本发明涉及癌症治疗，特别是涉及用于抑制、减少，和/或预防癌症转移的癌症治疗。
背景技术：
：：癌症为世界上主要的死亡原因。虽然癌症的主要治疗(手术、放射治疗，以及化学治疗)是有益的，且使得癌症痊愈及整体存活期增加，但持续的复发率导致相当大比例的癌症患者发生复发和/或转移的癌症。大多数死于癌症的病患并非死于原发性肿瘤，而是死于转移性疾病。当患者进行手术时，外科医生并不知道患者身体其他部位是否存在其他较小的病变。本领域仍然需要有效预防癌症转移及复发的治疗剂。技术实现要素：本发明的目的之一为通过治疗癌症转移来增加癌症患者的癌症痊愈及整体存活期。本发明的另一个目的为提供一种组合物或其试剂盒，以辅助原发性癌症治疗，从而治疗癌症转移。为了达到上述目的，本发明提供了治疗癌症转移的方法，包括向有需要的受试者施用治疗有效量的白细胞介素-35(interleukin-35，il-35)拮抗剂。本发明还提供了il-35拮抗剂在制备用于治疗癌症转移的药物组合物中的用途；其中所述药物组合物包含治疗有效量的il-35拮抗剂和药学上可接受的载体。然后，本发明提供了用于治疗已接受原发性癌症治疗的受试者的癌症转移的药物组合物，其包含：治疗有效量的il-35拮抗剂；以及药学上可接受的载体。本发明还提供了一种用于治疗已接受原发性癌症治疗的受试者的癌症转移的试剂盒，包含：含有il-35拮抗剂的第一容器；以及含有csf1r拮抗剂的第二容器。本发明进一步提供了一种治疗癌症的方法，包括(a)向有需要的受试者施用原发性癌症治疗；以及(b)向所述受试者施用治疗有效量的il-35拮抗剂和/或治疗有效量的csf1r拮抗剂。根据以上所述，本发明提供了一种il-35拮抗剂用于治疗癌症转移的用途。因此，本发明提供了通过使用il-35拮抗剂治疗癌症转移的方法、药物组合物、及试剂盒。本发明成功实现了增加癌症痊愈及整体存活期，并且对于癌症治疗方案是有价值的。附图说明图1a显示了在接种4t1细胞5周后，从原发性肿瘤(ptam；p)及转移性肺脏(mtam；m)分离的cd11b+f4/80+tam中m1标记(nos2、tnf、il15、cxcl9，以及cxcl10)与m2标记(arg1、mrc1、il10、chil3，以及ccl17)的表达的rt-qpcr分析结果。数据以来自健康小鼠的骨髓衍生的巨噬细胞(bonemarrow-derivedmacrophages，bmdm)标准化。n＝3。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。***p<0.001。n.s.＝无显著差异。图1b显示了在接种4t1细胞5周后，从原发性肿瘤(ptam；p)及转移性肺脏(mtam；m)分离的cd11b+f4/80+mrc1+细胞中m2标记(arg1、mrc1、il10以及chil3)的表达的rt-qpcr分析结果。数据以来自健康小鼠的bmdm(n＝3)标准化。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01；***p<0.001。图1c显示了在来自原发性(n＝11)及转移性人类癌症(n＝12)的cd14+tam中m1标记(tnfa、il6、il1b)与m2标记(il10、cd163、ccl18)的表达的rt-qpcr分析结果。数据以周围血单核细胞衍生的巨噬细胞(peripheralbloodmonocytes-derivedmacrophages，pmm)标准化(n＝5)。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。p值显示于图中。n.s.＝无显著差异。图2a显示了在pbs或氯膦酸二钠脂质体处理(50、100及200μg/ml，处理24小时)下，4t1细胞的存活力的mtt测定分析结果。n＝2。图2b显示了通过气管内注射氯膦酸二钠脂质体(liposomalclodronate)的4t1原位实验中肺脏巨噬细胞消除(macrophagedepletion)的图像。图2c显示了接受气管内注射氯膦酸二钠脂质体或载体对照组(pbs)的小鼠的肺脏中f4/80+巨噬细胞的定量。数据表示为6个代表性区域中f4/80+群体的相对倍数变化。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01。(每组n＝5)。图2d总结了巨噬细胞消除对转移的影响。上图：接受气管内注射氯膦酸二钠脂质体或对照组pbs的小鼠的原发性肿瘤照片(左)及肺脏的代表性照片(右)。红色箭头指示转移性肺脏中的结节。下图：结果的定量。比例尺，1cm。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01。(每组n＝5)。图2e显示了注射肿瘤细胞2周后ly6c-tam共注射实验(实施例2)的转移性肺脏结节的定量。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。***p<0.001。(每组n＝7)。图2f显示了mrc1+tam共注射实验(实施例2)的结果。上图：在注射具有/不具有mrc1+tam的4t1细胞2周后小鼠的肺脏的代表性照片。下图：转移性肺脏结节的定量。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01。(每组n＝6)。图3a说明了本说明书的所述例3的流程。(mφ：巨噬细胞)。图3b显示了以所示条件的培养基(conditionedmedium)处理48小时的4t1细胞中e-钙黏蛋白(e-cadherin)及n-钙黏蛋白(n-cadherin)的westernblot分析法结果。bmdm，骨髓衍生的巨噬细胞；ptam，cd11b+f4/80+原发性tam；mtam，cd11b+f4/80+转移性tam。图3c显示了是相位差图像，其显示a549与4t1细胞在不同的巨噬细胞条件培养基中培养48小时后的形态。比例尺，50μm。图3d显示了以transwell迁移试验分析以不同巨噬细胞条件培养基培养48小时后的a549细胞的迁移能力的结果。n＝2。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*p<0.05。图3e显示了通过流式细胞仪分析的来自人类cd14+单核细胞的极化(polarized)巨噬细胞的表面表达的m1标记(hla-dr)与m2标记(mr及cd163)的结果。图3f显示了来自人类cd14+单核细胞的极化巨噬细胞中m1标记(il1b、il6及ifng)与m2标记(mrc1、cd163及ccl18)的表达以确认成功极化的rt-qpcr分析结果。n＝2。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01；***p<0.001。图3g显示了内皮细胞管形成分析试验的结果。上图：huvec组织化的代表影像。比例尺，50μm。下图：通过测量当以m0、m1及m2条件培养基共培养12小时的分支点数量，以对管形成定量。n＝3。比例尺，50μm。(m0cm：静息巨噬细胞条件培养基；m1cm：m1巨噬细胞条件培养基；m2cm：m2巨噬细胞条件培养基)。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*p<0.05。图3h显示了在以指定条件培养基处理48小时后的oecm1细胞、4t1细胞及a549细胞中e-钙黏蛋白、n-钙黏蛋白、波形蛋白(vimentin)及γ-连环蛋白(γ-catenin)的westernblot分析法结果。图3i显示了在以指定条件培养基处理48小时后的4t1细胞、oecm1细胞及a549细胞中e-钙黏蛋白、n-钙黏蛋白及波形蛋白的免疫荧光染色。比例尺，100μm。图3j显示了实施例3中的跨内皮迁移分析试验的结果。上图：在指定条件培养基处理下，a549细胞及oecm1细胞的跨内皮迁移分析。比例尺，100μm。下图：癌细胞迁移的定量。n＝3。数据以迁移细胞数量的相对倍数变化呈现。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01；***p<0.001。图3k显示了从原位sas异种移植小鼠模型收集的肿瘤样品的苏木精-伊红染色。sas细胞于接种前以指定条件培养基处理48小时。比例尺，200μm。(每组n＝5)。图3l显示了m1cm或m2cm处理的a549细胞的体内转移定殖(colonization)能力。上图：来自以尾静脉注射经m1或m2cm或对照培养基预处理的a549细胞的小鼠肺脏的代表性照片。下图：肿瘤细胞注射后8周的转移性肺脏结节的定量(每组n＝6)。图4a显示了在接种4t1细胞后5周的小鼠的原发性肿瘤及转移性肺脏的ly6c-tam中il12a及ebi3表达的rt-qpcr分析结果(n＝3)。数据以来自健康小鼠的bmdm进行标准化(n＝3)。图4b显示了来自接种4t1细胞的小鼠的转移肺脏的ly6c-f4/80+及ly6c-f4/80-细胞中il-35(绿色)及f4/80(红色)的免疫荧光染色。蓝色，细胞核。比例尺，50μm。图4c显示了在培养24小时后，在收集自指定的巨噬细胞的培养基中测定il-35含量的elisa结果。n＝3。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*，p<0.05。图4d显示了来自转移性人类肿瘤的cd14+tam(n＝10)与周围血单核细胞衍生的巨噬细胞(pmm)(n＝10)中il12a及ebi3表达的rt-qpcr分析结果。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*，p<0.05。图4e显示了在培养24小时后，在收集自指定的巨噬细胞的培养基中定量分泌的il-35含量的elisa结果。n＝2。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现*p<0.05。图4f显示了以il-35(100ng/ml)处理48小时后，指定癌细胞株的迁移能力的transwell迁移试验分析结果。n＝3。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。***，p<0.001。图4g显示了实施例4中原位异种移植实验的结果。通过将sas细胞接种到小鼠的舌上进行实验。在接种前，将sas细胞以重组il-35(50ng/ml)或载体对照组预处理48小时。肿瘤接种后14天拍摄ivis影像以显示淋巴结(每组n＝6)。图4h显示了il-35中和对转移的影响。上图：在4t1原位肿瘤小鼠模型(体重：15至20g)中抗体施用的图像。肿瘤植入2周后，通过气管内注入50μgil-35中和抗体(v1.4c4.22；在100μlpbs中)或igg2b同型对照，并且每3天给予总共5个剂量的抗体。小鼠在第四周结束时处死。收集原发性肿瘤及肺脏进行分析。中图：原发肿瘤的照片及小鼠肺脏的代表性照片。比例尺，1cm。下图：肿瘤重量及肺脏结节的定量(n＝6)。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。***，p<0.001。图4i显示了抗体治疗实验的方案。将4t1细胞以原位植入小鼠，并在3周后以手术切除植入的肿瘤。手术后小鼠(体重：15至20g)以腹膜内注射(i.p.)100μg抗-il-35抗体(v1.4c4.22；在200μlpbs中)、igg2b同型对照、抗-csf1r抗体(在200μlpbs中)，以及igg2a同型对照，然后每三天给予50μg抗体，共给与4个剂量。ivis检验在第5周结束时进行。每组n＝7。图4j显示了手术后2周以指定抗体处理的小鼠的生物发光信号(如图4i所示)。图4k显示了经肿瘤移除的小鼠在施用抗体后的总生存率。p值显示在图中。图5a显示了在以tnfα(20ng/ml)、m1cm、或对照培养基处理24小时后，a549细胞中il-12rβ2、e-钙黏蛋白及n-钙黏蛋白的westernblot分析法的结果。图5b显示了经tnfα(20ng/ml)处理24小时后不同癌细胞株中il12rb2表达的rt-qpcr分析结果。n＝2。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。图5c显示了以5×105静息(m0)或m2巨噬细胞与1×106经tnfα预处理的a549细胞共同注射的小鼠中转移性肺脏结节的定量。尾静脉注射后2个月处死小鼠(每组n＝6)。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*，p<0.05；**，p<0.01。图5d显示了用于证实在接受针对il12rb2或对照序列(plko)的shrna的a549细胞中il-12rβ2的抑制效率的rt-qpcr(上图)及westernblot分析法(下图)的结果。数字表示用于shrna实验的两条独立序列。针对rt-qpcr，n＝2。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*p<0.05；**p<0.01。图5e显示了实施例5中的原位肿瘤实验的结果。将感染针对il12rb2(shil12-rβ2)或对照序列(plko)的shrna的4t1细胞接种至小鼠。在肿瘤植入后4周收获肿瘤及肺脏。上图：带肿瘤小鼠的原发性肿瘤及肺脏的照片。比例尺，1cm。下图：肿瘤重量及肺脏结节的定量(每组n＝6)。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。**p<0.01。图5f显示了用于证实在接受针对il12rb2(#1、#2)或对照序列(plko)的shrna的4t1细胞中il-12rβ2的抑制效率的rt-qpcr(上图)及westernblot分析法(下图)的结果。数字表示用于shrna实验的两条独立序列。针对rt-qpcr，n＝3。数据以平均值±s.e.m.的方式呈现。*p<0.05；***p<0.001。图5g显示了体内转移性定殖实验的结果。将经抑制il12rb2且经gfp标记的4t1细胞与ly6c-f4/80+mtam共同注射，并且在注射后5天取出肺脏(每组n＝5)。上图：在肺脏的代表性切片中的gfp的免疫组织化学(immunohistochemical，ihc)染色。下图：通过计数来自5个石蜡包埋的肺脏切片的平均gfp+定殖群落来定量ihc结果。图5h显示了kaplan-meier存活分析结果，以显示胃癌及肺癌中il12rb2表达与预后的关系。通过对数等级检验来估算p值。数据来自kaplan-meier绘图软件(http://kmplot.com/)。图5i显示了头颈癌样品中il-12rβ2的ihc染色结果(n＝91)。上图：具有代表性的ihc影像。比例尺，100μm。下图：显示il-12rβ2表达与患者随后转移发生相关性的交叉表(p：原发性肿瘤，m：转移性肿瘤)。低h值，0～127；高h值，128～300。具体实施方式本发明涉及il-35在癌症转移中的药学应用。通过使用il-35拮抗剂，可以抑制、减少和/或预防癌转移。如本文所用，在受试者或患者中的“癌症”或“原发性癌症”指存在具有典型致癌细胞特征的细胞，例如不受控制的增殖、永生、转移潜能、快速生长及增殖速度，以及某些特征性的形态特征。在某些情况下，癌细胞将为肿瘤形式，或者这样的细胞可能局部性地存在于动物体内，或作为独立的细胞在血流中循环。术语“转移”、“转移的”或“转移化”指癌细胞从原发性或原始肿瘤扩散或迁移到另一个器官或组织，并且通常通过存在“继发性肿瘤”或属原发性或原始肿瘤的组织类型被辨识，而非以该次级(转移性)肿瘤所在的器官或组织的“次级细胞团”被辨识。例如，已经迁移到骨头的前列腺癌被认为是转移的前列腺癌，并且包括在骨组织中生长的癌性前列腺癌细胞。转移可以被理解为包括微转移，即在器官或身体部位存在无法检测的数量的癌细胞，其不直接与原始癌肿瘤的器官相连。转移还可以定义为一个过程的几个步骤，例如癌细胞从原始肿瘤部位或原发肿瘤离开，且癌细胞向身体其他部位的迁移和/或侵入。在某些方面，转移指在治疗原始肿瘤后，与原始肿瘤位于不同位置的癌性肿瘤的后续生长或出现。术语“白细胞介素-35拮抗剂”或“il-35拮抗剂”指抵抗或阻断il-35的生理功能的化合物或物质。或者，该il-35拮抗剂可为抗体型il-35拮抗剂、rnai型il-35拮抗剂或小分子抑制剂。在另一个具体实施例中，该抗体型il-35拮抗剂为抗体或其抗原结合片段，包括但不限于与il-35、人类疱疹病毒第四型诱导基因3(epstein-barr-virus-inducedgene3，ebi3)、il-35的亚单位p35结合的抗体或抗原结合片段、ebi3/p35异二聚体、癌细胞上的il-35受体、gp130、il-12rβ2、il-27rα、gp130/il-12rβ2异二聚体、il-27rα/il-12rβ2异二聚体或其组合。在另一个可选的具体实施例中，该rnai型il-35拮抗剂为shrna、sirna、mirna，该shrna、该sirna和/或该mirna抵抗il-35、ebi3、p35、il-35受体、gp130、il-27rα，或il-12rβ2的表达。在另一个具体实施例中，本文所用的“小分子抑制剂”指对il-35的生理功能具有抑制作用的化合物。在另一个具体实施例中，该il-35拮抗剂可为多特异性抗体或其抗原结合片段。在另一个具体实施例中，该il-35拮抗剂为双特异性抗体或其抗原结合片段，其结合选自il-35、ebi3、il-35的亚单位p35、ebi3/p35异二聚体、癌细胞上的il-35受体、gp130、il-12rβ2、gp130/il-12rβ2异二聚体，以及csf1r所组成的群组的两个抗原。在一个特定的具体实施例中，该il-35拮抗剂为与il-35及csf1r结合的双特异性抗体或其抗原结合片段。同样地，术语“群落刺激因子1受体拮抗剂”或“csf1r拮抗剂”指抵抗或阻断csf1r生理功能的化合物或物质。在另一个具体实施例中，该csf1r拮抗剂为与csf1r结合的抗体或其抗原结合片段，或抵抗csf1r表达的shrna、sirna或mirna。在另一个可选的具体实施例中，该csf1r拮抗剂为小分子csf1r抑制剂。术语“抗体”涵盖各种形式的抗体，包括但不限于完整抗体、抗体片段、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、t细胞抗原决定簇缺失的抗体及其他基因工程改造的抗体，只要保留本发明的特征性特性即可。“抗体片段”包含全长抗体的一部分，优选为其可变结构域，或至少其抗原结合位点。抗体片段的实例包括双功能抗体、单链抗体分子及由抗体片段形成的多特异性抗体。scfv抗体描述于例如houston,j.s.，methodsinenzymol.203(1991年)46-88。此外，抗体片段包含具有以下特征的单链多肽：与抗原结合的vh结构域(即能够与vl结构域组装)或与抗原结合的vl结构域(即能够与vh结构域组装)，形成功能性抗原结合位点且由此提供该特性。本发明的抗体可以通过与各种分子例如酶、荧光物质、放射性物质及蛋白质连接而被修饰。修饰的抗体可以通过化学修饰抗体来获得。该修饰方法是本领域中常用者。此外，抗体可以是具有源自非人类抗体的可变区及源自人类抗体的恒定区的嵌合抗体，或者可以是人源化抗体，其包含源自非人类抗体的互补决定区，以及源自人类抗体的框架区(frameworkregion，fr)及恒定区。这样的抗体可以通过使用本领域已知的方法来制备。本文所用的“抵抗表达(againsttheexpression)”指减少、停止、阻止目标蛋白或基因的转录或转译。用于抵抗目标蛋白或基因表达的常用工具包括但不限于shrna、sirna或mirna。如本文所用，“原发性癌症治疗”指任何用于或具有部分或完全消除、破坏、损坏、切除、减小体积、呈现良性或抑制癌症或肿瘤生长的效果的治疗或手段。例如，初级治疗可以包括内分泌治疗、化学治疗、放射治疗、激素治疗、手术，基因治疗、热治疗，以及超声波治疗中的一种或多种。在另一个具体实施例中，主要的癌症治疗为手术切除实体肿瘤。如本文所用的术语“施用”、“施予”或“给药”指植入、吸收、摄取、注射、吸入或以其他方式引入本文所述的本发明的药物组合物。本文所用的“治疗癌症转移”的描述涉及抑制、减少和/或预防癌症转移。具体而言，在另一个具体实施例中，该抑制癌症转移指抑制癌症转移的进展或发展。在另一个具体实施例中，该减少癌症转移指降低癌症转移的程度、面积或量。在另一个具体实施例中，该预防癌症转移指预防癌症转移的发生或复发。本文所用的“有效量”或“治疗有效量”指赋予受试者所需效果(例如，治疗癌症转移为本发明的所需效果)所需的每种活性剂的量，不论是单独或与一种或多种其它活性剂组合。如本领域技术人员所认识的，有效量的变化可根据所治疗的特定病症、病况的严重程度、个别患者参数，包括年龄、身体状况、体积、性别及体重、治疗持续时间、并行治疗的性质(如果有的话)，特定的给药途径，以及在医护人员的知识及专长之内的类似的因素。这些因素对于本领域的普通技术人员来说是众所周知的，并且可以用不超过常规的实验来解决。通常优选为使用单独组成分或其组合的最大剂量，即根据合理的医学判断的最高安全剂量。然而，本领域普通技术人员将理解，出于医学原因、心理原因或实际上任何其他原因，患者可能坚持较低的剂量或可耐受的剂量。在本发明的第一方面，提供了一种治疗癌症转移的方法。本发明治疗癌症转移的方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的il-35拮抗剂。该治疗有效量如前述段落所定义。在本发明的另一个具体实施方案中，该治疗有效量可以从动物模型试验或人类临床试验确定；例如产业指引(guidanceforindustry，fda，2005年，第7页，表1)所教导的。在一些具体实施例中，该治疗有效量的il-35拮抗剂为0.01-20mg/每公斤受试者体重。在一个优选的具体实施例中，该治疗有效量可以为以下数字之间的任何范围：0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、12、14、16、18、20mg/每公斤受试者体重。在一个优选的具体实施例中，本方法进一步包括向该受试者施用治疗有效量的csf1r拮抗剂。在一个替代具体实施例中，该csf1r拮抗剂的治疗有效量为0.01至20mg/每公斤该受试者体重。在一个优选的具体实施例中，治疗有效量可以为以下数字中的任何两个之间的范围：0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、12、14、16、18、20mg/每公斤该受试者体重。在某些具体实施例中，该il-35拮抗剂及该csf1r拮抗剂可以同时或以任一相互间隔施用。在一个替代具体实施例中，该间隔可为1、3、5、10、30、60、120、240，或600分钟。在另一个具体实施例中，首先施用该il-35拮抗剂，然后施用该csf1r拮抗剂。在另一个具体实施例中，首先施用该csf1r拮抗剂，然后施用该il-35拮抗剂。在某些具体实施例中，该il-35拮抗剂和/或该csf1r拮抗剂的施用频率为每周两次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次或每十周一次；或每月一次、每两个月一次或每三个月一次或更长时间。这种疗法的进展很容易通过常规技术及分析进行监测。施用方案(包括使用的抗体)可随时间而改变。在一些具体实施例中，可以使用药物领域的普通技术人员已知的常规方法将该il-35拮抗剂和/或该csf1r拮抗剂施用于受试者，视该要被治疗的癌症类型而定。该组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、吸入喷雾、局部(外用)、直肠、经鼻、颊部、阴道或经由植入的储库。本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输注技术。此外，可以通过可注射长效制剂给药途径(injectabledepotroute)，例如使用1个月、3个月或6个月长效制剂注射或生物可降解材料及方法，将其施用给受试者。在本发明的第二方面，提供了il-35拮抗剂在制备用于治疗癌症转移的药物组合物中的用途。在本发明的第三方面，提供了该药物组合物。该药物组合物包含il-35拮抗剂及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受”指本领域已知的含义。例如，所述“药学上可接受”指对受试者无毒且不干扰所讨论的药物组合物的活性成分的功效。该药学上可接受的载体包括但不限于水、pbs、盐类溶液、明胶、油、醇或其组合。该药物组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。该赋形剂包括但不限于崩解剂、黏合剂、润滑剂、防腐剂、或其组合。该il-35拮抗剂可以含有适当百分比的该药物组合物。本领域已知的是，药物组合物中活性成分的量可基于若干因素确定，例如活性成分的稳定性、活性成分的功效(对应于活性成分的有效量)、医师的方案、及患者依从性。在另一个具体实施例中，该药物组合物基于该药物组合物的总重量包含0.1至100mg/ml的所述il-35拮抗剂。在另一个可选择的具体实施例中，所述il-35拮抗剂的量为以下数字中的任何两个之间的范围：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/ml。在一个优选的具体实施例中，该药物组合物还包含csf1r拮抗剂。优选地，基于该药物组合物的总重量，该药物组合物包含0.1至100mg/ml的该csf1r拮抗剂。在另一个可选择的具体实施例中，该csf1r拮抗剂的量为以下数字中的任何两个之间的范围：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/ml。在本发明的第四方面，提供了用于治疗已接受原发性癌症治疗的受试者的癌症转移的试剂盒。该试剂盒包括含有il-35拮抗剂的第一容器；以及包含csf1r拮抗剂的第二容器。该“已接受原发性癌症治疗的受试者”指该受试者具有原发性癌症，但已通过癌症治疗进行治疗。该原发性癌症治疗如上述所定义。在一个优选的实施方案中，该第一容器包含如上所述的本发明的药物组合物。在一个可选择的具体实施例中，根据储存稳定性、给药途径等的要求，配制包含在上述容器中的该il-35拮抗剂和/或该csf1r拮抗剂。例如，包含在该第一容器的该il-35拮抗剂可以配制成注射剂，且该第一容器为安瓿。在此具体实施例中，该il-35拮抗剂和/或该csf1r拮抗剂配制为注射剂，该试剂盒可进而包含注射器。在本发明的第五方面，一种用于治疗癌症的方法，包括(a)向有需要的受试者施用原发性癌症治疗；以及(b)向该受试者施用治疗有效量的il-35拮抗剂和/或治疗有效量的csf1r拮抗剂。在一个替代的实施方案中，该步骤(a)及该步骤(b)以任何间隔进行。例如，30分钟、60分钟、5小时、10小时、20小时、1天、3天、5天、1周、3周、1个月、3个月、6个月。在一个优选的实施方案中，在该步骤(b)中，给予该受试者该il-35拮抗剂及该csf1r拮抗剂两者；其中该il-35拮抗剂及该csf1r拮抗剂同时施用或以任一相互间隔施用。该间隔如前述段落所述。为了可以更充分地理解本文所述的发明，提出以下实施例/实验。应该理解的是，这些实施例仅用于说明的目的，并不被解释为以任何方式限制本发明。实施例1：原发性及转移性肿瘤中肿瘤相关巨噬细胞的特征描述在本研究中，调查了在原发性及转移性肿瘤的肿瘤相关巨噬细胞(即ptam及mtam)的不同作用。我们将同源4t1乳癌细胞接种到balb/c小鼠以产生小鼠原位乳癌模型。肿瘤细胞接种4至5周后发生肺脏转移。从原发肿瘤及转移性肺脏组织中分离cd11b+f4/80+巨噬细胞，以用于进一步分析。结果显示，ptam主要表达m1巨噬细胞相关标记。有趣的是，他们也表达了某些m2巨噬细胞相关的标记(如，arg1与mrc1)。相较之下，在mtam中注意到主要为m2模式而非m1(图1a)。此外，我们从原发性及转移性肿瘤中分离出f4/80+mrc1+tam。在这个群体中，mtam仍然表达比ptam更高含量的m2相关标记(图1b)。收集自原发性及转移性肿瘤中的m1标记及m2标记的免疫组织化学(ihc)染色结果证实了该发现(数据未显示)。接下来，我们从人类原发性及转移性癌症中分离出cd14+tam，并检测免疫学标记的表达。我们注意到一致的结果：该ptam表达m1-特异性标记(例如，tnf、il6，以及il1b)，而与ptam相比，mtam更倾向表达更多的m2标记(例如，cd163)(图1c)。总而言之，这些结果表明，ptam与mtam为独立的群体，表达不同的标记及具有不同的功能。实施例2：mtam促进转移性肿瘤的定殖在本研究中，我们推测mtam参与转移性定殖，因此着重于巨噬细胞在转移部位的作用。文件中已知，巨噬细胞的消除(depletionofmacrophages)可以通过氯膦酸二钠脂质体来达到(qian等，2009年；pallasch等，2014年)。因此，我们通过气管内注射氯膦酸二钠脂质体来消除肺脏巨噬细胞，并观察对转移性定殖的影响。氯膦酸二钠本身对4t1细胞的增殖没有显著的影响(图2a)。肺脏巨噬细胞的消除显著减少肺脏转移而不影响原发性肿瘤的重量(图2b-图2d)。接着我们研究ptam与mtam的促定殖效应(pro-colonization)。与共注射cd11b+f4/80+ly6c-ptam相比，经由尾静脉共注射4t1细胞与cd11b+f4/80+ly6c-mtam增加了肺脏肿瘤的定殖(图2e)。通过尾静脉共注射4t1细胞与f4/80+mrc1+ptam或mtam证实了一致的结果。与ptam相比，f4/80+mrc1+mtam也具有较强的促进肺脏定殖的能力(图2f)。总之，这些结果表明mtam具有较大的促进转移性定殖的能力。实施例3：m2样巨噬细胞促进癌细胞的上皮表型(epithelialphenotype)接着，我们研究了mtam是否能够直接影响癌细胞的定殖。越来越多的证据支持间质-上皮细胞转化(mesenchymal-epithelialtransition，met)在转移性定殖中的作用(tsai等，2012年)。我们调查了mtam是否调节癌细胞的上皮可塑性(epithelialplasticity)，并进行体外实验来排除其他免疫细胞的影响。为此，我们从4t1原位模型中分离出ptam及mtam，然后以来自tam的条件培养基处理了癌细胞(a549细胞与4t1细胞)(图3a)。与ptam的作用相比，以来自mtam的培养基处理的4t1细胞增加了e-钙黏蛋白的表达以及下调了n-钙黏蛋白(图3b)的表达。来自mtam的培养基也诱导了上皮形态并减少了癌细胞的迁移(图3c与图3d)，显示间质表型(mesenchymalphenotype)在以来自mtam的条件培养基处理时被抑制。由于mtam主要表达出m2样表型(先前显示)，因此我们将人类cd14+单核细胞于体外极化为类m1及类m2巨噬细胞以用于随后的实验。根据先前的报告(martinez等，2006年；kzhyshkowska等，2008年；park等，2009年)进行标准的极化程序。经表面标记、基因表达图谱，以及血管生成能力的分析证实了巨噬细胞被成功地极化(图3e、图3f、图3g)。我们进一步进行cdna微阵列分析，以产生以m1或m2巨噬细胞的条件培养基处理的肺脏癌细胞株a549的转录组特征图谱(m1-cm、m2-cm；数据未显示)。基因组富集分析(gsea)显示m1-cm处理的癌细胞的基因表达特征与上皮-间质转化(epithelial-mesenchymaltransition，emt)核心特征有显著相关。相较之下，发现m2-cm处理的特征与emt特征为逆相关(数据未显示)，表示m2分泌物影响癌细胞获得上皮表型并经历反向emt。一致的是，相较于来自m1巨噬细胞的条件培养基，来自m2巨噬细胞的培养基诱导在不同的癌细胞株中的met，其由上皮标记的上调以及间质标记的下调(图3h)、具有e-钙黏蛋白膜性表达的上皮形态(图3i)，以及穿透内皮的能力降低(图3j)所呈现。由于emt的抑制降低了局部侵入(localinvasion)但利于转移性定殖(yan等，2010年；tsai等，2012年)，我们进行了两个实验，以验证在体内该癌细胞的m2-cm-调节上皮可塑性的效应。首先，我们以m1、m2或对照培养基处理口腔癌细胞株sas，然后在小鼠的舌上接种sas细胞。结果显示m1-cm处理的sas细胞局部侵入增加，然而，m2-cm处理的细胞形成没有外周侵入的局部肿瘤(第三k图)。接着，我们通过尾静脉注射经m1-cm或m2-cm处理的a549细胞来研究转移性定殖的能力。在接受经m2-cm处理的癌细胞的小鼠组别中注意到转移性结节数量的显著增加(第三l图)。总之，这些结果表示类m2巨噬细胞抑制emt并促进癌细胞的转移性定殖。实施例4：转移性tam分泌il-35以促进癌细胞的定殖为了阐明mtam调节的肿瘤定殖所涉及的因素，我们对从4t1原位肿瘤模型中分离的ptam与mtam进行了微阵列分析。发现il-35(由ebi3及il-12a组成)是在mtam中被上调的分泌因子。在4t1小鼠肿瘤模型中，相较于骨髓来源的巨噬细胞(bmdm)，在mtam中，而非在ptam中，注意到ebi3及il12a的表达显著地升高(图4a)。在这些小鼠的肺脏中，在f4/80+tam中，而非在f4/80-细胞中，注意到了il-35的表达，这证实了转移性肿瘤中il-35表达的来源(图4b)。相较于ptam及bmdm，ly6c-mtam分泌较高含量的il-35(图4c)。在人类癌症样品中，来自转移性肿瘤的cd14+tam与周围血单核细胞衍生的巨噬细胞(pmm)相比表达出较高量的ebi3及il12a(图4d)。体外极化的人类m2巨噬细胞表达并分泌大量的il-35(图4e)。此外，注意到以il-35预处理降低了4t1细胞、a549细胞、oecm1细胞，以及sas细胞的迁移能力(图4f)。接种以il-35预处理的sas细胞于裸鼠舌上增加了肿瘤细胞的转移性定殖(图4g)。一致地，在带有4t1-肿瘤的小鼠的气管内注射il-35中和抗体显著减少了肺脏转移，而不影响原发性肿瘤的生长(图4h)。抗il-35抗体对4t1细胞的增殖没有任何影响(数据未显示)。为了验证il-35在转移性定殖中的作用，我们在植入3周后的4t1小鼠模型中去除了原发性肿瘤。手术后，给小鼠施用抗il-35抗体、抗csf1r抗体或两者或igg同型对照(图4i)。手术后2周通过ivis分析监测转移的发展。抗il-35抗体或抗csf1r抗体的施用减少了转移的发展，抗il-35抗体及抗csf1r抗体的组合对防止转移具有最好的改善作用(图4j)。经抗il-35抗体处理或经抗csf1r抗体处理提高了小鼠的存活率。其中，接受组合治疗的小鼠(抗il-35与抗csf1r)显示出最佳的提高的存活率(图4k)。总之，这些结果表示巨噬细胞分泌的il-35在各种癌细胞的转移性定殖中具有重要的作用。此外，il-35的中和可减少小鼠的转移并提高存活率。实施例5：tnfα诱导癌细胞il-12rβ2的表达而促进转移性定殖我们接着研究了可接受tam信号的癌细胞上il-35受体的表达情况。il-35受体为包含il-12rβ2及gp130的异二聚体(collison等，2012年)。肿瘤坏死因子(tnf)-α，一种由巨噬细胞产生的促发炎细胞激素，可诱导emt(数据未显示)。我们检测tnfα引发(tnfα-primed)的癌细胞是否携带il-35受体以接受转移处的信号。m1-cm或tnfα在a549细胞中诱导emt标记(n-钙黏蛋白)与il-12rβ2的表达(图5a)。此外，tnfα上调了四种不同癌细胞株中il12rb2mrna的含量(图5b)。接着，我们阐释经tnfα引发的癌细胞在il-35调节信号导致的转移性定殖的作用。经tnfα预处理的a549细胞具有较高的肺脏定殖能力。与m2巨噬细胞的共注射显著增强了tnfα引发的癌细胞的定殖(图5c及图5d)。在4t1同源肿瘤模型中，抑制il-12rβ2表达减少了转移，而不影响原发性肿瘤的生长(图5e及图5f)。此外，在il12rb2基因敲低的肿瘤细胞组别，mtam引发的转移性定殖现象已消除(图5g)。公开资料库的分析显示癌症样本中高含量的il12rβ2与肺脏癌及胃癌患者的低生存率有关(图5h)。以ihc检测了91例头颈癌原发肿瘤中il-12rβ2的表达，结果显示高表达量的il-12rβ2与后续发生转移的较高可能性有相关性(表1)。此外，在10组配对的原发-转移性肿瘤样品中分析il-12rβ2的表达，显示转移性肿瘤中il-12rβ2的表达较高(图5i)。表1总而言之，这些数据标明，炎症诱导的emt上调了癌细胞中il-12rβ2的表达，这对于癌细胞响应于来自mtam的il-35以完成转移性定殖至关重要。材料与方法细胞株、质体，以及试剂。人类头颈癌细胞株sas(rid#cvcl_1675)、人类胚胎肾细胞株293t(atcccrl-11268)、人类肺癌细胞株a549(atccccl-185)、balb/c小鼠乳癌细胞株4t1(atcccrl2539)，以及c57bl/6小鼠肺脏癌细胞株llc1(atcccrl-1642)皆是购自atcc。人类头颈癌细胞株oecm1由张国威(kuo-weichang)博士提供(台湾阳明大学)。plko.1-对照(asn0000000004)、hil12rβ2#1shrna(trcn0000436750)、hil12rβ2#2shrna(trcn0000058158)、mil12rβ2#1shrna(trcn0000067720)，以及mil12rβ2#2shrna(trcn0000067721)获自台湾rnai核心设施以用于基因沉默。重组人类干扰素γ(ifn-γ)、白细胞介素-4(il-4)、巨噬细胞群落刺激因子(m-csf)，以及粒细胞巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)购自peprotech公司(rockyhill，纽泽西州)。重组人类tnfα购自abbiotec公司(目录号600173，abbiotec公司，sandiego，加州)。重组人类il-35购自biolegend公司(目录号578502，biolegend公司，sandiego，加州)。脂多醣(lps)与地塞米松购自sigma-aldrich公司(st.louis，密苏里州)。动物模型。动物实验由台北荣民总医院实验动物照护及使用委员会批准(iacuc2016-115)。我们使用三个模型来监测转移的发展。在同源及原位的小鼠肿瘤模型，将1.5×105个4t1细胞接种到5至6周龄的balb/c小鼠的乳腺脂肪垫。在同源模型，将1.5×105个llc细胞从皮下接种到c57bl/6小鼠中。在原位异种移植模型，将1×105个sas细胞植入6周龄裸鼠的舌头。4至5周后，在4t1及llc模型中检查转移性肺脏结节，并使用xenogenivis影像系统检查异种移植sas模型中的转移淋巴结。转移性定殖。为了测定转移性定殖的能力，将携带荧光素酶载体的癌细胞悬浮并注射到小鼠尾静脉中。通过肺脏表面结节测量肺脏转移，在肺脏石蜡切片上进行gfp染色，或用ivis系统进行活体外成像。向腹腔注射氯膦酸二钠脂质体(liposomalclodronate)以用于全身性消除巨噬细胞或于气管内注射以消除肺脏巨噬细胞。拦截转移信号的抗体也通过腹膜内或气管内递送。为了研究微转移对定殖的影响，在接种3周后手术切除4t1原位模型的原发性乳房肿瘤，并使用ivis影像来确认肿瘤完全切除。手术后，如图所示，以抗体、抑制剂或对照组处理小鼠。通过ivis成像显示复发/转移的肿瘤，并通过kaplan-meier方法评估小鼠的存活。从小鼠及人类肿瘤中分离tam。从新鲜的原发性及转移性肿瘤样品中分离tam。简言之，将组织切碎成小块，并以含有1.5mg/ml胶原酶iv(no.9001-12-1，thermofisherscientific公司，waltham，马萨诸塞州)与1.5mg/ml透明质酸酶(no.h6254，sigma-aldrich公司，st.louis，密苏里州)的dulbecco改良的eagle培养基(dmem)于37℃下处理1小时。随后通过200μm细胞过滤器过滤细胞。然后将细胞以700g离心20分钟，并使用percoll(no.17-5445-02，sigma-aldrich公司，st.louis，密苏里州)分离不同层的细胞。通过使用cd14微珠(no.130-050-201，miltenyibiotec公司，bergischgladbach，德国)的磁化细胞分离法(macs)分离人类tam，并使用bdfacsaria细胞分选仪(bdbiosciences，sanjose，加州)以图中所示的指示标记对小鼠tam进行分选。患者样本。该研究经台北荣民总医院人体试验委员会批准(2016-07-001cc)。本研究中使用了三组患者样本。第一组包括来自相同头颈癌患者的10个原发性及10个转移性肿瘤的石蜡包埋样品。这些样品用于il-12rβ2的ihc分析。第二组包括11个新鲜分离的原发性肿瘤(6个结肠癌、4个头颈癌，以及1个胃癌)与12个新分离的转移性肿瘤(7个结肠癌、4个头颈癌，以及1个胃癌)。以手术取得后立即以含有1.5mg/ml胶原酶iv与1.5mg/ml透明质酸酶的dmem培养基处理该样品，并以macs分离cd14+tam以用于随后的分析。将来自10个健康捐赠者的周围血单核细胞(pbmc)所极化的人类周围血单核细胞衍生的巨噬细胞(pmm)作为研究的对照组。第三组包括来自头颈癌症患者的91个肿瘤。这些样品用于il-12rβ2的ihc分析，并检查il-12rβ2表达量与癌症转移之间的相关性。定量rt-pcr。使用steponeplus即时pcr系统(appliedbiosystems公司，fostercity，加州)进行定量pcr。用于即时pcr的引子序列列于下表中的引子序列表。流式细胞仪。收获细胞并以pbs洗涤两次。然后将细胞与一级抗体(参见下表的抗体列表)于4℃下作用1小时，然后于4℃下与二级抗体作用30分钟。使用cytomicscxp分析软体(beckmancoulter公司，brea，加州)在cytomicstmfc500流式细胞仪(beckmancoulter公司，brea，加州)上分析染色的细胞。westernblot。以前人所述方法进行此实验流程(hsu等，2014年)。使用gelas-4000(gehealthcare公司，marlborough，马萨诸塞州)测量结果。巨噬细胞消除。氯膦酸二钠脂质体与磷酸盐缓衝溶液脂质体购自clodronateliposomes.org(haarlem，荷兰)。氯膦酸二钠在脂质体制剂中的浓度为5mg/ml。单剂量的氯膦酸二钠脂质体通过腹膜内(1mg/小鼠)或气管内(0.5mg/小鼠)注射在指定时间施用。内皮细胞微血管形成试验。使用条件培养基(获自bmdm、分选的tam、pmdm、m1巨噬细胞或m2巨噬细胞)将5×104个huvec细胞重新悬浮，然后将其直接接种于matrigel上。12小时后，通过测量分支数量以分析并定量微血管的形成。基因作用途径分析。如前所述(hsu等，2014年)，使用ingenuitypathwayanalysis(ipa；systems，www.ingenuity.com)进行途径及全局功能分析(pathwayandglobalfunctionalanalyses)。简而言之，上传包含基因标识符和相应表达值的数据集，并使用ingenuitypathwaysknowledgebase(ipkb)定位每个基因。公开资料库与gsea的分析。从网站(http://kmplot.com/analysis/)获得肺脏癌与胃癌患者基因表达的生存曲线。使用java程式(http://www.broadinstitute.org/gsea)执行gsea。使用核心emt基因特征(taube等人，2010年)以整合经m1-cm及m2-cm处理的a549细胞中的转录组变化。人类单核细胞的制备。通过以ficoll-paque(amershambiosciences公司，piscataway，新泽西州)的标准密度梯度离心从健康捐赠者的血液中分离周围单核细胞。随后使用抗-cd14微珠(no.130-050-201，miltenyibiotec公司，bergischgladbach，德国)通过高梯度磁分选从周围单核细胞纯化cd14+细胞。将cd14+单核细胞在含有hm-csf的rpmi-1640培养基(lifetechnologies公司，gaithersburg，马里兰州)中培养5天以进行m0巨噬细胞的极化。在第三天加入含有hm-csf(10ng/ml)的新鲜培养基。巨噬细胞极化与条件培养基收集。通过在5％fbsrpmi-1460培养基中分别加入1μg/mllps加上20ng/mlifn-γ或20ng/mlil-4加0.1μm地塞米松，将m0巨噬细胞极化为m1或m2巨噬细胞。48小时后，将极化巨噬细胞培养基更换为新鲜的培养基，再经48小时后即为不同的m1与m2条件培养基。酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)。使用il-35elisa试剂盒(目录号440508与439508，biolegend公司)测定条件培养基。将分选的tam或极化的巨噬细胞接种并培养24小时。离心后收集上清液，通过elisa测定il-35。免疫荧光。将细胞接种在涂有聚-l-离胺酸的切片上，以4％多聚甲醛固定，并用0.5％tritonx-100破膜。dapi用于核染色。使用装备有60x油物镜(olympusuplsapo60xo，na1.35)的olympusfluoviewfv10i激光扫描共焦显微镜(olympus公司，东京，日本)拍摄图像。使用共焦激光扫描显微镜依次收集图像，并使用olympusfv10-aswversion3.0软件分析。免疫组织化学染色。如先前所述(yang等，2010年)进行脱蜡、覆水、抗原修复(10mm柠檬酸钠缓衝液，ph6.0)、破膜化、抗体杂交及呈色。对于免疫组织化学分级，将il-12rβ2的强度定义为0、1+、2+，或3+。以每个样品的强度(0-3+)乘以表达百分比(0-100)定义免疫评分(h评分)。切片由两位人员独立评分。细胞活力与增殖试验。对于细胞活力测定，将每孔1×104个细胞接种在96孔盘中并作用整夜，然后以各种浓度的试剂处理。24小时后移除生长培养基，37℃下加入mtt检测液作用1小时。以二甲基亚砜溶解新形成的线粒体mtt晶体，再使用微量盘式分析仪读取吸光度。细胞迁移试验。使用具有8μm滤膜上室的transwells(greinerbio-one)评估细胞迁移。将悬浮于100μl的0.5％fbs培养基中的细胞(2×105个)施加到上室，并于下室添加600μl10％fbs培养基。24小时后，将滤膜以4％pfa固定，然后染色以显示。登录号码。用于条件培养基处理的a549细胞的cdna微阵列的数据集以登录号gse596943保藏在基因表达综合体资料库(geneexpressionomnibus，geo)中。将来自4t1小鼠模型的ptam与mtam(以bmdm作为对照)的cdna微阵列的数据集以登录号gse596944保藏在基因表达综合体资料库(geo)中。统计分析。使用双尾独立student’st-检验来比较两组之间的连续变量。卡方检验用于比较非二分变量。使用kaplan-meier评估与对数等级检验来比较患者组之间的存活率。所有统计数据皆独立收集，至少进行两次独立实验分析；p值<0.05被认为是显著的。当前第1页12当前第1页12