使用生物正交反应进行的生物材料的代谢标记和分子增强的制作方法

本申请要求于2016年6月15日提交的美国临时申请号62/350,259的权益。以上文献的全部内容通过引用结合在此。本发明涉及哺乳动物器官和组织的代谢标记和进一步官能化。
背景技术：
：假体网状物是许多临床问题的常见解决方案，其中最常见的是疝修复。虽然合成假体网状物很牢固并且提供低复发率，但已证明了网状物相关并发症(包括感染)的增加。(darehzereshki,a.等人worldj.surg.[世界外科杂志]38,40-50(2014))合成网状物在活动性感染的情况下是忌用的，并且在处于感染高风险下的患者或处于污染高风险下的操作中是相对禁忌的。已使用各种组织来源和加工技术开发了生物修复术。这些网状物中的大多数由已灭菌并通常经固定的去细胞化细胞外基质(ecm)构成。最常用的网状物来自猪小肠猪真皮(permacoltm)或人尸体真皮(allomaxtm)。这些生物假体对感染具有增强的抵抗力，但这些材料仍存在失败率和细菌感染。(darehzereshki,a.等人worldj.surg.[世界外科杂志]38,40-50(2014)；bellows,c.f.,wheatley,b.m.,moroz,k.,rosales,s.c.和morici,l.plosone[公共科学图书馆：综合]6,(2011))此外，细菌定植后生物网状物的生物力学特性显著下降。(bellows,c.f.,wheatley,b.m.,moroz,k.,rosales,s.c.和morici,l.plosone[公共科学图书馆：综合]6,(2011))网状物感染使1％-8％的疝修复复杂化，这最通常是由于葡萄球菌属物种(staphylococcusspp.)，特别是金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、链球菌属物种(streptococcusspp.)(包括b组链球菌)和其他葡萄球菌物种引起的。(collage,r.d.和rosengart,m.r.surg.infect.[外科感染](larchmt).11,311-8(2010))万古霉素是一种糖肽类抗生素，其对葡萄球菌和链球菌微生物两者(包括造成一半以上的网状物感染的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa))均具有杀菌作用。(collage,r.d.和rosengart,m.r.abdominalwallinfectionswithinsitumesh[腹壁感染与原位网状物].surg.infect.[外科感染](larchmt).11,311-8(2010))用万古霉素进行全身治疗需要静脉内输注和持续的治疗药物水平监测，以确保疗效并避免有害的肾毒性。器官移植是末期器官衰竭的确定性治疗。然而，它受供体器官短缺的限制。基于去细胞化器官支架的器官再生为移植提供了活的移植物的替代来源。该概念已在啮齿动物模型中的心脏(ott,h等人naturemedicine[自然医学]14(2):213-21(2008))、肺(ott,h等人naturemedicine[自然医学]16(8):927-33(2010)；petersen,t.等人science[科学]329(5991):538-41(2010))、肝(uygun,b.等人naturemedicine[自然医学]16(7):814-820(2010))和肾(song,j.等人naturemedicine[自然医学]19(5):646-51(2013))的再生中被证明。该策略还经比例放大为人体大小器官的去细胞化和再生(ko,i等人biomaterials[生物材料]40:72-9(2014)；ren,x.等人naturebiotechnology[自然生物技术]33,1097-1102(2015)；guyette,j.等人circulationresearch[循环研究]118(1):56-72(2016))。去细胞化器官支架主要由细胞外基质构成，该细胞外基质是定义器官解剖学、机械学和生物化学特征的基本组分中的一种。通过固定生物活性分子使去细胞化器官支架官能化有望促进器官再生和改善再生移植物的体内性能。然而，目前使去细胞化器官支架官能化的技术基于随机交联化学并且不具选择性(ma,b.等人regenerativebiomaterials[再生生物材料]1(1):81-9(2014)；bao,j.等人scientificreports[科学报告]5:10756(2015)),这极大地改变了生物材料的机械和生物化学特征。器官(例如肺)移植代表了许多患者的最终希望，这些患者经历以器官(例如肺)衰竭为代表的病状，例如慢性阻塞性肺病(copd)、囊性纤维化、肺癌、和先天性肺病等。器官(例如肺)移植的典型等待时间可以为两年或更长时间，导致等待名单上的人的死亡率为30％。尽管其具有广泛的潜力，但器官移植的持续成功取决于充足的器官供应。越来越明显的是，以传统方式从脑干死亡供体获得的器官数量已达到稳定水平。此外，缺血/再灌注损伤是器官移植后的常见后果，并且影响短期以及长期移植物结果。临床缺血/再灌注损伤与移植物功能延迟、移植物排斥、慢性排斥和慢性移植物功能障碍相关。伴随移植的微生物暴露和组织损伤导致病原体和损伤相关并发症(例如血液凝固)两者的发生，以及交叉反应性同种异体反应性t细胞的产生。技术实现要素：在一些方面，本披露提供了使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法，该方法包括：(i)选择哺乳动物以使器官或组织的细胞外基质官能化；并且(ii)向该哺乳动物给予营养素，其中该营养素用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化。在一些方面，本披露提供了使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法，该方法包括：(i)收获器官或组织；并且(ii)使用包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的培养基培养该器官或组织。在一些方面，本披露提供了制备用于移植的器官或组织的方法，该方法包括：(i)向供体受试者给予用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素；(ii)从该供体受试者手术移除该器官或组织；并且(iii)用保存溶液处理分离的器官或组织，该保存溶液包含用与官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子。在一些方面，器官或组织是牛、猪、鼠或人器官或组织。在一些方面，器官或组织选自下组，该组由以下组成：颈动脉、肺、心脏、肝脏、肾脏和皮肤。在一些方面，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团选自下组，该组由以下组成：叠氮化物(-n3)、炔烃、硝酮、异氰化物、环丙烯和四嗪。在一些方面，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团选自叠氮化物(-n3)和炔烃。在一些方面，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)。在一些方面，营养素选自下组，该组由以下组成：糖、氨基酸、脂肪酸、和甘油三酯。在一些方面，营养素是单糖。在一些方面，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素选自下组，该组由以下组成：叠氮化物标记的半乳糖胺、叠氮化物标记的葡萄糖胺和叠氮化物标记的甘露糖胺。在一些方面，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素选自ac4galnaz、ac4mannaz和ac4glcnaz。在一些方面，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是四酰化的n-叠氮基乙酰基半乳糖胺(ac4galnaz)。在一些方面，营养素通过腹膜内注射、皮下注射或通过气管内途径给予。在一些方面，营养素通过腹膜内注射给予。在一些方面，本披露提供了包含官能化细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架，其中细胞外基质通过在此所述方法中的任一种官能化。在一些方面，本披露提供了包含细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架，其中去细胞化支架的细胞外基质用至少一种生物活性分子化学选择性官能化。在一些方面，本披露提供了制备去细胞化支架的方法，该方法包括使如在此所述的去细胞化支架与用与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在一些方面，本披露提供了制备生物假体网状物的方法，该方法包括使如在此所述的去细胞化支架与用与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在一些实施例中，反应包括将去细胞化支架与生物活性分子一起输注(例如，用含有生物活性分子的缓冲溶液输注支架)。在一些方面，互补反应性化学基团是叠氮化物(-n3)、炔烃、硝酮、异氰化物、环丙烯或四嗪。在一些方面，炔烃是脂族炔烃或环辛炔。在一些方面，环辛炔是二苯并环辛炔(dbco)、二氟苯并环辛炔(difbo)、二芳基氮杂环辛酮(barac)、二苯并环辛炔(dibo)、二氟化环辛炔(difo)、单氟化环辛炔(mofo)、二甲氧基氮杂环辛炔(dimac)或无芳基辛炔(alo)。在一些方面，炔烃是脂族炔烃并且反应在铜(i)催化剂存在下进行。在一些方面，炔烃是环辛炔并且反应在无铜条件下进行。在一些方面，生物活性分子是生长因子、肽、抗体、抗凝血剂或抗生素。在一些方面，抗凝血剂是香豆素、肝素、因子xa的戊糖抑制剂、直接因子xa抑制剂或直接凝血酶抑制剂。在一些方面，抗凝血剂是肝素。在一些方面，抗生素是喹诺酮、β-内酰胺、头孢菌素、青霉素、碳青霉烯、脂肽、氨基糖苷、糖肽、大环内酯、安莎霉素或磺酰胺。在一些方面，抗生素是万古霉素。在一些方面，抗体是针对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)具有特异性的抗体。在一些方面，用与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子选自肝素-炔烃、肝素-炔烃-生物素(肝素ab)、万古霉素-炔烃、肝素-dbco、万古霉素-dbco、抗tnf-α-炔烃和抗tnf-α-dbco。在一些方面，本披露提供了制备用于移植的哺乳动物器官或组织的方法，该方法包括用受体来源的细胞接种如在此所述的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架以获得用于移植的器官或组织。在一些方面，受体来源的细胞选自上皮细胞、内皮细胞、基质细胞、肌肉细胞和神经元。在一些方面，器官或组织通过在此所述方法中的任一种制备。在一些方面，本披露提供了用于移植的哺乳动物器官或组织，其中该器官或组织通过如在此所述方法中的任一种制备。在一些方面，本披露提供了用至少一种生物活性分子生物正交官能化的生物假体网状物，其中该生物假体网状物通过在此所述方法中的任一种制备。除非另外定义，否则在此使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在此描述了用于本申请的方法和材料；还可以使用本领域已知的其他适合的方法和材料。这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。在此提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目、和其他参考文献通过引用以其整体结合。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。本披露的其他特征和优点将从下列详述和附图以及从权利要求中显而易见。附图说明本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，官方将提供带有一幅或多幅彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。图1a示出了向供体动物给予叠氮化物标记的糖。图1b示出了用叠氮化物标签标记的非细胞外基质(ecm)相关的糖蛋白和ecm相关的糖胺聚糖或糖蛋白两者。图示出了肺作为实例。图1c示出了去细胞化后保存在ecm中的糖胺聚糖或糖蛋白上的叠氮化物标签。图示出了肺作为实例。图1d示出了具有与炔官能团缀合的多种功能的生物分子。图1e示出了通过高选择性铜催化的点击反应固定到去细胞化器官支架上的炔烃缀合的生物分子。图示出了肺作为实例。图2a示出了在使用ac4galnaz、ac4mannaz和ac4glcnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠肺支架中的叠氮化物标记的检测。图2b示出了通过测量生物素染色的荧光强度(归一化为ecm层粘连蛋白染色的荧光强度)来定量生物素标记。图2c示出了三种叠氮化物标记的糖(ac4glcnaz、ac4galnaz和ac4mannaz)的代谢标记效率的比较。图3示出了使用ac4galnaz进行的大鼠颈动脉的体内代谢标记。图4示出了可点击肝素(肝素-炔烃)的产生。图5示出了去细胞化大鼠上腹部真皮基质皮瓣，其具有深的腹壁下动脉和静脉插管。图6a示出了尸体上腹部皮瓣(苏木精和伊红(h&e)染色)的低功率视图。图6b示出了尸体上腹部皮瓣(苏木精和伊红(h&e)染色)的高功率视图。图6c示出了去细胞化上腹部皮瓣(苏木精和伊红(h&e)染色)的低功率视图。图6d示出了去细胞化上腹部皮瓣(苏木精和伊红(h&e)染色)的高功率视图。图7示出了使用ac4galnaz进行的大鼠上腹部皮瓣的体内代谢标记。图8示出了大鼠器官/组织的去细胞化支架的离体代谢工程图。图9示出了人肺的去细胞化支架的离体代谢工程图。图10示出了在代谢工程后，去细胞化大鼠肺支架中的叠氮化物标记的检测。图11示出了在离体代谢工程后，去细胞化大鼠颈动脉支架中的叠氮化物标记的检测。图13示出了大鼠器官/组织的去细胞化支架的体内代谢工程图。图14示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠颈动脉支架中的叠氮化物标记的检测。图15示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠心脏支架中的叠氮化物标记的检测。图16示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠肝脏支架中的叠氮化物标记的检测。图17示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠肾脏支架中的叠氮化物标记的检测。图18示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠皮肤支架中的叠氮化物标记的检测。图19是示出供体肺组织在其用于移植的冷保存期间的分子细化程序的图。图20是示出保存在冰上临床perfadex溶液中的dbco-生物素和叠氮基糖标记的肺移植物和对照肺移植物的无铜点击反应的照片。图21是示出可用于培养分离器官的生物反应器的图。图22是示出万古霉素与炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯的缀合反应的图。图23是符合万古霉素-炔烃结构的lc-ms/ms色谱图。图24是示出在点击反应后在去细胞化大鼠上腹部皮瓣(ref)上对万古霉素进行免疫荧光染色的图像。图25a是大鼠中器官ecm的体内代谢工程图。简而言之，通过经由每天腹膜内注射给予代谢标记试剂三天来进行体内代谢工程。然后收获器官并去细胞化。图25b是通过经由点击反应将生物素-炔烃缀合到叠氮化物配体上，随后使用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白检测生物素在组织切片上检测ecm中的叠氮化物配体的图。图25c含有示出对通过ac4galnaz、ac4mannaz和ac4glcnaz进行的无细胞肺ecm的体内代谢标记效率进行比较的图像。使用生物素-炔烃点击反应和链霉抗生物素蛋白染色，成像检测无细胞肺ecm中的叠氮化物配体(如图25b所示)，用层粘连蛋白共染色无细胞肺ecm(比例尺：200μm)。图25d是示出对通过ac4galnaz、ac4mannaz和ac4glcnaz进行的无细胞肺ecm的体内代谢标记效率进行比较的条形图。叠氮化物-生物素-链霉抗生物素蛋白标记强度的定量，归一化为层粘连蛋白的荧光强度(每种代谢标记试剂的n＝3)。**p<0.01。图25e是蛋白质印迹，其示出在使用ac4galnaz或dmso(对照)进行体内代谢工程后，从无细胞肺ecm提取的ecm蛋白中的叠氮化物-生物素-链霉抗生物素蛋白标记的检测(每组的n＝3)。将层粘连蛋白蛋白质印迹用作上样对照。图26a是大鼠和猪肺ecm的离体代谢工程图。简而言之，在ac4galnaz(50μm)或dmso(不含ac4galnaz的对照)存在下，将新鲜分离的大鼠肺或猪左肺在生物反应器中离体培养24小时，并去细胞化。图26b含有示出在使用ac4galnaz或dmso进行离体代谢工程后，无细胞大鼠肺中的叠氮化物配体的检测的图像(每组的n＝3)。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击反应，随后进行链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞肺ecm与层粘连蛋白共染色(比例尺：200μm)。图26c是蛋白质印迹，其示出在使用ac4galnaz或dmso进行离体代谢工程后，从无细胞大鼠肺提取的ecm蛋白中的叠氮化物-生物素-链霉抗生物素蛋白标记的检测(每组的n＝3)。将层粘连蛋白蛋白质印迹用作上样对照。图26d是示出经历离体培养和代谢工程的猪左肺的图像。图26e是示出经历离体去细胞化的猪左肺的图像。图26f是示出在使用ac4galnaz或dmso进行离体代谢工程后，无细胞猪左肺中的叠氮化物配体的检测的图像(分析了ac4galnaz或dmso猪肺的三个代表性区域；比例尺：200μm)。图26g是蛋白质印迹，其示出在使用ac4galnaz或dmso进行离体代谢工程后，从无细胞猪左肺提取的ecm蛋白中的叠氮化物-生物素-链霉抗生物素蛋白标记的检测(分析了ac4galnaz或dmso猪肺的三个代表性区域)。图26h是允许将炔烃标记的感兴趣生物分子固定到完整叠氮化物标记的无细胞器官支架上的全器官输注点击反应的图(示出肺作为实例的图)。图26i含有示出在使用ac4galnaz或dmso进行离体代谢工程，随后进行生物素和层粘连蛋白共染色的链霉抗生物素蛋白染色后，无细胞大鼠肺中的生物素-炔烃输注点击反应的图像(上方图像的比例尺：2000μm；下方图像的比例尺：200μm)。图27a是示出可点击肝素-炔烃-生物素(肝素-ab)的制备的图。简而言之，肝素中的羧基基团被edc和磺基-nhs活化为胺反应性的，并与胺-peg4-炔烃和胺-peg3-生物素缀合。图27b是示出胶原-叠氮化物(胶原蛋白-az)板测定的图。简而言之，我们使用叠氮基-peg4-nhs酯(az-nhs)将叠氮化物基团缀合到胶原蛋白i包被的组织培养板上，这允许经由点击反应将肝素-ab固定到板上用于可视化和生物活性评估。点击固定的肝素-生物素(肝素-b)进一步结合并固定化atiii，并且增强抑制因子xa(fxa)的atiii活性。图27c含有在点击固定的肝素-b的链霉抗生物素蛋白染色后，具有和不具有az-nhs缀合的代表性胶原蛋白孔的图像。将胶原蛋白i共染色以指示ecm。图27d是示出固定化肝素-b在具有和不具有az-nhs缀合的胶原蛋白孔上的定量的线图(每组的n＝4)。**p<0.01。图27e是示出固定化atiii在具有和不具有az-nhs缀合的胶原蛋白孔上的定量的线图(每组的n＝4)。**p<0.01。图27f是示出在胶原蛋白孔中孵育5、15和30分钟后，使用与底物s2222的显色反应对剩余fxa活性进行定量的线图。胶原蛋白孔具有和不具有az-nhs缀合，并且与肝素-ab点击反应混合物和atiii顺序孵育(如图27b所示)。**p<0.01。图27g是通过输注点击反应和随后固定atiii将肝素-ab固定到离体代谢工程化叠氮化物标记的大鼠肺上的图。图27h含有示出在具有和不具有离体ac4galnaz代谢工程的情况下无细胞大鼠肺上点击固定的肝素-b的链霉抗生物素蛋白染色和可视化的图像。将无细胞肺ecm与层粘连蛋白共染色(上方图像的比例尺：2000μm；下方图像的比例尺：200μm)。图27i是蛋白质印迹，其示出在具有和不具有离体ac4galnaz代谢工程的情况下固定在肝素-b-点击的无细胞大鼠肺上的atiii的分析。将层粘连蛋白蛋白质印迹用作上样对照。图27j是示出在无细胞大鼠肺中灌注5、15、30和60分钟后，使用与底物s2222的显色反应对剩余fxa活性进行定量的线图。在fxa灌注和抑制测定之前，将具有和不具有离体ac4galnaz代谢工程情况下的无细胞大鼠肺与肝素-ab点击反应混合物和atiii顺序孵育(如图27g所示)。**p<0.01。图28含有示出在使用ac4galnaz或dmso(不含ac4galnaz的对照)进行体内代谢工程后，无细胞大鼠心脏中的叠氮化物配体的检测的图像。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击反应，随后进行用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞心脏ecm与层粘连蛋白共染色(每组的n＝3；比例尺：200μm)。图29含有示出在使用ac4galnaz或dmso(不含ac4galnaz的对照)进行体内代谢工程后，无细胞大鼠肾脏中的叠氮化物配体的检测的图像。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击反应，随后进行用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞肾脏ecm与层粘连蛋白共染色(每组的n＝3；比例尺：200μm)。图30含有示出在使用ac4galnaz或dmso(不含ac4galnaz的对照)进行体内代谢工程后，无细胞大鼠肝脏中的叠氮化物配体的检测的图像。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击反应，随后进行用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞肝脏ecm与层粘连蛋白共染色(每组的n＝3；比例尺：200μm)。图31含有示出在使用ac4galnaz或dmso(不含ac4galnaz的对照)进行体内代谢工程后，无细胞大鼠皮肤中的叠氮化物配体的检测的图像。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击，随后进行用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞皮肤ecm与层粘连蛋白共染色(每组的n＝3；比例尺：200μm)。图32含有示出在使用ac4galnaz或dmso(不含ac4galnaz的对照)进行体内代谢工程后，无细胞大鼠颈动脉中的叠氮化物配体的检测的图像。在具有和不具有cu(i)催化剂的情况下使用生物素-炔烃点击，随后进行用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白染色来检测叠氮化物配体。将无细胞颈动脉ecm与层粘连蛋白共染色(每组的n＝3；比例尺：100μm)。具体实施方式本申请涉及天然细胞外基质(ecm)的选择性共价修饰，而没有细胞外基质的官能团的随机交联。通过例如，洗涤剂灌注、或使组织(例如，肺组织)经历重复的冻-融循环，通过全器官或组织去细胞化来产生天然基质。选择性修饰可以首先通过例如，通过向供体动物给予(例如饲喂或通过注射)叠氮化物标记的糖将叠氮化物标签置于器官/组织ecm上来实现，这些叠氮化物标记的糖在去细胞化后保留在ecm支架中。在另一个实例中，将叠氮化物标签置于器官/组织ecm上可以通过用含有叠氮化物标记的糖的培养基培养组织(例如肺组织)来实现。然后可以通过高选择性铜催化或无铜点击反应将炔烃标记的生物分子缀合到去细胞化器官/组织支架上的叠氮化物标签上。例如，通过将感兴趣的生物分子与炔烃基团缀合，可以将各种生物分子和小分子固定到叠氮化物标记的去细胞化器官/组织支架上。本申请的方法允许通过例如用生长因子/肽(例如vegf、fgf)固定ecm来增强ecm上的细胞植入、通过例如用抗凝血试剂(例如肝素)固定ecm来降低血栓形成，以及通过例如用抗生素(例如万古霉素)固定ecm来降低感染风险。生物分子(如生长因子和肝素)在合成或天然材料上的固定主要使用碳二亚胺试剂(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc))/n-羟基琥珀酰亚胺(hns)介导的交联化学1-3进行。用于ecm生物材料官能化的常规方法通常涉及利用这些生物材料内的天然氨基酸残基(如赖氨酸残基3、9-10)进行交联化学。例如，edc/hns交联化学取决于活化羧基基团与伯胺之间的反应。羧基和胺基基团两者均在为ecm主要组分的蛋白质(例如胶原蛋白)中普遍存在。由于天然ecm内的这些反应性氨基酸残基的大丰度，因此这些交联缀合反应缺乏特异性11-15。因此，如果应用于天然细胞外基质，则非选择性edc/nhs化学引起基质的不希望的交联并显著改变ecm的生物化学和机械特性。本申请的方法允许通过化学选择性点击化学选择性修饰天然ecm。铜催化或无铜点击化学是叠氮化物与炔烃官能团之间的缀合反应。叠氮化物和炔烃官能团不存在于生物分子中，因此用叠氮化物官能化的生物分子与具有炔烃官能团的分子之间的反应是高度特异性的(生物正交)。虽然edc/nhs化学需要在通常与生物或生命系统不相容的极端化学条件(例如极端ph、有机溶剂)下进行，但铜催化或无铜点击化学可以在常规生物缓冲液中进行。因此，本申请的方法可以有利地用于生物材料官能化。归因于天然生物系统中叠氮化物和炔烃部分的生物和化学惰性，例如叠氮化物与炔烃修饰的生物分子之间的缀合是高度特异性的。然而，由于缺乏用于生物相容性和有效地将点击反应性配体(如叠氮化物或炔烃)结合到ecm中的方法，因此点击化学用于使去细胞化ecm生物材料官能化的应用受到阻碍。已开发了体内代谢工程方法以将点击反应性配体结合到氨基酸、聚糖、脂质和核酸16-25中。这些研究集中于细胞组分的标记，并且很少关注组织和器官ecm的代谢标记的可行性、有效性和稳定性。在此所述的是一种代谢工程方法，该方法经由体内代谢工程将例如点击反应性叠氮化物配体结合到组织和器官的ecm中。在一些方面，本申请涉及一种通过分离真皮基质并使用天然细胞外基质(ecm)的选择性共价修饰来固定抗生素(例如万古霉素)以制备抗生素包被的生物网状物的新方法。点击化学(也称为叠氮化物-炔烃huisgen环加成)在室温下使用铜(cu)作为催化剂。与用于固定生物分子的其他方法不同，在此所述的方法避免任何脱靶交联。成功的反应需要供体动物的天然ecm用叠氮化物(未以其他方式在体内发现的官能团)标记。为了实现这一点，在终点组织收获之前，用叠氮化物标记的糖给予(例如腹膜内注射)动物特定的时间间隔。注射的叠氮化物标记的碳水化合物结合到ecm中，并用点击反应所必需的叠氮化物基团标记糖胺聚糖或糖蛋白。通过将万古霉素与炔烃官能团缀合而对该分子的简单修饰允许抗生素通过万古霉素上的炔烃基团与ecm上的叠氮化物基团之间的点击反应与ecm共价结合。在一些方面，通过使用炔烃与叠氮化物之间(例如，dbco与叠氮化物之间)的生物正交化学反应将生物活性分子固定到供体器官上，本申请提供了改进的供体器官移植物(例如，肺移植物)。tnf-α是器官移植后缺血/再灌注损伤的主要原因中的一种，并且阻断/中和tnf-α信号传导有利于改善器官移植后的缺血/再灌注损伤。在一些方面，本申请中披露的方法允许在其冷保存期间将抗tnf-α抗体固定到供体器官上，从而中和缺血/再灌注期间产生的tnf-α，并且有利地保护供体肺移植物并改善其移植结果。定义如在此所使用的，术语“细胞”是指在体外、离体或在体内的细胞。在一些实施例中，离体细胞可以是从生物如哺乳动物切离的组织样品的一部分。在一些实施例中，体外细胞可以是细胞培养物中的细胞。在一些实施例中，体内细胞是生活在生物如哺乳动物中的细胞。如在此所使用的，术语“去细胞化”和“无细胞”可互换使用并且定义为使用标准组织学染色程序，在组织切片中完全或几乎完全不存在可检测的细胞内、内皮细胞、上皮细胞、和细胞核。优选但不是必需地，残留的细胞碎片也已从去细胞化的器官或组织中去除。如在此所使用的，术语“生物正交”用于指可以在体外和体内在生命系统中发生而不干扰天然生物化学过程的化学反应。在一些实施例中，生物正交反应可以发生在两种或更多种生物分子(如生长因子、酶、细胞外蛋白、和核酸)之间。在一些实施例中，生物正交反应可以发生在生物分子与异生物质之间。在一些实施例中，生物正交反应可以发生在两种或更多种异生物质之间。在一些实施例中，生物正交化学反应是叠氮化物与炔烃之间的1,3-偶极环加成。在一些实施例中，生物正交化学反应是硝酮与炔烃之间的反应。在一些实施例中，生物正交化学反应是叠氮化物与膦之间的staudinger反应。如在此所使用的，术语“化学选择性”用于指一个官能团在其他官能团存在下与另一个官能团的选择性反应性。如在此所使用的，术语“预防”意指例如当患者或受试者易患病状或者处于疾病或病状的风险中时，完全或几乎完全阻止疾病或病状(例如，感染、缺血或再灌注损伤)发生。预防还可以包括抑制，即阻止病状的发展。如在此所使用的，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指1)抑制该疾病；例如，抑制正在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的该疾病、病状或病症(即，阻止病理学和/或症状学的进一步发展)，或2)改善该疾病；例如，改善正在经历或显示疾病、病状或病症的病理学或症状学的个体的该疾病、病状或病症(即，逆转病理学和/或症状学)。如在此所使用的，可互换使用的术语“个体”、“患者”、或“受试者”是指任何动物，包括哺乳动物，优选小鼠、大鼠、其他啮齿类动物、兔、狗、猫、猪、牛、绵羊、马、或灵长类动物，并且最优选人。在一些实施例中，受试者可以是器官或组织的供体或者器官或组织的受体。如在此所使用的，术语“生物正交附着”用于描述使用生物正交化学反应偶联在一起的两个或更多个分子。如在此所使用的，单独或与其他术语组合采用的术语“cn-m烷基”是指可以是直链或支链的饱和烃基，其具有n至m个碳。烷基部分的实例包括但不限于化学基团如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基；更高同系物如2-甲基-1-丁基、正戊基、3-戊基、正己基、1,2,2-三甲基丙基等。在一些实施例中，烷基基团含有从1至6个碳原子、从1至4个碳原子、从1至3个碳原子、或1至2个碳原子。如在此所使用的，术语“亚烷基”意指仅含有碳和氢的二价支链或直链化学基团，如亚甲基、亚乙基、正亚丙基、异亚丙基、正亚丁基、异亚丁基、仲亚丁基、叔亚丁基、正亚戊基、异亚戊基、仲亚戊基和新亚戊基。亚烷基基团可以是未经取代的或被一个或多个取代基取代的。亚烷基基团可以是在一个或若干个位置处饱和或不饱和的(例如，含有-c＝c-或-c≡c-亚基)。在一些实施例中，亚烷基基团包含1至9个碳原子(例如，1至6个碳原子、1至4个碳原子、或1至2个碳原子)。如在此所使用的，“cn-m炔基”或“炔基”是指具有一个或多个碳-碳三键的烷基基团(其中“n至m”是指炔基基团可以含有的碳原子数量)。在一些实施例中，炔基基团是脂族的。示例性脂族炔基基团包括但不限于乙炔基、丙炔-1-基、丙炔-2-基等。在一些实施例中，脂族炔基部分含有2至6、2至4、或2至3个碳原子。在一些实施例中，炔基基团是-c≡ch或-ch2c≡ch。在一些实施例中，炔基基团是环状的(例如，环辛炔或环壬炔)。在一些实施例中，环辛炔选自如在此所述的dbco、mofo、difo、oct、dimac、alo和bcn。如在此所使用的，术语“点击反应”是指两种或更多种具有低活化能垒的底物之间的高产率和高度特异性反应。在一些实施例中，点击反应是指带有炔烃的分子与带有叠氮化物的分子之间的反应。在其他实施例中，点击反应是指带有烯烃的分子与带有四嗪的分子之间的反应。在又其他实施例中，点击反应是指带有烯烃的分子与带有叠氮化物的分子之间的反应。如在此所使用的，术语“营养素”是指由生命系统(例如，动物或植物)代谢以用于存活和生长的分子。如在此所使用的，营养素可以是碳水化合物(例如，糖(例如，单糖、低聚糖、多糖))、氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、甘油三酯、维生素或辅因子。如在此所使用的，术语“细胞外基质(ecm)”是指细胞外生物分子的集合，这些细胞外生物分子为周围细胞和组织提供结构支持(例如，物理支架)和生物化学信号。在一些实施例中，胶原蛋白(例如，i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii和/或xiv型)是细胞外基质的主要组分。在一些实施例中，细胞外基质的纤维还包含弹性蛋白、糖胺聚糖、蛋白多糖、纤连蛋白和/或层粘连蛋白。在一些实施例中，ecm通过去除所有细胞组分同时留下概述微观解剖学的物质而源自原始组织和器官。如在此所使用的，术语“培养”是指体外/离体实验技术，该实验技术允许在适于代谢的条件下维持分离的器官或组织(或者器官或组织的一部分)的细胞。在一些实施例中，培养保存器官或组织的功能。这可以通过在约37℃下用包含一种营养素或多种营养素的培养基处理器官或组织来实现。如在此所使用的，术语“分离的器官”、“分离的组织”、“收获的器官”或“收获的组织”是指从供体受试者手术移除用于再次使用(例如，器官或组织移植到受体受试者)的器官或组织(例如，心脏、肝脏、肾脏、肺、血管或皮肤)。如在此所使用的，术语“器官移植”或“组织移植”是指从供体受试者手术移除器官或组织并将该器官或组织置于受体受试者。在一些实施例中，当供体受试者是受体受试者时，器官或组织移植被称为“自体移植”。在一些实施例中，当供体受试者和受体受试者属于同一物种时(例如，当供体受试者是人并且受体受试者是人时)，器官或组织移植被称为“同种异体移植”。在一些实施例中，当供体受试者和受体受试者属于不同物种时(例如，当供体受试者是猪并且受体受试者是人时)，器官或组织移植被称为“异种移植”。如在此所使用的，术语“生物假体网状物”和“假体网状物”是指例如可用于切口疝修复以促进组织附着的假体生物材料(例如，包含网状物层的平片)。在一些实施例中，网状物是指一类柔性片，这些柔性片允许在手术已完成后组织通过网状物中的开口生长以增强对周围组织的附着。如在此所使用的，术语“支架”是指在体外和体内为周围组织提供结构支持(例如，用于细胞附着和组织形成)的材料。在一些实施例中，支架是一种基质，细胞可以在其上培养(例如，存活和增殖)。如在此所使用的，术语“互补反应性基团”是指通常已知与另一种官能团反应以形成化学键的官能团。例如，在形成1,2,3-三唑环的反应中，当第一反应性官能团是叠氮化物时，互补反应性基团是炔烃。另一方面，当第一反应性官能团是炔烃时，互补反应性官能团是叠氮化物。本披露的方法在一些实施例中，本披露提供了使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法，该方法包括向该哺乳动物给予用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素。在一些实施例中，本披露提供了使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法，该方法包括(i)选择用于使器官或组织的细胞外基质官能化的哺乳动物；并且(ii)向该哺乳动物给予营养素，其中该营养素用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化。在一些实施例中，本披露提供了使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法，该方法包括(i)收获器官或组织；并且(ii)使用包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的培养基培养该器官或组织。在一些实施例中，本披露提供了包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架。在一些实施例中，本披露提供了包含细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架，其中去细胞化支架的细胞外基质用生物活性分子化学选择性官能化。在一些实施例中，本披露提供了制备包含用生物活性分子生物正交官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架的方法，该方法包括使包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架与用与该官能化细胞外基质的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在一些实施例中，本披露提供了制备生物假体网状物的方法，该方法包括使包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架与用与该官能化细胞外基质的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在一些实施例中，本披露提供了制备用于移植的器官或组织的方法，该方法包括(i)向供体受试者给予用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素；(ii)从该供体受试者手术移除该器官或组织；并且(iii)用保存溶液处理分离的器官或组织，该保存溶液包含用与该官能化营养素的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子。在一些实施例中，本披露提供了用于移植的器官或组织，其中该器官或组织用如在此所述的生物活性分子官能化。用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是碳水化合物(例如，糖)、氨基酸、肽、蛋白质、脂肪酸、核酸、核苷、核苷酸或甘油三酯。例如，营养素可以是天然氨基酸(例如，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸)或非天然氨基酸(例如，甲酰甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、γ-氨基丁酸(gaba)、对氨基苯甲酸、氨基乙酰丙酸、脱氢丙氨酸、氨基异丁酸、羊毛硫氨酸、异亮氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸、别苏氨酸、或肌氨酸)。在一些实施例中，营养素是包含从约2至约50个氨基酸的肽。在一些实施例中，营养素是包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个或25个或更多个氨基酸的肽。在另一个实例中，营养素是蛋白质。在一些实施例中，肽或蛋白质可以包含在此所述氨基酸中的任一种。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是脂肪酸(例如，饱和脂肪酸，如庚酸、辛酸、壬酸、癸酸、十一烷酸、月桂酸、十三烷酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、棕榈酸、十七烷酸、硬脂酸、十九烷酸、花生酸、二十一烷酸(heneicosylic)、二十二烷酸、二十三烷酸、二十四烷酸、二十五烷酸、二十六烷酸、二十七烷酸、二十八烷酸、二十九烷酸、三十烷酸、三十一烷酸、三十二烷酸、三十三烷酸、三十四烷酸、三十五烷酸、三十六烷酸、三十七烷酸或三十八烷酸；或者，例如，单不饱和脂肪酸如巴豆酸、肉豆蔻酸、棕榈油酸、十六碳烯酸、油酸、反油酸、十八碳烯酸、鳕油酸、二十碳烯酸、芥酸、或神经酸；或者，例如，二不饱和脂肪酸如亚油酸、二十碳二烯酸、或二十二碳二烯酸；或者，例如，三不饱和脂肪酸如亚麻酸、皮诺敛酸、桐酸、蜂蜜酸、二高-γ-亚麻酸或二十碳三烯酸；或者，例如，四不饱和脂肪酸如十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳四烯酸、或肾上腺酸；或者，例如，五不饱和脂肪酸如伯色五烯酸(bosseopentaenoicacid)、二十碳五烯酸、奥唑酸(ozubondoacid)、沙丁酸(sardineacid)、或二十四碳五烯酸；或者，例如，六不饱和脂肪酸如二十二碳六烯酸或二十四碳六烯酸)。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是甘油三酯(例如，由甘油和如在此所述的三种脂肪酸组成的酯)。在一些实施例中，甘油三酯是甘油和油酸、棕榈酸和硬脂酸的酯。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是碳水化合物，如糖(例如，单糖、二糖、低聚糖、或多糖)。在一些实施例中，单糖是戊糖(例如，d-或l-戊糖)如阿拉伯糖、来苏糖、核糖、核酮糖、木酮糖、或木糖。在一些实施例中，单糖是己糖(例如，d-或l-己糖)如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖或塔格糖。在一些实施例中，二糖是蔗糖、乳果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、壳二糖、曲二糖、黑曲霉糖、异麦芽糖、β,β-海藻糖、α,β-海藻糖、槐糖、昆布二糖、龙胆二糖、松二糖、麦芽酮糖、帕拉金糖、龙胆二酮糖、甘露二糖、蜜二糖、melibiulose、芸香糖、芸香酮糖、或木二糖。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是核酸(例如，脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna))。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是核苷。在一些实施例中，核苷是核糖核苷(例如，腺苷、鸟苷、5-甲基尿苷、尿苷、或胞苷)。在一些实施例中，核苷是脱氧核糖核苷(例如，脱氧腺苷、脱氧鸟苷、胸苷、脱氧尿苷、或脱氧胞苷)。在另一个实例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以是核苷酸(例如，在此所述核苷中任一种的单磷酸酯、二磷酸酯或三磷酸酯)。例如，核苷酸可以是atp、gtp、ctp或utp。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的单糖是氨基糖或其衍生物(例如，半乳糖胺、葡萄糖胺、n-乙酰基-d-葡萄糖胺、道诺糖胺、神经氨酸、唾液酸、n-乙酰基甘露糖胺(mannac)、n-乙酰基葡萄糖胺(glcnac)、n-乙酰基半乳糖胺(galnac)、β-d-半乳糖胺五乙酸酯、β-d-葡萄糖胺五乙酸酯、或β-d-甘露糖胺五乙酸酯)。在实例中，单糖是硫代异鼠李糖。在一些实施例中，该化学基团是在huisgen环加成(也称为炔烃和叠氮化物用于形成三唑的[3+2]环加成，或“点击”反应)中具有反应性的化学基团中的任一种。在一些实施例中，该化学基团是在以下反应中具有反应性的化学基团中的任一种：施陶丁格连接(即，叠氮化物与膦之间的反应)、氧杂降冰片二烯和叠氮化物用于形成三唑的反应、四嗪(例如，二吡啶基四嗪)和反式环辛炔的相反需求diels-alder反应、四嗪(例如，单芳基四嗪)和降冰片烯的相反需求diels-alder反应、四嗪和环丙烯的反应、环丙烯和腈亚胺的反应、四唑和烯烃的光诱导的1,3-偶极环加成、氧化腈和降冰片烯的1,3-偶极环加成、异氰化物和四嗪的[4+1]环加成或硝酮和炔烃的1,3-环加成。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)、炔烃(例如，-c≡ch)、环辛炔、环辛烯、硝酮、异氰化物、环丙烯、降冰片烯、二苯基膦、腈亚胺、四唑、氧化腈、或四嗪。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)或炔烃。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是炔烃。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素选自l-叠氮基丙氨酸、l-叠氮基高丙氨酸、l-高炔丙基甘氨酸、(2s)-n-fmoc-5-叠氮基-戊酸、(r)-n-fmoc-2-(2’-丙炔基)丙氨酸、(s)-n-fmoc-2-(2’-丙炔基)丙氨酸、(s)-n-fmoc-2-(4’-叠氮基丁基)丙氨酸、(s)-n-fmoc-2-(5’-叠氮基戊基)丙氨酸、(s)-n-fmoc-2-(6’-叠氮基己基)丙氨酸、2-氨基-3-巯基-n-(丙-2-炔基)丙酰胺、2-氨基-n-(3-叠氮基丙基)-3-巯基丙酰胺、boc-d-炔丙基甘氨酸、boc-lys(n3)-oh、boc-叠氮基赖氨酸、fmoc-4-叠氮基苯丙氨酸和fmoc-d-炔丙基甘氨酸。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是描述于nucl.acidsres.[核酸研究](2015),1-12中的叠氮化物修饰的rna分子中的任一种，该文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是3’-末端叠氮化物修饰的rna(例如，如bioconjugchem.[生物共轭化学]2014年1月15日；25(1):188-195中所述，该文献的披露内容通过引用以其整体结合在此)。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是叠氮基核苷。在一些实施例中，叠氮基核苷是3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷或具有下式的化合物：在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是炔烃核苷。在一些实施例中，炔烃核苷是(2’s)-2’-脱氧-2’-氟-5-乙炔基尿苷、5-乙炔基-2’-脱氧胞苷或5-乙炔基-2’-脱氧尿苷。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是叠氮基核苷酸。在一些实施例中，叠氮基核苷酸是8-叠氮基-amp、8-叠氮基-adp、8-叠氮基-atp、γ-(2-叠氮基乙基)-atp、γ-(6-叠氮基己基)-atp、γ-[(6-叠氮基己基)-亚氨基]-atp、n6-(6-叠氮基)己基-atp、n6-(6-叠氮基)己基-3’-datp、n6-(6-叠氮基)己基-datp、5-dbco-peg4-dctp、5-dbco-peg4-dutp、3’-叠氮基-2’,3’-ddatp、叠氮化物-peg4-氨基烯丙基-dutp、5-叠氮基-c3-utp、5-叠氮基-peg4-utp、5-叠氮基-peg4-ctp、pcp-叠氮化物、aztmp、azttp、2’-叠氮基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸酯、2’-叠氮基-2’-脱氧胞苷-5’-三磷酸酯、2’-叠氮基-2’-脱氧鸟苷-5’-三磷酸酯、或2’-叠氮基-2’-脱氧尿苷-5’-三磷酸酯。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是炔烃核苷酸。在一些实施例中，炔烃核苷酸是n6-炔丙基-atp、5-tco-peg4-dutp、5-反式-环辛烯-peg4-dutp、γ-[(炔丙基)-亚氨基]-atp、γ-炔丙基-atp、γ-[(炔丙基)-亚氨基]-atp、2-乙炔基-atp(2-eatp)、c8-炔烃-dctp、c8-炔烃-dutp、5-乙炔基-utp(5-eutp)或5-乙炔基-dutp(5-edutp)。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是叠氮基脂肪酸(例如、ω-叠氮基脂肪酸)或炔基脂肪酸。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是具有式z-(y)xcoor的脂肪酸衍生物，其中y是-ch2-或-ch＝ch-，z是-n3或炔基，x是从1至20的整数(例如，n是6或7)，并且r是h或c1-6烷基。在一些实施例中，叠氮基脂肪酸或炔基脂肪酸是描述于journaloftheamericanoilchemists’society[美国油脂化学家学会会志],2009,86,1115-1121中的叠氮基脂肪酸或炔基脂肪酸中的任一种。在一些实施例中，叠氮基脂肪酸是描述于chembiochem[生物化学],2015,16(11),1588-1591中的叠氮基脂肪酸中的任一种，该文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，叠氮基脂肪酸选自12-叠氮基十二烷酸、11-叠氮基十一烷酸、9-叠氮基壬酸、13-叠氮基十三烷酸、5-(1-叠氮基-己烷-6-硫杂)戊酸、2-(1-叠氮基-壬烷-9-硫杂)乙酸、4-(1-叠氮基-辛烷-6-硫杂)丙酸、9-(1-叠氮基-乙烷-2-氧杂)壬酸、8-(1-叠氮基-丙烷-3-氧杂)辛酸、5-(1-叠氮基-己烷-6-氧杂)戊酸、和2-(1-叠氮基-壬烷-9-氧杂)乙酸。在一些实施例中，炔基脂肪酸选自15-十六碳炔酸、17-十八碳炔酸、和5z,8z,11z,14z-二十碳四烯-19-炔酸。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是炔基糖(例如，炔基糖)。在一些实施例中，炔基糖是描述于例如us2012/0149887中的炔基糖中的任一种，该文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，炔基糖选自炔基岩藻糖和炔基mannac。在一些实施例中，炔基岩藻糖是具有下式的1,2,3,4-四乙酰基炔基岩藻糖：在一些实施例中，炔基mannac是具有下式的1,3,4,6-四-o-乙酰基-n-4-戊炔酰基甘露糖胺：在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是炔烃标记的半乳糖胺、炔烃标记的葡萄糖胺或炔烃标记的甘露糖胺。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素选自1-叠氮基-1-脱氧-β-d-吡喃半乳糖苷、2-叠氮基-d-半乳糖四乙酸酯、6-叠氮基-6-脱氧-d-半乳糖、α-d-吡喃甘露糖基叠氮化物四乙酸酯、2,3,4-三-o-乙酰基-β-d-吡喃木糖基叠氮化物、2-乙酰氨基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、2-叠氮基-β-d-葡萄糖四乙酸酯、6-叠氮基-6-脱氧-d-葡萄糖、1,3,4,6-四-o-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-d-吡喃半乳糖、1,3,4,6-四-o-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖、1,6-脱水-2-叠氮基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖、1,6-脱水-2-叠氮基-4-o-苄基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖、1,6-二-o-乙酰基-2-叠氮基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖、2,3,4,6-四-o-乙酰基-α-d-吡喃甘露糖基叠氮化物、2,3,4,6-四-o-乙酰基-β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、2,3,4-三-o-乙酰基-1-叠氮基-1-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖醛酸甲酯、2,3,4-三-o-乙酰基-6-叠氮基-6-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、2,3,4-三-o-乙酰基-6-叠氮基-6-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖胺、2-乙酰氨基-3,4,6-三-o-乙酰基-2-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、2-叠氮基-2-脱氧-d-吡喃半乳糖1,3,4,6-四乙酸酯、2-叠氮基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖1,3,4,6-四乙酸酯、2-氯-4-硝基苯基2-叠氮基-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖苷、2-氟-4-硝基苯基2-叠氮基-2-脱氧-β-d-吡喃半乳糖苷、3-o-乙酰基-1,6-脱水-2-叠氮基-2’,3’-二-o-苄基-4’,6’-o-亚苄基-2-脱氧-β-d-纤维二糖、3-o-乙酰基-2-叠氮基-2’,3’-二-o-苄基-4’,6’-o-亚苄基-2-脱氧-纤维二糖、6,6’-二叠氮基-6,6’-二脱氧-α,α-d-海藻糖、6-叠氮基-6-脱氧-2,3-o-异亚丙基-α-l-呋喃山梨糖、6-叠氮基-6-脱氧-d-半乳糖、6-叠氮基-6-脱氧-d-吡喃葡萄糖、6-叠氮基-6-脱氧-l-半乳糖、6-叠氮基-6-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基6-叠氮基-6-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷、6-叠氮基-6-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖胺、6-叠氮基-d-岩藻糖、6-叠氮基-l-岩藻糖、6-o-乙酰基-2-叠氮基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-d-吡喃葡萄糖、甲基(6-o-乙酰基-2-叠氮基-3,4-二-o-苄基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基)-(1→4)-2,3-二-o-苄基-β-d-吡喃葡萄糖醛酸甲酯-(1→4)-3,6-二-o-乙酰基-2-叠氮基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-2-o-乙酰基-3-o-苄基-α-l-吡喃艾杜糖醛酸甲酯-(1→4)-6-o-乙酰基-3-o-苄基-2-苄氧羰基氨基-2-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷、甲基2,3,4-三-o-乙酰基-1-脱氧-β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、甲基2,3,4-三-o-乙酰基-6-叠氮基-6-脱氧-α-d-吡喃葡萄糖苷、α-d-吡喃甘露糖基叠氮化物、α-d-吡喃木糖基叠氮化物、β-d-吡喃葡萄糖基叠氮化物、和β-d-吡喃木糖基叠氮化物。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是叠氮化物标记的半乳糖胺、叠氮化物标记的葡萄糖胺或叠氮化物标记的甘露糖胺。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是四酰化的n-叠氮基乙酰基葡萄糖胺(ac4glcnaz)：在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是四酰化的n-叠氮基乙酰基甘露糖胺(ac4mannaz)：在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是四酰化的n-叠氮基乙酰基半乳糖胺(ac4galnaz)：体内代谢器官标记(动物饲喂)在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素可以通过口服、直肠、鼻腔、局部(包括口腔和舌下)、或肠胃外(包括腹膜内、皮下、肌肉内、静脉内和皮内)途径给予哺乳动物。在一些实施例中，营养素可以与食物一起或以可以通过药学领域熟知的任何方法制备的单位剂型(例如，片剂、胶囊、小袋、粉末、颗粒、缓释胶囊、或脂质体)给予哺乳动物。当口服给予时，营养素可以与常用的载体(如乳糖和玉米淀粉)一起给予。如果希望，则可以加入常用的甜味剂和/或调味剂和/或着色剂，并且可以使用本领域公知的各种稀释剂和赋形剂(例如氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、缓冲物质(如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质(如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚亚乙基吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚亚丙基酸酯、蜡、聚亚乙基-聚氧亚丙基嵌段聚合物、以及聚乙二醇)。在一些实施例中，营养素可以通过肌肉内、静脉内、腹膜内(i.p.)、或皮下注射给予哺乳动物。在一些实施例中，营养素可以通过腹膜内注射给予。适于注射(例如，腹膜内或皮下注射)的组合物包括水性和非水性无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期的受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液(其可以包括助悬剂和增稠剂)。无菌可注射制剂还可以是处于无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如，如1,3-丁二醇中的溶液。在一些实施例中，溶剂是水、dmso或其混合物(例如，约10/90、约20/80、约30/70、约40/60、约50/50、约60/40、约70/30、约80/20、或约90/10dmso/水)。在可以采用的其他可接受的运载体和溶剂中有甘露糖醇、林格氏溶液以及等渗氯化钠溶液。此外，常规地采用无菌的固定油作为溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备可注射物，天然的药学上可接受的油类(如橄榄油或蓖麻油)、尤其是它们的聚氧乙烯化形式也是如此。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链的醇稀释剂或分散剂。在一些实施例中，营养素可以通过吸入或雾化(例如，气管内、鼻内给予，或通过肺递送)给予哺乳动物。在一些实施例中，营养素可以通过喷雾或气雾剂(例如，鼻气雾剂或吸入器)给予。包含营养素的用于吸入和/或雾化的组合物(以及用于给予这些组合物的装置)可以根据药物配制品领域熟知的方法和技术来制备，并且可以制备(例如，使用在此所述赋形剂中的任一种)成溶液(例如，水性溶液或盐水溶液)、固体配制品，采用苯甲醇或其他适合的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物、推进剂(例如，丁烷或丙烷)和/或本领域已知的其他增溶剂或分散剂。参见，例如：rabinowitzjd和zaffaroniac，美国专利6,803,031，转让给艾利斯达分子递送公司(alexzamoleculardeliverycorporation)。在一些实施例中，减小了营养素的粒度以用于吸入给予。在一些实施例中，粒度可以通过干磨或湿磨该营养素来减小(例如，使用球磨机、喷射磨机、针磨机、流体能量磨机、棒磨机、辊磨机、破碎机磨机、spex型磨机、磨碎机型磨机、siebtechnik磨机、simoloyer磨机、或hicom磨机)。在一些实施例中，在颗粒体积平均基础上，营养素的粒度是从约10nm至约1000nm、从约20nm至约900nm、从约30nm至约800nm、从约40nm至约700nm、从约50nm至约600nm、从约60nm至约500nm、从约70nm至约400nm、从约70nm至约300nm、从约100nm至约200nm。)。在一些实施例中，在颗粒体积平均基础上，营养素的粒度是约100nm、约200nm、约300nm、约400nm、约500nm、约600nm、约700nm、约800nm、约900nm、或约1000nm。在一些实施例中，在颗粒体积平均基础上，营养素的粒度是从约1μm至约100μm、从约1μm至约90μm、从约1μm至约80μm、从约1μm至约70μm、从约1μm至约60μm、从约1μm至约50μm、从约1μm至约40μm、从约1μm至约30μm、从约1μm至约20μm、或从约1μm至约10μm。在一些实施例中，在颗粒体积平均基础上，营养素的粒度是约1μm、约5μm、约10μm、约20μm、约25μm、约30μm、约40μm、约50μm、约75μm、约100μm、约150μm、或约200μm。营养素颗粒的大小是中值粒度，在等效球形颗粒体积基础上确定为中值粒径。应理解，“中值”描述将群体分成两半使得该群体的50％大于或小于该大小的粒度。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的剂量可以是从约100mg至约1000g、从约100mg至约900g、从约100mg至约800g、从约100mg至约700g、从约100mg至约600g、从约100mg至约500g、从约100mg至约400g、从约100mg至约350g、从约100mg至约300g、从约100mg至约200g、从约100mg至约100g、从约100mg至约50g、从约100mg至约40g、100mg至约30g、100mg至约20g、从约200mg至约15g、从约300mg至约10g、从约400mg至约9g、从约500mg至约8g、从约600mg至约7g、从约700mg至约6g、从约800mg至约5g、从约900mg至约4g、或从约1g至约3g。在一些实施例中，该剂量是约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约700mg、约800mg、约900mg、约1g、约2g、约3g、约4g、约5g、约6g、约7g、约8g、约9g、约10g、约15g、约20g、约25g、约30g、约40g、约50g、约60g、约70g、约80g、约90g、约100g、约150g、约200g、约250g、约300g、约350g、约400g、约500g、约600g、约700g、约800g、约900g、或约1000g。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素/受试者体重的剂量可以是从约10mg/kg至约10g/kg、从约10mg/kg至约7.5g/kg、从约10mg/kg至约5g/kg、从约50mg/kg至约4g/kg、从约100mg/kg至约3g/kg、从约150mg/kg至约2g/kg、从约200mg/kg至约1g/kg、从约250mg/kg至约900mg/kg、从约300mg/kg至约800mg/kg、从约350mg/kg至约700mg/kg、或从约400mg/kg至约600mg/kg。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的剂量可以是约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg、约100mg/kg、约120mg/kg、约150mg/kg、约175mg/kg、约200mg/kg、约225mg/kg、约250mg/kg、约275mg/kg、约300mg/kg、约350mg/kg、约400mg/kg、约500mg/kg、约750mg/kg、约1g/kg、约2g/kg、约3g/kg、约4g/kg、约5g/kg、约6g/kg、约7g/kg、约8g/kg、约9g/kg、或约10g/kg。在一些实施例中，营养素的剂量是约300mg/kg体重。在一些实施例中，营养素每天给予一次、两次或三次。在一些实施例中，营养素每天给予一次。在一些实施例中，当营养素通过腹膜内注射给予时，注射的体积是从约100μl至约2000ml、从约100μl至约1900ml、从约100μl至约1800ml、从约100μl至约1750ml、从约100μl至约1700ml、从约100μl至约1600ml、从约100μl至约1500ml、从约100μl至约1250ml、从约100μl至约1000ml、从约100μl至约900ml、从约100μl至约800ml、从约100μl至约700ml、从约100μl至约600ml、从约100μl至约500ml、从约100μl至约400ml、从约100μl至约300ml、从约100μl至约200ml、从约100μl至约150ml、从约100μl至约100ml、从约100μl至约50ml、从约100μl至约40ml、从约100μl至约20ml、从约100μl至约15ml、从约150μl至约12ml、从约200μl至约10ml、从约250μl至约5ml、从约300μl至约4ml、从约400μl至约3ml、从约500μl至约2ml、或从约500μl至约1ml。在一些实施例中，注射的体积是约50μl、约100μl、约150μl、约200μl、约250μl、约300μl、约500μl、约1ml、约2ml、约4ml、约7.5ml、或约10ml。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素在终点器官或组织收获之前可以给予哺乳动物约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、或约10天。在一些实施例中，营养素可以给予哺乳动物约3至约7天。在一些实施例中，营养素可以给予哺乳动物约3天。在其他实施例中，营养素可以给予哺乳动物约7天。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是ac4galnaz，并且该营养素在70％水性dmso中以约300mg/kg的剂量通过腹膜内注射每天一次给予哺乳动物约3天或约7天。离体代谢器官标记(器官培养)在一些实施例中，为了使哺乳动物的未官能化的分离的器官或组织(例如，器官或组织的细胞外基质)官能化，可以使用如在此所述的包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的培养基培养该分离的器官或组织。本领域已知的用于维持和促进细胞生长的任何生长或培养基可以用于使如在此所述的器官和组织的细胞外基质官能化。在一些实施例中，培养基包含水性溶剂、电解质(例如，nacl、kcl、kh2po4、mgso4、na2co3、nahco3)、营养素(例如，氨基酸(例如，在此所述氨基酸中的任一种)、葡萄糖)、维生素(例如，叶酸、烟酰胺、核黄素、b12)、矿物质(例如，铁、镁)、或谷氨酰胺(例如，l-谷氨酰胺)。在一些实施例中，培养基包含人白蛋白、羟乙基淀粉、葡聚糖、吡哆醇、或吡哆醛。在一些实施例中，培养基包含ham’sf-12营养素混合物。在一些实施例中，培养基包含选自以下的组分：二水合氯化钙、五水合硫酸铜、七水合硫酸铁、无水氯化镁、氯化钾、碳酸氢钠、氯化钠、无水磷酸氢二钠、四水合硫酸锌、甘氨酸、l-丙氨酸、l-精氨酸盐酸盐、无水l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-半胱氨酸盐酸盐、l-谷氨酸、一水合l-组氨酸盐酸盐、l-异亮氨酸、l-亮氨酸、l-赖氨酸盐酸盐、l-蛋氨酸、l-苯丙氨酸、l-脯氨酸、l-丝氨酸、l-苏氨酸、l-色氨酸、l-酪氨酸二钠盐、l-缬氨酸、生物素、氯化胆碱、d-ca-泛酸盐、叶酸、烟酰胺、盐酸吡哆醇、核黄素、盐酸硫胺素、维生素b12、i-肌醇、d-葡萄糖、次黄嘌呤钠盐、亚油酸、硫辛酸、酚红钠盐、腐胺二盐酸盐、丙酮酸钠、和胸苷。在一些实施例中，该培养基以从约10mg/l至约10000mg/l、从约20mg/l至约9000mg/l、从约30mg/l至约8000mg/l、从约40mg/l至约7000mg/l、从约50mg/l至约6000mg/l、从约60mg/l至约5000mg/l、从约70mg/l至约4000mg/l、从约80mg/l至约3000mg/l、从约90mg/l至约2000mg/l、从约100mg/l至约1000mg/l、从约200mg/l至约1000mg/l、从约300mg/l至约1000mg/l、从约400mg/l至约1000mg/l、从约500mg/l至约1000mg/l、从约600mg/l至约1000mg/l、从约2000mg/l至约6000mg/l、从约3000mg/l至约5000mg/l或从约3500mg/l至约4500mg/l的浓度包含葡萄糖。在一些实施例中，该培养基以约500mg/l、约600mg/l、约700mg/l、约800mg/l、约900mg/l、约1000mg/l、约2000mg/l、约3000mg/l、约4000mg/l、约4500mg/l或约5000mg/l的浓度包含葡萄糖。在一些实施例中，该培养基以从约0.1gm/l至约1.1gm/l、从约0.2gm/l至约1.0gm/l、从约0.3gm/l至约0.9gm/l、从约0.4gm/l至约0.8gm/l、或从约0.5gm/l至约0.7gm/l的浓度包含l-谷氨酰胺。在一些实施例中，该培养基以约0.1gm/l、约0.2gm/l、约0.3gm/l、约0.4gm/l、约0.5gm/l、约0.6gm/l、或约0.7gm/l的浓度包含l-谷氨酰胺。在一些实施例中，l-谷氨酰胺的浓度是约0.584gm/l。在一些实施例中，培养基包含胎牛血清(fbs)。在一些实施例中，培养基中fbs的浓度(w/w％)是从约1％至约30％、从约5％至约20％、或从约10％至约15％。在一些实施例中，培养基中fbs的浓度是约5％、约10％、约15％、或约20％。在一些实施例中，培养基包含抗生素(例如，在此所述抗生素中的任一种)。在一些实施例中，抗生素是青霉素-链霉素。在一些实施例中，抗生素是庆大霉素-两性霉素b。在一些实施例中，当抗生素是青霉素-链霉素时，培养基包含从约10单位/ml至约500单位/ml青霉素和从约10μg/ml至约500μg/ml链霉素、从约20单位/ml至约400单位/ml青霉素和从约20μg/ml至约400μg/ml链霉素、从约30单位/ml至约300单位/ml青霉素和从约30μg/ml至约300μg/ml链霉素、从约40单位/ml至约200单位/ml青霉素和从约40μg/ml至约200μg/ml链霉素、或从约50单位/ml至约100单位/ml青霉素和从约50μg/ml至约100μg/ml链霉素。在一些实施例中，当抗生素是青霉素-链霉素时，培养基包含100单位/ml青霉素和约100μg/ml链霉素。在一些实施例中，当抗生素是庆大霉素-两性霉素b时，培养基包含从约1μg/ml至约20μg/ml庆大霉素和从约0.1μg/ml至约0.5μg/ml两性霉素b、从约5μg/ml至约15μg/ml庆大霉素和从约0.12μg/ml至约0.4μg/ml两性霉素b、或从约8μg/ml至约12μg/ml庆大霉素和从约0.15μg/ml至约0.35μg/ml两性霉素b。在一些实施例中，当抗生素是庆大霉素-两性霉素b时，培养基包含约10μg/ml庆大霉素和约0.25μg/ml两性霉素b。在一些实施例中，培养基包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素。在一些实施例中，培养基中的用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是在此所述营养素中的任一种。在一些实施例中，培养基中营养素的浓度是从约1μm至约1000μm、从约2μm至约900μm、从约3μm至约800μm、从约4μm至约700μm、从约5μm至约600μm、从约6μm至约500μm、从约7μm至约400μm、从约8μm至约300μm、从约9μm至约200μm、从约10μm至约100μm、从约20μm至约90μm、从约25μm至约80μm、从约30μm至约70μm、或从约40μm至约60μm。在一些实施例中，培养基中营养素的浓度是约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、v、约80μm、约85μm、约90μm或约100μm。在一些实施例中，培养基是eagle极限必需培养基、glasgow极限必需培养基、洛斯维帕克纪念研究所(roswellparkmemorialinstitute)培养基、dulbecco改良的eagle培养基(dmem)、或dulbecco/vogt改良的eagle极限必需培养基。在一些实施例中，培养基是dmem/f-12。在一些实施例中，培养基包含浓度为约50μm的ac4galnaz。在一些实施例中，培养基包含约10w/w％胎牛血清、浓度为约50μm的ac4galnaz和青霉素-链霉素(10,000单位/ml青霉素和10,000μg/ml链霉素的原液的1:100稀释液)或庆大霉素-两性霉素b(具有5mg/ml庆大霉素、125μg/ml两性霉素b的原液的1:500稀释液)。在一些实施例中，在生物反应器中培养器官或组织。在一些实施例中，生物反应器是本领域已知的适于培养器官和组织、或其片段的任何生物反应器。在一些实施例中，生物反应器是描述于例如us2016/0053213、us9,127,242、wo2009/002772、us2007/0275363、或us2013/0177972中的生物反应器中的任一种，这些文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，可以用于器官或组织培养的生物反应器如图21所描绘。参见图21，生物反应器包括包含培养基和在该培养基中的分离的器官或组织的腔室、向培养基提供氧气的充氧盘管、过滤器、泵和用于向器官或组织连续供应培养基的套管。对于大多数器官或组织，套管可以连接到饲喂分离的器官或组织的主动脉。对于血管，如颈动脉，套管连接到血管的一端。充氧盘管提供灌注液与周围环境(如孵育箱)之间的氧气和二氧化碳的有效交换。泵允许恒速灌注。在一些实施例中，器官或组织的培养包括用包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的培养基灌注该器官或组织。如有必要，还可以调整灌注速率以进行压力控制灌注。提供过滤器用于平衡腔室内与周围环境(如孵育箱)之间的压力和气体含量。在一些实施例中，以恒定的灌注速率用培养基灌注器官或组织。在一些实施例中，培养基灌注速率是从约0ml/min至约1000ml/min、从约1ml/min至约900ml/min、从约2ml/min至约800ml/min、从约3ml/min至约700ml/min、从约4ml/min至约600ml/min、从约5ml/min至约500ml/min、从约6ml/min至约400ml/min、从约7ml/min至约300ml/min、从约8ml/min至约200ml/min、从约9ml/min至约100ml/min、或from约10ml/min至约100ml/min。在一些实施例中，培养基灌注速率是从约0ml/min至约10ml/min、从约0ml/min至约7.5ml/min、从约0ml/min至约5ml/min、从约0ml/min至约2.5ml/min、或从约0.1ml/min至约0.2ml/min。在一些实施例中，培养基灌注速率是从约0ml/min至约50ml/min、从约0.5ml/min至约40ml/min、从约1ml/min至约30ml/min、从约2ml/min至约25ml/min、从约4ml/min至约20ml/min、或从约5ml/min至约15ml/min。在一些实施例中，培养基灌注速率是约0.1ml/min、约0.2ml/min、约0.5ml/min、约1ml/min、约2ml/min、约5ml/min、约7.5ml/min、约10ml/min、约15ml/min、或约20ml/min。在一些实施例中，该器官是大鼠肺并且灌注速率是约5ml/min。在一些实施例中，该器官是人肺叶并且灌注速率是约10ml/min。在一些实施例中，该器官是大鼠上腹部皮瓣并且灌注速率是约0.2ml/min。在一些实施例中，将器官或组织培养从约1小时至约10天、从约6小时至约9天、从约12小时至约8天、从约18小时至约7天、从约24小时至约6天的时间段。从约2天至约5天、或从约3天至约4天。在一些实施例中，将器官或组织培养约1小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、或约一周。器官收获(尸体器官、用于移植的器官)在一些实施例中，器官或组织是人器官或组织。在一些实施例中，器官或组织是非人器官或组织。在一些实施例中，器官或组织、或其一部分是牛(例如，牛科(bovinae)家族，动物界的牛科亚家族)、猪(例如，猪科(suidae)家族，动物界的猪科亚家族)、灵长类动物(例如，猴子或猿)、绵羊(例如，牛科家族，动物界的羊亚科(caprinae)亚家族)、鼠(例如，鼠科(muridae)家族，动物界的鼠科亚家族)或人器官或组织。器官或组织可以是小动物或大动物器官或组织。在一些实施例中，器官或组织是小鼠、大鼠、猪(野生或家养)、野猪、牛、公牛、野牛、水牛、兔子、野兔、狗、猫、马、山羊(例如，家养山羊)、绵羊(例如，家养绵羊)、大猩猩、黑猩猩、或猩猩器官或组织。在一些实施例中，器官或组织取自雄性或雌性受试者物种。在一些实施例中，器官或组织取自生长中或老化的受试者。在一些实施例中，器官或组织选自下组，该组由以下组成：肢体(例如，上肢(如手臂)、或下肢(如腿))、骨骼、舌头、胃、小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠)、大肠、肝脏、胆囊、胰腺、气管、肺(例如，右肺或左肺)、支气管、膈膜、肾脏、膀胱、输卵管、子宫、血管、淋巴管、动脉(例如，主动脉、肺动脉、脐动脉、头臂动脉、颈动脉、锁骨下动脉)、静脉(例如，下腔静脉、腹腔静脉、锁骨下静脉)、脾脏、心脏、软骨、肌肉组织(例如，平滑肌、心肌、骨骼肌)、软骨、上皮、肌腱、韧带、和皮肤(例如，皮肤皮瓣)。在一些实施例中，器官或组织选自下组，该组由以下组成：颈动脉、肺、心脏、肝脏、肾脏和皮肤。用于从人和动物供体受试者分离供体器官(例如，肺)的方法和材料是本领域已知的。取决于受试者的性别、年龄和一般健康状况、可能的其他治疗性治疗，熟练的外科医生将能够选择适当的时间、方法和/或器械来手术移除(例如，收获)器官或组织。例如，适当的方法描述于pasquemk等人standardizingthoracicorganprocurementfortransplantation.[标准化用于移植的胸腔器官获得]jthoraccardiovascsurg.[胸心血管外科杂志]2010年1月；139(1):13-7和bribriescoac等人experimentalmodelsoflungtransplantation.[肺移植的实验模型]frontbiosci[生物科学前沿](elite编).2013年1月1日；5:266-72中。可以使用如在此所述的用于分离器官或组织的任何适当的方法。制备去细胞化组织和器官支架在一些实施例中，使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法包括(i)向该哺乳动物给予如在此所述的用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素；并进一步包括(ii)收获如在此所述的器官或组织；并且(iii)去细胞化该器官或组织以获得包含该器官或组织的官能化细胞外基质的去细胞化支架。在一些实施例中，使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法包括(i)选择用于使器官或组织的细胞外基质官能化的哺乳动物；(ii)向该哺乳动物给予如在此所述的用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素；并进一步包括(iii)收获如在此所述的器官或组织，并且(iv)去细胞化该器官或组织以获得包含该器官或组织的官能化细胞外基质的去细胞化支架。在一些实施例中，使哺乳动物器官或组织的细胞外基质官能化的方法包括(i)收获如在此所述的器官或组织；(ii)使用如在此所述的包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素的培养基培养该器官或组织，并进一步包括(iii)去细胞化该器官或组织以获得包含该器官或组织的官能化细胞外基质的去细胞化支架。在一些实施例中，器官或组织可以根据使用本领域已知的用于制备去细胞化器官或组织基质的方法和材料而去细胞化。任何适当的材料可以用于制备这种基质。在一些实施例中，器官或组织基质可以是从去细胞化器官或组织开发的无细胞组织支架。例如，可以通过适当的方法去细胞化组织如人肺(例如一个或一对人肺或其部分，或者例如人、猪、牛、灵长类动物、或绵羊尸体肺或其部分)以从该组织去除天然细胞，同时维持该组织或组织部分的形态完整性和脉管系统并保存细胞外基质(ecm)蛋白质。描述了用于去细胞化哺乳动物器官和组织的方法，例如o’neilljd等人,decellularizationofhumanandporcinelungtissuesforpulmonarytissueengineering.[人和猪肺组织的去细胞化以用于肺组织工程].annthoracsurg.[胸外科年鉴]2013年9月；96(3):1046-55；nicholsje等人,productionandassessmentofdecellularizedpigandhumanlungscaffolds[去细胞化猪和人肺支架的产生和评估],tissueengparta.[组织工程，a辑]2013年9月；19(17-18):2045-62；gilpinse等人,perfusiondecellularizationofhumanandporcinelungs:bringingthematrixtoclinicalscale.[人和猪肺的灌注去细胞化：使基质达到临床规模]journalofheartandlungtransplantation.[心与肺移植杂志]在印刷中；songjj等人,bioartificiallungengineering.[生物人工肺工程]amjtransplant.[美国移植杂志]2012年2月；12(2):283-8；guyette,j.p.等人perfusiondecellularizationofwholeorgans.[全器官的灌注去细胞化]natprotoc[自然方案]9,1451-1468(2014)，otthc等人,regenerationandorthotopictransplantationofabioartificiallung.[生物人工肺的再生和原位移植]natmed.[自然医学]2010年8月；16(8):927-33；wo2016/036764、us2015/0306148、wo2014/008844、us8,470,520、us8,790,920、us2005/0256588、us6,479,064、wo2002/040630、us2002/0115208、us6,753,181、us2015/0344842、us2015/0238656、us2011/0045566、us2008/0095662、以及us2007/0244568，前述的披露内容通过引用以其整体结合在此。示例性的去细胞化方法可以包括使组织(例如，肺组织)经历反复的冻融循环，例如使用液氮。在其他情况下，可以使组织经受(例如，灌注)阴离子或离子细胞破裂介质，如十二烷基硫酸钠(sds)、脱氧胆酸钠(sdc)、3-((3-胆酰氨丙基)二甲氨基)-1-丙磺酸盐(chaps)、聚乙二醇(peg)、或tritonx。还可以用(例如，灌注)核酸酶溶液(例如，核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶)、或磷脂酶溶液处理组织，并在无菌磷酸盐缓冲盐水中伴随轻轻搅拌进行洗涤。示例性方法是本领域已知的，例如o’neilljd等人,decellularizationofhumanandporcinelungtissuesforpulmonarytissueengineering.[人和猪肺组织的去细胞化以用于肺组织工程]annthoracsurg.[胸外科年鉴]2013年9月；96(3):1046-55。在一些情况下，可以通过使用本领域已知的方法和材料冲洗该器官或组织的脉管、导管、和/或腔来执行去细胞化。例如，如maghsoudloup等人,preservationofmicro-architectureandangiogenicpotentialinapulmonaryacellularmatrixobtainedusingintermittentintra-trachealflowofdetergentenzymatictreatment.[使用洗涤剂酶促处理的间歇性气管内流获得的肺无细胞基质中的微构造和血管生成潜力的保存]biomaterials.[生物材料]2013年9月；34(28):6638-48中所述。在冲洗步骤之后，可以经由管线用如上所述的细胞破裂介质例如在去离子水中的1％sds来灌注该器官或组织。灌注穿过组织可以是顺行或逆行的，并且可以交替方向性以改进灌注效率。取决于器官或组织的大小和重量以及一种或多种特定的阴离子或离子洗涤剂和细胞破裂介质中一种或多种阴离子或离子洗涤剂的浓度，通常用细胞破裂介质以从约2至约12小时/10克组织来灌注组织。包括洗涤，器官可以每10克组织灌注持续长达约12至约72小时。一般将灌注调整为包括流速和压力的生理条件，例如5-100mmhg之间的压力和0.1-10倍于源生物或个体的生理心输出量的流速。在示例性方法中，去细胞化方法包括将洗涤剂，例如，(1)0.1％sds，(2)2％脱氧胆酸钠(sdc)，或(3)8mmol/升(3)3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(chaps)(ph12)洗涤剂，以30cmh2o的恒定压力灌注通过肺动脉。所有3种洗涤剂的方案包括：(1)用磷酸盐缓冲盐水(pbs)进行10分钟的初始顺行洗涤，(2)洗涤剂灌注持续可视化不透明的半透明基质(指示去细胞化)所需的时间加上该初始时间的另外20％(例如，70分钟+14分钟)，(3)15分钟的去离子h2o洗涤，和(4)用加入的抗生素和抗真菌剂进行另外172小时的pbs洗涤。这种去细胞化方法例如可以包括在去离子h2o之后另外的1％triton-x洗涤。sdc方案可以包括sdc之前0.1％triton-x灌注和sdc之后1mol/升nacl洗涤。类似地，猪和人器官和组织(例如，肺)去细胞化方法可以包括以恒定压力通过肺动脉来灌注洗涤剂或其他去细胞化剂，随后用h2o、1％triton-x溶液、和pbs顺序洗涤。与大鼠肺类似，在视觉检查和不透明的半透明基质出现后，可以认为去细胞化完成。起始器官的变异性主要是由于收获期间预冲洗的充分性，并且任何产生的凝块均可能贡献于灌注所需的长度。通常，去细胞化灌注的时间可以变化，例如从4至7天。器官或组织的去细胞化支架可以基本上由组织的全部或大部分区域的细胞外基质(ecm)组分(包括血管树的ecm组分)(例如，至少：按重量计85％纯、90％纯、92％纯、95％纯、96％纯、97％纯、98％纯、和99％纯)组成。ecm组分可以包括以下项中的任一项或全部或者以下项的任何组合：纤连蛋白、原纤维蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白家族成员(例如，胶原蛋白i、iii、和iv)、糖胺聚糖、基质(groundsubstance)、网状纤维和血小板反应蛋白(thrombospondin)，其可以保持组织化为定义的结构，如基膜。在一些实施例中，去细胞化器官或组织(例如，肺)基质保留完整的去细胞化脉管系统。保存基本上完整的去细胞化脉管系统使移植后组织基质能够与受试者的血管系统连接。此外，去细胞化组织基质可以用例如照射(例如，uv、γ)进一步处理以减少或消除留在去细胞化组织基质上或去细胞化组织基质中的任何类型的微生物的存在。用于使用物理、化学、和酶促方法获得去细胞化组织基质的方法是本领域已知的，参见例如，liao等人,biomaterials[生物材料]29(8):1065-74(2008)；gilbert等人,biomaterials[生物材料]27(9):3675-83(2006)；teebken等人,eur.j.vasc.endovasc.surg.[欧洲血管与血管内外科杂志]19:381-86(2000)。还参见美国专利公布号2009/0142836；2005/0256588；2007/0244568；和2003/0087428。用于分子增强器官和组织的生物活性分子以及去细胞化组织/器官支架在一些实施例中，生物活性分子选自下组，该组由以下组成：治疗性生物分子(例如，多肽、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、多糖(例如，低聚糖)、多核苷酸和核酸、或此类分子的类似物或衍生物)、治疗性蛋白质(例如，抗体、激素、跨膜蛋白、生长因子、酶、或结构蛋白)、或治疗性小分子。在一些实施例中，生物活性分子可用于治疗或预防细菌感染。在一些实施例中，生物活性分子可用于治疗或预防炎性疾病或病状。在一些实施例中，生物活性分子可用于治疗或预防器官移植排斥(例如，治疗急性肾移植排斥)。在一些实施例中，生物活性分子可用于预防选自器官移植后缺血和再灌注损伤的病状。在一些实施例中，生物活性分子是小分子药物。小分子药物是低分子量有机化合物(典型地约2000道尔顿或更小)。在一些实施例中，小分子药物是喹诺酮抗生素(例如，左氧氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、洛美沙星、氟罗沙星、司帕沙星、格帕沙星、曲伐沙星、克林沙星、吉米沙星、依诺沙星、西他沙星、那氟沙星、妥舒沙星、西诺沙星、罗索沙星、米洛沙星、莫西沙星、加替沙星、cinnoxacin、依诺沙星、氟罗沙星、洛马沙星、洛美沙星、米洛沙星、萘啶酸、那氟沙星、恶喹酸、培氟沙星、吡咯米酸、吡哌酸、罗索沙星、芦氟沙星、替马沙星、托氟沙星、曲伐沙星、或贝西沙星)。在一些实施例中，小分子药物是β-内酰胺抗生素(例如，青霉素或头孢菌素类抗生素)。在一些实施例中，小分子药物是青霉素抗生素(例如，青霉素g、青霉素v、普鲁卡因青霉素、和苄星青霉素、氨苄青霉素、和阿莫西林、苄青霉素、苯氧甲基青霉素、苯唑西林、甲氧西林、双氯西林、氟氯西林、替莫西林、阿洛西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林、哌拉西林、阿帕西林、海他西林、巴氨西林、磺苄西林、mecicilam、匹美西林、环己西林、酞氨西林(talapicillin)、阿扑西林、氯唑西林、奈夫西林、或匹氨西林)。在一些实施例中，小分子药物是头孢菌素抗生素(例如，头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢氨苄、头孢噻啶、头孢孟多、头孢磺啶、头孢尼西、头孢哌酮、头孢丙烯、或头孢曲松)。在一些实施例中，小分子药物是碳青霉烯抗生素(例如，噻烯霉素、托莫培南、来那培南、泰比培南、阿祖培南、亚胺培南、美罗培南、厄他培南、多利培南、帕尼培南(倍他米隆)、或比阿培南)。在一些实施例中，小分子药物是脂肽抗生素(例如，多粘菌素b、粘菌素(多粘菌素e)、或达托霉素)。在一些实施例中，小分子药物是糖肽抗生素(例如，万古霉素、替考拉宁、特拉万星、雷莫拉宁、达托霉素、德卡拉宁、或博来霉素)。在一些实施例中，生物活性分子是万古霉素。万古霉素(cas登记号1404-90-6)是具有下式的化合物：或其药学上可接受的盐。在一些实施例中，小分子药物是大环内酯类抗生素(例如，阿奇霉素、克拉霉素、红霉素、非达霉素、泰利霉素、卡波霉素a、交沙霉素、北里霉素、麦迪霉素/醋酸麦迪霉素、竹桃霉素、索利霉素、螺旋霉素、醋竹桃霉素、泰乐菌素(tylosin/tylocine)、罗红霉素、地红霉素、醋竹桃霉素、壮观霉素、酒霉素、新酒霉素、红霉内酯、巨大霉素、苦霉素、那波霉素、竹桃霉素、三乙酰竹桃霉素、兰卡霉素、久慈霉素a、白环霉素或烬灰霉素b)在一些实施例中，小分子药物是安莎霉素抗生素(例如，曲张霉素、格尔德霉素、除莠霉素、利福霉素、利福平、利福布汀、利福喷汀、或利福昔明(rifamixin))。在一些实施例中，小分子药物是磺胺类抗生素(例如，磺胺、磺胺醋酰、磺胺吡啶、磺胺噻唑、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺索嘧啶、柳氮磺胺吡啶、磺胺米隆、磺胺甲恶唑、磺胺甲氧哒嗪、磺胺地索辛、磺胺二乙三嗪、磺胺多辛、磺胺甲氧吡嗪、磺胺胍、琥珀酰磺胺噻唑、或邻苯二甲酰磺酰噻唑)。在一些实施例中，抗生素可用于治疗由以下引起的感染：葡萄球菌属物种(尤其是金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa))、链球菌属物种(包括b组链球菌)、大肠杆菌物种(e.spp.)、肺炎克雷白杆菌(k.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、鲍曼不动杆菌(a.baumannii)、屎肠球菌(e.faecium)、粪肠球菌(e.faecalis)、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、或炭疽芽孢杆菌(b.anthracis)。在一些实施例中，抗生素可用于治疗由以下引起的感染：炭疽芽孢杆菌(bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)、汉氏巴尔通体(bartonellahenselae)、五日热巴尔通体(bartonellaquintana)、百日咳博德特氏菌(bordetellapertussis)、伯氏疏螺旋体(borreliaburgdorferi)、伽氏疏螺旋体(borreliagarinii)、阿氏疏螺旋体(borreliaafzelii)、回归热疏螺旋体(borreliarecurrentis)、流产布鲁氏菌(brucellaabortus)、犬布鲁氏菌(brucellacanis)、马尔他布鲁氏菌(brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(brucellasuis)、空肠弯曲杆菌(campylobacterjejuni)、肺炎衣原体(chlamydiapneumoniae)、沙眼衣原体(chlamydiatrachomatis)、鹦鹉热衣原体(chlamydophilapsittaci)、肉毒杆菌(clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(clostridiumperfringens)、破伤风梭菌(clostridiumtetani)、白喉棒状杆菌(corynebacteriumdiphtheria)、粪肠球菌(enterococcusfaecalis)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、大肠埃希氏杆菌(escherichiacoli)、土拉热弗朗西丝菌(francisellatularensis)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenzae)、幽门螺旋杆菌(helicobacterpylori)、嗜肺军团菌(legionellapneumophila)、问号钩端螺旋体(leptospirainterrogans)、圣地罗西钩端螺旋体(leptospirasantarosai)、韦氏钩端螺旋体(leptospiraweilii)、野口钩端螺旋体(leptospiranoguchii)、单核细胞增生李斯特氏菌(listeriamonocytogenes)、麻风分枝杆菌(mycobacteriumleprae)、结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)、溃疡分枝杆菌(mycobacteriumulcerans)、肺炎支原体(mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(neisseriagonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitidis)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、立克次氏立克次氏体(rickettsiarickettsii)、伤寒沙门氏菌(salmonellatyphi)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)、宋内志贺氏菌(shigellasonnei)、表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、或腐生葡萄球菌(staphylococcussaprophyticus)。在一些实施例中，小分子药物是凝血级联抑制剂(例如，抗凝血剂)，如肝素、阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、西洛他唑、双嘧达莫、己酮可可碱、阿昔单抗、依替巴肽、替罗非班、磺达肝癸钠、依达肝素、利伐沙班、水蛭素、重组水蛭素、比伐卢定、阿加曲班、avoralstat、或达比加群。在一些实施例中，抗凝血剂是维生素k拮抗剂(例如，香豆素、华法林、醋硝香豆素、苯丙香豆素、黑毛桩菇霉素(atromentin)、或苯茚二酮)。在一些实施例中，抗凝血剂是低分子量的肝素衍生物(例如，依诺肝素、达肝素或亭扎肝素)在一些实施例中，小分子药物是抗纤维蛋白溶解剂(例如，氨基己酸、凝血酸、比索布啉、抑肽酶、氨基己酸、氨甲环酸、抑肽酶)。在一些实施例中，小分子药物是抗炎剂(例如，对乙酰氨基酚、阿司匹林、可待因、芬太尼、布洛芬、吲哚美辛、酮咯酸、吗啡、萘普生、非那西汀、吡罗昔康、甾体镇痛药、舒芬太尼、舒林酸或替尼达普)在一些实施例中，生物活性分子是生长因子，例如，肾上腺髓质素、血管生成素、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(bmp)、脑衍生神经营养因子(bdnf)、表皮生长因子(egf)、促红细胞生成素(epo)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胎牛生长激素(fbs)、神经胶质细胞系衍生神经营养因子(gdnf)、粒细胞集落刺激因子(g-csf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、生长分化因子-9(gdf9)、肝细胞生长因子(hgf)、肝细胞癌衍生生长因子(hdgf)、胰岛素样生长因子(igf)、角质形成细胞生长因子(kgf)、促移行因子(msf)、肌生长抑制素(gdf-8)、神经生长因子(ngf)、血小板衍生生长因子(pdgf)(例如，“愈合因子”)、促血小板生成素(tpo)、t细胞生长因子(tcgf)、转化生长因子α(tgf-α)、肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、血管内皮生长因子(vegf)、或胎盘生长因子(pgf)。在一些实施例中，生物活性分子是细胞因子，如转化生长因子-β(tgf-β)、干扰素(例如，干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ)、集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(gm-csf))、和胸腺基质淋巴细胞生成素(tslp)。在一些实施例中，干扰素是干扰素-αcon1、干扰素-α2a、干扰素-α2b、干扰素-αn3、干扰素-β1a、或干扰素-γ1b。在一些实施例中，细胞因子是白细胞介素，如白细胞介素-1、白细胞介素-2、白细胞介素-3、白细胞介素-4、白细胞介素-5、白细胞介素-6、白细胞介素-7、或白细胞介素-8。在一些实施例中，生物活性分子是免疫抑制药物(例如，芬戈莫德、细胞因子、干扰素等)。在一些实施例中，免疫抑制药物可以用于预防移植器官和组织的排斥。在一些实施例中，生物活性分子是抗溶血栓剂(例如，组织纤溶酶原激活物、链激酶、阿替普酶、瑞替普酶、替奈普酶、阿尼普酶或尿激酶、及其功能衍生物)。在一些实施例中，生物活性分子是抗体。在一些实施例中，抗体针对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)具有特异性(例如，阿达木单抗)。在一些实施例中，针对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)具有特异性的抗体是描述于us2004/0260069或us7,227,003中的tnf-α抗体中的任一种，这些文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，生物活性分子是可用于治疗或预防炎性疾病或病状的抗体(例如，阿达木单抗、阿仑单抗、阿特利珠单抗、巴利昔单抗、康纳单抗、赛妥珠单抗、赛妥珠单抗(certolizumabpegol)、达利珠单抗、莫罗单抗、依法利珠单抗、fontolizumab、戈利木单抗、英夫利昔单抗、美泊利单抗、那他珠单抗、奥马珠单抗、鲁利珠单抗、尤特科单抗、visilizumab、扎木单抗、维多珠单抗、贝利木单抗、奥昔珠单抗、teplizumab、利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、依帕珠单抗、依库珠单抗、或briakinumab)。在一些实施例中，生物活性分子是白蛋白、人白蛋白、或免疫球蛋白。在一些实施例中，生物活性分子是因子viia、因子viii、因子ix、抗凝血酶iii、蛋白c、屈曲可净-α、非格司亭、聚乙二醇化非格司亭、沙格司亭、或奥普瑞白介素。在一些实施例中，在此所述的生物活性分子中的任一种包含至少一个反应性官能团。在这些实施例的一些方面，官能团是羟基基团(-oh)、酮基基团(-c(＝o)-)、醛基基团(-c(＝o)h)、氨基基团(-nh2)、硫醇基团(-sh)(例如，半胱氨酸残基)、羧酸(-c(＝o)oh)、羧酸酯基团(-c(＝o)o-c1-3烷基)、磺酸基团(-s(＝o)2oh)、或膦酸酯基团(-p(＝o)(oh)2)。例如，这些官能团可以用于将生物活性分子与如在此所述的包含在生物正交化学反应中具有反应性的官能团的适合试剂缀合。用在生物正交化学反应中具有反应性的官能团进行的生物分子的官能化。在一些实施例中，在此所述生物分子中的任一种可以使用包含在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团的试剂，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化。在一些实施例中，反应性化学基团与官能化营养素(例如，在此所述的官能化营养素中的任一种)的反应性化学基团互补。在一些实施例中，当官能化营养素的反应性化学基团是叠氮化物时，生物活性分子可以用炔烃(例如，脂族炔烃或环炔烃)反应性基团官能化。在一些实施例中，当官能化营养素的反应性化学基团是炔烃(例如，脂族炔烃或环炔烃)时，生物活性分子可以用叠氮化物反应性基团官能化。在一些实施例中，营养素是ac4galnaz并且生物活性分子可以用如在此所述的炔烃(例如，脂族炔烃或环炔烃)反应性化学基团官能化。在一些实施例中，该化学基团是在huisgen环加成(也称为炔烃和叠氮化物用于形成三唑的[3+2]环加成，或“点击”反应)中具有反应性的化学基团中的任一种。在一些实施例中，该化学基团是在以下反应中具有反应性的化学基团中的任一种：施陶丁格连接(即，叠氮化物与膦之间的反应)、氧杂降冰片二烯和叠氮化物用于形成三唑的反应、四嗪(例如，二吡啶基四嗪)和反式环辛炔的相反需求diels-alder反应、四嗪(例如，单芳基四嗪)和降冰片烯的相反需求diels-alder反应、四嗪和环丙烯的反应、环丙烯和腈亚胺的反应、四唑和烯烃的光诱导的1,3-偶极环加成、氧化腈和降冰片烯的1,3-偶极环加成、异氰化物和四嗪的[4+1]环加成或硝酮和炔烃的1,3-环加成。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)、脂族炔烃(例如，-c≡ch)、环辛炔、环辛烯、硝酮、异氰化物、环丙烯、降冰片烯、二苯基膦、腈亚胺、四唑、氧化腈、或四嗪。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)或炔烃。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是叠氮化物(-n3)。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团是炔烃。在一些实施例中，包含在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团的试剂是具有式(i)的化合物：f-l-b(i)，其中f是选自以下的反应性化学基团：n3、-c≡ch、-ch2-c≡ch、-o-nh2、环辛炔、环辛烯、硝酮、异氰化物、环丙烯、降冰片烯、二苯基膦、腈、亚胺、四唑、氧化腈、和四嗪。在一些实施例中，包含炔烃官能团的试剂是具有式(ia)的化合物：在一些实施例中，包含叠氮化物官能团的试剂是具有式(ib)的化合物：n3-l-b(ib)。在在此披露的式中的任一个的一些实施例中：l不存在或者l是选自c1-20亚烷基和以下式中的任一个的接头：x1不存在或者x1是c1-6亚烷基；x2不存在或者x2是c1-6亚烷基；x3是c1-6亚烷基；x4不存在或者x4是c1-6亚烷基；y1不存在或者选自-o-和-nh-；y2不存在或者选自-o-和-nh-；n是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；x表示与炔烃官能团的附着点，并且y表示与b的附着点；b是独立地选自以下的官能团：卤素、-oh、-o-nh2、-nh2、-sh、-c(＝o)oh、-c(＝o)h、-o-c1-3烷基、具有下式的基团：具有下式中的任一个的活化苯酚酯：具有下式的nhs酯：以及具有下式中的任一个的马来酰亚胺：hal是选自i、br和cl的卤素；并且x5是c1-6亚烷基；在一些实施例中，卤素是i、br或cl。在这些实施例的一些方面，卤素是i。在一些实施例中，b是具有下式的官能团：在一些实施例中，b是具有下式的官能团：在一些实施例中，x1不存在。在一些实施例中，x1是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，x1是亚乙基。在一些实施例中，x2不存在。在一些实施例中，x2是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，x2是亚甲基。在一些实施例中，x3是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，x3是亚乙基。在一些实施例中，x4不存在。在一些实施例中，x4是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，x4是亚乙基。在一些实施例中，y1不存在。在一些实施例中，y1是-o-。在一些实施例中，y1是-nh-。在一些实施例中，y2不存在。在一些实施例中，y2是-o-。在其他实施例中，y2是-nh-。在一些实施例中，x5是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，x5是亚乙基。在一些实施例中，x5是亚丙基。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是10。在一些实施例中，具有式(i)的化合物选自以下化合物中的任一种：其中n如在此所描述。在一些实施例中，包含炔烃官能团的试剂是炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯。在一些实施例中，包含炔烃官能团的试剂是氨基-peg4-炔烃。在一些实施例中，包含炔烃官能团的试剂选自以下试剂中的任一种：hc≡c-ch2-pegn-nh2；hc≡c-ch2-pegn-ch2ch2coonhs酯；hc≡c-ch2-pegn-oh；hc≡c-ch2-pegn-ch2ch2cooh；hc≡c-ch2-pegn-sh。在一些实施例中，包含叠氮化物官能团的试剂选自以下试剂中的任一种：n3-pegn-nh2；n3-pegn-ch2ch2coonhs酯；n3-pegn-oh；n3-pegn-ch2ch2cooh；n3-pegn-sh。在一些实施例中，包含炔烃官能团的试剂是具有式(ii)的化合物：a-l-b(ii)，其中：a是具有下式中的任一个的含环辛炔部分：l不存在或者是选自c1-20亚烷基和以下式中的任一个的接头：w1不存在或者是c1-6亚烷基；w2是c1-6亚烷基；z1选自-o-、-nh-、-(c＝o)-、和-c(＝o)nh-；z2选自-o-、-nh-、-(c＝o)-、和-c(＝o)nh-；w3是c1-6亚烷基；n是独立地选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整数；x表示与环炔烃的附着点，并且y表示与b的附着点；b是独立地选自以下的官能团：卤素、-oh、-o-nh2、-nh2、-sh、-c(＝o)oh、-c(＝o)h、-o-c1-3烷基、具有下式的基团：具有下式中的任一个的活化苯酚酯：具有下式中的任一个的nhs酯：以及具有下式中的任一个的马来酰亚胺：hal是选自i、br和cl的卤素；并且w4是c1-6亚烷基；在一些实施例中，卤素是i、br或cl。在这些实施例的一些方面，卤素是i。在一些实施例中，b是具有下式的官能团：在一些实施例中，b是具有下式的官能团：在一些实施例中，w1是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，w1是亚乙基。在一些实施例中，w2是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，w2是亚乙基。在一些实施例中，z1是-o-。在一些实施例中，z1是-nh-。在一些实施例中，z1是-c(＝o)nh-。在一些实施例中，z2是-o-。在一些实施例中，z2是-nh-。在一些实施例中，w3是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，w3是亚乙基。在一些实施例中，w4是亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、或亚己基。在一些实施例中，w4是亚乙基。在一些实施例中，n是1。在一些实施例中，n是3。在一些实施例中，n是6。在一些实施例中，n是10。在一些实施例中，具有式(ii)的化合物选自以下化合物中的任一种：其中n如在此所描述。在一些实施例中，包含环炔烃官能团的试剂是dbco-peg5-nhs酯。在一些实施例中，包含环炔烃官能团的试剂是dbco-peg4-胺。在一些实施例中，包含nhs酯官能团的试剂可用于将炔烃或环辛炔反应性化学基团与包含伯胺基团的生物活性分子缀合。在一些实施例中，包含胺官能团的试剂可用于将炔烃或环辛炔反应性化学基团与包含酮基基团(-c(＝o)-)、醛基基团(-c(＝o)h)、羧酸基团(-c(＝o)oh)、磺酸基团(-s(＝o)2oh)、或膦酸酯基团(-p(＝o)(oh)2)的生物活性分子缀合。在一些实施例中，包含马来酰亚胺官能团的试剂可用于将炔烃或环辛炔官能团与包含硫醇基团(例如，半胱氨酸残基)的生物活性分子缀合。具有式(i)、(ia)、(ib)和式(ii)的试剂可以根据多种可能的合成途径中的任一种与在此所述生物活性分子中的任一种缀合。本领域技术人员知道如何选择和实施适当的合成途径。起始材料、中间体和产物的适合的合成方法可以通过参考文献鉴定，包括如以下的参考资源：carreira等人(编)scienceofsynthesis[合成科学],第1-48卷(2001-2010)；katritzky等人(编)comprehensiveorganicfunctionalgrouptransformations[综合有机官能团转化],(pergamonpress[珀加蒙出版社],1996)；katritzky等人(编)；smith等人,march’sadvancedorganicchemistry:reactions,mechanisms,andstructure[march的高等有机化学：反应、机理与结构],第6版(wiley,2007)；trost等人(编),comprehensiveorganicsynthesis[综合有机合成](pergamonpress[珀加蒙出版社],1991)。用于制备在此提供的化合物的反应可以在可以易于由有机合成领域的技术人员选择的适合溶剂中进行。适合溶剂可以实质上不与起始材料(反应物)、中间体、或产物在进行反应所处的温度(例如可以在溶剂的冷冻温度至溶剂的沸腾温度的范围内的温度)下反应。给定反应可以在一种溶剂或多于一种溶剂的混合物中进行。取决于具体反应步骤，技术人员可以针对具体反应步骤选择适合的溶剂。在此提供的化合物的制备可以涉及各种化学基团的保护和脱除保护。保护和脱保护的需要以及适当的保护基团的选择可以由本领域技术人员容易地确定。保护基团的化学性质可以例如在p.g.m.wuts和t.w.greene,protectivegroupsinorganicsynthesis[有机合成中的保护基团],第4版,wiley&sons,inc.[威利父子公司],纽约(2006)中找到。在一些实施例中，生长因子(如碱性成纤维细胞生长因子(bfgf)和血管内皮生长因子(vegf))可以通过使用包含n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs酯)的含炔烃或环炔烃的试剂与炔烃或环炔烃(例如，dbco)官能团缀合。可以在该试剂的炔烃或环炔烃官能团与nhs酯之间引入各种长度的peg接头或亚烷基接头、或两者(例如，如对于具有式(i)和式(ii)的化合物所述)。该方法适用于含有伯胺的许多其他生长因子和其他蛋白质。在一些实施例中，抗体可以通过使用包含马来酰亚胺的含炔烃或环炔烃的试剂与炔烃或环炔烃(例如，dbco)官能团缀合。可以在该试剂的炔烃或环炔烃官能团与nhs酯之间引入各种长度的peg接头或亚烷基接头、或两者(例如，如对于具有式(i)和式(ii)的化合物所述)。该方法适用于含有半胱氨酸残基的抗体和其他蛋白质。在一些实施例中，抗生素(如万古霉素)可以通过使用包含nhs酯的含叠氮化物、脂族炔烃或环炔烃的试剂与叠氮化物、脂族炔烃或环炔烃(例如，dbco)官能团缀合。万古霉素仅具有一个游离伯胺，并且可以通过与炔烃缀合的nhs酯反应与炔烃缀合，或者通过与dbco缀合的nhs酯反应与dbco缀合。可以在该试剂的炔烃或环炔烃官能团与nhs酯之间引入各种长度的peg接头或亚烷基接头、或两者(例如，如对于具有式(i)、(ia)、(ib)和式(ii)的化合物所述)。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是万古霉素-叠氮化物。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有下式的万古霉素-炔烃：其中l如在此对于式(ia)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有下式的万古霉素-环辛炔：其中a和l如在此对于式(ii)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是万古霉素-dbco。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有下式的万古霉素-炔烃：在一些实施例中，万古霉素-炔烃或万古霉素-环辛炔(例如，万古霉素-dbco)可以通过使具有式(ia)的化合物或具有式ii的化合物与万古霉素反应来制备。该反应可以根据本领域已知的任何合成方法来进行。例如，在缓冲液(如dulbecco磷酸盐缓冲盐水(dpbs))中的浓度为约1mm的万古霉素可以与具有如在此所述的式中的任一个的试剂(例如，炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯)在约室温下反应约24小时。本领域普通技术人员将容易地选择和实施适当的合成方法。在一些实施例中，万古霉素-炔烃具有下式：在一些实施例中，万古霉素-dbco具有下式：在一些实施例中，万古霉素-dbco具有下式：在一些实施例中，抗凝血剂(如肝素)可以通过使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)部分活化肝素中的游离羧基基团，随后与包含胺官能团的含炔烃或环炔烃的试剂反应与炔烃或环炔烃(例如，dbco)缀合。可以在该试剂的炔烃或环炔烃官能团与nhs酯之间引入各种长度的peg接头或亚烷基接头、或两者(例如，如对于具有式(i)、(ia)和式(ii)的化合物所述)。在其他实施例中，脱氨基肝素(例如，在亚硝酸处理条件下脱氨基的肝素)中的游离醛基基团可以在例如苯胺作为催化剂的情况下与氨氧基炔烃缀合。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是肝素-叠氮化物。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有任何下式的肝素-炔烃：其中l如在此对于式(ia)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有任何下式的肝素-炔烃-生物素(肝素ab)：其中每个l如在此对于式(ia)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有任何一个下式的肝素-炔烃：其中a和l如在此对于式(ii)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有任何下式的肝素-炔烃-生物素(肝素ab)：其中每个a和每个l如在此对于式(ii)所述。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有下式的肝素-炔烃-生物素(肝素ab)：其中n各自独立地是从1至20的整数。在一些实施例中，每个n是3。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有下式的肝素-炔烃-生物素(肝素ab)：在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是肝素-dbco。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是具有任何一个下式的肝素-炔烃：在一些实施例中，肝素-炔烃具有下式：在一些实施例中，肝素-炔烃具有下式：在一些实施例中，肝素-dbco具有下式：在一些实施例中，肝素-炔烃或肝素-环辛炔(例如，肝素-dbco)可以通过使具有式(ia)的化合物或具有式ii的化合物与肝素反应来制备。该反应可以根据本领域已知的任何合成方法来进行。例如，浓度为约10mm的脱氨基肝素可以在催化剂(如对苯二胺)存在下在约室温下于约0.1m柠檬酸钠溶液中，与具有如在此所述的式中的任一个的试剂(例如，浓度为约100mm的邻-(丙-2-炔基)-羟胺盐酸盐)反应约20小时。本领域普通技术人员将容易地选择和实施适当的合成方法。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是针对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)具有特异性的抗体(例如，阿达木单抗)。在一些实施例中，抗tnf-α抗体用脂族炔烃官能化。在一些实施例中，抗tnf-α抗体用环辛炔官能化。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是抗tnf-α-炔烃。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的生物活性分子是抗tnf-α-dbco。在一些实施例中，抗tnf-α抗体用叠氮化物官能化。其他生物分子，如细胞表面受体的免疫抑制剂、抑制剂或活化剂，也可以以类似的方式与炔烃或环炔烃缀合以官能化去细胞化天然生物材料在一些实施例中，在此所述营养素中的任一种可以使用如在此所述的包含在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团的试剂(具有式i、ia、ib、和式ii的试剂中的任一种)，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化。使用化学选择性连接进行的器官支架的官能化在一些实施例中，本披露提供了包含细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架，其中去细胞化支架的细胞外基质用生物活性分子化学选择性官能化。在一些实施例中，本披露提供了制备包含用生物活性分子生物正交官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架的方法，该方法包括使包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架与用与该官能化细胞外基质的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的反应性化学基团是叠氮化物；生物活性分子是万古霉素或肝素；并且与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团是炔烃。在一些实施例中，在生物正交化学反应中具有反应性的反应性化学基团是炔烃；生物活性分子是万古霉素或肝素；并且与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团是叠氮化物。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用叠氮化物官能化的细胞外基质。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用炔烃官能化的细胞外基质。在一些实施例中，生物活性分子用炔烃官能化。在一些实施例中，生物活性分子用脂族炔烃官能化。在一些实施例中，生物活性分子用环辛炔官能化。在一些实施例中，生物活性分子用叠氮化物官能化。在一些实施例中，生物活性分子是万古霉素-叠氮化物。在一些实施例中，生物活性分子是万古霉素-炔烃。在一些实施例中，生物活性分子是肝素-叠氮化物。在一些实施例中，生物活性分子是肝素-炔烃。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用叠氮化物官能化的细胞外基质；并且生物活性分子用炔烃(例如，脂族炔烃或环辛炔)官能化。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用炔烃官能化的细胞外基质；并且生物活性分子用叠氮化物官能化。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用叠氮化物官能化的细胞外基质；并且生物活性分子是万古霉素-炔烃。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用炔烃官能化的细胞外基质；并且生物活性分子是万古霉素-叠氮化物。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用叠氮化物官能化的细胞外基质；并且生物活性分子是肝素-炔烃。在一些实施例中，哺乳动物器官或组织的去细胞化支架包含用炔烃官能化的细胞外基质；并且生物活性分子是肝素-叠氮化物。在一些实施例中，该反应在溶剂(例如，dmf、乙腈、dmso)中进行。在一些实施例中，该反应在水中进行。在一些实施例中，该反应在醇(如乙醇、甲醇、或叔丁醇)中进行。在一些实施例中，该反应在叔丁醇/水中进行。在一些实施例中，该反应在四氢呋喃(thf)中进行。在一些实施例中，该反应在不存在溶剂的情况下进行(例如，如appliedcatalysisa:general[应用催化，a辑：总论],453,26,2013,151-158中所述)。在一些实施例中，该反应在描述于“copper-catalyzedazide-alkyneclickchemistryforbioconjugation[铜催化的叠氮化物-炔烃点击化学用于生物缀合]”,currprotocchembiol.[化学生物学现代方法]2011；3(4):153-162中的任何条件下进行，该文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，该反应在无空气条件下进行。在一些实施例中，该反应在空气气氛中进行。在一些实施例中，该反应在生物反应器(例如，在此所述的生物反应器中的任一种)中通过用包含用与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子的缓冲液或培养基(例如，在此所述的任何缓冲液或培养基)灌注包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架进行。在这些实施例的一些方面，灌注的速率是从约0.1ml/min至约20ml/min、从约0.2ml/min至约15ml/min、从约0.3ml/min至约10ml/min、或从约0.5ml/min至约5ml/min。在这些实施例的其他方面，灌注的速率是约0.1ml/min、约0.2ml/min、约0.3ml/min、约0.4ml/min、约0.5ml/min、约1ml/min、约2ml/min、约5ml/min、或约10ml/min。在一些实施例中，该反应在生物反应器中通过用包含用与官能化细胞外基质的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子的缓冲液或培养基(例如，在此所述的任何缓冲液或培养基)输注包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架进行。在一些实施例中，输注介质中的官能化生物活性分子的浓度是从约1μm至约10m、从约5μm至约5m、从约10μm至约1m、从约10μm至约100mm、从约20μm至约50mm、从约50μm至约20mm、或从约100μm至约10mm。在一些实施例中，该输注在约室温下进行。在一些实施例中，该反应包括在输注后孵育支架从约10min至约24小时、从约30min至约6小时、从约45min至约3小时、或从约1小时至约2小时的时间段。在一些实施例中，该反应使用来自赛默飞世尔公司(thermofisher)的细胞反应试剂盒(目录号c10269)进行。在一些实施例中，当反应性化学基团是脂族炔烃时，该反应在铜催化剂存在下进行。在一些实施例中，当反应性化学基团是脂族炔烃时，该反应在不存在铜催化剂的情况下进行。在一些实施例中，铜催化剂选自金属铜、铜(i)化合物和与还原剂一起使用的铜(ii)化合物。在一些实施例中，铜催化剂选自cuso4、cuaac、cu(mecn)4pf6、cubr、和cui。在一些实施例中，铜催化剂与稳定配体(例如，tbta、thpta)一起使用。在一些实施例中，该反应在抗坏血酸钠存在下进行。在一些实施例中，铜催化剂的量是从约0.1mol.％至约5mol％、从约0.2mol.％至约4mol％、从约0.3mol.％至约3mol％、从约0.5mol.％至约2mol％、或从约0.7mol.％至约1.5mol％。在一些实施例中，铜催化剂的量是约0.1mol.％、约0.2mol.％、约0.3mol.％、约0.4mol.％、约0.5mol.％、约0.6mol.％、约0.7mol.％、约0.8mol.％、约0.9mol.％、约1.0mol.％、约1.1mol.％、约1.2mol.％、约1.3mol.％、约1.5mol.％、或约2.0mol.％。在一些实施例中，当反应性化学基团是环辛炔时，该反应在不存在铜催化剂的情况下进行。在一些实施例中，当反应性化学基团是环辛炔时，该反应在铜催化剂(例如，如在此所述的cuso4、cuaac、cu(mecn)4pf6、cubr、和cui)存在下进行。在一些实施例中，该反应在从约0℃至约50℃、从约0℃至约40℃、从约0℃至约30℃、从约0℃至约25℃、从约0℃至约20℃、从约0℃至约15℃、从约0℃至约10℃、或从约0℃至约5℃的温度下进行。在一些实施例中，该反应在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、或在环境温度下进行。在一些实施例中，该反应在约0℃的温度下进行。在一些实施例中，该反应在环境温度下进行。在一些实施例中，官能化生物活性分子的浓度是从约1μm至约1000μm、从约2μm至约900μm、从约3μm至约800μm、从约4μm至约700μm、从约5μm至约600μm、从约6μm至约500μm、从约7μm至约400μm、从约8μm至约300μm、从约9μm至约200μm、从约10μm至约100μm、从约20μm至约90μm、从约25μm至约80μm、从约30μm至约70μm、或从约40μm至约60μm。在一些实施例中，官能化生物活性分子的浓度是约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm或约100μm。在一些实施例中，官能化生物活性分子的浓度是从约1mm至约1000mm、从约2mm至约900mm、从约3mm至约800mm、从约4mm至约700mm、从约5mm至约600mm、从约6mm至约500mm、从约7mm至约400mm、从约8mm至约300mm、从约9mm至约200mm、从约10mm至约100mm、从约20mm至约90mm、从约25mm至约80mm、从约30mm至约70mm、或从约40mm至约60mm。在一些实施例中，官能化生物活性分子的浓度是约1mm、约2mm、约3mm、约5mm、约7.5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、v、约80mm、约85mm、约90mm或约100mm。在一些实施例中，该反应进行从约5min至约24小时、从约15min至约18小时、从约30min至约12小时、从约45min至约6小时、或从约1小时至约2小时的时间段。在一些实施例中，该反应进行约15min、约30min、约45min、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约4小时、约5小时、或约6小时。细胞接种/再细胞化器官和组织以用于移植在一些实施例中，本披露提供了制备用于移植的哺乳动物器官或组织的方法，该方法包括用受体来源的细胞接种如在此所述的包含用生物活性分子生物正交官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架以获得用于移植的器官或组织。在一些实施例中，受体来源的细胞是分化的或再生的细胞。可以使用任何适当的再生细胞类型(如初试或未分化的细胞类型)来接种如在此所述的器官或组织支架。这些细胞可以在包括但不限于干细胞阶段(例如，诱导后)、祖细胞阶段、成血管细胞阶段、或分化阶段(例如，cd31+、vwf+)的多个阶段进行接种。如在此所使用的，再生细胞可以包括但不限于祖细胞、前体细胞、和“成体”衍生的干细胞(包括脐带细胞(例如，人脐静脉内皮细胞)和胎儿干细胞)。再生细胞也可以包括分化或定向细胞类型。适合于在此提供的方法和材料的干细胞可以包括诱导的人多能干细胞(ipsc)(例如，未分化的、分化的内胚层、前内胚层(anteriolizedendoderm)、ttf-1阳性肺祖细胞)、人间充质干细胞、人脐静脉内皮细胞、多潜能成体祖细胞(mapc)、ips衍生的间充质细胞、或胚胎干细胞。在一些情况下，也可以使用衍生自其他组织的再生细胞。例如，可以使用衍生自皮肤、骨骼、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪组织的再生细胞来开发接种了干细胞的组织基质。在一些实施例中，在此提供的器官或组织支架可以可替代地或进一步接种分化的细胞类型如(优选人)上皮细胞和内皮细胞。例如，肺基质可以经由脉管系统(例如，通过动脉管线或静脉管线)接种内皮细胞，并且当该器官或组织是肺时，经由气道(例如，通过气管管线)接种上皮细胞。器官或组织支架还可以接种一个或多个细胞类型(例如，以下中的一个或多个类型：上皮细胞和间充质细胞、成体外周血衍生的上皮细胞、脐带血衍生的上皮细胞、ips衍生的上皮细胞、祖细胞阶段细胞(例如，平滑肌)、成体肺衍生的细胞混合物(例如，大鼠人)、可商购的小气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、胚胎干(es)细胞衍生的上皮细胞、和/或人脐静脉内皮细胞(huvec)。任何类型的适当的可商购培养基和/或培养基试剂盒可以用于细胞的接种和培养。例如，sagm培养基可以用于小气道细胞(例如，龙沙公司(lonza)的sagmbulletkit)并且egm-2试剂盒可以用于内皮细胞(例如，龙沙公司的egm-2bulletkit)。如例如brudnoy等人enhancingmicrovascularformationandvesselmaturationthroughtemporalcontrolovermultiplepro-angiogenicandpro-maturationfactors.[通过对多种促血管生成和促成熟因子的时间控制增强微血管形成和血管成熟]biomaterials[生物材料]34(2013)9201-9209中所述，可以使用针对接种的内皮细胞类型定制的培养基(例如，通过增加或减少生长因子，如vegf)。在内皮细胞的情况下，可以使用一系列不同的培养基组合物来诱导细胞的接种、扩增、植入、和成熟的不同阶段。例如，在第一阶段，可以用’血管生成培养基’灌注细胞接种的构建体2-30天，以增加内皮细胞的扩增、迁移、和代谢。该培养基的特征在于高浓度的细胞因子，例如，5-100ng/ml的vegf和5-100ng/ml的bfgf，以及存在佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(pma)，例如，5-100ng/mlpma，其通过活化蛋白激酶c和ang-1来活化血管生成途径，从而刺激内皮细胞发芽。在第二阶段，然后可以用支持内皮细胞成熟和形成紧密连接的’收紧培养基’灌注细胞接种的构建体。收紧培养基具有较低水平的细胞因子，具有与血管生成培养基相同的基本组成，但具有降低水平的vegf、bfgf和pma(0.1-5ng/mlvegf、fgf、和pma)。可以进一步向收紧培养基中加入促进紧密连接形成并已证明减轻肺水肿的氢化可的松以促进血管成熟。可以向收紧培养基中加入另外的促成熟因子(如pdgf和ang-2)以增强血管形成。可以滴定这些因子的浓度以支持不同的容器大小。培养基的变化可以逐步进行，以避免突然发生细胞因子变化的不利影响。与内皮细胞支持培养基类似，顺序培养基变化可以用于指导上皮细胞命运。初始培养基可以含有例如10-200ng/ml的活化素a和0.01-1um的pi3k抑制剂(如zstk474)以诱导确定的内胚层，随后是01-10um的tgf-β抑制剂(如a-8301)和0.05-1um的bmp4拮抗剂(如dmh-1)以诱导前内胚层，并且最后是1-100ug/ml的bmp4、10-500ng/ml的fgf2、10-500nm的gsk-3β抑制剂(如chir99021)、1-100nm的pi3k抑制剂(如pik-75)和1-100nm的甲氨蝶呤以诱导肺祖细胞的产生。可以使用任何适当的方法来分离和收集用于接种的细胞。例如，诱导的多能干细胞通常可以通过转录因子(如oct4、sox2、klf4、c-myc、nanog、和lin28)的异位表达从体细胞“重编程”到多能状态获得。参见takahashi等人,cell[细胞]131:861-72(2007)；park等人,nature[自然]451:141-146(2008)；yu等人,science[科学]318:1917-20(2007)；zhu等人,cellstemcell.[细胞干细胞]7:651-52010；和li等人,cellres.[细胞研究]21:196-204(2011)；malik和rao,methodsmolbiol.[分子生物学方法]2013；997:23-33；okano等人,circres.[循环研究]2013年2月1日；112(3):523-33；lin和ying,methodsmolbiol.[分子生物学方法]2013；936:295-312。外周血衍生的单核细胞可以从患者血液样品分离并用于产生诱导的多能干细胞。在其他实例中，诱导的多能干细胞可以通过用针对oct4、sox2、klf4、c-myc结合小分子(如转化生长因子β(sb431542)、mek/erk(pd0325901)和rho激酶信号传导(thiazovivin))的高共表达优化的构建体重编程获得。参见groβ等人,currmolmed.[现代分子医学]13:765-76(2013)和hou等人,science[科学]341:651:654(2013)。用于从干细胞产生内皮细胞的方法综述于reed等人,brjclinpharmacol.[英国临床药理学杂志]2013年4月；75(4):897-906中。脐带血干细胞可以从新鲜或冷冻的脐带血分离。间充质干细胞可以从例如，原始未纯化的骨髓或聚蔗糖纯化的骨髓分离。上皮细胞和内皮细胞可以根据本领域已知的方法从活体或尸体供体(例如，从将接受如在此所述的器官或组织的受试者)分离并收集。例如，真皮上皮细胞可以从皮肤组织样品(例如，钻孔活组织检查)获得，并且内皮细胞可以从血管组织样品获得。在一些实施例中，通过置于脉管系统中的导管将蛋白水解酶灌注到组织样品中。可以使酶处理的组织的一部分经受进一步的酶促和机械破坏。可以分离以该方式获得的细胞混合物以纯化上皮细胞和内皮细胞。在一些情况下，基于流式细胞术的方法(例如，荧光激活细胞分选)可以用于基于特定细胞表面标志物的存在或不存在来分选细胞。例如，器官或组织细胞(上皮细胞、间充质细胞、和内皮细胞)可以从器官或组织活组织检查获得，当器官是肺时，可以经由经支气管和支气管内活组织检查获得，或经由器官或组织的外科活组织检查获得。在使用非自体细胞的情况下，应考虑选择免疫类型匹配的细胞，以使得器官或组织在植入到受试者中时不被排斥。可以将分离的细胞在缓冲溶液(例如，ph7.4的磷酸盐缓冲盐水)中漂洗，并重悬于细胞培养基中。可以使用标准细胞培养方法来培养和扩增细胞的群体。一旦获得，则这些细胞可以用于接种器官或组织支架，例如，经由动脉或静脉管线(内皮细胞)或通过气道(气管)管线(上皮细胞)引入到基质中。例如，组织基质可以在体外以任何适当的细胞密度接种至少一个细胞类型。例如，用于接种基质的细胞密度可以是至少1x103个细胞/克基质。可以使用的细胞密度范围可以在约1x105至约1x1010个细胞/克基质之间(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000个细胞/克基质)。在一些实施例中，如在此提供的去细胞化或人工肺组织基质可以通过灌注接种来接种上述细胞类型和细胞密度。例如，可以使用流体灌注系统经由保存在组织基质中的血管系统(例如，通过动脉管线)来接种去细胞化肺组织基质。在一些情况下，可以在适当的条件下使用自动化流体灌注系统。这种灌注接种方法可以改进接种效率并且在整个组合物中提供更均匀的细胞分布。可以使用定量生化和图像分析技术来评估在静态或灌注接种方法后接种的细胞的分布。在一些实施例中，细胞接种可以根据例如描述于us6,479,064、us8,470,520、us2012/0064537、和us2013/0156744中的方法和程序进行，前述的披露内容通过引用以其整体结合在此。在一些实施例中，可以用一种或多种生长因子浸渍器官或组织支架以刺激接种的再生细胞的分化。例如，器官或组织支架可以用适合于在此提供的方法和材料的生长因子浸渍，例如，血管内皮生长因子(vegf)、tgf-β生长因子、骨形态发生蛋白(例如，bmp-1、bmp-4)、血小板衍生的生长因子(pdgf)、成纤维细胞生长因子(fgf)(例如，fgf-10)、胰岛素样生长因子(igf)、表皮生长因子(egf)、或生长分化因子5(gdf-5)。参见例如，desai和cardoso,respire.res.[呼吸研究]3:2(2002)。可以封装这些生长因子以进行时间控制释放。支架的不同部位可以用不同的生长因子进行增强，以增加对生长因子刺激的空间控制。接种的组织基质可以在接种后孵育一段时间(例如，从数小时至约14天或更长)以改进细胞在组织基质中的植入和渗透。可以在以下条件下维持接种的器官或组织支架：其中至少一些再生细胞可以在无细胞组织基质之内和之上繁殖和/或分化。此类条件可以包括但不限于适当的温度(35℃-38℃)和/或压力(例如，大气压)、电活动和/或机械活动(例如，经由正压或负压通气，其中呼气末正压为1-20cmh2o，气道压力均值为5-50cmh2o，并且峰值吸气压力为5-65cmh2o)、适当量的流体(例如o2(1％-100％fio2)和/或co2(0％-10％fico2))、适当量的湿度(10％-100％)、以及无菌或接近无菌的条件。此类条件还可以包括湿式通气、湿到干通气和干式通气。在一些情况下，可以将营养补充剂(例如营养素和/或碳源(如葡萄糖))、外源激素、或生长因子添加到接种的组织基质中。可以进行组织学和细胞染色以测定接种细胞的繁殖。可以进行任何适当的方法来测定接种细胞的分化。因此，在此所述的方法可以用于产生可移植的器官或组织，例如，用于移植到人受体受试者中。在一些实施例中，可移植的器官或组织保留可以连接到患者血管系统的足够完整的脉管系统。假体网状物在一些实施例中，本披露提供了制备生物假体网状物的方法，该方法包括使包含用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架与用与该官能化细胞外基质的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子反应。在这些实施例的一些方面，该反应使用任何在此所述的方法和程序进行。在这些实施例的一些方面，器官或组织是在此所述器官或组织中的任一种。在这些实施例的其他方面，器官或组织是皮肤皮瓣。在一些实施例中，本披露提供了包含含有用生物活性分子官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架的生物假体网状物。在这些实施例的一些方面，生物活性分子是万古霉素或肝素。在这些实施例的一些方面，器官或组织是在此所述器官或组织中的任一种。在这些实施例的其他方面，器官或组织是皮肤皮瓣。在一些实施例中，生物假体网状物进一步包含选自以下的材料：聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe，eptfe)、涤纶、奥伦、聚乙烯、聚酯薄膜和马勒克斯。在一些实施例中，生物假体网状物进一步包含生物可降解聚合物。在一些实施例中，生物假体网状物进一步包含聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)。在一些实施例中，聚(丙交酯-共-乙交酯)(plga)包含乳酸与乙醇酸单体的一系列比率，例如，从约1:9至约9:1、从约1:4至约4:1、从约3:7至约7:3、或从约3:2至约2:3。在一些实施例中，生物假体网状物包含脂族聚酯聚合物。在一些实施例中，脂族聚酯聚合物选自下组，该组由以下组成：聚己内酯(pcl)、聚丁二酸丁二醇酯(pbs)、和聚羟基链烷酸酯(pha)，如聚羟基丁酸酯。在一些实施例中，脂族聚酯聚合物选自聚乳酸(pla)和聚乙醇酸(pga)。在一些实施例中，网状物包含钛/丙烯复合材料。在一些实施例中，网状物是复合网状物。在一些实施例中，生物假体网状物是多层复合物。在一些实施例中，网状物是可吸收的。在一些实施例中，网状物是永久性的。在一些实施例中，网状物包含阻隔涂层。在一些实施例中，网状物包含甘油和丙二醇(例如，包含这些材料的膜)。在一些实施例中，网状物是单丝。在一些实施例中，网状物是双丝。在其他实施例中，网状物是复丝。在一些实施例中，网状物是轻质的。在其他实施例中，网状物是重质的。在一些实施例中，网状物的重量是从约1g/cm2至约500g/cm2、从约10g/cm2至约400g/cm2、从约20g/cm2至约300g/cm2、从约30g/cm2至约200g/cm2、从约40g/cm2至约150g/cm2、或从约50g/cm2至约150g/cm2。在一些实施例中，网状物的重量是约1g/cm2、约10g/cm2、约20g/cm2、约30g/cm2、约40g/cm2、约50g/cm2、约60g/cm2、约70g/cm2、约80g/cm2、约90g/cm2、约100g/cm2、约150g/cm2、或约200g/cm2。在一些实施例中，生物假体网状物的孔径允许巨噬细胞、成纤维细胞、血管和胶原蛋白渗透。在一些实施例中，生物假体网状物的孔径是从约1μm至约1000μm、从约2μm至约950μm、从约3μm至约900μm、从约4μm至约850μm、从约5μm至约800μm、从约6μm至约750μm、从约7μm至约700μm、从约8μm至约650μm、从约9μm至约600μm、从约10μm至约550μm、从约20μm至约500μm、从约30μm至约450μm、从约40μm至约400μm、从约50μm至约350μm、从约60μm至约300μm、从约70μm至约250μm、从约80μm至约200μm、或从约100μm至约200μm。在一些实施例中，生物假体网状物的孔径是约1μm、约5μm、约7μm、约10μm、约20μm、约30μm、约40μm、约50μm、约75μm、约100μm、约200μm、约300μm、约400μm、约500μm、约600μm、约750μm、或约1000μm。在一些实施例中，网状物在约32n/cm下的弹性是从约10％至约80％、从约20％至约70％、或从约30％至约60％。在一些实施例中，网状物在约32n/cm下的弹性是约10％、约20％、约30％、约38％、约40％、约50％、约60％、约70％、或约80％。在一些实施例中，网状物在约16n/cm下的弹性是从约1％至约60％、从约2％至约50％、从约3％至约40％、从约4％至约30％、从约4％至约20％、从约4％至约15％、或从约20％至约40％。在一些实施例中，网状物在约16n/cm下的弹性是约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约20％、约30％、或约40％。在一些实施例中，假体网状物的拉伸强度是从约10n/cm至约1000n/cm、从约20n/cm至约900n/cm、从约30n/cm至约800n/cm、从约40n/cm至约700n/cm、从约50n/cm至约600n/cm、从约60n/cm至约500n/cm、从约70n/cm至约400n/cm、从约80n/cm至约300n/cm、或从约75n/cm至约150n/cm。在一些实施例中，假体网状物的拉伸强度是约10n/cm、约20n/cm、约30n/cm、约40n/cm、约50n/cm、约60n/cm、约70n/cm、约80n/cm、约90n/cm、约100n/cm、约150n/cm、约200n/cm、约300n/cm或约500n/cm。在一些实施例中，生物假体网状物可以使用如在此所述的包含用生物活性分子官能化的细胞外基质的哺乳动物器官或组织的去细胞化支架制备。在一些实施例中，生物假体网状物可以通过描述于例如us2002/0042658、us2009/0192528、us2010/0272782、us2010/0318108、us2015/0297798、us2016/0015503、wo2013/093921、和wo2016/061450中的方法中的任一种制备，这些文献的披露内容通过引用以其整体结合在此。如在此所述的生物假体网状物有利地治疗涉及开放腹部、污染、和/或严重感染、使得先前已知假体网状物不适合使用的病状的最具挑战性的复杂疝。如在此所述的生物假体网状物有利地提供完全愈合所必需的细胞外组分，允许重建新的和健康的组织，并恢复腹壁的机械和功能完整性。器官或组织移植的分子增强在一些实施例中，本披露提供了用于移植的器官或组织，其中该器官或组织用生物活性分子(例如，在此所述的生物活性分子中的任一种)官能化。在这些实施例的一些方面，生物活性分子是万古霉素。在这些实施例的其他方面，生物活性分子是针对肿瘤坏死因子-α(tnf-α)具有特异性的抗体(例如，阿达木单抗)。在一些实施例中，本披露提供了制备用于移植的器官或组织的方法，该方法包括(i)向供体受试者给予用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素(例如，使用任何在此所述的方法)，以获得用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的器官或组织；(ii)如在此所述，从该供体受试者手术移除该器官或组织；并且(iii)用如在此所述的保存溶液处理分离的器官或组织以获得用生物活性分子官能化的器官或组织，该保存溶液包含用与该官能化营养素的该反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子。在一些实施例中，该方法进一步包括用保存溶液洗涤用生物活性分子官能化的器官或组织，以获得制备用于移植的器官或组织。在一些实施例中，营养素用其官能化的反应性化学基团是叠氮化物或炔烃(例如，脂族炔烃或环辛炔)。在一些实施例中，用在生物正交化学反应中具有反应性的化学基团官能化的营养素是在此所述营养素中的任一种。在这些实施例的一些方面，营养素选自炔基岩藻糖、炔基mannac、炔烃标记的半乳糖胺、炔烃标记的葡萄糖胺、炔烃标记的甘露糖胺、炔烃标记的半乳糖胺、炔烃标记的葡萄糖胺、炔烃标记的甘露糖胺、叠氮化物标记的半乳糖胺(例如，ac4galnaz)、叠氮化物标记的葡萄糖胺(例如，ac4glcnaz)、叠氮化物标记的甘露糖胺(例如，ac4mannaz)。在这些实施例的一些方面，营养素选自ac4glcnaz、ac4mannaz和ac4galnaz。在这些实施例的一些方面，营养素是ac4galnaz。在一些实施例中，与官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团是叠氮化物。在一些实施例中，与官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团是脂族炔烃。在一些实施例中，与官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团是环辛炔。在一些实施例中，环辛炔是dbco。在一些实施例中，dbco-官能化生物活性分子是万古霉素。在一些实施例中，叠氮化物-官能化生物活性分子是万古霉素。在一些实施例中，炔烃-官能化生物活性分子是万古霉素。在一些实施例中，dbco-官能化生物活性分子是肝素。在一些实施例中，叠氮化物-官能化生物活性分子是肝素。在一些实施例中，炔烃-官能化生物活性分子是肝素。在一些实施例中，dbco-官能化生物活性分子是抗tnf-α抗体。在一些实施例中，叠氮化物-官能化生物活性分子是抗tnf-α抗体。在一些实施例中，炔烃-官能化生物活性分子是抗tnf-α抗体。在一些实施例中，受体受试者在移植如在此所述的用生物活性分子官能化的器官或组织后不易受选自缺血、再灌注损伤和细菌感染的病状的影响。在一些实施例中，该处理在从约0℃至约40℃、从约0℃至约37℃、从约25℃至约37℃、从约0℃至约25℃、从约0℃至约20℃、从约0℃至约15℃、从约0℃至约10℃、或从约0℃至约5℃的温度下进行。在一些实施例中，该处理在约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约37℃、约40℃或环境温度下进行。在一些实施例中，该处理在约0℃下进行。在一些实施例中，该处理在约25℃下进行。在一些实施例中，该处理在约37℃下进行。在一些实施例中，该处理进行从约5min至约24小时、从约15min至约18小时、从约30min至约12小时、从约45min至约6小时、或从约1小时至约2小时的时间段。在一些实施例中，该反应进行约15min、约30min、约45min、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约12小时、约18小时、或约24小时。在一些实施例中，该处理在不存在任何催化剂的情况下进行。在一些实施例中，该处理在不存在铜催化剂的情况下进行。在一些实施例中，该处理在铜(i)催化剂存在下进行。在一些实施例中，铜(i)催化剂选自cuso4、cuaac、cu(mecn)4pf6、cubr、和cui。在这些实施例的一些方面，铜催化剂与稳定配体(例如，tbta、thpta)一起使用。在这些实施例的一些方面，该处理在抗坏血酸钠存在下进行。在这些实施例的一些方面，铜催化剂的量是从约0.1mol.％至约5mol％、从约0.2mol.％至约4mol％、从约0.3mol.％至约3mol％、从约0.5mol.％至约2mol％、或从约0.7mol.％至约1.5mol％。在这些实施例的其他方面，铜催化剂的量是约0.1mol.％、约0.2mol.％、约0.3mol.％、约0.4mol.％、约0.5mol.％、约0.6mol.％、约0.7mol.％、约0.8mol.％、约0.9mol.％、约1.0mol.％、约1.1mol.％、约1.2mol.％、约1.3mol.％、约1.5mol.％、或约2.0mol.％。在一些实施例中，保存溶液是或保存溶液中的任一种。在一些实施例中，保存溶液是水性溶液(注射级水)。在一些实施例中，保存溶液是本领域已知的保存溶液中的任一种。在一些实施例中，保存溶液包含选自以下的成分：乳糖酸、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、五水合棉子糖、腺苷、别嘌呤醇、谷胱甘肽、氢氧化钾、氢氧化钠和盐酸。在一些实例中，保存溶液可以包括低钾细胞外类溶液，如或如表1中所示的组合物。还可以向保存溶液中加入氨基酸、抗生素、或药剂(例如，表2中所示的那些或在此所述氨基酸、抗生素、和药剂中的任一种)。表1保存溶液组成成分表2保存溶液组成成分ros清除剂(谷胱甘肽/n-乙酰基半胱氨酸)第二信使(二丁酰基camp(camp类似物))葡萄糖代谢(胰岛素)膜稳定剂(氢化可的松)生长因子(vegf，fgf)氧载体(红细胞、全氟化碳、血红蛋白结合氧载体)在一些实施例中，用与如在此所述的官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子在保存溶液中的浓度是从约0.01μm至约1000mm、从约0.01μm至约100mm、从约0.01μm至约10mm、从约0.01μm至约1mm、从约0.01μm至约500μm、从约0.01μm至约250μm、从约0.01μm至约100μm、从约0.01μm至约50μm、从约0.01μm至约25μm、从约0.01μm至约10μm、从约0.01μm至约1μm、从约0.01μm至约0.5μm、从约0.05μm至约10μm、从约0.1μm至约10μm、从约1μm至约10μm、从约0.05μm至约1mm、从约0.1μm至约1mm、从约0.5μm至约1mm、从约1μm至约1mm、从约10μm至约1mm、从约100μm至约1mm、从约1mm至约1000mm、从约2mm至约900mm、从约3mm至约800mm、从约4mm至约700mm、从约5mm至约600mm、从约6mm至约500mm、从约7mm至约400mm、从约8mm至约300mm、从约9mm至约200mm、从约10mm至约100mm、从约20mm至约90mm、从约25mm至约80mm、从约30mm至约70mm、或从约40mm至约60mm。在一些实施例中，用与如在此所述的官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子在保存溶液中的浓度是约0.01μm、约0.05μm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约2μm、约5μm、约10μm、约25μm、约50μm、约100μm、约250μm、约500μm、约1mm、约2mm、约3mm、约5mm、约7.5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约45mm、约50mm、约55mm、约60mm、约65mm、约70mm、约75mm、v、约80mm、约85mm、约90mm或约100mm。在一些实施例中，用与如在此所述的官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子在保存溶液中的浓度是从约1μm至约1000μm、从约2μm至约900μm、从约3μm至约800μm、从约4μm至约700μm、从约5μm至约600μm、从约6μm至约500μm、从约7μm至约400μm、从约8μm至约300μm、从约9μm至约200μm、从约10μm至约100μm、从约20μm至约90μm、从约25μm至约80μm、从约30μm至约70μm、或从约40μm至约60μm。在一些实施例中，用与如在此所述的官能化营养素的反应性化学基团互补的反应性化学基团官能化的生物活性分子在保存溶液中的浓度是约10μm、约15μm、约20μm、约25μm、约30μm、约35μm、约40μm、约45μm、约50μm、约55μm、约60μm、约65μm、约70μm、约75μm、约80μm、约85μm、约90μm或约100μm。参考文献1.chiu,l.l.y.,andradisic,m.(2010).scaffoldswithcovalentlyimmobilizedvegfandangiopoietin-1forvascularizationofengineeredtissues.biomaterials31,226-241.2.shen,y.h.,shoichet,m.s.,andradisic,m.(2008).vascularendothelialgrowthfactorimmobilizedincollagenscaffoldpromotespenetrationandproliferationofendothelialcells.actabiomaterialia4,477-489.3.wissink,m.j.b.,beernink,r.,pieper,j.s.,poot,a.a.,engbers,g.h.m.,beugeling,t.,vanaken,w.g.,andfeijen,j.(2001).immobilizationofheparintoedc/nhs-crosslinkedcollagen.characterizationandinvitroevaluation.biomaterials22,151-163.4.darehzereshki,a.etal.biologicversusnonbiologicmeshinventralherniarepair:asystematicreviewandmeta-analysis.worldj.surg.38,40-50(2014).5.bellows,c.f.,wheatley,b.m.,moroz,k.,rosales,s.c.&morici,l.a.theeffectofbacterialinfectiononthebiomechanicalpropertiesofbiologicalmeshinaratmodel.plosone6,(2011).6.collage,r.d.&rosengart,m.r.abdominalwallinfectionswithinsitumesh.surg.infect.(larchmt).11,311-8(2010).7.ott,h.c.etal.perfusion-decellularizedmatrix:usingnature’splatformtoengineerabioartificialheart.nat.med.14,213-221(2008).8.halaweish,i.etal.novelinvitromodelforassessingsusceptibilityofsyntheticherniarepairmeshestostaphylococcusaureusinfectionusinggreenfluorescentprotein-labeledbacteriaandmodernimagingtechniques.surg.infect.(larchmt).11,449-454(2010).9.chiu,l.l.y.&radisic,m.scaffoldswithcovalentlyimmobilizedvegfandangiopoietin-1forvascularizationofengineeredtissues.biomaterials31,226-241(2010).10.yang,c.-h.evaluationofthereleaserateofbioactiverecombinanthumanepidermalgrowthfactorfromcrosslinkingcollagensponges.journalofmaterialsscience:materialsinmedicine19,1433-1440(2008).11.grover,c.n.etal.crosslinkingandcompositioninfluencethesurfaceproperties,mechanicalstiffnessandcellreactivityofcollagen-basedfilms.actabiomaterialia8,3080-3090(2012).12.pieper,j.s.,oosterhof,a.,dijkstra,p.j.,veerkamp,j.h.&vankuppevelt,t.h.preparationandcharacterizationofporouscrosslinkedcollagenousmatricescontainingbioavailablechondroitinsulphate.biomaterials20,847-858(1999).13.oldedamink,l.h.h.etal.cross-linkingofdermalsheepcollagenusingawater-solublecarbodiimide.biomaterials17,765-773(1996).14.grover,c.n.,farndale,r.w.,best,s.m.&cameron,r.e.theinterplaybetweenphysicalandchemicalpropertiesofproteinfilmsaffectstheirbioactivity.journalofbiomedicalmaterialsresearchparta100a,2401-2411(2012).15.davidenko,n.etal.controlofcrosslinkingfortailoringcollagen-basedscaffoldsstabilityandmechanics.actabiomaterialia25,131-142(2015).16.chang,p.v.etal.metaboliclabelingofsialicacidsinlivinganimalswithalkynylsugars.angewandtechemieinternationaledition48,4030-4033(2009).17.hang,h.c.,yu,c.,kato,d.l.&bertozzi,c.r.ametaboliclabelingapproachtowardproteomicanalysisofmucin-typeo-linkedglycosylation.proceedingsofthenationalacademyofsciences100,14846-14851(2003).18.chang,p.v.etal.copper-freeclickchemistryinlivinganimals.proceedingsofthenationalacademyofsciences107,1821-1826(2010).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atiii固定的蛋白质印迹分析。在37℃下以3ml/min用3ml在tris-hcl(ph8.4)中的2.4nkat/mlfxa灌注剩余左肺5、15、30和60分钟，以使fxa失活。在每个时间点，从肺灌注移除50μlfxa灌注液，并使用如上所述的s-2222生色底物定量灌注液中剩余的fxa活性。组织切片上的点击反应和组织学将所有样品用4％多聚甲醛(波士顿生物产品公司(bostonbioproducts))固定、石蜡包埋，并以5-μm厚度切片。在使用antigenunmaskingsolution(vector实验室)进行脱蜡、再水合和抗原修复后，对切片进行处理以进行部分点击反应或定期组织学染色。对于部分点击反应，将源自体内或离体代谢工程的无细胞器官支架的部分在具有和不具有硫酸铜(ii)的情况下用生物素-炔烃点击反应混合物在室温下孵育1小时，随后用pbs充分洗涤。对于生物素和层粘连蛋白的常规组织学染色，将切片用兔-抗-层粘连蛋白抗体(艾博抗公司，ab11575，1:200)在4℃下孵育过夜，随后用alexafluor488缀合的驴-抗-兔抗体(a-21206，1:500)和alexafluor647缀合的链霉抗生物素蛋白(生命科学公司，s-32357，1:500)染色。使用nikoneclipsete200显微镜和nis-elements成像软件获取图像。使用imagej(nih)定量叠氮化物-生物素-链霉抗生物素蛋白和层粘连蛋白染色的荧光强度。点击反应和蛋白质印迹为了将生物素-炔烃缀合到叠氮化物标记的无细胞肺ecm上用于蛋白质印迹分析，将一小片肺组织用温和macs解离器(miltenyibiotec公司)在pbs中匀浆，并用1ml生物素-炔烃点击反应混合物在室温下孵育1小时，随后在pbs中充分洗涤。如下所述，使用尿素缓冲液提取来自点击的肺组织的ecm蛋白。为了直接提取肺ecm和ecm相关蛋白，将无细胞肺组织用温和macs解离器在尿素缓冲液(在pbs中的5m尿素、2m硫脲、50mmdtt、0.1％sds和1％蛋白酶抑制剂，ph7.4)中匀浆(参见，例如ngoka,l.sampleprepforproteomicsofbreastcancer:proteomicsandgeneontologyrevealdramaticdifferencesinproteinsolubilizationpreferencesofradioimmunoprecipitationassayandurealysisbuffers.[乳腺癌蛋白质组学的样品制备：蛋白质组学和基因本体论揭示放射免疫沉淀测定和尿素裂解缓冲液在蛋白质溶解偏好方面的显著差异]proteomescience[蛋白质组科学]6,30(2008))，在室温下搅拌孵育2小时，并使用截留分子量为10kda的amicon超级离心机过滤器(西格玛-奥德里奇公司)用pbs透析。在bca定量后，将蛋白质样品在还原条件下使用sds-page分析，转移到硝酸纤维素印迹膜，并在4℃下用一抗孵育过夜，随后在室温下用hrp缀合的二抗孵育1小时，然后进行放射自显影。使用的一抗包括atiii(圣克鲁斯生物技术公司，sc-32453，1:400)和层粘连蛋白(艾博抗公司，ab11575，1:1000)，并且使用的二抗包括hrp缀合的驴-抗-兔抗体(艾博抗公司，ab98440，1:10,000)和hrp缀合的驴-抗-山羊抗体(艾博抗公司，ab98519，1:10,000)。对于生物素分析，将印迹用hrp缀合的链霉抗生物素蛋白(生命科学公司，434323，1:10,000)孵育。统计分析通过单向onova和tukey多重比较测试或学生t测试进行统计分析。统计显著性定义为*p<0.05和**p<0.01。图表中的值表示为具有s.d的平均值。将microsoftexcel(微软公司(microsoft))和prism7(graphpad软件公司)用于数据管理、统计分析和图形准备。实例1-三种叠氮化物标记的糖(ac4galnaz、ac4glcnaz和ac4mannaz)的代谢标记效率的比较目前描述的方法和程序中的第一步是使用叠氮化物标记的糖通过代谢标记在去细胞化器官/组织支架上产生配体(叠氮化物标签)以用于化学选择性连接(点击反应)。在所述的方法中，将叠氮化物标记的半乳糖胺(ac4galnaz)用于代谢标记去细胞化天然器官/组织支架。以去细胞化肺支架为模型，证明了ac4galnaz与其他可商购叠氮化物标记的糖(如ac4glcnaz和ac4mannaz)相比，显示出更高的标记效率。在图2a中，图像示出了在供体大鼠中代谢标记3天后，去细胞化大鼠肺上的叠氮化物标签(紫色)和ecm组分层粘连蛋白(绿色)的染色。使用生物素-炔烃(经由点击反应)(西格玛奥德里奇公司，目录号764213)和alexafluor647-缀合的链霉抗生物素蛋白(赛默飞世尔公司，目录号：s21374)进行叠氮化物标签染色。与ac4glcnaz和ac4mannaz相比，ac4galnaz在标记去细胞化大鼠肺支架方面显示出更高的效率(参见图2a和2b)。ac4galnaz在无细胞肺中产生最强的代谢叠氮化物标记强度(图25c-25d)。分析了与生物素-炔烃点击缀结合后从用ac4galnaz标记的去细胞化肺分离的ecm蛋白，通过蛋白质印迹显示了生物素标记的丰度，证明了肺ecm的叠氮化物标记在性质上是共价的(参见图25e)。通过ac4galnaz的三天腹膜内给予，进一步证明了ac4galnaz对大鼠颈动脉、心脏、肝脏、肾脏和皮肤的去细胞化支架的有效体内代谢叠氮化物标记(参见实例5)。还证明了使用ac4galnaz的代谢标记可以在生长中和老化的动物两者中进行，也可以在离体培养期间在分离的器官中进行(参见实例4)。除肺之外，使用ac4galnaz的高效代谢标记也在血管(参见图3)和皮肤皮瓣的去细胞化支架中实现。相同的标记技术可以应用于许多其他器官/组织，以及来自大型动物(如猪)支架的去细胞化产物。在图3中，图像示出了在供体大鼠中代谢标记3天后，去细胞化大鼠颈动脉上的叠氮化物标签(紫色)和ecm组分层粘连蛋白(绿色)的染色。使用生物素炔烃(经由点击反应)和alexafluor647缀合的链霉抗生物素蛋白进行叠氮化物标签染色。实例2a-可点击肝素(肝素-炔烃)的产生开发了方法用于产生感兴趣的炔烃缀合的生物分子，以使得这些炔烃-生物分子可以选择性地固定在叠氮化物修饰的去细胞化器官支架上。例如，通过将炔烃基团与脱氨基肝素的醛末端缀合产生可点击肝素。简而言之，在90mm对苯二胺(西格玛奥德里奇公司)催化剂存在下，使大约10mm脱氨基肝素(卡波姆)在室温下与100mm邻-(丙-2-炔基)-羟胺盐酸盐(圣克鲁斯生物技术公司)在0.1m柠檬酸钠溶液(ph4.5)中反应20h。使用截留分子量为3kda的amicon超级离心机过滤器用水透析产物。脱氨基肝素与邻-(丙-2-炔基)-羟胺盐酸盐的成功缀合通过以下检查：使450um透析产物与550um30kdapeg-叠氮化物分子在两种点击条件(具有或不具有铜催化剂)下反应1小时，并且使用1％(w/v)乙酸钡0.5％琼脂糖凝胶在0.05m二氨基丙烷缓冲液(ph9.0)中进行电泳。通过将其浸入在水中的0.1％(w/v)n-十六烷基-n,n,n-三甲基溴化铵中固定凝胶15min，用0.1％(w/v)甲苯胺蓝在乙酸:乙醇:水(0.1:5:5比率)中的新鲜溶液染色3小时，并在10％(v/v)乙醇中脱色。在图4中，炔烃缀合的肝素(肝素-炔烃)与peg(30k)-叠氮化物使用点击反应在具有和不具有铜催化剂的情况下反应。仅在铜催化剂存在下，肝素-炔烃显示出由于肝素与peg(30k)-叠氮化物之间经由肝素上的炔烃与peg(30k)上的叠氮化物之间的点击反应的缀合而发生的分子转移。实例2b-肝素-炔烃-生物素(肝素-ab)的合成和特性将240mg肝素(西格玛-奥德里奇公司)与12mmedc(西格玛-奥德里奇公司)和12mm磺基-nhs(生命科学公司)在mes缓冲液(ph4.7，西格玛-奥德里奇公司)中在室温下混合30min。随后，将20mmez-连接胺-peg3-生物素(生命科学公司)和20mm胺-peg4-炔烃(点击化学工具)加入到反应中，并将ph增加至8.0。在室温下搅拌孵育2小时后，使用截留分子量为3-kda的amicon超级离心机过滤器(西格玛-奥德里奇公司)用pbs充分透析产物。肝素-炔烃-生物素(肝素-ab)的合成在图27a中示出。肝素的生物素修饰允许容易地可视化固定的肝素。进一步开发了胶原蛋白-叠氮化物孔测定，其中叠氮化物缀合到胶原蛋白包被的孔上，作为叠氮化物标记的ecm的简单模型。这允许将肝素-ab点击固定到叠氮化物标记的ecm上用于可视化和生物活性评估(参见图27b中的图)。在具有和不具有叠氮化物标记的情况下进行肝素-ab在胶原蛋白孔上的点击固定，并观察肝素-生物素(肝素-b)的特异性固定(参见图27c和27d)，这进一步固定抗凝血酶iii(atiii)(参见图27e)并允许加速抑制因子xa(fxa)(参见图27f)。实例3-可点击万古霉素(万古霉素-炔烃)的产生方法：万古霉素购自cayman化学品公司(目录号15327，cas号1404-93-9)。炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯购自西格玛奥德里奇公司(目录号764191)。将炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯制备成在dmso中的30mm储备溶液。万古霉素-炔烃的制备：将万古霉素(1mm)与在dpbs(ph8.3)中的3mm炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯在室温下反应24小时。通过hplc纯化所得万古霉素-炔烃。图22示出了从万古霉素和炔烃-peg5-n-羟基琥珀酰亚胺酯制备万古霉素-炔烃的合成方案。图23示出了万古霉素-炔烃产物的全扫描质谱。实例4.器官/组织的细胞外基质的体内代谢标记方法对于大鼠模型中器官/组织体内的代谢工程，每天通过腹膜内注射给予叠氮化物标记的糖(300mg/kg体重，在70％dmso中)。在最后一次叠氮化物标记的糖给予后一天，收获器官/组织并进行灌注去细胞化(参见图1和13)。通过进行铜催化的点击反应来评估去细胞化支架中叠氮化物标记的存在。动物饲喂、器官分离和去细胞化：在终点组织收获之前，将100克spraguedawley大鼠腹膜内注射(300mg/kg体重，在70％dmso中)叠氮化物标记的半乳糖胺(ac4galnaz)3天或7天，并进行全器官的灌注去细胞化。参见图25a中的图。在体内结合阶段完成后，将动物麻醉、剃毛、并准备进行手术。进行剖腹手术并将动物系统地肝素化并通过放血处死。在血管蒂完整的情况下收获深腹壁下动脉分布中的全厚度皮肤皮瓣。将动脉插管并结扎所有分支。然后将皮瓣无菌移入灌注去细胞化生物室中并根据先前所述的方案(例如，描述于ott,h.c.等人nat.med.[自然医学],2008,14,213-221中的方案)进行去细胞化(参见图5)。在去细胞化后，切下样品并固定以用于组织学分析(参见图6a-d)。叠氮化物结合的确认：在代谢工程和去细胞化后，将去细胞化支架在4％多聚甲醛中在4℃下固定过夜。然后将支架嵌入石蜡中并以5-μm的厚度切片。根据标准组织学染色程序对石蜡包埋的切片进行脱蜡和再水合。使用炔烃缀合的生物素(10μm)和细胞反应缓冲液试剂盒(赛默飞世尔公司，目录号：c10269)在室温下对这些切片进行铜催化的点击反应1小时，随后通过荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白检测生物素。通过使用点击反应将生物素-炔烃缀合到叠氮化物配体上，随后使用荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白进行生物素检测来评估叠氮化物在组织学切片上的去细胞化ecm中的结合，参见图25b。使用免疫荧光的组织学分析证实叠氮化物结合到去细胞化ecm上的确认：在图7中，图像证明了在供体大鼠中代谢标记3天后，去细胞化大鼠上腹部皮瓣上的叠氮化物标签(紫色)和ecm组分层粘连蛋白(绿色)的染色(点击#1和点击#2)。使用生物素-炔烃(经由点击反应)和alexafluor647缀合的链霉抗生物素蛋白进行叠氮化物标签染色。图像证明了在用于阴性对照(去细胞化)的3天dmso注射后，在具有或不具有cu的情况下在去细胞化大鼠上腹部皮瓣上缺少叠氮化物标签。图14示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠颈动脉支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：500μm)。图15示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠心脏支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：200μm)。图16示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠肝脏支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：200μm)。图17示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠肾脏支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：200μm)。图18示出了在使用ac4galnaz进行体内代谢工程后，去细胞化大鼠皮肤支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：500μm)。图28-32中示出的实验证明了源自用ac4galnaz给予的动物的心脏、肝脏、肾脏、皮肤和颈动脉的强烈且特异性的ecm标记。这突出了在此所述的代谢工程策略的广泛适用性。实例5-叠氮化物标记的去细胞化支架与万古霉素-炔烃的点击反应。通过将炔烃基团与如上所述存在的唯一伯胺缀合，使万古霉素可点击(参见例如，图22，实例3)。通过lc-ms/ms分析证实了所得可点击万古霉素-炔烃的结构(图23)。使用先前描述的点击反应，将万古霉素固定到ecm上。使用万古霉素-炔烃(100μm)和细胞反应缓冲液试剂盒(赛默飞世尔公司，目录号：c10269)通过灌注(0.5ml/min)在室温下在去细胞化大鼠上腹部皮瓣上进行铜催化的点击反应1小时，随后进行充分洗涤并使用万古霉素特异性抗体检测固定的万古霉素。在图24中，图像示出在点击反应后固定在大鼠上腹部皮瓣(ref)的去细胞化ecm上的万古霉素的免疫荧光染色：在万古霉素染色(红色)后dmso对照(a，左上图像)相比于ac4galnaz标记的ref(b，右下图像)(比例尺＝100μm)。参见图24，来自a/b的染色的荧光强度定量显示了ac4galnaz标记的ref上万古霉素的增加(p<0.05)。图24示出了在整装ref上的万古霉素的表面荧光染色(绿色)：dmso对照(d，左下图像)相比于ac4galnaz标记的ref(e，右下图像)。来自d/e的染色的荧光强度定量显示了ac4galnaz标记的ref上万古霉素的增加(p<0.001)。与没有叠氮化物标记(dmso对照)的ecm相比，在具有代谢标记的叠氮化物标签的ecm上，万古霉素的水平在横截面和整装染色两方面均更高。然后将所得网状物储存在-20℃下的20％蔗糖中用于进一步测试和/或如在此所述进行使用。结论：具有固定化万古霉素的真皮基质网状物具有许多潜在的益处。网状物应对万古霉素敏感的细菌渗透和随后的生物膜形成具有更强的抵抗力。万古霉素有效杀死从感染网状物培养的最常见细菌。通过消除这些细菌，网状物更好地维持了必要的生物力学特性，并且对于患有复杂腹壁病变的患者来说是更持久、长期的解决方案。此外，通过使用该网状物，用网状物重建腹壁后浅表部位感染将显著减少。用万古霉素治疗患者对于医疗保健系统来说是具有挑战性和繁重的。它需要患者具有静脉通路，并且除治疗药物水平监测功效和安全性之外，典型地还要求每天至少两次给药。万古霉素的肾毒性是重要的健康问题。在如在此所述的系统中，万古霉素-官能化网状物固定在ecm上，导致体内循环中几乎没有万古霉素，从而大大降低了毒性的可能性。除腹壁重建之外，生物网状物广泛用于重建手术以支持假体植入物。感染是这些程序的罕见但具有破坏性的并发症，并且抗感染网状物为这些程序中的使用提供了益处。优势涂有万古霉素的网状物提供了针对细菌感染的显著抗性，从而产生更持久和功能性的重建材料实例6a-器官/组织的细胞外基质的离体代谢标记在ecm中结合生物正交反应性配体的方法对于离体培养过程中分离的器官/组织的代谢工程，使用补充有10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素(10,000单位/ml青霉素和10,000μg/ml链霉素的原液的1:100稀释液)的dmem/f12培养基。将叠氮化物标记的糖(ac4galnaz)以50μm加入到培养基中。在生物反应器中使用恒速灌注一天培养器官/组织(图21)。对于大鼠肺部，灌注速率是5ml/min。对于人肺叶，灌注速率是10ml/min。对于大鼠上腹部皮瓣，灌注速率是0.2ml/min。在培养后，对器官/组织进行灌注去细胞化(参见图8和图9)。参见图26a中所示的图，其示出了在新鲜分离的器官的离体培养过程中ecm的代谢叠氮化物标记。在恒速灌注(5ml/min)下在生物反应器中在含有10％胎牛血清(dmem/f12-fbs)的dmem/f12培养基(补充和未补充ac4galnaz(50μm))中培养一天，随后进行灌注去细胞化的新鲜分离的大鼠肺(图26a)在离体培养期间仅在ac4galnaz存在下以及在与生物素-炔烃的点击缀合期间在cu(i)催化剂存在下显示肺ecm的稳健共价叠氮化物标记(参见图26b和26c以及在此所述的实验)。在恒速灌注(300ml/min)下，将新鲜分离的猪左肺在相同dmem/f12-fbs培养基(补充和未补充50μmac4galnaz)中培养一天，随后进行灌注去细胞化(图26a、26d和26e)。与在无细胞大鼠肺ecm工程中观察到的一致，可以使用与生物素-炔烃点击缀合来检测结合到代谢工程化无细胞猪肺ecm中的特异性和共价叠氮化物(参见图26f和26g)。叠氮化物结合的确认：通过进行铜催化的点击反应来评估去细胞化支架中叠氮化物标记的存在。在代谢工程和去细胞化后，将去细胞化支架在4％多聚甲醛中在4℃下固定过夜。然后将支架嵌入石蜡中并以5-μm的厚度切片。根据标准组织学染色程序对石蜡包埋的切片进行脱蜡和再水合。使用炔烃缀合的生物素(10μm)和细胞反应缓冲液试剂盒(赛默飞世尔公司，目录号：c10269)在室温下对这些切片进行铜催化的点击反应1小时，随后通过荧光团缀合的链霉抗生物素蛋白检测生物素。图10示出了在代谢工程后，去细胞化大鼠肺支架中的叠氮化物标记的检测。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的细胞外基质(ecm)蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：200μm)。图11示出了颈动脉的去细胞化支架的成功标记。将样品与层粘连蛋白(其是丰富的ecm蛋白)共染色，以促进去细胞化ecm的可视化(比例：200μm)。离体代谢工程方法可以应用于大鼠、人和其他模型(如猪模型)的其他器官/组织。实例6b-代谢标记的器官/组织细胞外基质与修饰的生物分子的反应器官输注期间的点击反应为了实现官能化ecm的后续生物医学应用(如全器官工程)，示出了通过输注点击反应将炔烃修饰的感兴趣生物分子缀合到整装叠氮化物标记的无细胞器官支架上的可行性(参见图26h)。使用离体工程化的叠氮化物标记的无细胞大鼠肺和生物素-炔烃作为模型，证明了在用点击反应混合物输注肺并在室温下孵育1小时后，生物素在整个无细胞肺中的有效且均匀的点击固定(参见图26i)。生物分子固定在合成的ecm表面上在确认肝素-ab在其点击固定到合成ecm表面上后保留的生物活性后(参见实例2b)，证明了肝素-ab在叠氮化物标记的无细胞肺上的固定(参见图27g中的图)。在具有和不具有离体ac4galnaz代谢工程的情况下，在无细胞大鼠肺中进行肝素-ab的输注点击反应，并观察肝素-b在整个叠氮化物标记的无细胞肺中的特异性和均匀固定(参见图27h)。类似于在胶原蛋白-叠氮化物孔上观察到的(参见实例2b)，固定在叠氮化物标记的无细胞肺上的肝素-b导致增强的atiii固定(参见图27i)和fxa抑制(参见图27j)。总而言之，这些结果证明源自ac4galnaz代谢工程的、叠氮化物标记的点击反应性无细胞肺ecm可以经由点击缀合有效地用于固定炔烃修饰的感兴趣生物分子，同时在固定后保持其生物活性。实例7-供体器官移植物的生物正交修饰以改善器官保存和移植程序该程序包括两个步骤。在第一步中，用ac4galnaz注射供体大鼠三天(如实例4中所述)。这允许用叠氮基标签代谢标记供体肺。在第二步中，将具有叠氮基标记的供体肺于在冰上的含有浓度为100μm的dbco活化的生物素的保存溶液(perfadex)中保存1小时。然后用保存溶液(perfadex)充分洗涤肺并准备移植。固定肺用于固定的生物活性分子的组织学染色(如由生物素所示)。供体肺组织在其用于移植的冷保存期间的分子细化程序的图在图19中示出。结果为了证明在临床相关环境中使用无铜点击化学使可移植活肺组织官能化的概念，于在冰上的临床保存溶液perfadex中的冷肺保存阶段期间进行点击反应。将dbco活化的生物素用于原理验证。如图20所示，使用生物正交和化学选择性反应将生物素固定到供体肺组织上，在一小时内在冷的临床保存溶液中以高效率发生。在此所述的是通过体内和离体共价结合叠氮化物配体以代谢工程化天然ecm生物材料的策略。这使得可以用由通过点击化学共价固定例如炔烃修饰的生物活性分子赋予的希望特征化学选择性官能化这些生物材料。结果表明，点击反应性叠氮化物配体可以通过腹膜内给予ac4galnaz有效地结合到器官的ecm中。在所检查的所有组织和器官(包括肺、心脏、肾脏、肝脏、皮肤和血管)的ecm中均观察到有效的叠氮化物结合(参见实例)。这表明在此所述的策略适用于宽范围的天然ecm生物材料。使用肺作为模型，结果表明也可以在啮齿动物和猪模型两者中在新鲜分离的器官的离体培养期间实现有效的ac4galnaz代谢ecm工程。当给予供体动物ac4galnaz不可行时，这进一步拓宽了所述方法对环境的适用性。这还打开了将代谢ecm工程直接应用于供体人器官的可能性。使用肝素-ab作为模型，证明了源自代谢工程的“可点击的”无细胞肺可以有效地用于固定生物活性分子，这些生物活性分子在点击固定到全器官ecm上后仍保持生物活性。重要的是，在此所述的用于天然生物材料官能化的方法已证实了生物相容性。结果表明，叠氮化物配体可以在体内结合到活体和功能器官的ecm中，这表明叠氮化物结合位点可以被视为不对器官常规功能产生明显干扰的“安全位点”。在去细胞化后，可以使用点击化学将炔烃修饰的感兴趣生物分子进一步缀合到这些“安全位点”上。总而言之，通过将生物选择性叠氮化物结合到ecm中和随后用希望的炔烃修饰的生物分子进行化学选择性点击连接组合，在此所述的方法提供了创新的解决方案以使得能够以高特异性和生物相容性实现天然ecm生物材料的官能化。此外，在使用交联化学的常规生物材料官能化中，由于其不同的化学特性，通常需要针对每种感兴趣的生物分子单独开发固定化反应。使用交联化学进行生物材料官能化，由于在化学活化时生物分子之间的潜在交叉反应性和它们与生物材料的反应性的差异，在一个反应中将多个功能性生物分子组合在一起也具有挑战性。相比之下，当使用叠氮化物标记的“可点击的”ecm生物材料时，基于点击化学的缀合反应可以以最小的修饰应用于大多数炔烃修饰的生物分子。考虑到这些炔烃修饰的生物分子彼此之间的化学惰性，还可能的是在单一缀合反应中将不同的炔烃修饰的生物分子组合在一起。因此开发具有多种希望特征的复合生物材料是可能的。应了解，为明确起见而描述于分开实施例的上下文中的本披露的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反，为简洁起见而描述于单个实施例的上下文的本披露的不同特征也可以分开地或以任何适合的子组合形式提供。其他实施例应理解，虽然已结合其详细描述对本申请进行了描述，但以上描述旨在说明而非限制本申请的范围，本申请的范围由所附的权利要求书的范围限定。其他方面、优点、以及修饰均在以下权利要求书的范围内。当前第1页12