)是具有组蛋白去乙酰化酶和一些转录因子活性的酶，其调节参与心血管疾病、衰老和抗逆性(stressresistance)的发展的代谢途径(jiangwjbiochem.biophys.res.commun.,2008,373(3):341)。认为白藜芦醇直接或间接激活sirt1(nad依赖性去乙酰化酶-1脱乙酰酶)和pgc-1(过氧化物酶体增殖物激活的γ受体辅激活因子)，并影响线粒体功能(lagougem.等人，cells，2006,127(6)：1109；alcainfj和villalbajm，expertopintherpat，2009,19(4)：403；beherd.等人，chembioldrugdes，2009,74(6)：619)。在用白藜芦醇处理的细胞中，sod2(mnsod)作用(超氧化物歧化酶2，线粒体，也称为锰依赖性超氧化物歧化酶)增加，减少了超氧化物，这涉及在几种疾病中对线粒体功能障碍、通透性转变和细胞凋亡的死亡的抗性。已经发现白藜芦醇还充当gper激动剂(gpr30)(g蛋白偶联的雌激素受体1，也称为g蛋白偶联受体30)(prossnitze.r.和bartonm.，mol.cell.endocrin.2014,389(1-2):71)。白藜芦醇的可能作用机制可归因于自噬调节(旨在消除功能失调的机制组分的自噬作用)(ghoshh.s.等人，plosone，2010,5(2).e9199)。实验动物已显示白藜芦醇作为抗糖尿病治疗的积极作用(baurja等人，nature，2006,444(7117)：337；lagougem.等人，cells，2006,127(6).1109.)。该化合物作为pparγ激动剂(由过氧化物酶体增殖物激活的γ受体(ppar-γ或pparg)，也称为格列酮(glitazone)受体，或r1c3(核受体亚家族1，c组，成员3)是ii型核受体)，被认为是治疗2型糖尿病的药理学靶标(l.wang等人，biochempharmacol2014,92(1)：73)。过氧化物酶体是细胞器，其在功能不正常时可导致疾病和衰老过程。刺激内皮型一氧化氮合酶(enos)活性和抑制血小板聚集的能力被归因于白藜芦醇(vitaj.a.duffysj，curropinionlipid，2003,14(1).21；olasb.和wachowiczb.，platelets，2005,16(5)：251)。

植物提取物可以被认为是抗氧化剂来源，白藜芦醇类似物。romerot.2016年3月8日的美国专利2016/9,278,104建立了使用莲叶提取物来减少和/或消除与代谢综合征相关的一种或多种风险因子。该组合物考虑肌酸酐(一种氮化有机酸)的存在，其非常类似于位于不同生物体的肌肉和神经细胞中的氨基酸结构。它在肝脏、胰腺和肾脏中由氨基酸如精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸以每天一克肌酸的速率天然合成。它被认为是运输atp并为肌肉肌原纤维提供能量的立即和直接的载体。

gokarajug.r.等人在2016年1月26日的美国专利2016/9,241,964中建立了用于药物用途或作为膳食补充剂的源自绒毛戴星草(sphaeranthusindicus)和/或山竹(garciniamangostana)的植物化学成分的组合物。该组合物用于肥胖症、代谢综合征、糖尿病和其他代谢紊乱的控制、预防和治疗，还用于在哺乳动物中调节能量消耗、预防冠状动脉和腹主动脉粥样硬化斑块、增加胰岛素敏感性、控制葡萄糖水平、甘油三酯水平和平衡血糖水平。提到了含有氨基酸和其他成分的提取物；但是，这些都没有公开。

众所周知，氨基酸是参与人体新陈代谢的各种蛋白质合成中的重要部分。本发明被认为是可以选择所述组合物用于治疗和预防代谢综合征、肥胖症、糖尿病和衰老的原因。

varfolomeevs.d.和gurevichk.g.(在russianchemicalbulletin，2001,50(10)：1709中)进行了生物计算机分析，证明在不同酶家族的一级序列的确定位置中最常发现甘氨酸氨基酸(37.5％)。作者将此属性归因于甘氨酸在酶结构中的作用：是具有手性原子的氨基酸，其允许蛋白质链的运动和灵活性。这证明了甘氨酸对新陈代谢的重要性。以下5种氨基酸是天冬氨酸(12.9％)、半胱氨酸(6.7％)、组氨酸(6.2％)和精氨酸(5.5％)。由于硫桥的形成，半胱氨酸负责维持各种蛋白质的构象。组氨酸和精氨酸如天冬氨酸一样在酶活性位点中常见，其在催化位点中起核心剂和亲电试剂的作用。

对于精氨酸的情况(wug.a.b.等人在curropinclinnutrmetabolcare，2000,3(1)：59中)报道了其帮助降低胰岛素抗性的能力，允许糖尿病治疗中减少胰岛素量，增加葡萄糖耐量和改善2型糖尿病患者的胰岛素敏感性。

半胱氨酸是谷胱甘肽合成的限制性底物-负责保护细胞免受病毒、细菌、真菌、致癌物以及其他疾病状态的影响。不建议使用不含任何其他成分的口服半胱氨酸，因为它会被快速分解代谢到胃肠道，进入毒性状态。由于硫醇参与氧化还原反应的能力，半胱氨酸具有抗氧化特性。这些半胱氨酸抗氧化剂性质主要在三肽谷胱甘肽中表达。口服谷胱甘肽的可用性不足，因此其必须从构成它的氨基酸-半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸-生物合成，其中半胱氨酸是限制性底物。通过实验室测试补充的不同试验表明，衰老与血浆半胱氨酸和谷胱甘肽细胞内浓度的逐渐降低直接相关。这种减少导致了与年龄相关的氧化应激。正常饮食以上的半胱氨酸补充通过帮助骨骼和肌肉系统、减少炎症和细胞因子水平来减少各种衰老过程(l.wang等人，biochem.pharmacol.2014,92(1):73)。

控制细胞增殖对于任何生物体的正常功能都是必不可少的。这种调节的改变是癌症等疾病的原因-由于基因突变而导致无限制和不受控制的细胞增殖。相反，细胞增殖能力的丧失是导致衰老的因素之一。

细胞分裂的细胞外控制可以通过细胞周期促分裂原、几种生长因子以及存活因子来进行。促分裂原是刺激细胞分裂、从而抵抗阻止循环进展的细胞内停止机制(rb)的蛋白质。

任何生物或器官的生长都取决于生长和细胞分裂。如果细胞在没有生长的情况下分裂，它们每次都会变小。生长因子通过促进蛋白质和其他大分子的合成和抑制来刺激细胞生长(细胞质量增加)。细胞生长不依赖于细胞周期。例如，神经和肌肉细胞尤其在细胞分裂后生长。像大多数促分裂原一样，生长因子与细胞表面受体结合，然后激活不同的细胞内信号传导途径，这可诱导：蛋白质合成增加或蛋白质降解减少。所有这些都会导致细胞生长。

存活因子通过抑制细胞内死亡程序或细胞凋亡来促进细胞存活。这些需要来自其他细胞的生存信号仅在需要时帮助细胞存活。例如，神经元是过量产生的，它们相互竞争以获得生长因子，而那些具有最大量生长因子的神经元将存活。作为促分裂原和生长因子，存活因子倾向于与细胞膜受体结合，所述细胞膜受体激活抑制细胞死亡的细胞内信号传导途径，通常通过调节属于bcl-2家族的蛋白质。一些存活因子是il-3、scf、igf-1，其主要由肝脏响应来自生长激素(gh)的信号而分泌。

基于上述并且为了解决上述问题，本发明的目的是提供由以下组成的制剂的用途：白藜芦醇、甘氨酸、精氨酸和半胱氨酸，基于卤虫(artemiasalina)模型的研究设定组分浓度的范围。在这种情况下所要保护的是该制剂的用途，以及其用于治疗疾病的方法。该制剂具有在体外刺激细胞培养物和淋巴细胞增殖的新效果，同时没有基因毒性的证据，揭示了降低在健康实验室动物中观察到的诱导糖尿病的内脏脂肪形成的能力，在四氧嘧啶诱导的糖尿病模型中显示的具有较少胰岛素或没有胰岛素的血糖指数的可控性，存在于用四氧嘧啶处理的动物的胰腺中的该治疗的细胞保护作用，在6个月期间在治疗的患者中纠正代谢综合征和肥胖症的症状。在下面描述的实施例中，证明该制剂具有活化成分，其在能量产生的水平、氧代谢的恢复和与糖、脂肪酸和胆固醇代谢相关的各种酶循环的再活化上起作用，增加了细胞中可用的能量以增加功能和存活率，其以增加的增殖表示。实施例证明，当所述制剂应用于动物和人类时，与糖尿病、肥胖症和/或代谢综合征的负面因素相关的改变的功能被标准化。根据这些实施例，用设计的制剂进行治疗是控制衰老、代谢综合征、肥胖症和糖尿病的方法。

附图说明

图1.显示了以不同浓度施用的白藜芦醇(r)、甘氨酸(g)、精氨酸(a)和半胱氨酸(c)组分的毒性，其以卤虫(a.salina)的死亡率表示。

图2.在不同浓度的制剂i存在下的卤虫存活率。

图3.用不同浓度的制剂i处理的样品中淋巴细胞的数量(顶部)及其存活率(底部)。

图4.以不同浓度施用的制剂i在单核细胞(淋巴细胞)中的测试遗传毒性，上部：电泳板；中间：完整dna(头部)的百分比(*p<0.05vs.具有rpmi的白色)；下面：基于电泳样品末端结果的计算(*p<0.05vs.具有0.1mmh2o2的阳性对照)。

图5.不同浓度的制剂i对人胚肾细胞系hek-293细胞培养物(上面)和非洲绿猴(vero)肾细胞培养物的存活率的影响。

图6.显示用制剂i处理和未处理的动物的血液化学参数值的图：上面-雄性兔；下面，-雄性大鼠，在施用单剂量之前和施用1000mg/kg14天之后。

图7.在经受处理的不同兔类动物组中的体重变化动态(顶部)和葡萄糖浓度(毛细血管血糖)(下面)：i-胰岛素和50、70、90mg/kg的制剂i剂量。

图8.在用i-胰岛素和50、70、90mg/kg的制剂i剂量处理的不同啮齿动物组中的体重变化动态(顶部)和葡萄糖浓度(毛细血管血糖)(下面)。

图9.在用制剂i和胰岛素治疗和未治疗的诱导型糖尿病的兔子中胰腺水平上观察到的组织学变化的比较。上面，-从仅用胰岛素处理的雌性胰腺中取出的组织的组织学切片，显示器官被完全破坏：仅发现具有充血血管的脂肪组织和具有反应性变化的两个淋巴结，进行了仔细的搜索，没有识别到可用的胰腺组织。下面-仅用制剂i(左)处理的雌性胰腺组织的组织学切片(10×)，鉴定了分泌部分胰腺保存腺泡，没有相关的组织学变化，但是，没有鉴定出内分泌成分(胰岛细胞)；图像(40×)对应于完整的胰腺分泌部分(腺泡)的途径(右)。

图10.在用制剂i和胰岛素治疗和未治疗的诱导型糖尿病兔子中在肾脏水平上观察到的组织学变化的比较。上面-仅用胰岛素处理的雌性肾组织的组织学切片：在肾小球水平，肾小球膜细胞增加，无异型性，血管壁局灶性增厚，未形成硬化结节，这对应于以肾小球系膜轻微增加为特征的早期糖尿病肾病(左)；仅用胰岛素治疗的雄性肾切片，骨皮质保存良好，肾小球丰富，细胞性好，轻微充血，无硬化改变。在肾小管组件中，存在凝固性坏死和核固缩的变化(右)。在中间：用胰岛素和至90mg/kg的制剂i治疗的组织学雌性肾切片显示良好的骨皮质保存，鉴定了丰富的肾小球，具有良好的细胞性，具有非常轻微的充血，没有硬化改变。在肾小管组件中，可以看到凝固性坏死和核固缩核的初始变化。下面：在由至70mg/kg的制剂i处理的雄性充血性肾组织的组织学切片(左，-10×)，在髓质和皮质处具有红细胞外渗(显微镜出血)，鉴定了显示没有异型性的肾小球系膜细胞增加的结构，轻微充血；绘图对应于充血性肾小球的途径(右侧-为40×)。

具体实施方式

本发明的特征细节由以下组成：定义制剂i，定义其应用，在不同水平的生命系统(细胞、健康动物或糖尿病诱导的人有机体)中的生物效应。以下段落描述了限定本发明的目的，说明了本发明的新颖性和实用性，但并不限制本发明的范围，并且不旨在对其进行不适当的限制。以下实施例基于定义制剂i的测试，以及测试它们对体外和体内系统的影响。

根据本发明的包含本发明的基本组合物和制品的制剂的描述示于表1中。

根据权利要求1的组合物，其进一步的特征在于包含本发明化合物的潜在组合的一个实施方案，其对晚期疾病病例具有更高的治疗效果，还包括减少剂量方案的纳米颗粒的实施方案。

实施例1

进行该测定以评估对制剂i(白藜芦醇、甘氨酸、精氨酸和半胱氨酸)提出的组分对卤虫(artemiasalina)无节幼体的毒性。卤虫是一种对多种具有生物活性和化学结构差异很大的化合物敏感的甲壳类动物。michael等人(michaela.s.等人，science，1956,123：464)和vanhaecke等人(vanhaecke等人，ecotoxicolenvironsaf1981,5：382)提出了其用于毒性测试的用途。该试验允许对不同性质的物质进行实际和经济的毒性研究。与其他特异性细胞毒性试验有很好的相关性。该模型被fda(食品药品管理局)和epa(环境保护局，2002年)接受，作为评估药物和/或食品的毒性和生态毒性的测试。

根据使用每种制剂i组分的不同稀释度标准化的方法进行测定。在卤虫孵化器中，在27℃的温度，在人工海水中以37g/l孵育0.5g卤虫卵囊，并持续通气24小时。在96孔板中的每5个孔中，使用单通道移液管与10个无节幼体(从孵化器中分离并逐个计数以实现精确分离10个无节幼体)一起施加0.1ml人造海水(37g/l)。从2000ppm的白藜芦醇储备溶液制备甘氨酸、精氨酸和半胱氨酸系列稀释液。使用多通道微量移液管，加入0.1ml在板中制备的溶液，使每5个无节幼体孔的最终浓度达到62.5、125、250、500和1000ppm。对于空白样品，将10个未处理的无节幼体放入0.2ml体积的人造海水中(37g/l)。将微孔板在25℃孵育24小时。在孵育期后，用立体显微镜计数存活和死亡的卤虫无节幼体并测定死亡率百分比。毒性表示为卤虫无节幼体的死亡率百分比：0-10％为无毒，中等毒性为11-50％，51-90％为高毒性和100％为极毒性，考虑gualdron等人的标度(gualdronr.等人，chemrev.col.farm,1997,26:15-19)。对制剂i的组分溶液进行5倍测试。使用statisticalpackagegraphpadprism版本6，通过方差分析(anova)测试和tukey多重比较(p<0.05)分析数据。

数据分析的结果表示为±标准偏差平均值，并显示在图1中。甘氨酸、精氨酸和半胱氨酸在任何测试浓度下都是无毒的，因此表明如果发生毒性，它只能在高于1000ppm时发生(图1)。对于白藜芦醇，在62.6ppm溶液中存在38％的死亡率(中等毒性)，而lc50(50％无节幼体的致死浓度)估计为89.48ppm，表明从该浓度开始，白藜芦醇具有高毒性。将该数据考虑在内以定义制剂i：选择白藜芦醇浓度为低于cl50；对于氨基酸，可以使用低于1000ppm的任何浓度。

实施例2

作为本文举例说明的制剂i，考虑以下组成的生物活性组分：5.7mg白藜芦醇、74.3mg甘氨酸、5.7mg精氨酸和2.9mg半胱氨酸/kg重量或kg溶剂，分别用于哺乳动物(包括人)或细胞培养物。根据实施例1中定义的结果选择白藜芦醇浓度，即，比其cl50低约15倍以防止毒性表现。精氨酸重量相当于白藜芦醇，半胱氨酸比白藜芦醇少约2倍，甘氨酸为白藜芦醇重量的13倍。制剂i是生物活性组分混合物的实例，其不应限制本发明的范围。在这种情况下，定义了剂量i剂量为88.6mg/kg。

使用制剂i进行类似于实施例1中所述的测定以确定其毒性范围。结果显示在图2中。结果表明，在浓度低于或等于500ppm时，100％的卤虫无节幼体存活，而对于1000ppm的制剂i只有58％存活。这表明根据应用的模型，制剂i在高达500ppm的浓度时无毒，但是在高达1000ppm的较高浓度下，显示出中等毒性行为。这表明，通过使用制剂i，考虑到没有毒性，其浓度可以在宽范围的浓度和剂量范围内变化。

实施例3

将制剂i应用于测试以确定它们对人细胞的作用，即，刺激生长作用(促有丝分裂作用)或引起细胞死亡(细胞毒性作用)。

对于该测定，使用生物体外系统，其使用来自外周血单核细胞-外周人淋巴细胞的单核细胞培养物。选择该系统是因为它们形成25％至35％的白细胞，并且它们是促进细胞的主要免疫应答，因为它们识别外来抗原并激活细胞免疫应答介质，从而在内源或外源刺激之前引起增殖或抑制现象。这些培养物被广泛用于研究以评估各种化合物的作用(marti-centellesr.等人，j.medchemeur，2015,103：488)。评估对细胞增殖的影响，并测定制剂i对体外人淋巴细胞的lc50和lc100(分别减少50％和100％活细胞量的浓度)。作为阳性对照，使用伴刀豆球蛋白a(cona)进行测试，这是一种植物来源的球蛋白，其诱导淋巴细胞中的有丝分裂从而导致克隆增殖(ganem和martingonzalezbaezfao.，universodiagnóstico，2000,1(1)：1)。进行rpmi-1640(未经处理的培养基)的测定作为空白。通过计数细胞总数和用锥虫蓝染料染色的死细胞来评估以200至2000ppm的浓度应用的制剂i的作用。

制备补充有10％fbs的1l的rpmi-1640培养基(sigma)，加入1ml1×的链霉素和两性霉素b溶液(sigma)，使用0.22微米膜通过无菌过滤单元(corning)灭菌。由2000ppm制剂i的储备溶液制备200、400、600、800、1000和2000ppm的系列稀释液。

通过静脉穿刺获得来自健康志愿者供体的30ml外周血，将其收集在含有edta作为抗凝血剂的塑料管中。然后，通过ficoll-hypaque密度梯度(sigma-aldrich)通过在25℃以1200转/分钟(rpm)离心30分钟来分离外周血单核细胞(pbmc)。pbmc用pbs1×洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于培养基中。pbmc由单核细胞和淋巴细胞组成。单核细胞的特征在于是缺乏增殖潜力的贴壁细胞。否则它们则代表淋巴细胞，其是悬浮细胞，能够在内源或外源刺激后增殖。为了从淋巴细胞中分离单核细胞，将获得的pbmc在25cm³箱中水平培养，使得单核细胞在37℃、湿润气氛、5％co2气氛中，在5小时内粘附于表面。孵育时间后，将淋巴细胞(保留于悬浮液中的细胞)在无菌的1.5ml管中分离，并以1200rpm离心10分钟(eppendorfcentrifuge5810-r)，然后将1ml培养基加入细胞包中。在eppendorf管中制备500,000个细胞/ml的悬浮液，向其中加入不同浓度的制剂i(200、400、600、800、1000和2000ppm)，添加1.25mg/ml伴刀豆球蛋白a(一种细胞增殖诱导剂)的阳性对照和空白(未处理的细胞)，加入培养基。将样品在37℃在含5％co2的潮湿气氛中孵育48小时，足以使淋巴细胞完成细胞分裂，显示产物具有类似阳性对照的增殖(cona)或引起细胞毒性。终止孵育后，将含有不同样品的eppendorf管以1200rpm离心10分钟，倾去上清液，将细胞包重悬于1mlrpmi-1640中。

使用具有40×物镜的光学显微镜。使用0.05ml每一重悬样品在0.4mlpbs1x和0.05ml锥虫蓝中的悬浮液，用neubauer室计数细胞。在三个独立事件中一式三份进行测定。通过spss版本16的方差分析测试(anova)分析结果，然后应用dunnet测试来辨别对照和实验处理之间是否存在差异，将p<0.05的值视为显著。

图3显示了测试结果。当与未处理的空白相比时，施用至200ppm的制剂i增加细胞浓度的效果在表观上(每毫升的细胞数)达到15％显著(p<0.05)：分别为6,372,333和5,518,333个细胞/ml。对于伴刀豆球蛋白a，其计数细胞数增加至65％以获得9,101,667个细胞/ml(图3)，证实其促有丝分裂活性。另一方面，在浓度为1000和2000ppm的制剂i存在下，分别观察到细胞数减少：4,291,667和3,540,333个细胞/ml。

计算相对细胞存活率(vcr)的百分比，发现在浓度为200、400和600ppm的情况下，97％的细胞存活，如空白对照和阳性对照。从800ppm开始，以及1000和2000ppm的制剂i，人淋巴细胞的细胞存活率显著降低(图3下)，分别为以下百分比：90.58％、84.38％和64.96％。制剂i的lc50和lc100分别估计为2,726.8ppm和5,165.82ppm。该值显著高于卤虫试验中检测到的值，并证明制剂i在施用剂量下缺乏细胞毒性。根据两个试验，在50-90ppm的剂量，制剂i没有细胞毒性。这些剂量在刺激淋巴细胞增殖的范围内，证实了其对衰老治疗方法的重要作用。

实施例4

以下实施例表明，实施例3中所示的增殖作用和抑制作用与dna(脱氧核糖核酸)损伤的水平无关。为此目的，开发了彗星试验(cometassay，一种快速、灵敏、简单和可量化的方法)来测量脱氧核糖核酸(dna)水平的损伤程度。该试验被认为是研究化合物或对dna修复的有害影响的工具(azquetaa.和a.r.archtoxicolcollins，2013,87：949)。它在不同科学学科中被用于体内、体外、离体的系统，用于遗传毒性测试、临床前和临床研究、生态毒理学基因测试、细胞遗传学、光遗传毒性等。

根据实施例3中描述的相同方法分离单核细胞和人外周血淋巴细胞。通过使用培养基，将细胞浓度调节至1×10⁶个细胞/ml。将获得的细胞以3×10⁴个细胞/ml的密度接种在eppendorf小瓶中，并在37℃和5％co2下孵育24小时以稳定。随后将小瓶在22℃以1250rpm离心5分钟，并用制剂i溶液替换上清液至7.81、15.63、31.25、62.50、125、250、500和1000ppm(各自n＝4)。将空白测试细胞重悬于培养基(n＝8)中，其他测试细胞重悬于0.1mm过氧化氢(阳性对照，n＝8)。将细胞孵育24小时，随后通过以1200rpm离心5分钟沉淀，并用0.1ml胰蛋白酶(0.25％)在37℃和5％co2下处理3分钟。将细胞重悬于1mlrpmi1640培养基中，再次以1200rpm离心5分钟，弃去上清液，将细胞用1ml裂解液(nacl2.5m，na2edta100mm，trishcl10mm，和1％triton)在4℃孵育24小时。在24小时后，将小瓶在4℃以1200rpm离心。弃去上清液，用1ml中和缓冲液(0.4mtrisph7.5)在4℃处理细胞5分钟。将小瓶在4℃以1200rpm离心5分钟，将细胞重悬于0.02ml加样缓冲液(溴酚蓝0.25％，甘油50％，tris-hcl10mm和50mmna2edta)中。琼脂糖凝胶通过以下方法制备：在100℃的加热板中将1％琼脂糖溶解在盐水磷酸盐缓冲液(pbs)中。一旦溶解，并且在60℃，添加0.01mlgelred(荧光染色dna化合物)。将该混合物置于水平电泳室中60分钟。将裂解的细胞加载到琼脂糖凝胶上，并用电泳溶液(1mmna2edta和300mmnaoh，ph13.5)在4℃孵育20分钟。电泳运行在25v和300ma下在4℃进行30分钟。从电泳室中取出凝胶并在荧光信号分析室中显示。用高分辨率数码相机获取生成的图像(图4，上)，并用imagequanttlv8.1软件分析。通过密度计分析定量代表完整dna的彗星头的区域，并绘制为相对于阴性对照(培养基)的百分比(图4，中间)。代表受损dna的彗星尾部以毫米为单位测量，并表示为阳性对照(h2o2)的百分比。数据表示为平均值±平均标准偏差(图4，下)。通过方差分析(anova)分析获得的数据，在存在任何差异的情况下使用graphpadprismv6.0软件进行事后tukey测试，p<0.05。

结果(图4)显示用补充有10％fbs的rpmi1640培养基中的各种浓度的制剂i处理的人外周血单核细胞未显示dsdna(dsdna)的损伤。彗星头(完整的dna)中没有产生明显的损伤(图4，中间)。相反，已知具有遗传毒性作用的过氧化氢(0.1mm)显示出检测到更快速的dsdna扩散(图4，上下)的行为，这是一种遗传毒性指示，并且由于这种现象，与空白相比，读取的测量区域高得多(图4，下)。用制剂i处理的样品的行为类似于空白，表明用其处理24小时不会对单核外周血细胞dna产生有害作用(图4)。此外，再现了由过氧化氢诱导的遗传毒性作用(azquetaa.和a.r.collins，archtoxicol,2013,87:949)，表明在实验条件下，所开发的方法是敏感和可信的。制剂i对细胞生长产生影响而不会对人单核细胞dna产生有害影响。

实施例5

使用3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑鎓(mtt)的微稀释测定法评估不同浓度的制剂i对人胚胎肾(hek-293)细胞系和vero细胞系(非洲绿猴肾细胞)的影响(mosmannt.，j.immunolmethods，1983,65(1-2.)：55)。基于还原3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物的mtt方法是反映细胞代谢功能的测定法。mtt是黄色染料，其由线粒体脱氢酶还原为甲臜(蓝色染料)，其是活细胞呼吸链的一部分(hwa等人，2015)。它用于定量比色微稀释方法，用于测定哺乳动物细胞的存活和增殖能力(mosmannt.，j.immunolmethods，1983,65(1-2)：55)。它是用于评估细胞增殖和细胞毒性的合适的体外试验，因为它对于活细胞群是简单、有效、经济、可重复、灵敏、安全和有效的。

使用dulbecco改良的eagle最低要求标准培养基/f12(dmem/f12)，其补充有10％胎牛血清(fbs)和1ml抗生素混合物(200,000iu青霉素和0.5g链霉素)。制备0.25％的胰蛋白酶溶液(difco)。由制剂i的2000ppm储备溶液和作为溶剂dmem/f12的tritonx-100制备系列稀释液。制备1ml各稀释液以获得1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125、250、500和1000ppm的浓度。使用dmem/f1225cm³培养板生长每种细胞培养物的细胞，直至获得平板表面上的汇合单层。用于细胞培养的条件是37℃，含有5％co2的潮湿气氛。使用0.25％胰蛋白酶将汇合的细胞单层从25cm³平板上提起。这如下进行：除去dmem/f12培养基，然后用1×盐水磷酸盐缓冲液洗涤单层1至3次，然后加入0.5ml0.25％胰蛋白酶，并将内容物在37℃在含有5％co2的潮湿气氛中孵育5分钟。在提升的细胞上加入3mldmem/f12，用0.1-1ml微量移液管重悬细胞，将其置于15ml无菌锥形管中，随后以1000rpm离心5分钟。从锥形管中取出dmem/f12。在细胞包上加入3mldmem/f12，将细胞重新悬浮，并在neubauer室中进行计数。然后制备250,000个细胞/ml的细胞悬浮液。在96孔微量培养板的所有孔中加入每孔0.1ml的250,000个细胞/ml的微量培养板细胞悬浮液，将微量培养板在37℃、5％co2的潮湿气氛中培养24小时。真空除去每个孔的dmem/f12培养基，保持每个孔底部的单层，然后加入0.1ml的从制剂i和tritonx-100制备的每一稀释液(1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.50、125、250、500、1000和2000ppm)。此外，留下8个孔，其中使用未处理的细胞作为细胞存活率的对照(没有处理的细胞培养基-空白)，向其中加入0.1ml的dmem/f12。随后将微量培养板在37℃在含5％co2的潮湿气氛中孵育24小时。然后用制剂i和tritonx-100的样品除去dmem/f12培养基，用磷酸盐缓冲盐水洗涤孔一次。添加0.02ml的5mg/ml的mtt溶液，并将内容物在37℃孵育2小时，以通过活细胞线粒体脱氢酶进行mtt至甲臜的完全还原过程。随后除去mtt溶液，保留形成的甲臜盐，然后加入0.1ml异丙醇，在具有gen5嵌入软件的synergyht微量培养板读数器中读取540nm处的吸光度。在计算细胞存活率百分比时，在未处理的培养基中增殖的细胞的孔中检测到的吸光度被认为是100％的活细胞。制剂i溶液一式五份进行测试，阳性对照溶液一式三份进行测试。该试验分三个单独的活动进行。使用graphpadprism版本6统计软件包，通过student’st检验估计制剂i和tritonx-100的lc50数据(p<0.05)。数据分析的结果表示为平均值±标准偏差(图5)。

结果表明，对于浓度低于500ppm的制剂i，观察到对hek-293和vero细胞系的增殖和线粒体活性的刺激。hek-293系列在1.95ppm时增加140％，在62.5ppm浓度时增加超过40％，而在vero细胞中，与空白相比仅增加10％。结果证明了制剂i刺激细胞增殖的作用。

在高于500ppm时观察到剂量依赖性细胞毒性作用，因为随着制剂i浓度增加，观察到细胞存活率降低(图5)。

在两种细胞系中，阳性对照(tritonx-100)显示出剂量依赖性效应，因为通过增加该物质的浓度观察到吸光度的降低，根据预期它是细胞毒性化合物，在任何测试浓度下存活率没有任何增加(大于100％的值)，但与空白(未经处理)相比检测到吸光度降低。

制剂i和tritonx-100的lc50分别对于hek-293细胞系评估为2,417.00±65.77和764.10±21.93ppm，以及对于vero细胞系评估为4,289.00±289.90和42.80±1.60ppm。

获得的结果证明，在50-90ppm范围的浓度下没有观察到制剂i的细胞毒性。在此剂量下，观察到细胞代谢刺激。观察到的现象类似于实施例3中描述的现象，并证明制剂i应被认为是生长和细胞代谢因子-启动子。

实施例6

在健康的实验室动物如啮齿动物和兔类动物模型(wistar大鼠和新西兰兔)的高剂量急性毒性试验(单次施用，监测14天)中观察制剂i的效果，所述高剂量高于实施例2(1000和1350mg/kg)和亚慢性毒性试验(对于50、70和90mg/kg的九十天剂量为每天施用，每天施用两次)中描述的卤虫测定的lc50。在每种动物物种的阴性对照动物中平行进行添加安慰剂(纯化水)、重量测量和血糖测量的相同程序。

在对实验动物进行的所有测试中，在分别对啮齿动物和兔类动物的常规饲料消耗之后，通过口胃插管以重量依赖性措施口服给予治疗(欧洲共同体委员会，off.j.eur.comm(l383a),1992,35:110)。

将动物保持在单独的笼子中并在给予制剂i后的最初24小时连续观察，继续观察并将每个测试期间所需的中间兽医护理记录在关于任何动物反应的日志中。在实验的开始和结束时测定并记录体重。同样在兔子的情况下，在每次测试之前和之后进行临床实验室测试：血液生物测定、血液化学和转氨酶的活性：天冬氨酸氨基转移酶(ast)、丙氨酸氨基转移酶(tgp)和转肽酶γ谷氨酰转氨酶(ggt)。在大鼠中，仅在测试结束时测定这些参数以防止失血。最后，我们继续使用一系列麻醉药和氯化钾(kcl)对动物实施安乐死步骤。随后，根据每种情况进行器官和基本组织的肉眼检查和尸检，主要包括心脏、肾脏、脾脏、胰腺、肺、肝、卵巢和睾丸。将获取的样品进行组织病理学研究。

在急性毒性试验中测试的最大剂量为1350mg/kg，因为对于啮齿动物和兔类动物，口胃插管施加的最大体积分别为1或3ml，并且较高剂量的使用导致获得更粘稠的溶液，难以通过口胃插管。对于测试浓度，未观察到实验室动物的任何死亡，因此未确定ld50值。关于本发明，显示大多数评估的参数，包括重量和肝酶的活性和血液生物测定，在处理之前和之后没有显示显著差异，并与空白(未处理)进行比较。然而，在治疗的动物中，葡萄糖水平的降低、尿酸和胆固醇的降低(图6)被认可。因为这些参数与代谢综合征、痛风和糖尿病有关，所以测试结果表明单一制剂i的高剂量的应用导致上述代谢物水平的降低，并证实了该治疗用于所述病症的效果。

对于亚慢性毒性研究结果观察到相同的趋势。通过应用不同剂量的制剂i观察到葡萄糖、胆固醇、尿酸、肌酸酐和肝酶的水平降低。然而，仅对于葡萄糖控制获得了统计学上证明的差异，而改变其他参数具有与所研究动物中的受试者的个体性相关的大的标准偏差。治疗动物的体重的增加低于对照。此外，观察到肝酶活性的反复降低，这可以被认为是制剂i改善肝活性的效果的证据。进行尸检时的特征性观察结果是，在肉眼评估中，用制剂i治疗的动物具有显著的肌肉发育和体脂的少量发展，同样，它们也没有表现出肝脏脂肪变性。所有这一切即使在笼内运动很少的情况下(即，没有锻炼和根据体重和年龄正常的食物摄入)也保持了90天。这些结果还证实，制剂i的应用允许由减少量的脂肪组织、葡萄糖控制和偶尔血液化学的其他特征介导的体重控制，而不改变健康哺乳动物的血液生物测定和肝功能。

实施例7

此外，进行了对于患有用四氧嘧啶诱导的糖尿病的大鼠和兔子的试验。在该测试中，以及在亚慢性毒性研究中，应用三个剂量的制剂i(50、70和90mg/kg)的治疗。检查5组具有治疗的动物(胰岛素加上三种所述剂量的制剂i、70mg/kg的制剂i和单独的胰岛素)。每24小时在单次早晨给药中以0.7u/kg的剂量皮下施用甘精胰岛素。

在测定开始和结束时对诱导糖尿病的兔子的血液化学分析结果的比较发现，即使在治疗下，血糖也表现为高水平。观察到尿素和肌酸酐增加，证实肾损伤。然而，在用制剂i处理的兔子的情况下，观察到尿酸和胆固醇水平的降低。

施用治疗21天之前和之后兔血液的血液生物测量结果显示，在动物中诱导的糖尿病导致的与单核细胞和血小板以及血红蛋白的存在相关的参数降低。单核细胞增多症是存在被称为单核细胞的一类空白血细胞的存在增加的病症。单核细胞在骨髓中形成，并在免疫系统的正常功能中起重要作用。血小板参与血液凝固，有助于在受伤时止血。观察到的变化表明，在四氧嘧啶诱导的糖尿病的治疗期间，形成血液或骨髓的病症。

在临床监测期间，几个兔子标本显示与食物摄入和水的改变(带有烦渴的厌食症的时期)相关的体重减轻，这是在任何糖尿病体中的预期临床数据。对于用90mg/kg制剂i和胰岛素治疗的动物组的一些兔子，未与所有其他动物一样检测到体重减轻，甚至具有体重增加的证据，这表明制剂i显示有机保护。图7(上)显示了在该研究中测试的不同动物组中体重变化的趋势。应理解，制剂i的应用导致较少的体重减轻。对于用制剂i和胰岛素治疗的组，在施用90mg/kg的组中观察到更大的体重增加。这表明该效应是剂量依赖性的。

同样地，用胰岛素和制剂i处理的所有样品证实它显示出如实施例5和6中的降血糖作用。图7(下)显示了在治疗应用的不同天数中毛细血管葡萄糖水平的平均值。可以看出，效果随着不同的剂量而变化，并且90mg/kg的效果大于50和70mg/kg。

图8(上)显示了每组患有诱导的糖尿病的大鼠的体重变化的平均值。在用纯胰岛素(i)治疗的动物组的情况下，与用研究处理测试的其他组相比，体重减轻的趋势更加明显。图8(下)表示葡萄糖浓度(毛细血管葡萄糖)的变化的平均值。对于仅用胰岛素治疗的大鼠，在治疗达19天后可见毛细血管葡萄糖增加的倾向。应理解，在此期间，通过仅将制剂i施用至70mg/kg，更有效地控制了增加的葡萄糖。对于70mg/kg剂量，观察到1型糖尿病动物中葡萄糖水平的最大降低。

在患有诱导糖尿病(1型糖尿病)的大鼠的临床监测中，仅用胰岛素或制剂i治疗的组的样本显示饲料摄入和水的变化(伴有烦渴的厌食症的时期)，如在兔中，这些临床数据在任何糖尿病体中都是预期的。然而，接受制剂i加胰岛素治疗的组中没有如此显著地显示这些临床数据，即，治疗的应用有助于改善动物的生活质量，并且用胰岛素联合管理可以改善患有糖尿病的动物的临床状态，从而显示出在本发明中要求保护的效果。

用50和70mg/kg制剂i加胰岛素(甘精胰岛素)治疗的大鼠中的葡萄糖水平倾向于标准化(图8，下)。关于监测用90mg/kg和胰岛素(甘精胰岛素)治疗的组，尽管在该短时间暴露期间血糖倾向于不正常化，但观察到与用相同剂量处理的兔类物种中获得的数据(图7)非常相似的数据。在两种情况下，结果表明制剂i显示出对患有糖尿病的哺乳动物的有机保护。

在试验中不同组大鼠之间的血液化学分析结果的比较证明，仍然在治疗中，血糖显示高水平并且观察到高的尿素和肌酸酐值，从而证实了对肾脏的损害。血液生物测定结果显示，不同测试组之间没有显著差异。

在患有i型糖尿病的兔和大鼠尸检后的肉眼观察研究中，观察到仅用补充剂或胰岛素处理的组呈现最严重的胰腺改变，已在组织病理学切片中得到证实(图9)。因此，四氧嘧啶作为糖尿病诱导剂，影响该器官，并且预期在所有动物中都会发生改变。然而，用制剂i和胰岛素治疗的动物未显示肉眼可检测的改变。已知白藜芦醇增加胰岛素受体敏感性的作用(chachayv.s.等人，brjclinpharmacol，2011,72(1)：27)。然而，在本发明的描述中，当在胰岛素存在下起作用时，制剂i还表现出对动物器官的进一步细胞保护作用和对受损组织的恢复作用。

根据用诱导糖尿病的动物样品进行的组织病理学结果，观察到肾损伤(与血液化学分析一致的结果)。然而，在用胰岛素和制剂i治疗的组的样本中，观察到的肾损伤少于仅用制剂i或仅用胰岛素治疗的样本。与体重控制和毛细血管血糖的结果一起，这些结果提供了证据，即，在试验期间(21天)，使用制剂i和胰岛素的治疗导致保护肾脏和胰腺等器官免受由糖尿病引起的变化。

本文所示的实施例证实了制剂i在与胰岛素一起施用时保护1型糖尿病哺乳动物的器官免于恶化的能力。此外，注意到控制血糖的能力，其在胰岛素存在下增强，并且可以看到保持体重增加、降低胆固醇和尿酸的效果。

实施例8

一名48岁的男性出现胸部不适，随后被诊断患有代谢综合征。体检显示其为体重87千克，身高170厘米，体重指数32千克/m²的肥胖者。血压(bp)为160/110mmhg，空腹血糖(ga)为150mg/dl，甘油三酯(tg)为215mg/dl，总胆固醇(tc)为320mg/dl，ldl-c为212mg/dl，hdl-c37mg/dl，hbalc为8.46％。如实施例2中所述，患者接受制剂i治疗，在接下来的6个月中每天三次，在每次食物摄取后服用。制剂i的施用形式在一杯水或果汁悬浮液中制备。进行定期评估以估计亲和疗法(affinitytherapy)并避免任何副作用。在用制剂i治疗的这段时间后，我们继续进行生化研究。检测值为：ga115mg/dl，hbalc6.69％，tc235mg/dl，ldl-c123.7mg/dl，hdl-c40mg/dl，tg119mg/dl，体重下降74kg。与基线相比，11-脱氢血栓素b2和血小板聚集的水平分别降低了75％和90％。对治疗的反应是100％。通过这种方法，患者对代谢综合征的危险因素产生了相当大的改变。

最后，必须理解，甘氨酸、半胱氨酸、精氨酸和白藜芦醇用于治疗和预防代谢综合征、糖尿病、肥胖症和作为抗衰老治疗的用途不限于上述制剂i和实施方案，以及本领域技术人员将被本文所述的教导训练以改变本发明的治疗组合物，该范围将仅由权利要求确定。

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