具有疏水侧链的聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)(PLP)聚合物的制作方法

本公开涉及提供新型可生物降解的包含疏水侧链的基于两亲性肽和肽类似物的衍生物；它们在哺乳动物细胞的透化中的用途以及所述基于肽或肽类似物的衍生物在一种或多种试剂的细胞内递送中的用途。

背景技术：

纳米粒子近年来由于其有利的物理和化学性质而在生物学和医学中的应用快速增长。可发现纳米粒子由各种无机或有机材料构成，并且用于各种生物医学应用，例如细胞疗法、组织工程、生物标志物、标记和追踪剂、用于基因疗法的载体、磁共振成像(mri)、成像剂和药物递送。

出于药物递送的目的，将纳米粒子定义为其中期望的药物被溶解、包封、复合或共价连接的生物相容的亚微米大小粒子(<1μm)。纳米粒子不得不满足宽范围的经常相互矛盾的技术特征以用于生物医学应用中。纳米粒子必须高度稳定以允许靶向药物递送和持续释放。期望纳米粒子具有允许转运亲水化合物和疏水化合物两者的两亲性质，并提供经常限制材料的选择的化学修饰的适合性。另外，不得不调整纳米粒子以适合各种施用途径，例如口服施用或通过吸入施用。另一重要方面是纳米粒子由生物相容的、可生物降解的材料(例如合成或天然聚合物或脂质)构成，以将排斥的风险降到最低并避免降解为有毒组分。有机可生物降解的聚合物例如聚羟基丁酸酯(phb)、聚乳酸(pla)、聚己内酰胺(pcl)、聚氨基酸、聚酰胺、聚缩水甘油等目前被认为是用于开发用于药物递送的纳米粒子的适合材料。基于纳米粒子的递送媒介物的又一目的是提供一种手段，通过该手段，使治疗剂特异性地靶向治疗疾病和病症中的细胞，其减少剂量并由此减少副作用特征，从而为患者提供改善的治疗方案。

已设计了可生物降解的假肽聚合物并将其用作试剂递送中的聚合物透化剂。例如，在wo2011089391中，公开了此类聚合物的用途，所述聚合物具有一个或多个接枝到聚(l-赖氨酸间苯二甲酰胺)(plp)的羧酸基团上的疏水氨基酸，以便可逆地透化细胞膜，以改善试剂(例如海藻糖，它是已知的细胞保护剂)的摄取。在wo2004/052402中，公开了基于假肽的聚合物试剂，其用于任选与纳米粒子缔合的治疗剂(例如化学治疗剂)、抗体、抗生素和sirna的递送以及成像剂的递送。

迫切需要用于保存和长期储存生物产品的改善方法，以保护和储存用于临床医学和生物制药应用中的有价值的生物样品，例如造血细胞(例如红细胞、血小板和淋巴细胞)、干细胞(例如骨髓细胞)、免疫细胞、生殖细胞。细胞冷冻保存常规地用于实验室中以延长细胞寿命，并涉及传统的缓慢冷冻方法或在零下温度下超快速冷冻细胞或组织，旨在减少细胞中任何损害性的酶和化学活性。然而，尽管冷冻可延长细胞寿命，但它也可导致细胞间或细胞外冰晶形成或渗透休克引起的细胞损害。因此，经常在旨在保护细胞结构在冷却和加温过程期间免受损害的冷冻保护剂(cpa)(例如二甲亚砜、甘油、1,2-丙二醇、羟乙基淀粉或聚乙二醇)存在下进行诸如将细胞冷冻或玻璃化的冷冻保护方法，并且尽管已知这些化合物具有有益作用，但cpa的受控添加和去除对于防止细胞裂解、细胞分化和毒性是必需的。例如，二甲亚砜(dmso)是目前在细胞储存中最广泛使用的冷冻保护剂；然而，dmso是高毒性的并且导致30％的间充质干细胞死亡和大约50％的人胚胎干细胞死亡。此外，大约1.5％获得用cpa储存的细胞的患者经历极端副作用，例如呼吸和/或心血管问题。

从多细胞生物体缓步动物(tardigrada)已知天然细胞保存方法，该动物由于细胞中存在高浓度的海藻糖而可在冰冻中存活。已知小的碳水化合物糖(例如海藻糖、蔗糖或麦芽糖)具有优于传统cpa(例如dmso或甘油)并且是本领域已知的生理化学性质。wo2012/098358公开了作为保存剂与不同缓冲剂和重构溶液组合的海藻糖和其他碳水化合物，以改善冷冻干燥细胞的存活力和功能。

然而，尽管小糖的细胞保护性质优越，但它们难以跨细胞膜转运到细胞中，这是获得任何细胞保护作用所必需的。为了改善糖摄取方法，例如显微注射，已开发出电透化或通过使用细菌毒素增加细胞透化作用。us2005277107公开了用于通过显微注射递送到细胞中的包含碳水化合物(例如海藻糖)的组合物。us61227177公开了h5-α毒素用于临时穿孔细胞以加载生物防腐剂(例如海藻糖)的用途。已知聚合化合物(例如改性乙烯基聚合物(乙烯基聚(α-烷基丙烯酸)聚合物))在内体ph值下破坏脂质双层膜，并且在细胞质药物递送中具有潜在应用。然而，乙烯基聚合物不可生物降解。

本公开涉及提供新型的包含疏水侧链(例如脂族烷烃侧链)的基于两亲性肽和肽类似物的衍生物，以及此类基于肽或肽类似物的衍生物通过细胞膜透化增加试剂摄取的用途。例如，基于肽或肽类似物的衍生物用于递送保护细胞、组织和器官免受冷冻或干燥的有害影响的试剂的用途。另外，肽衍生物在治疗疾病和病症的治疗剂的递送中具有效用。

技术实现要素：

根据本发明的一个方面，提供了两亲性肽或两亲性肽类似物，其中所述肽包含一个或多个疏水侧链。

适合地，疏水侧链是c1-200烷基、c2-200烯基或c2-200炔基，所述基团中的任一个可被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、偶氮基、重氮基、磷酸基、磷酸酯基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、磷酸基、磷酸酯基，并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基。

适合的疏水侧链是c5-40烷基、c5-40烯基或c5-40炔基，其可任选如上文所述被取代。

在本说明书中，“卤基”是指氟、氯、溴或碘。

适合地，疏水侧链是c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个可被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c6-10芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-4烷基、c1-4卤代烷基、卤基、氰基或硝基；并且其中r³和r⁴中每一个独立地为h或c1-6烷基。

适合地，疏水侧链是c7烷基、c8烷基、c10烷基、c14烷基或c18烷基，其可任选如上文所述被取代。

适合的疏水侧链的示例选自由以下组成的组：三十八烷酸(c38)、三十一碳酸(c31)、二十二碳六烯酸(c22)、氨基官能化的聚丙交酯2500da和4000da、胺封端的聚(n-异丙基丙烯酰胺)2500da、5000da或5500da、普流尼克(pluronic)、饱和和不饱和脂肪酸、癸胺、十八烷基胺、二己胺、二(十八烷基)胺、3-丁烯基胺盐酸盐、油胺、乙基(丙-2-烯-1-基)胺、双[(2z)-3-氯丁-2-烯-1-基]胺、甲基[7-(甲基亚氨基)庚-1,3,5-三烯-1-基]胺、丁-3-炔-1-胺盐酸盐、3-氟-2-甲基辛-7-炔-1-胺、[4,4-二甲基-2-(戊-4-炔-1-基)环己基]甲胺、双(丁-2-炔-1-基)胺、(十一-1-炔-4-基)(丙基)胺、(8-氨基辛-1,3,5,7-四炔-1-基)硼烷、n-(2-萘基)-1-萘胺、c-(2-对甲苯基-咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-甲胺、1,1-双(4-氯苯基)-2-[(2-氟苄基)氨基]-1-乙醇、4-十四烷基苯胺双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺溶液、3-(fmoc-氨基)苄腈、h-cys(trt)-nh2、1,7-二苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷、2-(3-氧代-十氢-喹喔啉-2-基)-n-(4-苯氧基-苯基)-乙酰胺、滂酰胭脂红2b(pontacylcarmine2b)、2-[(2-氨基-4-甲基苯基)硫烷基]-n-(2-甲基苯基)乙酰胺、4-硝基苯乙胺盐酸盐、3-(乙氧基二甲基甲硅烷基)丙胺、(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)膦酸、基于聚(丙二醇)的聚合物、基于聚乙烯的聚合物和基于聚苯乙烯的聚合物。

可通过二环己基碳化二亚胺/二甲基氨基吡啶(dcc/dmap)偶合、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)偶合或使用本领域技术人员已知的其他已确立的交联技术将适合的疏水侧链缀合到两亲性肽或两亲性肽类似物。

疏水侧链可通过选自以下的接头连接到聚合物骨架：键、-c(o)-、-c(o)o-、-c(o)nh-、-o-、-s-、-so-、-so2-、-s(o2)n-、-ss、-nn-、-cn-、-c(o)oc(o)-、-p(o)o-、-sio-、-n3-、-s(o)-、-nr-、-op(ooh)o-、-p(oor)-。

在本发明的优选实施方案中，所述肽类似物包括聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)(plp)。

在本发明的实施方案中，所述肽包含具有弱可电离的羧酸基团的两亲性聚合物，其中所述聚合物包含以下的共聚物：(a)含有两个羧基的单体，例如间苯二甲酸，或含有两个酰氯的单体，例如间苯二甲酰氯；以及(b)含有两个胺基的单体，例如赖氨酸、半胱氨酸、硒代胱氨酸、2,4-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、鸟氨酸和2,6-二氨基庚二酸。

在本发明的又一替代实施方案中，所述肽包含天然聚氨基酸，例如聚(天冬氨酸)和聚(谷氨酸)，以及它们的衍生物。

具体实施方式

在本发明的一个方面或优选的实施方案中，提供了包含式(i)化合物的肽：

其中r包括

nr¹r²或oh，其中r中的至少一个是nr¹r²；

r¹和r²各自独立地包括h；c1-200烷基、c2-200烯基或c2-200炔基，其任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c6-10芳基；

c6-10芳基，其任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义；或

r¹和r²与它们所连接的氮原子一起形成5-12元杂环，所述杂环任选含有一个或多个选自n、o和s的另外的杂原子并且任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义；并且n≥4。

在替代实施方案中，所述肽是包含通式(i)的聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)化合物：

其中r包括

nr¹r²或oh，其中r中的至少一个是nr¹r²；

r¹和r²各自独立地包括：

h；

c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基、c6-10芳基或c5-10杂芳基；其中

烷基、烯基和炔基r¹和r²任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、＝nr³、＝o、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c3-7环烷基、c3-10杂环基、c6-14芳基或c4-14杂芳基；

其中环烷基、杂环基、芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r4、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、被r³取代的芳基和被r³取代的杂芳基，以及在化学上适当的情况下，＝o；并且

其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c6-10芳基；

c6-10芳基和杂芳基r¹和r²任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基或s-ch2c(o)nr⁵r⁶；

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义，并且r⁵和r⁶各自独立地为h、任选被or³或卤基取代的c1-6烷基或任选被c1-6烷基、oh、o(c1-6烷基)或o-c6-14芳基取代的c6-14芳基；或

r¹和r²与它们所连接的氮原子一起形成5-12元杂环，所述杂环任选含有一个或多个选自n、o和s的另外的杂原子并且任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、＝o、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基；

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴，

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义；并且

n≥4。

在一些情况下，在本发明的这一方面，r¹和r²各自独立地包括：

h；

c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，其任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r4、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、c6-10芳基；

c6-10芳基，其任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义；或

r¹和r²与它们所连接的氮原子一起形成5-12元杂环，所述杂环任选含有一个或多个选自n、o和s的另外的杂原子并且任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-16烷基、c1-16卤代烷基、卤基、氰基、硝基、重氮基、-op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基；

其中烷基和卤代烷基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴，

其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴；

其中r³和r⁴如上文所定义；并且n≥4。

在优选的化合物中，n为4-3623；优选4-1000、1001-2000、2001-3000且甚至更优选3001-3623。

在替代的优选化合物中，n为4-362；优选4-272、4-181且甚至更优选4-150。

在替代的优选化合物中，n为4-200；优选20-170且甚至更优选40-140。

在替代的优选化合物中，n为120-150；优选地，n＝130。

在替代的优选化合物中，n为40-60，优选地，n＝49。

plp聚合物的示例在专利申请wo2004/052402和us2006172418中给出，所述专利申请的内容在此以引用方式整体并入。

聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)衍生物可以是聚(l-赖氨酸间苯二甲酰胺)化合物。

在替代化合物中，r¹和r²各自独立地包括h、c5-40烷基、c5-40烯基或c5-40炔基，其可任选如上文所述被取代。

在替代化合物中，r¹和r²各自独立地包括h、c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，并且任选如上文所述被取代。

在替代化合物中，r¹和r²各自独立地包括h、c7-22烷基、c7-22烯基或c7-22炔基，并且任选如上文所述被取代。

在又一替代化合物中，r¹是h、c7-22烷基、c7-22烯基或c7-22炔基，并且r²是c7-22烷基、c7-22烯基或c7-22炔基，并且任选如上文所述被取代。

在替代化合物中，芳基是c6-10。在替代化合物中，杂芳基是c6-10。

在替代化合物中，r¹和r²各自独立地包括h、c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个可被一个或多个选自以下的取代基取代：卤基、氰基、硝基、重氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-10芳基或c4-14杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-4烷基、c1-4卤代烷基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、叠氮基、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴磷酸基；并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-6烷基。

在优选的化合物中，0.1％到99％，例如0.1％到5％、0.5％到10％、1％到20％、2％到19％、3％到18％、4％到17％、5％到16％、6％到15％、7％到14％、8％到13％、9％到12％、10％到95％、15％到85％、20％到80％、25％到75％、30％到70％、35％到65％、40％到60％、45％到55％的r部分是nr¹r²。

在又一优选的化合物中，3％到18％的r是nr¹r²。

在又一优选的化合物中，3％、10％或18％的r是nr¹r²。

在更适合的本发明化合物中，r¹和r²不都是h。因此，适合地，r¹如上文所定义并且r²如上文所定义，不同之处在于它不是氢。

在一些适合的化合物中，r¹如上文所定义，并且r²是c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基、c6-10芳基或c5-10杂芳基，所述基团中的任一个任选如上文所定义被取代。

更适合地，r¹是h、c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个可任选如上文所定义被取代，并且r²是c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个可任选如上文所定义被取代。

在一些适合的本发明化合物中，r¹是h或c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个未经取代或被f、cl、oh、sh、甲氧基或乙氧基取代；并且r²是c6-30烷基、c6-30烯基或c6-30炔基，所述基团中的任一个未经取代或被f、cl、oh、sh、甲氧基或乙氧基取代。

在特别适合的化合物中，r¹是h或未取代的c6-30烷基、未取代的c6-30烯基或未取代的c6-30炔基；并且r²是未取代的c6-30烷基、未取代的c6-30烯基或未取代的c6-30炔基。

在本发明的某些适合的化合物中，其中r¹是h且r²是c7-18烷基、c7-18烯基或c7-18炔基，所述基团中的任一个未经取代或被f、cl、oh、sh、甲氧基或乙氧基取代。

在这种类型的化合物中，优选r¹是h且r²是未取代的c7-18烷基，例如庚基、辛基、癸基、十四烷基或十八烷基，特别是直链c7-18烷基，例如正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十四烷基或正十八烷基，尤其是正癸基。

或者，r¹和r²中的每一个为c7-18烷基、c7-18烯基或c7-18炔基，所述基团中的任一个可任选如上文所述被取代。

在这种类型的化合物中，优选r¹和r²各自为c7-18烷基，例如庚基、辛基、癸基、十四烷基或十八烷基，特别是直链c7-18烷基，例如正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十四烷基或正十八烷基，尤其是正癸基。

适合地，r¹和r²中的每一个是c7-烷基、c8-烷基、c10烷基、c14烷基或c18烷基，其任一个可任选如上文所述被取代。

在一些情况下，r¹和r²中的至少一个未被取代。

在一些情况下，r¹和r²两者均未被取代。

在一些情况下，r¹和r²中的至少一个如上文所述被取代。

在一些情况下，r¹和r²两者均如上文所述被取代。

r¹和r²的更适合的取代基选自由以下组成的组：卤基、氰基、硝基、偶氮基、重氮基、磷酸基、磷酸酯基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c(o)sr³、c(o)nr³r⁴、叠氮基、c6-14芳基或c4-14杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被选自以下的一个或多个取代基取代：c1-10烷基、c1-10卤代烷基、c2-10烯基、c2-10炔基、卤基、氰基或硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、op(o)or³or⁴、-pr³r⁴，并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-10烷基、c2-10烯基、c2-10炔基。

或者，r¹和r²的适合取代基选自由以下组成的组：卤基、氰基、硝基、nr³r⁴、c(o)or³、or³、sr³、c6-10芳基或杂芳基，其中芳基和杂芳基任选被一个或多个选自以下的取代基取代：c1-4烷基、c1-4卤代烷基、卤基、氰基或硝基；并且其中r³和r⁴中的每一个独立地为h或c1-6烷基。

在又一优选的化合物中，r选自由以下组成的组：正癸基氨基、十八烷基氨基、二己基氨基、二(十八烷基)氨基、3-丁烯基氨基、5-己烯基氨基、辛基-3-烯-1-氨基、十四碳-3-烯-1-氨基、油基氨基、乙基(丙-2-烯-1-基)氨基、双[(2z)-3-氯丁-2-烯-1-基]氨基、甲基[7-(甲基亚氨基)七-1,3,5-三烯-1-基]氨基、丁-3-炔-1-氨基、己-5-炔氨基、辛-3-炔-1-氨基、十二碳-3-炔-1-氨基、3-氟-4-甲基辛-7-炔-1-氨基、[4,4-二甲基-2-(戊-4-炔-1-基)环己基]甲氨基、双(丁-2-炔-1-)基)氨基、(癸-1-炔-4-基)(丙基)胺、n-(2-萘基)-1-萘基氨基、c-(2-对甲苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-甲基氨基、[2,2-双(4-氯苯基)-2-羟基乙基]-(2-氟苄基)氨基、4-十四烷基苯基氨基、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]氨基、h-cys(trt)-nh2、4,10-二苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基、2-(3-氧代-十氢-喹喔啉-2-基)-n-(4-苯氧基-苯基)-乙酰胺、2-[(2-氨基-4-甲基苯基)硫烷基]-n-(2-甲基苯基)乙酰胺、4-硝基苯乙基氨基。

在本说明书中，术语“c1-200烷基”是指具有1到200个碳原子的直链或支链饱和烃基。可形成nr¹r²结构的试剂的示例包括癸胺、十八烷基胺、二己胺、二(十八烷基)胺。

在本说明书中，术语“c6-30烷基”是指具有6到30个碳原子的直链或支链饱和烃基。可形成nr¹r²结构的试剂的示例包括癸胺、十八烷基胺、二己胺、二(十八烷基)胺。

其他烷基，例如c1-4、c1-6和c1-10烷基如上文所定义，不同之处在于它们具有不同数目的碳原子。

术语“c2-200烯基”是具有2到200个原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。烯基可包含超过一个碳-碳双键，例如2个、3个、4个或5个双键。在一些情况下，烯基可含有超过5个双键。

术语“c6-30烯基”是具有6到30个原子和至少一个碳-碳双键的直链或支链烃链。烯基可包含超过一个碳-碳双键，例如2个、3个、4个或5个双键。在一些情况下，烯基可含有超过5个双键。可形成nr¹r²结构的试剂的示例包括5-己烯基胺、辛-3-烯-1-胺、十四碳-3-烯-1-胺、油胺。

其他烯基，例如c2-10烯基如针对c6-30烯基所定义，不同之处在于它们含有不同数目的碳原子。

术语“c2-200炔基”是具有2到200个碳原子和至少一个碳-碳三键的直链或支链烃链。炔基可含有超过一个碳-碳三键，例如两个、三个、四个或五个碳-碳三键。在一些情况下，烯基可含有超过5个三键。在一些情况下，除含有一个或多个碳-碳三键之外，炔基还可含有一个或多个碳-碳双键。

术语“c6-30炔基”是具有6到30个碳原子和至少一个碳-碳三键的直链或支链烃链。炔基可含有超过一个碳-碳三键，例如两个、三个、四个或五个碳-碳三键。在一些情况下，烯基可含有超过5个三键。在一些情况下，除含有一个或多个碳-碳三键之外，炔基还可含有一个或多个碳-碳双键。可形成nr¹r²结构的试剂的示例包括己-5-炔基胺、辛-3-炔-1-胺、十二-3-炔-1-胺、(癸-1-炔-4-基)(丙基)胺。

其他炔基，例如c2-10炔基如针对c6-30炔基所定义，不同之处在于它们含有不同数目的碳原子。

在本说明书的上下文中，术语“c6-10芳基”是指具有6到10个环碳原子并且含有单个环或两个稠环的具有芳族特征的环系。当芳基含有两个稠环时，两个环在特征上不必都是完全芳族的。芳族部分的示例是苯基、萘基、四氢化萘基、茚满基和茚基。

c6-14芳基如上文所定义，但具有6到14个环碳原子。示例包括蒽基和芴基。

在本说明书的上下文中，术语“杂芳基”是指具有4到14个环原子并且含有至多三个环的具有芳族特征的环系，所述环原子中的至少一个是选自例如n、o和s的杂原子。当杂芳基含有超过一个环时，并非所有环都必须在特征上是完全芳族的。杂芳基的示例包括吡啶基、嘧啶基、吲哚基、吡咯基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、噻唑基、苯并呋喃基、苯并咪唑基和吲哚烯基(indolene)。

通过以下方式制备通式(i)化合物

i)将含水赖氨酸甲酯·2hcl与当量的间苯二甲酰氯在丙酮中聚合，随后在dmso中用乙醇氢氧化钠水解，和

ii)r通过二环己基碳化二亚胺/二甲基氨基吡啶(dcc/dmap)偶合缀合到聚合物骨架上，其中r包括nr¹r²并且如上文所定义。

在本发明的又一优选实施方案中，r的所述缀合是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)偶合。

除了通式(i)的链之外，本发明的化合物还包含端基x和y，并且可由式(ia)表示。

其中x是oh或聚合引发剂或终止剂的残基，并且y是h或聚合引发剂或终止剂的残基。在一些情况下，x是oh，并且y是h。

部分x和y的确切性质将取决于所选择的聚合方法以及所用的引发剂和终止剂。适合的方法是本领域技术人员已知的并且描述于例如us2006172418和eccleston等，reactive&functionalpolymers,42,147-161(1999)中。us2006172418的内容在此以引用方式整体并入。

在本发明的优选实施方案中，所述聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)化合物(基于肽/肽类似物的衍生物)与用于细胞内递送到细胞的试剂直接或间接缔合。所述试剂可与所述肽共价或非共价缔合。

在本发明的优选实施方案中，所述共价缔合是通过酰胺偶合、二硫化物连接、腙连接、叠氮化物点击化学或通过使用交联剂(例如琥珀酰亚胺-马来酰亚胺交联剂)实现的。

在一些情况下，聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)化合物上的取代侧链(nr¹r²)可在与骨架聚合物的连接反应之前缀合到试剂(例如，其中涉及羧酸或酰卤，使得在试剂和聚合物骨架之间没有不期望的连接，或导致侧链连接到第二聚合物骨架或成环到同一骨架上的未反应的羧酸基团上的反应)。

在本发明的优选实施方案中，所述非共价缔合是通过静电复合、疏水缔合、氢键合、螯合、客体-主体相互作用或包封实现的。

非共价相互作用包括但不限于离子或静电相互作用，其中试剂上携带+、-、δ+或δ-电荷的的部分与根据本发明的肽上带有电荷的部分相互作用，在疏水药物/药物的疏水组分与聚合物的疏水组分之间的疏水缔合可用于药物加载。结合金属离子的配体(例如金-组氨酸，其中取代的侧链具有掺入的组氨酸样部分)以及范德华缔合(vanderwaals’association)包括在试剂与根据本发明的肽的非共价相互作用中。

非共价相互作用还包括生物“抗体-抗原”相互作用(例如，生物素-抗生蛋白链菌素，其中任一种预缀合到取代的侧链，而另一种缀合到如本文所公开的试剂)并包括在本公开的范围内，与如本文所公开的核酸试剂上的单链互补的单链dna/rna的掺入也是如此。

在本发明的优选实施方案中，所述试剂是治疗剂。

在本发明的优选实施方案中，所述治疗剂是小有机分子。

在本发明的优选实施方案中，所述有机分子是如下文所定义的化学治疗剂。

在本发明的替代优选实施方案中，所述小有机分子是如下文所定义的抗生素。

在本发明的又一替代实施方案中，所述小有机分子是如下文所定义的抗病毒剂。

在本发明的替代优选实施方案中，所述治疗剂是蛋白质的。

在本发明的优选实施方案中，所述蛋白质治疗剂是治疗性抗体或其活性结合片段。

在本发明的优选实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。

在本发明的优选实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。

在本发明的替代优选实施方案中，所述抗体是人源化抗体或人抗体。

在本发明的替代优选实施方案中，所述活性结合片段选自以下的组：fab、fab2、f(ab')2、fv、fc、fd、单链抗体片段。

在本发明的优选实施方案中，所述片段是单链抗体片段。

在本发明的替代优选实施方案中，所述蛋白质试剂是非抗体药物肽或蛋白质。

在本发明的又一替代优选实施方案中，所述治疗剂是核酸。

在本发明的优选实施方案中，所述核酸试剂包括反义rna或反义寡核苷酸。

在本发明的优选实施方案中，所述核酸试剂是小干扰rna[sirna]。

在本发明的优选实施方案中，所述反义寡核苷酸或sirna包括修饰的核苷酸。

在本发明的优选实施方案中，所述核酸试剂是mirna。

在本发明的替代实施方案中，所述核酸试剂是载体，优选表达载体。

在本发明的优选实施方案中，所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、病毒载体或基于病毒的载体。

在本发明的替代实施方案中，所述试剂是成像剂。

在又一优选的实施方案中，所述成像剂是钙黄绿素。

在本发明的优选实施方案中，所述试剂是保存剂，例如糖。

“糖”包括例如单糖、二糖和三糖。

在本发明的优选实施方案中，糖选自由以下组成的组：葡萄糖、蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖醇、乳果糖、乳糖、甘露二糖、异麦芽糖、帕拉金糖醇(palatinit)、山梨糖醇、棉子糖、麦芽三糖α-d-吡喃葡萄糖基-1-6-山梨糖醇、α-d-吡喃葡萄糖基-1-6-甘露醇、麦芽低聚糖和氢化麦芽低聚糖。

在本发明的优选实施方案中，所述保存剂是海藻糖。

保存剂通过将由于储存条件不足所致的氧化损害或细胞膜破坏或由于零下温度下的干燥、冻干或冷冻所致的损害最小化来延长细胞或一组细胞的寿命。保护细胞免受冷冻损害的常规化合物是二醇，例如甘油或dmso。

根据本发明的又一方面，提供了包含根据本发明的肽的组合物。

在本发明的优选实施方案中，所述组合物进一步包含用于细胞内递送到如本文所公开的细胞的试剂。

在本发明的优选实施方案中，所述试剂是治疗剂，并且所述组合物是包含药学上可接受的载体的药物组合物。

当被施用时，本发明的组合物以药学上可接受的制剂被施用。此类制剂可常规地含有药学上可接受浓度的盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体和补充治疗剂[例如抗癌剂]。

本发明的组合物可通过任何常规途径施用，包括口服、直肠、鼻、支气管(吸入)、经上皮、局部(包括真皮、透皮、滴眼剂、颊和舌下)、阴道或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和真皮内)施用，并且可通过药学领域熟知的任何方法制备。

可通过使上文所定义的活性剂与载体缔合来制备所述组合物。通常，通过如下方式制备所述制剂：均匀且紧密地使活性剂与液体载体或微细的固体载体或二者缔合，然后(如有必要)，使产品成形。本发明扩展到用于制备药物组合物的方法，所述方法包括使通式(i)的化合物与药学上或兽医学上可接受的载体或媒介物结合或缔合。

本发明中用于口服施用的制剂可呈现为：各自含有预定量的活性剂的离散单位，例如胶囊、小袋或片剂；作为粉末或颗粒；呈现为活性剂在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或呈现为水包油液体乳液或油包水液体乳液；或呈现为推注(bolus)等。

对于用于口服施用的组合物(例如片剂和胶囊)，术语“可接受的载体”包括媒介物，例如常用赋形剂，例如粘合剂，例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、蔗糖和淀粉；填料和载体，例如玉米淀粉、明胶、乳糖、蔗糖、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、磷酸二钙、氯化钠和海藻酸；以及润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸钠和其他金属硬脂酸盐、硬脂酸甘油酯、硬脂酸、硅酮油、滑石、蜡、油和胶体二氧化硅。还可使用调味剂，例如薄荷、冬青油、樱桃调味剂等。可能期望添加着色剂以使剂型易于鉴别。片剂还可通过本领域众所周知的方法包衣。

片剂可通过压缩或模制，任选地利用一种或多种辅助成分制得。压缩片剂可通过在适合的机器中压缩自由流动形式的活性剂(例如粉末或颗粒)，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合来制备。模制片剂可通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制得。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且可被配制成提供活性剂的缓慢或控制释放。

适于口服施用的其他制剂包括包含于调味基质(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)中的活性剂的锭剂；包含于惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的活性剂的软锭剂(pastille)；和包含于适合的液体载体中的活性剂的漱口剂。

对于局部施加于皮肤，可将通式(i)的化合物制成乳膏、软膏、胶状物、溶液或悬浮液等。可用于药物的乳膏或软膏制剂是本领域众所周知的常规制剂，例如，如药剂学标准教科书例如英国药典(britishpharmacopoeia)中所述。

通式(i)的化合物可用于通过鼻、支气管或颊施用例如气溶胶或喷雾剂来治疗呼吸道，所述气溶胶或喷雾剂可以粉末形式或以溶液或悬浮液滴形式分散药理活性成分。除活性成分之外，具有粉末分散性质的药物组合物通常还含有沸点低于室温的液体推进剂，以及(如果期望)辅助剂，例如液体或固体非离子型或阴离子型表面活性剂和/或稀释剂。其中药理活性成分在溶液中的药物组合物除此之外，还含有适合的推进剂，以及此外(如果需要)另外的溶剂和/或稳定剂。还可使用压缩空气代替推进剂，可能借助于适合的压缩和膨胀装置根据需要产生压缩空气。胃肠外制剂将通常是无菌的。

在本发明的优选实施方案中，所述组合物包含哺乳动物细胞或哺乳动物细胞集合。

在又一优选的实施方案中，所述细胞选自由以下组成的组：红细胞、hela细胞、cho细胞、su-dhl-8细胞、a549细胞、mes-sa细胞、mes-sa/dx5细胞或hmsc细胞，尤其是hela细胞、cho细胞或a549细胞。

在本发明的又一优选实施方案中，所述细胞集合是细胞聚集体、组织或器官，特别是组织或器官。

根据本发明的一个方面，提供了根据本发明的组合物，其用于将至少一种试剂递送到哺乳动物细胞、细胞聚集体、组织或器官，特别是组织或器官。

根据本发明的一个方面，提供了将试剂递送到细胞的体外或离体方法，其包括：

i)使细胞或包含细胞的细胞集集体、组织或器官与有效量的根据本发明的组合物接触；和

ii)培育所述细胞、细胞聚集体、组织或器官，以允许所述细胞或包含细胞的细胞聚集体、组织或器官透化，从而递送所述试剂。

适合地，所述方法包括在步骤(i)中接触细胞或包含细胞的组织或器官，以及在步骤(ii)中培育所述细胞或包含细胞的组织或器官，以允许所述细胞或包含细胞的组织或器官透化，从而递送所述试剂。

在本发明的优选方法中，所述组合物包含一种或多种如本文所公开的试剂。

在一实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。

在又一实施方案中、所述细胞选自由以下组成的组：卵母细胞、精细胞、红细胞、白细胞、干细胞和免疫细胞，尤其是卵母细胞、精细胞、红细胞、白细胞和干细胞。

在优选的方法中，在ph5.0到ph8.0下；优选在ph6.0-7.1下进行所述步骤i)。

在又一优选的方法中，在ph5.0到6.0下，甚至更优选在ph5.5下进行所述步骤i)。

根据本发明的又一方面，提供了治疗哺乳动物受试者的方法，其包括施用包含有效量的如本文所公开的试剂的根据本发明的组合物。

在本发明的优选方法中，所述哺乳动物受试者正罹患癌症。

根据本发明的又一方面，提供了根据本发明的组合物在治疗癌症中的用途。

根据本发明的又一方面，提供了包含根据本发明的组合物和用于治疗癌症的抗癌剂的组合制剂，其中所述组合物和所述抗癌剂可同时、依序或分开施用。

当同时施用时，组合物和抗癌剂可以单一组合物或以分开的组合物通过不同途径施用。

本发明还提供了本发明的组合物和抗癌剂在制备用于治疗癌症的试剂中的用途。

如本文所用的术语“癌症”是指具有自主生长能力，即以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或状况的细胞。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭性阶段无关。术语“癌症”包括各种器官系统的恶性肿瘤，例如影响例如肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及腺癌，包括诸如以下的恶性肿瘤：大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌。术语“癌”是本领域公认的并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌和黑素瘤。示例性癌包括由子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈、结肠和卵巢组织形成的那些。术语“癌”还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性组织和肉瘤样组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指来源于腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。术语“肉瘤”是本领域公认的并且是指间充质来源的恶性肿瘤。

根据本发明的又一方面，提供了用于保存哺乳动物细胞、细胞聚集体、组织或器官的体外或离体方法，其包括以下步骤：

i)提供包含哺乳动物细胞制剂、哺乳动物细胞聚集体、组织或器官和根据本发明的组合物的制剂；

ii)培育所述制剂以使所述哺乳动物细胞、细胞聚集体、组织或器官的哺乳动物细胞膜透化；和

iii)使所述透化的细胞、细胞聚集体、组织或器官与一种或多种保存剂接触。

适合地，所述方法用于保存哺乳动物细胞、组织或器官，并且在步骤(i)中，制剂包含哺乳动物细胞制剂或哺乳动物组织或器官和根据本发明的组合物；步骤(ii)包括培育所述制剂以使哺乳动物细胞、组织或器官的哺乳动物细胞膜透化；并且步骤(iii)包括使透化的细胞、组织或器官与一种或多种保存剂接触。

在本发明的优选方法中，所述保存剂是糖，例如海藻糖、蔗糖或麦芽糖。优选地，所述保存剂是海藻糖。

在优选的方法中，所述保存剂以至少0.001m、优选0.001m到1m且甚至更优选0.05-0.7m的浓度存在。

在又一优选的方法中，所述试剂以至少0.1m、适合地0.1到0.7m的浓度存在。

在优选的方法中，所述式(i)化合物以至少1μg/ml、优选10-5000μg/ml的浓度存在。

在又一优选的方法中，所述式(i)化合物以50-1000μg/ml且优选400μg/ml的浓度存在。

在替代方法中，所述式(i)化合物以5-10000μg/ml、甚至更优选100-500μg/ml的浓度存在。

在又一替代方法中，所述式(i)化合物以选自由以下组成的组的浓度存在：5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml、5000μg/ml或10000μg/ml。

在又一替代方法中，所述式(i)化合物以500μg/ml的浓度存在。

在优选的方法中，将所述细胞与所述试剂在ph5.0到ph8.0下培育。

在又一优选的方法中，将所述细胞与所述试剂在ph6.0-7.1下培育。

在优选的方法中，将所述细胞与所述试剂培育至少1min；优选1min到24h，且甚至更优选5min到9h，且甚至更优选5-60min。

在优选的方法中，将所述细胞与所述试剂培育5min。

在又一优选的方法中，将所述细胞与所述试剂培育10min。

在优选的方法中，将所述细胞在25-37摄氏度之间培育。

在又一优选的方法中，将所述细胞在37摄氏度下培育。

在又一优选的方法中，所述细胞含有至少50mm、优选100-500mm、150-300mm且甚至更优选200-225mm的海藻糖。

定义

小有机分子

“化学治疗剂”的一般定义是通常为小化学化合物的药剂，其优选杀死细胞、特别是患病细胞或至少是抑制细胞的。药剂可根据它们的结构或作用模式来划分。例如，化学治疗剂包括烷基化剂、抗代谢物、蒽环类、生物碱、植物萜类化合物和拓扑异构酶抑制剂。化学治疗剂通常对细胞分裂或dna合成产生其影响。烷基化剂的示例是顺铂、卡铂或奥沙利铂(oxaliplatin)。抗代谢物的示例包括嘌呤或嘧啶类似物。嘌呤类似物是本领域已知的。例如，硫鸟嘌呤用于治疗急性白血病。氟达拉滨(fludarabine)抑制dna聚合酶、dna引物酶和dna连接酶的功能，并且特异于细胞周期s期。喷司他丁(pentostatin)和克拉屈滨(cladribine)是腺苷类似物，且对毛细胞白血病有效。又一示例是巯基嘌呤，它是腺嘌呤类似物。嘧啶类似物同样是本领域已知的。例如，5-氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷和阿糖胞苷(cytosinearabinoside)。5-fu已被用于治疗乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌和其他癌症多年。5-fu还可由前药卡培他滨(capecitabine)形成，所述前药在肿瘤中转化为5-fu。甲酰四氢叶酸，也被称为亚叶酸，在癌症化学疗法中作为佐剂施用，并且增强5-fu对胸苷酸合酶的抑制作用。烷基化剂也是本领域已知的，且包括长春花生物碱，例如长春新碱或长春碱。萜类化合物已被使用多年，且包括紫杉烷类，例如紫杉醇。

抗生素和抗病毒剂可有效治疗微生物，例如细菌和寄生虫病原体以及病原性病毒。根据本发明的递送媒介物特别适合于治疗细胞内微生物病原体。例如，分枝杆菌属(mycobacterium)、布鲁氏菌属(brucella)、弗朗西斯氏菌属(francisella)、军团杆菌属(legionella)和李斯特菌属(listeria)的种可以细胞内形式存在。其他细菌种或者是细胞内的，或者是专性细胞内种，例如衣原体属(chlamydia)、立克次氏体属(rickettsia)、沙门氏菌属(salmonella)和耶尔森氏菌属(yersinia)的种。病毒当然是专性的细胞内寄生虫。寄生微生物细胞内病原体包括疟原虫属(plasmodia)、弓形虫属(toxoplasma)、利什曼原虫属(leishmania)和锥虫属种克氏锥虫(trypanosomacruzi)。可有效控制细菌病原体的抗生素类别的示例包括(仅举例来说)青霉素、头孢菌素、利福霉素(rifamycin)、磺酰胺(sulphonomide)、大环内酯和四环素。在本发明的范围内还包括抗细菌肽，例如皮西丁蛋白(dermicidin)、天蚕素(cecropin)和防御素。抗病毒剂包括抗逆转录病毒药物，例如齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、依法韦仑(efavrenz)和阿巴卡韦(abacavir)；以及抗病毒药物，例如更昔洛韦(ganciclovir)、阿昔洛韦(aciclovir)和奥司他韦(oseltamivir)。抗原生动物剂包括用于治疗疟疾的苯芴醇(lumefantrine)、甲氟喹(mefloquine)、阿莫地喹(amodiaquine)、磺胺多辛(sulfadoxine)、氯喹以及将这些药剂与青蒿素组合使用的组合疗法。这些是可与根据本发明的递送媒介物一起使用的试剂的非限制性示例。

抗体

抗体包括根据常规方法制备的多克隆抗体和单克隆抗体。

嵌合抗体是小鼠或大鼠抗体的所有v区与人抗体c区组合的重组抗体。人源化抗体是将来自啮齿动物抗体v区的互补决定区与来自人抗体v区的框架区融合的重组杂合抗体。还使用来自人抗体的c区。互补决定区(cdr)是抗体的重链和轻链两者的n-末端结构域内的区域，其中v区的大部分变异受到限制。这些区域在抗体分子的表面形成环。这些环提供抗体和抗原之间的结合表面。

来自非人动物的抗体引发对外来抗体的免疫应答并将其从循环中去除。当注射到人受试者中时，嵌合抗体和人源化抗体两者都具有降低的抗原性，因为重组杂合抗体内的啮齿动物(即外来)抗体的量减少，而人抗体区不诱发免疫应答。这导致较弱的免疫应答和抗体清除率的降低。当在人疾病的治疗中使用治疗性抗体时，这显然是期望的。人源化抗体被设计成比嵌合抗体具有更少的“外来”抗体区域，因此被认为免疫原性更低。

各种抗体片段是本领域已知的。fab片段是由共价偶合在一起的免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的免疫活性部分组成的多聚体蛋白质，并且能够特异性结合到抗原。通过完整免疫球蛋白分子的蛋白水解切割(用例如木瓜蛋白酶)产生fab片段。fab2片段包含两个接合的fab片段。当这两个片段通过免疫球蛋白铰链区接合时，产生f(ab')2片段。fv片段是由共价偶合在一起的免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区的免疫活性部分组成的多聚体蛋白质，并且能够特异性结合到抗原。片段还可以是仅含有一个轻链可变区的单链多肽，或其含有轻链可变区的三个cdr而无缔合的重链可变区的片段，或其含有重链可变区的三个cdr而无缔合的轻链部分的片段；和由抗体片段形成的多特异性抗体，这已例如描述于美国专利号6,248,516中。通常通过在相关鉴别区域的宿主细胞系中表达来产生fv片段或单区(结构域)片段。这些和其他免疫球蛋白或抗体片段在本发明的范围内，并且描述于例如paul的基础免疫学(fundamentalimmunology)或janeway等的免疫生物学(immunobiology)(上文引用)的标准免疫学教科书中。分子生物学现在允许这些片段的直接合成(通过在细胞中的表达或以化学方式)，以及其组合的合成。抗体或免疫球蛋白的片段也可具有如上文所述的双特异性功能。

抑制性rna

被广泛接受的特异性消除基因功能的技术是通过将双链rna(也被称为小抑制或干扰rna(sirna))引入细胞中，导致与包含在sirna分子中的序列互补的mrna的破坏。sirna分子包含彼此退火以形成双链rna分子的两条互补rna链(有义链和反义链)。sirna分子通常来源于待消融的基因的外显子。许多生物体通过激活导致sirna形成的级联来响应双链rna的存在。双链rna的存在激活包含rnaseiii的蛋白质复合体，所述rnaseiii将双链rna加工成成为核糖核蛋白复合体的一部分的较小片段(sirna，长度大约21-29个核苷酸)。sirna用作rnase复合体的向导，以切割与sirna的反义链互补的mrna，从而导致mrna的破坏。

修饰的核酸分子

如本文所用的术语″修饰的″描述一种核酸分子，其中：

i)其核苷酸中的至少两个通过合成核苷间连接(即，一个核苷酸的5'端和另一核苷酸的3'端之间的磷酸二酯连接以外的键连接)共价连接。或者或优选地，所述连接可以是一个核苷酸的连接到另一核苷酸的5'端的5'端，或一个核苷酸与另一核苷酸的3'端连接的3'端；和/或

ii)通常不与核酸缔合的化学基团(例如胆固醇)已共价连接到双链核酸。

iii)优选的合成核苷间连接是硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、磷酸三酯、乙酰胺酸酯(acetamidate)、肽和羧甲基酯。

术语“修饰的”还涵盖具有共价修饰的碱基和/或糖的核苷酸。例如，修饰的核苷酸包括具有共价连接到3'位除羟基以外以及5'位除磷酸基团以外的低分子量有机基团的糖的核苷酸。因此，修饰的核苷酸还可包含2'取代的糖，例如2'-o-甲基-；2-o-烷基；2-o-烯丙基；2'-s-烷基；2'-s-烯丙基；2'-氟-；2'-卤基或2；叠氮基-核糖、碳环糖类似物a-异头糖；差向异构糖，例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖和景天庚酮糖。

修饰的核苷酸是本领域已知的，且包含(以举例而非以限制的方式)烷基化的嘌呤和/或嘧啶；酰化嘌呤和/或嘧啶；或其他杂环。这些类别的嘧啶和嘌呤是本领域已知的，且包括假异胞嘧啶；n4,n4-桥亚乙基胞嘧啶(ethanocytosine)；8-羟基-n6-甲基腺嘌呤；4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶；5-氟尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-羧基甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；5羧甲基氨基甲基尿嘧啶；二氢尿嘧啶；肌苷；n6-异戊基-腺嘌呤；1-甲基腺嘌呤；1-甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；2,2-二甲基鸟嘌呤；2-甲基腺嘌呤；2-甲基鸟嘌呤；3-甲基胞嘧啶；5-甲基胞嘧啶；n6-甲基腺嘌呤；7-甲基鸟嘌呤；5-甲基氨基甲基尿嘧啶；5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶；β-d-甘露糖基q核苷(mannosylqueosine)；5-甲氧基羰基甲基尿嘧啶；5-甲氧基尿嘧啶；2甲硫基-n6-异戊烯基腺嘌呤；尿嘧啶-5-羟乙酸甲基酯；假尿嘧啶(psueouracil)；2-硫胞嘧啶；5-甲基-2硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶；4-硫尿嘧啶；5-甲基尿嘧啶；n-尿嘧啶-5-羟乙酸甲酯；尿嘧啶5-羟乙酸；q核苷；2-硫胞嘧啶；5-丙基尿嘧啶；5-丙基胞嘧啶；5-乙基尿嘧啶；5-乙基胞嘧啶；5-丁基尿嘧啶；5-戊基尿嘧啶；5-戊基胞嘧啶；和2,6,-二氨基嘌呤；甲基假尿嘧啶；1-甲基鸟嘌呤；1-甲基胞嘧啶。修饰的双链核酸还可包含碱基类似物，例如c-5丙炔修饰的碱基(参见wagner等，naturebiotechnology14∶840-844,1996)。

如本文所用的术语“反义寡核苷酸”或“反义”描述寡核苷酸，其是寡核糖核苷酸、寡脱氧核糖核苷酸、修饰的寡核糖核苷酸或修饰的寡脱氧核糖核苷酸，其在生理条件下与包含特定基因的dna或该基因的mrna转录物杂交，从而抑制该基因的转录和/或该mrna的翻译。反义分子被设计成在与靶基因杂交时干扰靶基因的转录或翻译。本领域技术人员将认识到反义寡核苷酸的确切长度和其与其靶标的互补程度将取决于所选择的特定靶标，包括靶标的序列和包含该序列的特定碱基。

优选构建和排列反义寡核苷酸，以便在生理条件下选择性地与靶标结合，即在生理条件下与靶序列的杂交显著多于与靶细胞中任何其他序列的杂交。为了对于抑制具有足够选择和有效性，此类反义寡核苷酸应包含至少7个(wagner等，naturebiotechnology14∶840-844,1996)且更优选至少15个与靶标互补的连续碱基。最优选地，反义寡核苷酸包含20-30个碱基的互补序列。

载体

使用病毒或“病毒载体”作为治疗剂是本领域众所周知的。另外，许多病毒通常用作用于递送外源基因的载体。常用的载体包括重组修饰的有包膜或无包膜的dna和rna病毒，其优选选自杆状病毒科(baculoviridiae)、细小病毒科(parvoviridiae)、picornoviridiae、疱疹病毒科(herpesveridiae)、痘病毒科(poxviridae)、腺病毒科(adenoviridiae)或picornnaviridiae。还可采用利用具有每种母体载体性质的有利元件的嵌合载体(参见例如feng，等(1997)naturebiotechnology15∶866-870)。此类病毒载体可以是野生型或可通过重组dna技术修饰为复制缺陷型、条件复制型或可复制型。

优选的载体来源于腺病毒基因组、腺相关病毒基因组和逆转录病毒基因组。在本发明最优选的实践中，载体来源于人腺病毒基因组。特别优选的载体来源于人腺病毒血清型2或5。通过e1a和/或e1b编码区中的修饰或缺失，可减弱此类载体的复制能力(到被认为是“复制缺陷”的程度)。优选对病毒基因组进行其他修饰以实现特定的表达特征或允许重复施用或降低免疫应答。

或者，病毒载体可以是条件复制型或可复制型。条件复制型病毒载体被用于在特定细胞类型中实现选择性表达，同时避免不利的广谱感染。条件复制型载体的示例描述于pennisi,e.(1996)science274∶342-343；russell和s.j.(1994)eur.j.ofcancer30a(8)∶1165-1171中。选择性复制载体的另外示例包括病毒复制所必需的基因受启动子控制的那些载体，所述启动子仅在特定细胞类型或细胞状态下有活性，使得在没有这种基因表达的情况下，病毒将不复制。此类载体的示例描述于henderson等的us5,698,443；henderson等的us5,871,726中，所述专利的全部教导以引用方式并入本文。已证实减弱复制的病毒也可用于基因疗法中。例如，在e1b55k基因中含有特异性缺失的腺病毒dl1520(barker和berk(1987)virology156∶107)已被用于人类中且有治疗效果。此类载体还描述于mccormickus5,677,178和us5,846,945中。

某些载体展现出对某些组织类型的天然向性。例如，已显示来源于疱疹病毒属(herpesviridiae)的载体对神经元细胞具有优先感染。重组修饰的疱疹病毒属载体的示例公开于us5,328,688中。也可在来源于具有特征性广泛感染的病毒的载体中通过病毒包膜蛋白质的修饰而实现细胞类型特异性或细胞类型靶向。例如，已利用腺病毒载体，通过对病毒基因组结节(knob)和纤维编码序列的选择性修饰而实现与独特细胞表面受体具有特异性相互作用的修饰的结节和纤维结构域的表达，实现细胞靶向。已通过抗体或抗体片段与包膜蛋白质的缀合实现了其他细胞特异性靶向方法(参见例如michael，等(1993)j.biol.chem268∶6866-6869；watkins等(1997)genetherapy4∶1004-1012；douglas等(1996)naturebiotechnology14∶1574-1578)。或者，可将特定部分缀合到病毒表面以实现靶向(参见例如nilson等(1996)genetherapy3∶280-286(egf缀合到逆转录病毒蛋白质)。

成像剂

“成像剂”是能够例如通过分光光度法、流式细胞术或显微镜检查检测的试剂。例如，标记可附着到递送媒介物上，从而允许在体内检测递送媒介物。成像剂的示例包括但不限于放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光剂、荧光团、半抗原、酶和其组合。用于标记的方法和选择适于各种目的的标记的指南论述于例如sambrook等(分子克隆：实验室手册(molecularcloning:alaboratorymanual)，coldspringharbor,newyork,1989)和ausubel等(分子生物学的现行方案(currentprotocolsinmolecularbiology)，johnwiley&sons,newyork,1998)中。

细胞、组织、器官

本发明涉及包含哺乳动物细胞的各种哺乳动物细胞类型、细胞聚集体、组织和哺乳动物器官，尤其是包含哺乳动物细胞的各种哺乳动物细胞类型、组织和哺乳动物器官的体外或体内处理。

例如包含诸如以下的细胞的哺乳动物细胞、细胞聚集体、组织或器官(尤其是哺乳动物细胞、组织或器官)：神经细胞、肌细胞(横纹、平滑、心)；肝细胞、肾细胞、血细胞(例如外周血单核细胞、红细胞、cd4+淋巴细胞、cd8+淋巴细胞、树突细胞、t调节细胞、先天淋巴细胞、自然杀伤细胞)、胰腺β细胞、上皮细胞、内皮细胞、精母细胞和卵母细胞、真皮成纤维细胞、胎儿成纤维细胞、角膜成纤维细胞、肠粘膜成纤维细胞、口腔粘膜成纤维细胞、口腔粘膜角质形成细胞和尿道成纤维细胞。

除了分化的细胞、细胞聚集体、组织和器官(尤其是分化的细胞、组织和器官)之外，本发明还预期干细胞和谱系限制性干细胞。术语“干细胞”代表具有自我更新能力、同时保留形成分化细胞和组织的不同潜力的一组通用未分化细胞。干细胞可以是多能或多潜能的。多能干细胞是能够形成在完整生物体中发现的所有组织的细胞，尽管多能干细胞不能形成完整的生物体。此外，已知人体细胞可重新编程为类似于胚胎干细胞的未分化状态。例如，wo2007/069666描述了无需使用胚胎干细胞对分化细胞(例如小鼠成纤维细胞)的重编程。通过将逆转录病毒载体转染到编码核重编程因子(例如oct家族转录因子、sox家族转录因子、klf家族转录因子和myc家族转录因子)的体细胞中来实现核重编程。体细胞去分化并表达人胚胎干细胞的标志物以产生“诱导性多能细胞”[ips]。在takahashi等[cell第131卷，第861-872页，2007]中，具有四种转录因子(oct3/4、sox2、klf4和c-myc)的成人真皮成纤维细胞在形态、增殖、表面抗原、基因表达、多能细胞特异性基因的表观遗传状态和端粒酶活性方面去分化为人es细胞。

多潜能细胞具有形成分化细胞和组织的有限能力。通常，成体干细胞是多潜能干细胞，并且是具有形成一些细胞或组织并补充衰老或受损细胞/组织的能力的前体干细胞或谱系限制性干细胞。通常它们不能形成生物体中发现的所有组织，尽管一些报道已声称此类“成体”干细胞的潜力比最初所认为的要大。多潜能干细胞的示例包括间充质干细胞。间充质干细胞分化成多种细胞类型，其包括成骨细胞、软骨细胞、肌细胞、脂肪细胞和神经元。通常，从骨髓获得间充质干细胞。目前，干细胞疗法正在探索不同来源的多能和多潜能干细胞以及细胞培养条件，以将干细胞有效地分化成适合用于组织修复中的细胞和组织。

干细胞，例如造血干细胞、神经干细胞、骨干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞、滋养层干细胞、上皮干细胞(来源于器官，例如皮肤、胃肠粘膜、肾、膀胱、乳腺、子宫、前列腺和内分泌腺，例如垂体)、内胚层干细胞(来源于器官，例如肝脏、胰腺、肺和血管)；胚胎干(es)细胞；胚胎生殖(eg)细胞。

疏水链与两亲性肽或肽类似物的缀合

疏水侧链可通过dcc/dmap偶合或通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)偶合连接到两亲性聚合物骨架。包含cooh的疏水链可通过交联剂n-boc-尸胺(sigma)(advancedfunctionalmaterials2013,23,565-574)和dcc/dmap偶合缀合到plp上。类似地，含硫醇的疏水链(或试剂)可通过可切割的二硫键交联剂(例如吡啶基二硫醇-和-酰肼交联剂)(thermofisherscientific)缀合到聚碳酸酯上。吡啶基二硫醇-和酰肼交联剂(例如pdph(3-(2-吡啶基二硫代)丙酰基肼))的胺基可通过dcc/dmap偶合与cooh偶合，并且通过pdph，可将含硫醇的疏水链(或试剂)缀合到聚合物上。而且，可通过点击化学，使用交联剂(例如胺-peg-叠氮化物(sigma))将含炔的疏水链(或试剂)或用炔基官能化的那些缀合到聚碳酸酯上。胺-peg-叠氮化物的胺基可通过dcc/dmap偶合与cooh偶合，并且通过点击化学，可将疏水链(或试剂)缀合到聚合物上。或者，聚合物可通过含胺的炔官能化，并且疏水链(或试剂)可用叠氮化物官能化。含胺的疏水链(或试剂)可通过本专利的材料和方法中所述的酰胺偶合化学直接缀合到聚碳酸酯上。可根据harris等描述的用于改性聚氧化乙烯的方法(journalofpolymerscience：polymerchemistryedition1984,22,341-352)合成伯胺封端的普流尼克衍生物。

在本说明书的说明和权利要求书通篇中，词语“包括(comprise)”和“含有”以及这些词的其他变化形式(例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”)意指“包括但不限于”并且不意在(且并不)排除其他部分、添加剂、组分、组成或步骤。“基本上由......组成”意指具有基本组成，但包括不实质影响基本组成的功能的组成。

在本说明书的说明和权利要求书通篇中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应被理解为涵盖复数以及单数。

结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特点、整数、特征、化合物、化学部分或基团应被理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。

现在将仅通过示例并参考以下附图来描述本发明的实施方案：

图1：(a)在室温下在d6-dmso中用酸形式的nda接枝的plp的1h-nmr谱。(b)用酸形式的nda接枝的plp的ftir谱。除了nda(c10)之外，包括hda(c7)、tda(c14)和oda(c18)在内的其他侧链也已缀合到假肽骨架。

图2：(a)plp(■)、plp-nda3％(●)、plp-nda10％(▲)和plp-nda18％(▼)以1.0mgml^-1于100mm缓冲液中的水溶液的ph依赖性透射率。(b)溶解于0.5mgml^-1的plp(■)、plp-nda3％(●)、plp-nda10％(▲)、plp-nda18％(▼)的水溶液中的芘的激发谱中i338/i333的ph依赖性变化。(c)在ph7.4下溶解于plp(■)、plp-nda3％(●)、plp-nda10％(▲)、plp-nda18％(▼)的水溶液中的芘的激发谱中i338/i333的浓度依赖性变化；

图3：浓度为0.5mgml^-1的(a)plp和(b)plp-nda18％在ph7.4(实线)和ph5.5(虚线)下的粒径分布；

图4：plp和其衍生物存在下红细胞的相对溶血。(a)与0.5mgml^-1的plp(■)、plp-nda3％(●)、plp-nda10％(▲)、plp-nda18％(▼)培育1h的rbc的ph依赖性溶血。(b)在ph7.4(空心柱)和ph5.5(实心柱)下与plp-nda18％培育的rbc的浓度依赖性溶血。(c)在ph5.5下与0.5mgml^-1的plp(■)、plp-nda3％(●)、plp-nda10％(▲)、plp-nda18％(▼)培育的rbc的时间依赖性溶血；

图5：体外细胞毒性。(a)与不同浓度的pl-nda18％培育4h(空白)、12h(灰色)、24h(黑色)和48h(条形)的hela细胞、(b)cho细胞和(c)a549细胞的存活力。(d)在0.5mgml^-1的聚合物浓度下达24h的plp(空白)和plp-nda18％(灰色)针对hela细胞、cho细胞和a549细胞的体外细胞毒性；

图6：显示钙黄绿素荧光的亚细胞分布的(a)hela细胞、(b)cho细胞和(c)a549细胞的共焦显微镜检查图像。分别用单独的2.0mgml^-1钙黄绿素、2.0mgml^-1钙黄绿素和0.5mgml^-1plp两者或2.0mgml^-1钙黄绿素和0.5mgml^-1plp-nda18％两者处理细胞。在1h摄取后获取hela和cho细胞的图像，并进一步培育3h。对于a549细胞，摄取2h且进一步培育2h。比例尺：10μm；

图7：plp-nda18％介导的具有不同分子量的fitc-葡聚糖向hela细胞中的递送。(a)在ph6.5下与0.5mgml^-1plp-nda18％和fitc-葡聚糖培育30min的hela细胞。(b)在ph6.5下与仅fitc-葡聚糖培育30min的hela细胞。(c)在ph7.4下与0.5mgml^-1plp-nda18％和fitc-葡聚糖培育30min的hela细胞。比例尺：20μm；

图8：聚合物浓度依赖性细胞内递送。将hela细胞在ph6.5下与各种浓度的18％plp-nda和200μmfitc-葡聚糖(4kda)培育30min。比例尺：20μm。

图9：通过流式细胞术分析的聚合物介导的递送的(a)共焦显微镜检查图像和(b)相对平均荧光强度(mfi)。在0.5mgml^-1含有具有不同长度的烷基链的梳状聚合物不存在(对照)或存在下，将hela细胞与200μmfitc-葡聚糖(4kda)在ph6.5下培育30min。比例尺：20μm。平均值±s.d.(n＝3)。

图10.ph依赖性聚合物介导的细胞内递送的共焦显微镱检查图像。将hela细胞与0.5mgml^-1plp-nda18％和200μmfitc-葡聚糖(4kda)在各种细胞外ph下共培育30min。比例尺：20μm。

图11.通过流式细胞术分析的聚合物介导的200μmfitc-葡聚糖(4kda)在不同细胞外ph下递送的(a)相对mfi和(b)代表性直方图。在0.5mgml^-1的plp-nda18％不存在(空心柱)或存在(实心柱)下，将hela细胞在不同的细胞外ph下培育30min。平均值±s.d.(n＝3)。

图12.时间依赖性聚合物介导的细胞内递送的共焦显微镜检查图像。将hela细胞与0.5mgml^-1plp-nda18％和200μmfitc-葡聚糖(4kda)在ph6.5下共培育不同的时间段。比例尺：20μm。

图13.通过流式细胞术分析的时间依赖性聚合物介导的细胞内递送的相对mfi。在0.5mgml^-1plp-nda18％不存在(空心柱)或存在(实心柱)下，将hela细胞与200μmfitc-葡聚糖(4kda)在ph6.5下培育不同的时间段。平均值±s.d.(n＝3)。

图14.聚合物介导的fitc-葡聚糖(4kda)向不同细胞类型中的递送的共焦显微镜检查图像。在ph6.5下用0.5mgml^-1plp-nda18％和200μmfitc-葡聚糖共处理所有细胞。hela细胞、cho细胞和su-dhl-8细胞的处理时间为30min，a549细胞的处理时间为180min，且mes-sa、mes-sa/dx5和hmsc的处理时间为60min。比例尺：20μm。

图15.显示聚合物介导的fitc-葡聚糖向不同细胞类型的递送的(a)相对mfi和(b)代表性直方图。在ph6.5下用0.5mgml^-1plp-nda18％和200μmfitc-葡聚糖(4kda)处理所有细胞。hela细胞、cho细胞和su-dhl-8细胞的处理时间为30min，a549细胞的处理时间为180min，且mes-sa细胞、mes-sa/dx5细胞和hmsc细胞的处理时间为50min。平均值±s.d.(n＝3)。

图16.(a)聚合物浓度依赖性体外细胞毒性。在ph6.5(实心柱)和ph7.4(空心柱)下用不同浓度的plp-nda18％将hela细胞处理1h。(b)时间依赖性体外细胞毒性。在ph6.5(实心柱)和ph7.4(空心柱)下用0.5mgml^-1的plp-nda18％将hela细胞处理不同时间段。(c)plp-nda18％对多种细胞系的体外细胞毒性。在ph6.5(实心柱)和ph7.4(空心柱)下用0.5mgml^-1的plp-nda18％将hela、a549、cho、mes-sa、mes-sa/dx5和hmsc细胞处理3h。平均值±s.d.(n＝3)。

图17：在0.36m海藻糖溶液中且在添加不同浓度的plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的海藻糖加载。[plp-nda18％]＝300、450、600和800μgml^-1；培育时间＝15min、30min和1h；温度＝37℃且ph＝7.05。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差。

图18：在0.36m海藻糖溶液中且在添加不同浓度的plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的溶血。[plp-nda18％]＝300、450、600和800μgml^-1；培育时间＝15min、30min和1h；温度＝37℃且ph＝7.05。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图19：在0.36m海藻糖溶液中且在添加不同浓度的plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的海藻糖加载。[plp-nda18％]＝600、800、1200μgml^-1；培育时间＝15min；温度＝37℃且ph＝7.05、6.8、6.5、6.1、5.6。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图20：在0.36m海藻糖溶液中且在添加不同浓度的plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的溶血。[plp-nda18％]＝600、800、1200μgml^-1；培育时间＝15min；温度＝37℃且ph＝7.05、6.8、6.5、6.1、5.6。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图21：在0.36m的海藻糖溶液中且添加800μgml^-1plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的时间依赖性海藻糖加载和溶血。温度＝37℃且ph＝6.1。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图22：在0.36m的海藻糖溶液中且添加800μgml^-1plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的温度依赖性海藻糖加载和溶血。培育时间＝15min且ph＝6.1。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图23：细胞外海藻糖浓度对在海藻糖溶液中且添加800μgml^-1plp-nda18％的情况下红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)的海藻糖加载和溶血的影响。培育时间＝1h，温度＝37℃且ph＝6.1。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图24：疏水侧链的长度对海藻糖加载的影响。在含有800μgml^-1plp-had(7碳链)、plp-nda(10碳链)、plp-tda(14碳链)和plp-oda(18碳链)的0.36m海藻糖溶液中处理红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)。培育时间＝15min；温度＝37℃且ph＝6.1。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图25：疏水侧链的长度对溶血的影响。在含有800μgml^-1plp-had(c7链)、plp-nda(c10链)、plp-tda(c14链)和plp-oda(c18链)的0.36m海藻糖溶液中处理红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)。培育时间＝15min；温度＝37℃且ph＝6.1。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图26：用疏水侧链nda接枝的程度对海藻糖加载和溶血的影响。在含有800gml^-1接枝度为3％、10％和18％的plp-nda的0.36m海藻糖溶液中处理红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)。培育时间＝15min；温度＝37℃且ph＝6.1。通过蒽酮法计算细胞内海藻糖浓度。收集上清液，并通过uv-vis分光光度法在541nm下测量吸光度。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差；

图27：聚合物介导的向红细胞中的递送的共焦显微镜检查图像。在温度＝37℃下在800μgml^-1pp50(用l-苯丙氨酸接枝的plp)或plp-nda18％不存在或存在下，将红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)与0.36m海藻糖和0.1mm钙黄绿素在不同ph下共培育15min。比例尺：2μm。

图28：聚合物介导的向红细胞中的递送的流式细胞术分析。在温度＝37℃下在800μgml^-1pp50或plp-nda18％不存在或存在下，将红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)与0.36m海藻糖和0.1mm钙黄绿素在不同ph下培育15min。平均值±s.d.(n＝3)。

图29：显示海藻糖加载后膜完整性的共焦显微镜检查图像。(a)与ph6.1的pbs缓冲液中的0.36m海藻糖培育15min、用ph7.4缓冲液洗涤两次并在ph7.4下与1μm钙黄绿素培育的红细胞。(b)用ph6.1的pbs缓冲液中的800μgml^-1plp-nda18％和0.36m海藻糖处理15min、用ph7.4缓冲液洗涤并在ph7.4下与1μm钙黄绿素培育的红细胞。比例尺：4μm。

图30：用不同聚合物处理的红细胞膜表面的形貌afm显微照片。在37℃下在800μgml^-1pp50或plp-nda18％不存在或存在下，将红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)与0.36m海藻糖溶液在ph6.1下培育15min。将细胞固定在聚赖氨酸涂覆的显微镜载玻片上，在戊二醛(1％)中交联，用去离子水洗涤三次，然后空气干燥。使用asylummfp-3d显微镜以轻敲模式进行afm。使用纳米传感器ppp-nchr尖端(谐振频率＝大约320khz，标称尖端半径7nm，标称弹簧常数42nm-1)并将其调谐到1-2v的目标轻敲幅值。

图31：红细胞的冷冻存活率(％)。将红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)悬浮于306mosmpbs缓冲液(■)、ph7.05的0.36m细胞外海藻糖溶液(●)和含有800μgml^-1plp-nda18％的ph＝6.10的0.36m细胞外海藻糖溶液(▲)中。培育时间＝15min且温度＝37℃。在海藻糖加载后，将红细胞转移到2ml的冷冻小管中，之后浸入液氮(-196℃)中并保持一段时间。然后将红细胞在37℃水浴中解冻15min。数据来源于三次重复。误差棒表示标准偏差。

表1plp和其衍生物的沉淀开始时的ph值(php)、疏水缔合(phh)、用于缔合的ph范围和临界缔合浓度(cac)。

表2.在ph7.4下plp和其衍生物在0.5mgml^-1浓度下的平均流体动力学直径。

表3.在ph7.4下具有各种浓度的plp-nda18％的平均流体动力学直径。

表5.用不同聚合物处理的红细胞的粗糙度平均值(ra)或均方根粗糙度(rms)。在37℃下在800μgml^-1pp50或plp-nda18％不存在或存在下，将红细胞(压积为15％，3.5×10⁹个细胞/ml)与0.36m海藻糖溶液在ph6.1下培育15min。将细胞固定在聚赖氨酸涂覆的显微镜载玻片上，在戊二醛(1％)中交联，用去离子水洗涤三次，然后空气干燥，之后进行afm测量。

材料和方法

癸胺(nda)、庚胺(hda)、十四烷基胺(tda)、十八烷基胺(oda)、间苯二甲酰氯、异硫氰酸荧光素-葡聚糖(fitc-葡聚糖，平均mw为4k、10k、70k、150k和2000k)、达尔伯克改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium)(dmem)、胎牛血清(fbs)、mem非必需氨基酸溶液、达尔伯克磷酸盐缓冲盐水(dulbecco’sphosphatebufferedsaline)(d-pbs)、青霉素和蒽酮购自sigmaaldrich(dorset,uk)。从fisherscientific(loughborough,uk)获得二甲亚砜(dmso)、芘、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、4-二甲基氨基吡啶(dmap)、甲醇(≥99.8％)、氯化钠、磷酸氢二钠七水合物、氯化钾和正磷酸二氢钾。赖氨酸甲酯二盐酸盐、n,n’-二环己基碳化二亚胺(dcc)、三乙胺、茚三酮和d-(+)-海藻糖二水合物(≥99％)购自alfaaesar(heysham,uk)。从vwr(lutterworth,uk)获得无水乙醇、丙酮、盐酸、氢氧化钠、氯仿、乙醚和硫酸(≥95％)。脱纤维蛋白的绵羊红细胞(rbc)购自tcsbiosciences有限公司(buckingham,uk)，储存在4℃冰箱中，并且一旦获得，在一周内使用。

从sigma获得基于聚(丙二醇)的聚合物、基于聚乙烯的聚合物和基于聚苯乙烯的聚合物。从3bscientific公司获得脂肪酸。以下化合物购自sigman-(2-萘基)-1-萘胺(762660)、c-(2-对甲苯基咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)-甲胺(cds008330)、1,1-双(4-氯苯基)-2-[(2-氟苄基)氨基]-1-乙醇(cds018870)、4-十四烷基苯胺(233552)、双[2-(二叔丁基膦基)乙基]胺溶液(739022)、3-(fmoc-氨基)苄腈(750352)、h-cys(trt)-nh2(cds018559)、1,7-二苄基-1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cds001040)、2-(3-氧代-十氢-喹喔啉-2-基)-n-(4-苯氧基-苯基)-乙酰胺(cds018799)、滂酰胭脂红2b(cds010534)、2-[(2-氨基-4-甲基苯基)硫烷基]-n-(2-甲基苯基)乙酰胺(cds015863)、4-硝基苯乙胺盐酸盐(184802)、3-(乙氧基二甲基甲硅烷基)丙胺(588857)、癸胺(d2404)、十八烷基胺(74750)、二己胺(131202)、二(十八烷基)胺(42358)、3-丁烯基胺盐酸盐(597678)、油胺(o7805)。

乙基(丙-2-烯-1-基)胺(molport-000-005-271)、丁-3-炔-1-胺盐酸盐(molport-004-968-587)、双(丁-2-炔-1-基)胺(molport-001-991-305)和双[(2z)-3-氯丁-2-烯-1-基]胺(molport-000-163-345)购自molport。

甲基[7-(甲基亚氨基)庚-1,3,5-三烯-1-基]胺(fch4099593)、3-氟-2-甲基辛-7-炔-1-胺(bbv-70832810)、[4,4-二甲基-2-(戊-4-炔-1-基)环己基]甲胺(bbv-49722550)、(8-氨基辛-1,3,5,7-四炔-1-基)硼烷(fch1957383)、(1,2,3,6-四氢吡啶-4-基)膦酸购自enaminestore(en300-298509)，且(癸-1-炔-4-基)(丙基)胺(csc013776799)购自chemspace。

聚合物合成

聚(赖氨酸间苯二甲酰胺)(plp)的合成

使用单相聚合技术合成plp。在典型的程序中，将赖氨酸甲酯·2hcl(0.15摩尔)和碳酸钾(0.6摩尔)溶解在750ml去离子水中并在冰浴中搅拌。向其中快速添加无水间苯二甲酰氯于干燥丙酮(0.2m)中的750ml预冷溶液。使反应进行直到聚(赖氨酸甲酯间苯二甲酰胺)(plp甲酯)沉淀。用去离子水将聚合物洗涤数次，并干燥过夜。

将无水乙醇中的5wt％naoh溶液(相对于plp甲酯2.5摩尔当量)分数份添加到相同体积(0.5m)的plp甲酯于无水dmso中的溶液中。水解产物在2-3min内沉淀出来，并通过真空过滤加以收集并且再溶解于去离子水中。将粗制聚合物溶液在visking管膜(medicell,mwco12-14kda)中用去离子水透析以去除无机盐、残余的有机溶剂和低分子量低聚物。通过真空过滤去除固体杂质。浓缩澄清溶液，使用naoh水溶液将其调节到约ph7.4，并冻干以产生钠盐形式的plp。为了制备其中性形式，用稀hcl溶液将透析的聚合物溶液酸化到ph约3.0。通过真空过滤收集沉淀物，用去离子水洗涤三次，并冻干成细白色粉末。

plp衍生物的合成

通过dcc/dmap偶合，将nda、hda、tda或oda以不同的取代度缀合到plp骨架上。简单地说，将plp(3g)、dmap(0.6g,20wt％的plp)溶解在无水dmso/dmf(1∶3v/v)中。将nda、hda、tda或oda溶解在氯仿中，然后转移到反应溶液中。逐滴添加无水dmf中的dcc(3摩尔当量的癸胺)。通过薄层色谱(chcl3:meoh:三乙胺＝8∶2∶0.2，使用茚三酮以显现胺)监测反应。通过真空过滤去除固体杂质，并向反应溶液中添加无水乙醇中的5wt％naoh，并且快速沉淀到5体积的乙醚中。收集沉淀物并将其再溶解于去离子水中。向溶液中添加0.2mhcl溶液以沉淀出聚合物沉淀物。将其通过真空过滤收集，并再溶解于具有0.2mnaoh的去离子水中。将沉淀-过滤-再溶解过程进行两次以去除无机盐和残余的有机溶剂。通过在visking透析管(medicell,mwco12-14kda)中针对去离子水进行透析来进一步纯化聚合物。在透析后，使用0.2mnaoh将聚合物溶液滴定到ph7.4，然后冻干。为了制备酸性形式，使用0.2mhcl将透析的聚合物溶液酸化到约ph3.0。收集沉淀物并冻干。

通过凝胶渗透色谱(gpc)系统确定plp的mw(35.7kda)。这意味着聚合度(n)的值为约130。通过d6-dmso中的¹h-nmr光谱确定每种聚合物的取代度(图1a)。使用积分0.77-0.91ppm与积分7.45-7.64ppm的比率来计算取代度。plp-nda3％、10％和18％表示为沿着母体骨架每100个羧酸基团的nda接枝数(mol％)。然后使用取代度和plp的mw来计算含有疏水侧链的衍生物的分子量。

如上文所述，通过dcc/dmap偶合使表4的化合物与plp骨架反应，可获得另外的plp衍生物。

表4

比浊测定

在uv-vis分光光度计(genesys10suv-vis,thermoscientific,uk)上在480nm下测量不同ph下的聚合物溶液的光密度。用不同ph的缓冲液制备聚合物溶液并使其平衡48h。

荧光光谱

芘已被用作探针以研究聚合物在水溶液中的构象转变。新制备无水甲醇中的1.0mm芘溶液，并将其添加到每种聚合物水溶液中，得到6×10^-7m的最终芘浓度。使聚合物溶液避光平衡48h。在荧光分光光度计(fluoromax,horiba,japan)上记录溶解于聚合物溶液中的芘在338和333nm(λem＝390nm)波长下的激发强度。计算i338/i333的荧光强度比。然后确定响应于ph和浓度的构象转变以及临界聚集浓度(cac)。

动态光散射

使用动态光散射(zetasizernanos,malvern,uk)研究聚合物在水溶液中的流体动力学直径和大小分布。在特定ph的缓冲液中制备聚合物溶液并使其平衡48h。将所有样品通过0.45μm过滤器过滤，并在10mm直径的池中以137°的散射角进行大小测量，每一运行重复11次。

溶血

使用脱纤维蛋白的绵羊红细胞(rbc)的溶血测定检查聚合物的脂质膜活性。简单地说，将聚合物添加到特定ph的0.1m磷酸盐缓冲液或0.1m柠檬酸缓冲液中。用150mmnacl将rbc洗涤至少三次，并重悬于聚合物溶液中，达到1-2×10⁸个rbcml^-1的最终浓度。以相同的细胞密度制备阴性对照(不存在聚合物)和阳性对照(在去离子水中裂解的rbc)。将样品在振荡水浴(120rpm)中在37℃培育特定时期，然后以4000rpm离心4min。通过使用uv-vis分光光度计测量上清液在540nm下的吸光度来研究血红蛋白释放。使用以下等式计算相对溶血百分比：

溶血(％)＝[(样品吸光度-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度-阴性对照吸光度)]×100

细胞培养

除非另有说明，否则使hela贴壁上皮细胞(人宫颈癌细胞)和a549贴壁上皮细胞(人肺癌细胞)在补充有10％(v/v)fbs和100uml^-1青霉素的dmem中生长。除非另有说明，否则在补充有1％(v/v)非必需氨基酸、10％(v/v)fbs和100uml^-1青霉素的dmem中培养cho贴壁上皮细胞(中国仓鼠卵巢细胞)。使用胰蛋白酶-edta对hela细胞、a549细胞和cho细胞进行胰蛋白酶消化并将其维持在具有5％co2的37℃加湿培育箱中。

除非另有说明，否则在含有10％(v/v)fbs和100uml^-1青霉素的mccoy's5a培养基中培养mes-sa粘附上皮细胞(人子宫癌细胞)和相应的多重耐药细胞mes-sa/dx5。将mes-sa和mes-sa/dx5细胞用edta溶液(0.8mmedta二钠、68.5mmnacl、6.7mm碳酸氢钠、5.6mm葡萄糖和5.4mmkcl)传代培养，并维持在37℃的具有5％co2的加湿培育箱中。

使su-dhl-8悬浮b淋巴细胞(人淋巴结细胞)在补充有10％(v/v)fbs和100uml^-1青霉素的rpmi-1640培养基中生长，并保持在37℃的具有5％co2的加湿培育箱中。

在含有10％fbs和100uml^-1青霉素的最低必需培养基伊格尔中培养间充质干细胞(hmsc，人骨髓来源)。使用胰蛋白酶-edta对细胞进行胰蛋白酶消化并将其维持在具有5％co2的37℃加湿培育箱中。

阿拉莫蓝测定

使用测定评价聚合物的细胞毒性。将细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种到含有培养基(每孔0.1ml)的96孔板(corning,usa)中并保持24h。用0.1ml含有0.22μm过滤器灭菌的不同浓度的聚合物的样品溶液替换用过的培养基。在培育特定时期后，用含有10％(v/v)的dmem替换含有聚合物的培养基。根据制造商说明书将板进一步培育4h，然后通过荧光分光光度计(-multidetectionsystem,promega)在580-640nm的发射波长与525nm的激发波长下测量每个孔的荧光。从荧光读数确定细胞毒性作用。

激光扫描共焦显微镜检查

采用钙黄绿素(不透膜的荧光团)来评估聚合物将内吞材料释放到细胞质中的能力。将2mlhela细胞、cho细胞或a549细胞(2×10⁵个细胞ml^-1)接种于玻璃底培养皿(35mm,mattek,usa)中并在37℃的具有5％co2的培养箱中培养。在24h后，除去用过的培养基，并用2ml0.22μm过滤器灭菌的无血清培养基替换，该培养基含有0.5mgml^-1的聚合物和2mgml^-1的钙黄绿素。在对照实验中，将细胞与单独的2mgml^-1钙黄绿素培育。在培育一段时间后，用补充有培养基的d-pbs缓冲液将细胞洗涤三次。通过激光扫描共焦显微镜使细胞成像。使用488nm激光激发钙黄绿素，并在535nm下收集发射。

在7种不同的细胞系中测试假肽聚合物递送宽大小范围的fitc标记的葡聚糖(4-2000kda)的能力。将贴壁细胞以2×10⁵个细胞的总细胞数在玻璃底皿中培养过夜，之后用含有假肽聚合物和fitc-葡聚糖的pbs在特定浓度和ph下处理一段时间。然后将细胞用d-pbs洗涤，并用lysotracker和hoechst染色，并且如上文所述成像。对于悬浮细胞(su-dhl-8)，将细胞离心并用1ml含有假肽聚合物和fitc-葡聚糖的pbs缓冲液重悬，以达到4×10⁵个细胞ml^-1的最终细胞浓度。在培育30min后，离心细胞以去除上清液，并用d-pbs重悬三次，并且在成像前用lysotracker和hoechst染色。

流式细胞术

采用流式细胞术来定量评价聚合物介导的有效负载递送。将贴壁细胞在6孔板(每孔3×10⁵个细胞)中培养过夜，并用含有特定浓度的假肽和fitc-葡聚糖的1mlpbs处理一段时间。此后，用d-pbs将细胞洗涤三次，使用胰蛋白酶分离，然后以1000rpm离心。将细胞沉淀重悬于无血清培养基中，并通过40μmflowmitm尖端过滤器(tipstrainer)(bel-art,usa)过滤以去除细胞聚集体。用含有聚合物和fitc-葡聚糖的pbs将su-dhl-8悬浮细胞(8×10⁵个细胞ml^-1)处理30min。然后将细胞离心以去除上清液并过滤。用lsrfortessa细胞分析仪在488nm的激发波长下进行流式细胞术。

细胞内糖递送

通过将136.89mm氯化钠、8.10mm磷酸氢二钠七水合物、2.68mm氯化钾和1.47mm正磷酸二氢钾溶解到1l去离子水中来制备306mosm磷酸盐缓冲盐水(pbs,ph＝7.4)。通过将297.74mmnacl、17.62mmna2hpo4·7h2o、5.83mmkcl和3.20mmkh2po4溶解于1l去离子水中而制成660mosmpbs缓冲液。

通过将一定量的糖溶解到pbs缓冲液中来制备糖溶液(有或无聚合物)，并将它们的ph调节到期望值。通过将125mg蒽酮添加到66％(v/v)h2so4中来制备蒽酮溶液。

将绵羊红细胞以大约1200rcf离心4分钟。然后在去除上清液后添加306mosmpbs缓冲液。将该过程重复3次，以完全去除游离血红蛋白。将糖溶液添加到预洗涤的rbc中，实现15％细胞压积(cpv)。将细胞均匀地重悬于溶液中。随后，将rbc在期望的温度下培育一段时间。

在培育后，通过uv-vis分光光度计在541nm下测量上清液的吸光度来检查溶血。用等渗pbs缓冲液(660mosm)将细胞沉淀洗涤两次以去除细胞外糖分子。然后将rbc在85℃水浴中用80％甲醇裂解1小时，并以大约11000rcf离心4分钟。将上清液置于100℃烘箱中过夜以完全去除水和甲醇，之后添加2ml去离子水。然后进行蒽酮法以定量细胞内糖浓度。具体地，将0.5ml上述溶液添加到蒽酮溶液中，之后在100℃水浴中保持15分钟。然后，通过uv-vis在620nm波长下测量吸光度，以计算加载到细胞内部的糖分子的量。

将压积为15％(3.5×10⁹个rbc/ml)的绵羊红细胞(rbc)置于2ml离心管中，向其中添加含有特定浓度的聚合物和海藻糖的处于期望ph的pbs缓冲溶液。在37℃培育一段时间后，使用上述方法确定加载到细胞内部中的海藻糖量。然后将血液溶液转移到2ml聚丙烯冷冻小瓶中。将冷冻小瓶浸入液氮(-196℃)中并保持一段时间。然后将rbc在37℃水浴中解冻15min。然后将细胞悬浮液离心并裂解细胞沉淀，以从裂解的rbc溶液在541nm下的吸光度计算活细胞的量。还测量了糖递送和冷冻-解冻过程期间的溶血并将其用于计算冷冻存活率。

rbc的共焦显微镜检查和流式细胞术

应用不透膜的钙黄绿素来进一步研究聚合物介导的向红细胞中的递送。将红细胞(15％细胞压积)洗涤三次，并分别与含有0.36m海藻糖+0.1mm钙黄绿素、0.36m海藻糖+0.1mm钙黄绿素+0.8mgml^-1pp50或0.36m海藻糖+0.1mm钙黄绿素+0.8mgml^-1plp-nda18％，在ph6.1下在37℃振荡水浴(120rpm)中培育15min。在培育后，将样品通过离心用pbs缓冲液洗涤两次，并用lsm-510倒置激光扫描共焦显微镜(zeiss,germany)在37℃下成像。在488nm下激发钙黄绿素，并收集535nm下的发射。使用lsrfortessa细胞分析仪(bd,usa)，在488nm的激发波长下进行流式细胞术测量。

为了评价海藻糖加载和洗涤后的膜渗透性，在聚合物不存在或存在下，在ph6.1、37℃下将rbc与海藻糖培育15min，之后用ph7.4pbs缓冲液洗涤两次。然后将处理过的rbc与含有1μm钙黄绿素的ph7.4pbs缓冲液培育，并如前所述用激光扫描共焦显微镜成像。

原子力显微镜检查(afm)

为了进一步研究由plp-nda18％介导的快速海藻糖细胞内加载的机制，应用afm来检查聚合物-细胞相互作用。将rbc洗涤三次，与含有0.36m海藻糖、0.36m海藻糖+0.8mgml^-1pp50或0.36m海藻糖+0.8mgml^-1plp-nda18％的pbs缓冲液在ph6.1下培育15min，并固定在聚赖氨酸涂覆的显微镜载玻片上。将细胞在戊二醛(1％)中交联10min，洗涤，然后空气干燥。使用asylummfp-3d显微镜(oxfordinstrumentsasylumresearch,us)以轻敲模式进行afm。使用具有约320khz谐振频率、尖端半径7nm和弹簧常数42nm^-1的纳米传感器ppp-nchr尖端并将其调谐到1-2v的目标轻敲幅值。

实施例1

已使用1h-nmr和ftir谱确认了用nda(c10)以及包括hda(c7)、tda(c14)和oda(c18)的其他侧链疏水链接枝的plp的形成(图1)。

实施例2

用不同程度的nda(％)取代的plp的水溶液的ph依赖性透射率(图2a)以及ph-和浓度依赖性疏水缔合(图2b和图2c)。如所示，plp-nda展示出ph依赖性。通过用疏水侧接侧链接枝plp并增加取代度，实现了沉淀开始时的ph(php)和疏水缔合(phh)的增加、用于缔合的ph范围的加宽以及cac的降低(表1)。

实施例3

聚合物plp和plp-nda的ph和浓度依赖性粒径分布(图3、表2和表3)。用疏水侧链取代的程度的增加可由于更强的疏水相互作用而导致粒径减小。

实施例4

发现用plp和其衍生物处理的红细胞的溶血依赖于ph、浓度和培育时间(图4)。聚合物的膜活性可通过疏水侧链的类型和取代度来操控。在ph7.4下，发现溶血水平低或可忽略不计，而在酸化时，膜去稳定能力增加。疏水侧链的取代度增加到高达18％导致膜活性增强。

实施例5

在hela细胞(图5a)、cho细胞(图5b)和a549细胞(图5c)中以及在各种plp-nda浓度下达4h(空白)、12h(灰色)、24h(黑色)和48h(条形)测试plp-nda18％的体外细胞毒性。就12h处理来说，plp-nda18％对hela的ic50为2.94±0.28mgml^-1，而其在处理24h和48h后分别降低到1.59±0.22mgml^-1和1.05±0.14mgml^-1。cho细胞表现出比hela细胞更好的耐受性，48h处理的ic50为2.81±0.95mgml^-1，而a549显示出就48h处理来说为4.51±0.06mgml^-1的最高ic50。图5d显示用0.5mgml-1plp或18％plp-nda处理24h的不同类型细胞的细胞存活力没有显著差异。

实施例6

当与单独用钙黄绿素处理或用plp和钙黄绿素处理的细胞比较时，用plp-nda18％和不透膜的钙黄绿素处理的hela细胞(图6a)、cho细胞(图6b)和a549细胞(图6c)显示出由于内吞的钙黄绿素释放到细胞质中而增加的荧光信号。

实施例7

plp-nda18％辅助具有不同分子量(mw)的fitc-葡聚糖递送到在ph6.5下培育30min后的hela细胞中(图7a)。当将细胞与仅fitc-葡聚糖(图7b)或与plp-nda18％和fitc葡聚糖在ph7.4下培育时，未检测到显著的转运(图7c)。

实施例8

转运效率依赖于聚合物浓度(图8)且在0.5-2mgml^-1的plp-nda18％浓度下最高。

实施例9

含有具有不同长度的烷基链的plp衍生物促进fitc-葡聚糖的递送(图9)。递送效率以plp-nda18％>plp-tda18％>plp-hda18％>plp-oda18％的顺序排序。当将细胞在ph6.5下与仅fitc-葡聚糖培育时，未观察到显著的细胞内递送。

实施例10

如通过共焦显微镜检查(图10)和流式细胞术(图11)所证实的，plp-nda18％响应细胞外ph介导细胞内有效负载递送。当将细胞在ph7.4下与plp-nda18％和fitc-葡聚糖共培育时，检测到fitc-葡聚糖的有限的细胞内递送。递送效率随着ph降低而显著增加。在细胞外ph5.5-6.5下实现最高的递送效率。

实施例11

共焦显微镜检查(图12)和流式细胞术(图13)测量显示，当将hela细胞与plp-nda18％和fitc-葡聚糖在ph6.5下共培育时，细胞内递送仅在10min处理后开始。递送效率随着培育时间的延长而增加。

实施例12

通过共焦显微镜检查(图14)和流式细胞术测量(图15)证实了plp-nda18％介导的细胞内递送的广泛适用性。在所有测试的细胞类型中均观察到强烈的弥散性绿色荧光，包括hela贴壁上皮细胞(人宫颈癌细胞)、cho贴壁上皮细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、a549贴壁上皮细胞(人肺癌细胞)、su-dhl-8悬浮b淋巴细胞系(人淋巴结细胞)、mes-sa贴壁上皮细胞系(人子宫癌细胞)、mes-sa/dx5贴壁多重耐药细胞系和人间充质干细胞(hmsc，人骨髓来源)。这确认了梳状聚合物可有效地将大分子递送到多种细胞类型中，包括粘附细胞和悬浮细胞、癌细胞和非癌细胞、多重耐药细胞、淋巴细胞和干细胞。

实施例13

评价plp-nda18％在不同细胞外ph、聚合物浓度和持续时间下针对不同细胞类型的体外细胞毒性(图16)。在酸性ph和中性ph下，在不同的培育持续时间后，聚合物在宽聚合物浓度范围内被多种细胞类型良好耐受。

实施例14

在不同条件(例如培育时间和聚合物浓度)下监测红细胞的海藻糖加载和溶血。在ph7.05下与plp-nda18％(300-800μgml^-1)培育15min后，可测量到细胞内海藻糖浓度的增加。在将细胞在800μgml^-1plp-nda18％中培育60min后，实现215mm的细胞内海藻糖浓度(图17)。发现红细胞的溶血相对于plp-nda聚合物浓度增加(图18)。

实施例15

海藻糖摄取和溶血是ph依赖性的。在6.1到5.6的ph下处理15min后，摄取增加，并且对于所有测试浓度，溶血都很低(图19)。当用600μgml^-1plp-nda处理细胞时，该ph下的溶血降低(图20)。

实施例16

海藻糖加载和溶血依赖于plp-nda培育时间(图21)和温度(图22)。0.36m海藻糖溶液中且在添加800μgml^-1plp-nda18％的情况下红细胞的细胞内海藻糖浓度在ph6.1下在60min加载后达到高达大约0.3m的高水平，溶血低于30％。在测试的温度范围(31-40℃)中，细胞内海藻糖和溶血在37℃达到峰值。

实施例17

海藻糖加载和溶血依赖于细胞外海藻糖浓度。将细胞在含有0.36m海藻糖和800μgml^-1plp-nda18％的溶液中培育1h导致低于30％的溶血和为300mm的高细胞内海藻糖浓度(图23)。

实施例18

监测疏水侧链的长度和取代度对细胞的海藻糖加载(图24和图26)和溶血(图25-26)的影响。用nda(c7)以18％取代度取代的plp显示出最佳的细胞内海藻糖加载。

实施例19

将不透膜的染料钙黄绿素与海藻糖混合，以通过共焦显微镜检查(图27)和流式细胞术(图28)追踪其向细胞中的易位。如所示，plp-nda18％在仅仅15min的处理后即诱导有效负载(钙黄绿素和海藻糖)的细胞内递送，比pp50(用疏水性氨基酸苯丙氨酸接枝的plp)快得多，据报道pp50需长达9小时。plp-nda18％诱导的细胞内递送也比pp50显著更有效。在ph7.4下，两种聚合物均介导有限的细胞内递送。

实施例20

评价糖加载后红细胞的膜完整性(图29)。在plp-nda18％不存在或存在下，在糖加载后，红细胞膜保持不可渗透，因为钙黄绿素在洗涤和ph调节到7.4后不能透过细胞膜。这表明聚合物不会引起永久性膜损害，并且聚合物介导的膜透化是可逆的。

实施例21

使用形貌afm比较由不同聚合物介导的红细胞的膜表面粗糙度(图30、表5)。细胞表面粗糙度以plp-nda18％>pp50>对照的顺序排序，表明与pp50相比，plp-nda18％促进了与细胞膜的强得多的相互作用。

实施例22

用800μgml^-1plp-nda18％和0.36m海藻糖溶液在ph6.1下处理15min的红细胞(图31)可达到大约85％的存活率，显著高于仅用0.36m海藻糖溶液处理的细胞。当冷冻保存的持续时间从5min延长到168小时时，冷冻存活率的变化并不显著。