本发明涉及物质和蛋白质的共无定形形式。本发明还涉及包含共无定形形式的组合物，例如药学、化妆品、兽医用、食品或膳食组合物，并且涉及制备和使用该共无定形形式的方法。
背景技术：
口服递送是药物施用的优选方式，因为口服制剂生产成本低并且对患者方便。然而，水溶性差的结晶药物物质的口服制剂是制药工业的主要挑战，这是因为这些物质表现出差的溶解性和低溶出速率，导致生物利用度低并且治疗性能差。
先前已使用无定形制剂来解决这些问题。通过将药物的结晶形式转化为其无定形对应物，药物物质的溶解性和溶出速率增加，从而改善生物利用度和治疗功效(hancock等人，pharm.res.17(2000)pp.397-404)。然而，无定形药物形式在物理上是不稳定的，并且在储存过程中倾向于重新结晶回到难溶的结晶形式(laitinen等人，int.j.pharm.453(2013)pp.65-79)。因此，制药工业使对无定形药物形式稳定化的方法显得必要。值得注意的是，本领域需要新的赋形剂，其可以进一步改善共无定形制剂的稳定性和/或溶解性。
本发明的详细描述
本发明基于以下令人惊讶的发现：当蛋白质或肽，特别是天然肽或天然蛋白质用于产生难溶性物质(例如难溶性药物)的共无定形形式时，所得的无定形形式是物质和蛋白质在分子水平上结合的完全均质的单相体系。以这种方式，与没有任何蛋白质赋形剂的物质本身的无定形形式相比，水溶性和口服吸收得到改善。此外，与无定形形式的药物本身和物质与蛋白质的物理混合物相比，共无定形形式的物理稳定性也增加。本发明的另一个优点是它可以利用在食品生产过程例如乳制品生产中作为副产品大量生产的廉价的蛋白质或蛋白质混合物。因此，本发明提供了物质和蛋白质的共无定形形式。但是，本发明背景下的关注点是药物物质。
药物物质的无定形形式以及药物物质的固体分散体是已知的。与这些形式相比，药物物质和蛋白质的共无定形形式具有改善的溶解性和稳定性特征。当共无定形形式用于医学用途或化妆品用途时，蛋白质应该是生理学上可接受的并且没有任何有害的药理学作用。
一方面，本发明提供一种物质和蛋白质的共无定形形式，其中所述蛋白质选自乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白分离物、大豆蛋白水解物、大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、豆球蛋白、豌豆球蛋白、肌红蛋白、溶菌酶、牛血清蛋白、卵白蛋白分离物、卵白蛋白水解物、卵蛋白分离物、卵清蛋白、卵粘蛋白、卵球蛋白、卵白素、卵类粘蛋白、卵转铁蛋白、酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白g、乳铁蛋白、角蛋白、大米蛋白分离物、大米蛋白水解物、扁豆蛋白分离物、豌豆蛋白分离物、蚕豆蛋白分离物、鹰嘴豆蛋白分离物、蟋蟀蛋白、蚕蛹蛋白、南瓜籽蛋白、大麻蛋白、胶原蛋白和明胶。
以下蛋白质在所附实施例中以共无定形形式使用：蛋白质是乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物、大豆蛋白分离物、大豆蛋白水解物、肌红蛋白、溶菌酶、卵蛋白分离物、卵白蛋白分离物、卵白蛋白水解物、卵蛋白分离物、卵清蛋白、酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白g、大米蛋白分离物、大米蛋白水解物和胶原蛋白。
水解物通常是购买的。它们可以通过将蛋白分离物暴露于高温和酶混合物中以使蛋白质变性并消化成几个氨基酸的小片段，从而制备。乳清蛋白水解物供应商在他们的网页上指出，他们使用酶将蛋白质消化成较小的片段，从而假设他们出于此目的使用酶混合物。
在本文的实施例中，仅使用两种单独的蛋白水解酶，即胰蛋白酶和胃蛋白酶。这些酶存在于人胃肠道，研究是否通过这样的单独的酶的消化会对所得到的产物的性能具有影响。以这种方式，更容易基于被给定的酶切割的链来鉴定水解的影响。如果一起使用几种酶，则更难以确定对于购买的wph而言由这些酶进行的消化的单独影响。
购买的wph与本发明人制备的由胃蛋白酶和胰蛋白酶消化的乳清蛋白之间存在差异是很自然的。水解物的供应商最有可能优化酶混合物和比例，以便获得对于使用这些作为运动补充剂的人们而言安全且性能良好的产品。
为了选择蛋白质和物质(特别是药物物质)的最佳组合，进行了以下一般性观察(参见实验部分)：
与活性物质的结晶形式的溶出速率相比，蛋白质和活性(药物)物质的共无定形形式的溶出速率在下列情况下的增加最高：
i)蛋白质和药物分子具有相反的电荷；观察到的影响很可能是基于物质的电荷，从而使得具有吸引力或排斥力。对于蛋白质，这是它的净电荷；或
ii)选择含有蛋白质混合物的蛋白质；这些蛋白质是乳清蛋白分离物、大米蛋白分离物、卵蛋白分离物和大豆蛋白分离物，或
iii)选择高分子量蛋白质，或
iv)选择乳清蛋白分离物。
关于乳清蛋白分离物，本文的实施例显示乳清蛋白分离物通常优于所有其他测试的蛋白质，并且上述一般但非必要的指导原则对乳清蛋白有效，因为它似乎具有非常合适的性质。
关于共无定形形式的物理稳定性(参见实施例6)，本文的实施例显示含有蛋白质比如乳清蛋白分离物、乳清蛋白水解物的共无定形形式通常具有优异的稳定性。值得注意的是，与任何其他测试的蛋白质相比，基于乳清蛋白分离物或乳清蛋白水解物的共无定形形式具有显著改善的物理稳定性。取决于所用药物物质，含有蛋白质比如卵清蛋白、酪蛋白、胶原蛋白、溶菌酶、肌红蛋白的共无定形形式可具有合适稳定性。与牛血清蛋白或与明胶的共无定形形式似乎不具有合适的稳定性。
如实施例中所证明的，乳清蛋白分离物和乳清蛋白水解物已被证明是适用于本发明背景的蛋白质。由于这些蛋白质含有单独的蛋白质/肽/氨基酸的混合物，因此预期这些蛋白质的任何组合都适合使用。因此，与本发明有关的特别相关的是选自β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、免疫球蛋白g、牛血清蛋白和乳铁蛋白及其水解物的蛋白质。基于蛋白质的总重量，牛血清蛋白在这样的组合中的存在量应为最多15％w/w，例如最多10％w/w。
值得注意的是，本发明提供了药物物质和蛋白质的共无定形形式，其中蛋白质是乳清蛋白分离物或乳清蛋白水解物。特别是天然乳清蛋白分离物(非变性)是令人感兴趣的。乳清蛋白分离物通常包含β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、免疫球蛋白g、牛血清蛋白和乳铁蛋白。然而，乳清蛋白分离物还可以包含较少量(总量不超过5％w/w，例如约0％w/w至约5％w/w)的其他成分，例如(但不限于)其他蛋白质、肽、碳水化合物、脂质矿物质、维生素和/或水。
乳清蛋白分离物通常包含约50％至约70％的β-乳球蛋白、约10％至约25％的α-乳清蛋白、约10％至约20％的免疫球蛋白g、约1％至约10％的牛血清蛋白、和约1％％至约10％的乳铁蛋白。
因此，包含以下物质的蛋白质或蛋白质混合物落在本发明的范围内：
i)至少约50％w/w的β-乳球蛋白，
ii)至少约10％w/w的α-乳清蛋白，
iii)至少约10％w/w的免疫球蛋白g，
iv)至少约1％w/w的牛血清蛋白，或
v)至少约1％w/w的乳铁蛋白，或
vi)其混合物。
虽然商业上可获得的乳清蛋白分离物的构成是明确定义的，但不能排除含量可能发生某些变化。因此，在本发明的范围内，乳清蛋白分离物如下限定：
i)乳清蛋白分离物，包含：
50％至70％的β-乳球蛋白
10％至25％的α-乳清蛋白
10％至20％的免疫球蛋白g
1％至10％的牛血清蛋白
1％至10％的乳铁蛋白
ii)乳清蛋白分离物，包含：
50％至70％的β-乳球蛋白
10％至25％的α-乳清蛋白
10％至15％的免疫球蛋白g
5％至10％的牛血清蛋白
1％至5％的乳铁蛋白
iii)乳清蛋白分离物，包含：
52％至72％的β-乳球蛋白
14％至22％的α-乳清蛋白
11％至16％的免疫球蛋白g
2％至8％的牛血清蛋白
2％至8％的乳铁蛋白
iv)乳清蛋白分离物，包含：
53％至68％的β-乳球蛋白
14％至22％的α-乳清蛋白
11％至15％的免疫球蛋白g
4％至8％的牛血清蛋白
2％至6％的乳铁蛋白。
商业上可获得的乳清蛋白分离物被描述为包含约55％至约65％的β-乳球蛋白、约15％至约21％的α-乳清蛋白、约13％至约14％的免疫球蛋白g、约7％的牛血清蛋白、和约3％的乳铁蛋白(dewit，乳业科学81(1998)，pp.597-608和jenness,奶蛋白v1中奶的蛋白质组成：化学和分子生物学(proteincompositionofmilkinmilkproteinsv1:chemistryandmolecularbiology),学术出版社,2012。更具体地，根据本发明使用的乳清蛋白分离物包括：
i)乳清蛋白分离物，包含：
55％的β-乳球蛋白，
21％的α-乳清蛋白，
14％的免疫球蛋白g，
7％的牛血清蛋白，和
3％的乳铁蛋白。
ii)乳清蛋白分离物，包含：
65％的β-乳球蛋白，
15％的α-乳清蛋白，
13％的免疫球蛋白g，
7％的牛血清蛋白，和
0％的乳铁蛋白。
如上所述，根据本发明的用于共无定形形式的另一种合适的乳清蛋白是乳清蛋白水解物。乳清蛋白水解物是衍生自乳清蛋白分离物的蛋白质/肽/氨基酸的混合物，所述乳清蛋白分离物经历任何形式的化学、酶、物理或机械降解并任选地被纯化以产生包含乳清蛋白分离物的相应降解产物的水解物。
本发明特别关注具有低水溶性并且希望增加水溶性或溶出速率的物质。本发明还感兴趣于如下的情况：物质优选以无定形形式使用，但无定形形式不具有合适的储存稳定性。这些物质包括催化剂、化学试剂、营养素、食品成分、酶、杀细菌剂、杀虫剂、杀真菌剂、消毒剂、芳香剂、调味剂、肥料和微量营养素以及药物物质。
本发明的主要焦点是当物质是治疗上、预防上和/或诊断上有活性的药物物质的情况。可替代地，该物质可用于治疗、预防或诊断目的。
在本发明的背景下，药物物质的低溶解度根据美国食品和药物管理局(fda)提供和定义的生物药剂学分类体系(bcs)来定义。术语“溶解性”在本文中是指化合物在溶剂中溶解以形成溶液的能力。与本公开特别相关的是根据四种不同类别的药物对术语“难溶或不溶”的定义：
·i类-高渗透性，高溶解性(渗透性和溶解性均不限制药物化合物的口服生物利用度)
·ii类-高渗透性，低溶解性(低溶解性限制药物化合物的口服生物利用度)
·iii类-低渗透性，高溶解性(低渗透性限制药物化合物的口服生物利用度)
·iv类-低渗透性，低溶解性(渗透性和溶解性均限制药物化合物的口服生物利用度)
根据该分类，如果最高剂量强度在1至7.5的ph范围内不溶于250ml或更少的水性介质，则药物具有低溶解性。
用于确定物质溶解性的溶剂是水性介质。水性介质可含有一种或多种ph调节剂或缓冲剂以确保ph特定在1至7.5的范围内，或者水性介质可以是水。
令人感兴趣的是根据本发明的共无定形形式，其含有通常不能通过口服途径施用的药物物质，例如bcs4类药物。其他感兴趣的药物物质可以是那些例如由于存在外排泵或类似的减少或阻止药物物质摄取的生理机制而不能口服施用的药物物质。对于这样的药物物质，需要显著改善的制剂以避免仅通过胃肠外途径施用，这样的胃肠外途径施用通常要涉及受过教育的卫生保健人员。
然而，预期本发明的概念具有一般特征，即它可以应用于所有类型的药物物质，因为具有溶解度的稳定性改善的优点。这样的药物物质可以选自：抗生素，例如阿莫西林；
抗感染药剂，例如阿昔洛韦、阿苯哒唑、阿尼芬净、阿奇霉素、头孢地尼、头孢托仑、头孢克肟、头孢替安、头孢泊肟、头孢呋辛酯、克拉红霉素、氯喹、环丙沙星、克拉霉素、氯法齐明、可比司他、氨苯砜、达托霉素、二氯尼特、强力霉素、依法韦仑、埃替格韦、红霉素、依曲韦林、灰黄霉素、茚地那韦、伊曲康唑、伊维菌素、利奈唑胺、洛匹那韦、甲苯咪唑、甲氟喹、甲硝唑、米卡芬净、萘啶酸、奈非那韦、奈韦拉平、氯硝柳胺、呋喃妥因、制霉菌素、吡喹酮、噻嘧啶、乙胺嘧啶、奎宁、利福平、利匹韦林、利托那韦、罗红霉素、沙奎那韦、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、舒他西林、托氟沙星和甲氧苄啶；
抗肿瘤药剂，例如比卡鲁胺、环丙孕酮、多西紫杉醇、吉非替尼、伊马替尼、伊立替康、紫杉醇、他莫昔芬；和心血管药剂，例如乙酰唑胺、阿托伐他汀、乙酰唑胺、贝尼地平、坎地沙坦、坎地沙坦西酯(cilexetil)、卡维地洛、西洛他唑、氯吡格雷、依普罗沙坦、二十碳五烯酸乙酯、依泽替米贝、非诺贝特、呋塞米、氢氯噻嗪、厄贝沙坦、洛伐他汀、马尼地平、硝苯地平、尼伐地平、奥美沙坦、辛伐他汀、螺内酯、替米沙坦、噻氯匹定、三氟柳(triflusal)、缬沙坦、维拉帕米和华法林；
cns药剂，例如醋氯芬酸、对乙酰氨基酚、乙酰水杨酸、阿立哌唑、卡马西平、卡立普多、塞来昔布、氯丙嗪、氯硝西泮、氯氮平、地西泮、双氯芬酸、氟比洛芬、氟哌啶醇、布洛芬、酮洛芬、拉莫三嗪、左旋多巴、劳拉西泮、美洛昔康、美他沙酮、哌甲酯、甲氧氯普胺、莫达非尼、大麻隆、萘丁美酮、尼麦角林、尼美舒利、奥氮平、奥卡西平、羟考酮、苯巴比妥、苯妥英、喹硫平、利培酮、罗非考昔、舍曲林、舒必利、丙戊酸和扎托洛芬；
皮肤病药剂，例如异维甲酸；内分泌和代谢药剂，例如卡麦角林、地塞米松、依帕司他、硫酸雌酮、格列本脲、格列齐特、格列美脲、格列吡嗪、甲羟孕酮、醋酸炔诺酮、吡格列酮、泼尼松、丙硫氧嘧啶和雷洛昔芬；
胃肠道药剂，例如比沙可啶、法莫替丁、美沙拉嗪(mesalamie)、莫沙必利、奥利司他、瑞巴派特、番泻苷a、柳氮磺胺吡啶、替普瑞酮和熊去氧胆酸；
营养药剂，例如叶酸、四烯甲萘醌、视黄醇和生育酚烟酸酯；
呼吸道药剂，例如依巴斯汀、羟嗪、l-羧甲司坦、氯雷他定、普仑司特和茶碱；
抗高尿酸血症药剂，例如别嘌呤醇；
以及用于治疗勃起功能障碍的药剂，例如西地那非和他达拉非。
关于上述的药物物质，可以设想，任何这些药物物质与选自那些本文所提及的蛋白特别是选自乳清蛋白分离物或乳清蛋白水解物或选自其组分或其任意组合(即α-乳清蛋白、β-乳球蛋白、免疫球蛋白g、牛血清蛋白和乳铁蛋白)的共无定型形式将在改善药学性质如改善稳定性和溶解性方面提供益处。尤其是，蛋白质是乳清蛋白分离物和/或乳清蛋白水解物。
根据本发明的物质和蛋白质的共无定形形式可含有1％w/w至95％w/w的所述物质和5％w/w至99％w/w的蛋白质。因此，共无定形形式可含有约2.5％w/w至90％w/w或约10％w/w至约80％w/w的所述物质。从实施例中可以看出，可以用各种浓度的药物和蛋白质获得希望的结果。合适的实施例包括含有约25％w/w至约75％w/w药物物质的共无定形形式。
根据本发明的共无定形形式可以根据该形式的具体用途配制成合适的应用形式。在该物质用于药品或化妆品用途的那些情况下，可以将共无定形形式配制成药物组合物或化妆品组合物。此类组合物包括用于口服、局部、粘膜、肺部、胃肠外、舌下、鼻、眼和肠内施用的组合物。如果可能，口服施用途径是优选的。
此类组合物可包含一种或多种药学上或化妆品上可接受的赋形剂。药学或化妆品制剂领域的技术人员将知道如何配制特定组合物，例如在雷明顿药学科学(remington'spharmaceuticalsciences)，第18版，马克出版公司(mackpublishingcompany)，1990的指导下。
给定一种特定物质，可以基于单个组分的物理化学性质选择用于形成共无定形形式的蛋白质。这样的选择或匹配可以根据大小(例如分子量和/或流体动力学体积)、疏水性(例如疏水性物质/疏水性蛋白质或亲水性物质/亲水性蛋白质)和/或静电相互作用(例如阴离子物质/阳离子蛋白质、阳离子物质/阴离子蛋白质和中性物质/中性蛋白质)进行。然而，也可以根据所讨论的物质预想其他选择和匹配的标准。
在一个方面，本发明提供了一种制备物质和蛋白质的共无定形形式的方法，其中所述共无定形形式通过热力学方法或通过动力学无序化过程制备，所述热力学方法例如喷雾干燥、溶剂蒸发、冷冻干燥、超临界流体沉淀、熔体淬火、热熔挤出、2d打印和3d打印，所述动力学无序化过程例如为包括球磨和低温碾磨的任何类型的碾磨过程。
如本文实施例所示，喷雾干燥提供了优异的结果。
制备如本发明所定义的共无定形形式的方法包括：
i)将物质和蛋白质置于容器中，并密封容器，
ii)通过机械活化将物质与蛋白质一起物理无序化，直至物质和蛋白质被完全破坏，获得共无定形产物，
iii)同时混合物质和蛋白质，
以获得包含物质和蛋白质的均质的共无定形单相体系。
制备如本发明所定义的共无定形形式的另一种方法包括：
i)将物质和蛋白质溶解在溶剂或溶剂混合物中以形成单相溶液，
ii)从来自步骤i)的所得溶液中除去溶剂，
以获得包含该物质和蛋白质的均质的单相共无定形混合物。
制备如本发明所定义的共无定形形式的又另一种方法包括：
i)将物质和蛋白质溶解在溶剂或溶剂混合物中以形成单相溶液，
ii)冷冻来自步骤i)的单相溶液，
iii)通过升华从来自步骤ii)的所得冷冻单相中除去溶剂或溶剂混合物，
以获得包含该物质和蛋白质的均质的单相共无定形混合物。
从本文的实施例中可以看出，合适的溶剂是水性溶液中的水。为了获得共无定形形式，似乎不需要ph调节，有机溶剂似乎也不是必需的。在实施例中，已将水用作溶剂。
制备如本发明所定义的共无定形形式的又另一种方法包括：
i)混合物质和蛋白质以获得两种组分的物理混合物，
ii)通过将混合物加热到高于药物的熔点、蛋白质的熔点或两者一起的熔点来使来自步骤i)的所得物理混合物无序化，以获得包含物质和蛋白质的均质的单相熔体，
iii)将来自步骤ii)的单相熔体冷却至低于玻璃化转变温度，
以获得包含该物质和蛋白质的均质的单相共无定形混合物。
药物物质和蛋白质的共无定形形式(药物物质为胃肠系统中外排泵的底物)
特别感兴趣的是通常通过口服途径施用的蛋白质和药物物质(例如抗癌药物物质)的共无定形形式，但是为此需要可替代的制剂以改善治疗功效和患者依从性。
为了产生治疗作用，任何口服施用的药物物质必须首先在肠液中溶解，然后渗透肠壁。因此，药物物质的充分水溶解和肠渗透性对于获得可接受的生物利用度是重要的。然而，许多药物物质如抗癌药物物质显示出差的水溶性，导致口服生物利用度低，因此药物作用效率低。
生物利用度差的另一个原因也可能是肠道吸收不良。许多药物物质(例如一些抗癌药物)吸收差的原因是这些药物物质是所谓的肠道外排泵如p-糖蛋白(也称为多药耐药蛋白或mdr1，除胃肠道外，还位于肝脏和肾脏以及血脑屏障中)的底物。这种外排泵通常位于肠的吸收细胞层中，其主要目的是通过将外来或有毒物质泵回肠腔来保护身体。许多药物物质如一些抗癌药物物质是这些外排泵的底物。然而，一些抗癌药物物质如比卡鲁胺除了具有抗癌作用外，还显示出外排泵抑制作用。
对于一些药物例如抗癌药物多西紫杉醇，情况变得更具挑战性，因为所述药物物质溶解性差且吸收性差，导致两种递送屏障。因此，这些药物物质的优选施用途径是通过静脉输注。然而，由于药物溶解性很差，仍然需要添加增溶剂和溶剂，这些增溶剂和溶剂可能对身体有害并可能引起刺激和严重的过敏反应。可注射制剂还需要是无菌的，这将是昂贵的并且仍具有感染的风险。此外，由于患者需要在输注期间住院，因此需要经过培训的工作人员进行管理。最后，静脉内疗法如化学疗法通常不如它们对应的口服疗法更有利，因为它们通常每2至3周施用一次，因此与每日口服疗法相比，导致药物物质的血浆分布更不均匀。因此，允许将静脉内疗法改为口服疗法的技术具有许多优点。
共无定形形式例如药物物质和蛋白质的共无定形形式对于通常仅通过静脉内途径可用的药物物质提供了口服施用方法，因为共无定形形式增加了药物物质的溶解度和稳定性，从而导致生物利用度提高。
特别地，共无定形形式可用于共同递送难溶性药物物质例如作为外排泵(例如p-糖蛋白)的底物的多西紫杉醇，以及另一种难溶性药物物质例如除了具有治疗作用还是所述外排泵的抑制剂的比卡鲁胺。通过将这些药物物质包含在相同的共无定形形式中，药物物质可以经分子间相互作用(例如氢键或离子相互作用)在无定形形式中使彼此稳定。由于稳定的无定形体系，两种难溶性药物物质都具有更高的溶解度和稳定性，这导致胃肠道中溶解的药物物质中能够吸收的量更高。此外，通过在相同的共无定形形式中包含外排泵底物和外排泵抑制剂，外排泵底物的摄取将得到改善，这导致口服生物利用度增加。
除了比卡鲁胺和多西紫杉醇配对之外，以下配对例示了外排泵底物和外排泵抑制剂的组合：他林洛尔和柚皮苷，利托那韦和槲皮素。
其他实例可以在文献中找到并且在本发明的范围内，其中一种或多种药物物质已经与蛋白质共无定型化。
定义
“物质”：
根据本发明，在共无定形形式的背景下，术语“物质”定义为一种或多种物质。因此，根据本发明，术语“物质和蛋白质的共无定形形式”描述了包含一种或多种物质的共无定形形式。术语“药物物质”描述了治疗或预防活性物质。
“蛋白质”：
根据本发明，在共无定形形式的背景下使用的术语“蛋白质”涉及一种或多种蛋白质，例如单一蛋白质、蛋白质混合物、蛋白质/肽/氨基酸混合物、蛋白质/氨基酸混合物、和肽/氨基酸混合物。
“乳清蛋白分离物”：
根据本发明，乳清蛋白分离物(wpi)定义为包含β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、免疫球蛋白g、牛血清蛋白和/或乳铁蛋白的蛋白质混合物。
通常，乳清蛋白分离物包含约50％w/w至约70％w/w的β-乳球蛋白、约10％w/w至约25％w/w的α-乳清蛋白、约10％w/w至约20％w/w的免疫球蛋白g、约1％w/w至约10％w/w的牛血清蛋白和约1％w/w至约10％w/w的乳铁蛋白。任选地，乳清蛋白分离物还可以包含较少量(总共不超过5％w/w)的其他成分，例如(但不限于)其他蛋白质、肽、碳水化合物、脂质、矿物质、维生素或水。
“乳清蛋白水解物”
根据本发明，乳清蛋白水解物被定义为衍生自乳清蛋白分离物的蛋白质/肽/氨基酸的混合物，其经历任何形式的化学、酶、物理或机械降解过程并任选地被纯化以产生包含乳清蛋白分离物的相应降解产物的水解物。
“共无定形”：
根据本发明，术语“共无定形”是指形成均质的无定形单相体系的两种或更多种组分的组合，其中组分在分子水平上紧密混合。“共无定形”样品可通过热力学方法或通过动力学无序化方法制备。xrpd与dsc一起用于鉴定样品在制备后是否是“共无定形”的。
附图说明
图1
吲哚美辛(ind)、卡维地洛(car)，对乙酰氨基酚(par)和呋塞米(fur)与乳清蛋白分离物(wpi)或乳清蛋白水解物(wph)的共无定形形式的xrpd衍射图。所有共无定形形式通过喷雾干燥获得。图(i)：a＝ind-wpi，b＝car-wpi，c＝par-wpi，d＝fur-wpi。图(ii)：a＝ind-wph，b＝car-wph，c＝par-wph，d＝fur-wph。
图2
结晶吲哚美辛(cind)、无定形吲哚美辛(aind)、通过球磨获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白分离物(bmind-wpi)、通过球磨获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白水解物(bmind-wph)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白分离物(sdind-wpi)、和通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白水解物(sdind-wph)的固有溶出速率。
图3
(a)结晶卡维地洛(ccar)、无定形卡维地洛(acar)、通过球磨获得的共无定形卡维地洛-乳清蛋白分离物(bmcar-wpi)、通过球磨获得的共无定形卡维地洛-乳清蛋白水解物(bmcar-wph)、通过喷雾干燥获得的共无定形卡维地洛-乳清蛋白分离物(sdcar-wpi)、和通过喷雾干燥获得的共无定形卡维地洛-乳清蛋白水解物(sdcar-wph)的固有溶出速率；(b)结晶对乙酰氨基酚(cpar)，无定形对乙酰氨基酚(apar)、通过球磨获得的共无定形对乙酰氨基酚-乳清蛋白分离物(bmpar-wpi)、通过球磨获得的共无定形对乙酰氨基酚-乳清蛋白水解物(bmpar-wph)、通过喷雾干燥获得的共无定形对乙酰氨基酚-乳清蛋白分离物(sdpar-wpi)、通过喷雾干燥获得的共无定形对乙酰氨基酚-乳清蛋白水解物(sdpar-wph)的固有溶出速率；(c)结晶呋塞米(cfur)、无定形呋塞米(afur)、通过球磨获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(bmfur-wpi)、通过球磨获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白水解物(bmfur-wph)、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(sdfur-wpi)、和通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白水解物(sdfur-wph)的固有溶出速率。
图4
(a)结晶吲哚美辛(cind)、无定形吲哚美辛(aind)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白分离物(sdind-wpi)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛与乳清蛋白分离物(胰蛋白酶消化的)(sdind-wpienzt)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛与乳清蛋白分离物(胰蛋白酶消化后胃蛋白酶消化的)(sdind-wpienzt+p)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛与乳清蛋白分离物(胃蛋白酶消化的)(sdind-wpienzp)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛与乳清蛋白分离物(胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化的)(sdind-wpienzp+t)的固有溶出速率；(b)结晶吲哚美辛(cind)、无定形吲哚美辛(aind)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-乳清蛋白分离物(sdind-wpi)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-牛血清蛋白(sdind-bsa)、通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-α-乳清蛋白(sdind-α乳清蛋白)、和通过喷雾干燥获得的共无定形吲哚美辛-β-乳球蛋白(sdind-β乳球蛋白)的固有溶出速率。
图5
结晶吲哚美辛(cind)、无定形吲哚美辛(aind)、吲哚美辛和乳清蛋白分离物的物理混合物(pmind-wpi)、通过球磨获得的吲哚美辛和乳清蛋白分离物的共无定形形式(bmind-wpi)、和通过喷雾干燥获得的吲哚美辛和乳清蛋白分离物的共无定形形式(sdind-wpi)的粉末溶出研究。
图6
乳清蛋白分离物(wpi)分别与吲哚美辛(ind)、卡维地洛(car)、对乙酰氨基酚(par)和呋塞米(fur)的共无定形形式的稳定性。测量wpi与ind、car和fur的混合物的5个月稳定性数据，并测量par-wpi的1个月稳定性，使用x射线粉末衍射(xrpd)进行评估。通过喷雾干燥获得所有共无定形混合物。a＝par-wpi，b＝fur-wpi，c＝car-wpi，d＝ind-wpi。每个月进一步进行稳定性研究直至药物开始重结晶，数据在表3中示出。
图7
结晶呋塞米(结晶fur)、无定形呋塞米(无定形fur)、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-聚乙烯吡咯烷酮(25:75w/w)(sdfur-pvp(75:25))、呋塞米-乳清蛋白分离物的物理混合物(50:50w/w)(pmfur-wpi(50:50))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(25:75w/w)(sdfur-wpi(25:75))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(50:50w/w)(sdfur-wpi(50:50))、和通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(75:25w/w)(sdfur-wpi(75:25))的绝对生物利用度。在口服施用于大鼠之后评估生物利用度。在实验中包括聚乙烯吡咯烷酮，因为它是制造固体分散体最常用的赋形剂，在优化具有差的溶解性和/或稳定性的药物物质的溶解性和/或稳定性方面，这是无定形化的主要竞争性技术。通过改变wpi的含量同时保持fur的含量恒定来改变wpi和fur的比例。
图8
结晶呋塞米(结晶fur)、无定形呋塞米(无定形fur)、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-聚乙烯吡咯烷酮(25:75w/w)(sdfur-pvp(75:25))、呋塞米-乳清蛋白分离物的物理混合物(50:50w/w)(pmfur-wpi(50:50))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(25:75w/w)(sdfur-wpi(25:75))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(50:50w/w)(sdfur-wpi(50:50))、和通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(75:25w/w)(sdfur-wpi(75:25))的血流中最大浓度(cmax)。在口服施用于大鼠之后评估生物利用度。在实验中包括聚乙烯吡咯烷酮，因为它是制造固体分散体最常用的赋形剂，在优化具有差的溶解性和/或稳定性的药物物质的溶解性和/或稳定性方面，这是无定形化的主要竞争性技术。通过改变wpi的含量同时保持fur的含量恒定来改变wpi和fur的比例。
图9
结晶呋塞米(结晶fur)、无定形呋塞米(无定形fur)、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-聚乙烯吡咯烷酮(25:75w/w)(sdfur-pvp(75:25))、呋塞米-乳清蛋白分离物的物理混合物(50:50w/w)(pmfur-wpi(50:50))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(25:75w/w)(sdfur-wpi(25:75))、通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(50:50w/w)(sdfur-wpi(50:50))、和通过喷雾干燥获得的共无定形呋塞米-乳清蛋白分离物(75:25w/w)(sdfur-wpi(75:25))的固有溶出速率。在实验中包括聚乙烯吡咯烷酮，因为它是制造固体分散体最常用的赋形剂，在优化具有差的溶解性和/或稳定性的药物物质的溶解性和/或稳定性方面，这是无定形化的主要竞争性技术。通过改变wpi的含量同时保持fur的含量恒定来改变wpi和fur的比例。
图10
吲哚美辛(ind)与各种蛋白质的共无定形形式的xrpd衍射图。通过喷雾干燥获得所有共无定形形式。a：sdind-大豆，b：sdind-大米，c：sdind-卵，d：sdind-明胶，e：sdind-胶原蛋白，f：sdind-肌红蛋白，g：sdind-溶菌酶，和h：sdind-酪蛋白。
图11(i)和(ii)
(i)sdind-明胶、sdind-卵、sdind-大豆、cind、aind的固有溶出速率；(ii)sdind-肌红蛋白、sdind-溶菌酶、sdind-胶原蛋白、sdind-酪蛋白、cind、aind的固有溶出速率。
图12
a：sdind-卵清蛋白，b：sdcel-wpi，c：sdcel-肌红蛋白，d：sdcel-溶菌酶，e：sdcel-酪蛋白，f：sdcel-胶原蛋白的xrpd衍射图。
图13
(i)sdind-肌红蛋白、sdind-溶菌酶、sdind-胶原蛋白、sdind-酪蛋白、sdind-wpi的固有溶出速率；(ii)sdcel-肌红蛋白、sdcel-溶菌酶、sdcel-胶原蛋白、sdcel-酪蛋白、sdcel-wpi的固有溶出速率；(iii)sdcar-肌红蛋白、sdcar-溶菌酶、sdcar-胶原蛋白、sdcar-酪蛋白、sdcar-wpi的固有溶出速率。
图14
(i)sdind-卵、sdind-大米、sdind-大豆、sdind-wpi、sdind-明胶的固有溶出速率；(ii)sdind-bsa、sdind-卵清蛋白、sdind-酪蛋白、sdind-wpi的固有溶出速率。
图15
(i)sdind-肌红蛋白、sdind-溶菌酶、sdind-胶原蛋白、sdind-酪蛋白、sdind-wpi的固有溶出速率(idr)；ii)sdcel-肌红蛋白、sdcel-溶菌酶、sdcel-胶原蛋白、sdcel-酪蛋白、sdcel-wpi的固有溶出速率(idr)；iii)sdcar-肌红蛋白、sdcar-溶菌酶、sdcar-胶原蛋白、sdcar-酪蛋白、sdcar-wpi的固有溶出速率(idr)；其中idr被绘制为蛋白质的等电点(pi)的函数。
图16
sdind-bsa，sdind-卵清蛋白，sdind-酪蛋白，sdind-wpi的固有溶出速率(idr)；其中(i)将idr绘制为蛋白质分子量(mw)的函数；(ii)idr被描述为蛋白质的等电点(pi)的函数。
图17
sdind-卵，sdind-大米，sdind-大豆，sdind-wpi，sdind-明胶的固有溶出速率(idr)；其中idr被绘制为蛋白质的等电点(pi)的函数。
图18
a：sdcar-肌红蛋白，b：sdcar-溶菌酶，c：sdcar-胶原蛋白，d：sdcar-酪蛋白的xrpd衍射图。
图19
在制备各共无定形制剂后20个月，sdind-wpi和sdind-wph的xrpd衍射图。
缩略语
bm，球磨
car，卡维地洛
cel，塞来昔布
fur，呋塞米
idr，固有溶出速率
ind，吲哚美辛
pi，等电点
lc-ms，液相色谱-质谱法
mdsc，调制式差示扫描量热法
mw，分子量
par，对乙酰氨基酚
pm，物理混合物
pvp，聚乙烯吡咯烷酮
sd，喷雾干燥
tga，热重分析
uvvis，紫外分光光度法
xrpd，x射线粉末衍射
wph，乳清蛋白水解物
wpi，乳清蛋白分离物
实验
材料
吲哚美辛(ind)购自hawkins，inc.(明尼阿波里斯市，mn，美国)。卡维地洛(car)购自ciplaltd.(印度孟买)，对乙酰氨基酚(par)购自fagron(丹麦哥本哈根)，呋塞米(fur)购自sigma-aldrich(圣路易，mo，美国)。所有这些粉末均为试剂级并按原样使用。乳清蛋白分离物(wpi)、乳清蛋白水解物(wph)、大米蛋白分离物、大豆蛋白分离物和卵蛋白分离物购自lspsporternahrung(德国波恩，www.lsp-sports.de)。聚乙烯吡咯烷酮(pvp，
方法
喷雾干燥：
以1:1的重量比制备ind、car、par、cel和fur与wpi或wph的物理混合物(用刮刀在容器中混合在一起的粉末)。然后将混合物溶解在由来自labwater(洛杉矶，ca，美国)的milliq水系统新鲜制备的250mlmilliq水(18.2μω，23.8℃)中。每种溶液中药物物质-wpi/wph的浓度为4mg/ml。使用装有除湿器(büchib296)的büchib-290喷雾干燥器(büchilabortechnikag，弗拉维尔，瑞士)进行喷雾干燥。喷雾干燥条件如下：入口温度：120℃；出口温度：约62℃；雾化空气流量：667升/小时；干燥空气流量(氮气)：40m3/小时，进料流速：9ml/分钟。为了进一步研究共无定形形式的溶出行为，将ind与wpi的主要成分(分别为α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和牛血清蛋白(bsa))一起喷雾干燥，并且与经历酶消化(分别经历胰蛋白酶消化、胃蛋白酶消化、胰蛋白酶消化后胃蛋白酶消化、和胃蛋白酶消化后胰蛋白酶消化)的wpi一起喷雾干燥。对于每100mgwpi，使用1mg酶进行酶促消化过夜。胃蛋白酶消化在ph8下进行，胰蛋白酶消化在ph3下进行。为了分析药物物质与不同性质的蛋白质的溶出性能，将ind与大米蛋白分离物、卵蛋白分离物、大豆蛋白分离物，卵清蛋白、胶原蛋白、明胶、肌红蛋白、溶菌酶和酪蛋白一起喷雾干燥，将cel和car与wpi、肌红蛋白、溶菌酶、胶原蛋白和酪蛋白一起喷雾干燥。
球磨：
为了将通过喷雾干燥获得的共无定形形式与通过球磨获得的共无定形形式进行比较，在冷室(4℃)中使用mixermillmm400(retsch，gmbh&co.，哈恩，德国)对ind、car、par和fur与wpi或wph的物理混合物进行振动球磨。通过将重量比为1:1的700mg总质量(药物物质-wpi/wph)置于具有两个12mm不锈钢球的25ml碾磨罐中来制备通过球磨获得的共无定形形式。在ind和car的情况下，在30hz下进行碾磨长达30分钟，在fur和par的情况下进行长达60分钟的碾磨。
用于测量固态形式的x射线粉末衍射(xrpd)：
通过xrpd使用x'pertpananalyticalprox射线衍射仪(pananalytical，阿尔默洛，荷兰)以cukα辐射
用于测量残留水分的热重分析：
在tgadiscovery仪器上进行热重分析(tainstruments，纽卡斯尔，美国)。将10mg样品置于铂盘中并用盖子密封并以10℃/分钟的速率从25℃加热至300℃。使用trios软件(tainstruments，纽卡斯尔，美国)分析所得到的重量-温度图，以计算在25℃至150℃之间的重量损失。
用于测量tg和tm的调制式差示扫描量热法(mdsc)：
使用discoverydsc仪器(tainstruments，纽卡斯尔，美国)进行热分析。将每个重约6-8mg的样品置于铝盘中并用盖子密封。用铟进行设备的校准，然后施加至样品的变幅为0.2120℃，持续40秒。采用2℃/min的加热速率，测量范围为-20℃至180℃。在每次测量期间施加50ml/min的恒定氮气流速。通过使用trios软件(tainstruments，纽卡斯尔，美国)分析所收集的数据来找到玻璃化转变温度(tg)，观察样品的起始中点和最终温度的半高度。
固有溶出速率：
固有溶出速率(idr)从用液压机(perkinelmer，液压机型号ixb-102-9，乌伯林根，德国)获得的粉末压块测定。将纯药物的球磨粉末和药物-蛋白质的喷雾干燥粉末压制成片剂。在124.9mpa的压力下将150mg的片剂直接压入充当固有溶解样品保持器的不锈钢圆筒45秒。片剂的压缩导致在圆筒的一端形成表面积为0.7854cm2的平坦表面。然后将这些圆筒置于900ml0.1m磷酸盐缓冲液(ph7.2，37℃)溶解介质中，并使用磁棒以50rpm的转速搅拌。在预定的时间点(1、5、10、15、20、25和30分钟，一些idr仅测定到长达20分钟)，取出5ml等分试样并立即用溶解缓冲液替换。然后使用uv分光光度计分析获得的样品(参见下文)。所有溶出实验一式三份地进行。
紫外分光光度法(uvvis)：
通过evolution300uv分光光度计(thermoscientific，剑桥，英国)在320nm、272nm、270nm、265nm和285nm下针对ind、car、par、cel和fur分别测量缓冲液中每种药物的浓度。
粉末溶出(uspii装置)：
粉末溶出在uspii型装置中进行。将200mg结晶ind、无定形ind、sdind-wpi和物理混合物(pm)ind-wpi一式三份地添加到50mlph为7.2的磷酸盐缓冲液(磷酸氢二钠七水合物和无水磷酸二氢钠)作为溶解介质。溶解桨以50rpm旋转1小时，在1、3、5、7、10、15、20、25、30、35、40、50、60和120分钟时取出样品。取出5ml的每个样品并用溶解介质代替。为了从介质中分离粉末，将样品通过0.45μm注射器过滤器(qmax，frisinetteaps)过滤，并丢弃最初的2ml以使由于吸附造成的损失最小化。使用uvvis检查样品以分析药物浓度。
稳定性：
将所有样品在室温下在干燥器中在硅胶上(0％相对湿度)储存，并对所有sd样品进行物理稳定性研究。在第0天通过xrpd分析每个样品，随后每个月进行一次。
体内药代动力学研究：
该研究在由丹麦动物实验监察局批准的研究方案(批准号2014-15-0201-00031)下进行。本研究的目的是研究(i)结晶fur与(ii)无定形fur；(iii)fur-wpi的物理混合物(50％fur，50％wpi)；(iv)sdpvp-wpi(75％pvp，25％fur)；(v)sdfur-wpi(75％fur，25％wpi)；(vi)sdfur-wpi(50％fur，50％wpi)；(vii)sdfur-wpi(25％fur，75％wpi)相比的性能。所有比例均以重量％计。sd、xrpd、dsc和固有溶出研究均使用1.2节中提到的相同条件进行。
将体重为250至348g的7周的雄性斯普拉格道利大鼠(spraguedawleyrat)(charlesriver，丹麦)用于实验。动物被允许自由获取水和食物，并在受控的环境条件下(恒定温度和湿度，12小时光暗周期)饲养。在施用药物之前，将所有动物禁食约12小时。将大鼠随机分成8组(每组6至8只大鼠)，包括静脉内接受fur的组，每只大鼠施用盐溶液中1.5mg(约5mg/kg)，在尾静脉中注射。其余7组使用2.5mm片剂厚度的管饲法口服施用。每片为每只大鼠4.5mgfur的剂量，相当于约15mg/kg。在0.25、0.5、1、2、4和24小时后通过刺破尾巴从尾静脉采集血样(0.2ml)。收集这些血液样品并储存在edta涂覆的管中，直到通过在3600g(12分钟，4℃)下离心收集血浆并转移到微管中。将血浆样品储存在-80℃直至用于进一步分析。在施用药物后约8小时后给予大鼠食物。在整个实验期间，大鼠可以自由地获取水。
通过液相色谱-质谱(lc-ms)定量分析血浆样品：
通过向30μl血浆中添加300μl乙腈以沉淀出蛋白质来评估血浆样品中的呋塞米含量。还向每个样品中添加由30μl非诺贝酸(fa)组成的内标。然后将这些最终混合物在8000rpm下离心10分钟(室温)。离心后，将上清液小心转移至lc-ms板，并使用具有6140四极检测器的agilenttechnologies1200系统来进行lc-ms。使用agilentzorbaxxdb-c18柱(2.1×50mm，3.5μm)进行色谱分离。在miiliq水(溶剂a)和乙腈(溶剂b)中的0.04％冰醋酸的梯度混合物中以0.5ml/min的流速洗脱样品。每个梯度程序为：0至8分钟，15％的溶剂b；8至10分钟，15％至80％的溶剂b；10至11分钟，80％的溶剂b；11至11.10分钟，80％至15％的溶剂b；11.10至14分钟，15％溶剂的b。自动取样器温度保持在8℃，每个注射样品的体积设定为5μl。lc-ms方法在氮气存在下进行以辅助雾化。
药代动力学分析：
从时间t＝0分钟至t＝1440分钟(最后血浆浓度)，通过线性对数梯形法确定血浆浓度相对于时间的曲线下面积(auc)。auc用于计算绝对生物利用度(fa)：
绝对
其中p.o.代表每次口服递送，i.v.代表静脉内剂量。还测定了fur血浆浓度cmax。
实施例
实施例1：喷雾干燥的药物物质-wpi/wph的x射线粉末衍射
使用xrpd分析所有样品的无定形相(xrpd中的晕结构-衍射图中没有布拉格峰)或结晶相(衍射图中的明显峰)。图1显示了在每种情况下无定形晕的外观，证明了所有药物-wpi/wph混合物的无定形化成功。
图10示出了实验中无定形晕的外观，其中ind分别与大米蛋白分离物、大豆蛋白分离物、卵蛋白分离物、胶原蛋白、明胶、肌红蛋白、溶菌酶和酪蛋白为共无定形形式。该图清楚地表明在所有情况下成功的无定形化。此外，图12示出了ind与卵清蛋白以及cel与肌红蛋白、溶菌酶、酪蛋白、胶原蛋白和wpi的晕结构，证实了共无定形制剂的形成。图18中car与肌红蛋白、溶菌酶、酪蛋白、胶原蛋白的晕结构也证实了共无定形制剂。
实施例2：喷雾干燥的药物物质-蛋白质混合物的热分析
tga证实，所有无定形药物和sd药物物质-蛋白质混合物中的残留水分含量为3.2％至8.3％。有关详细结果，参见表1a和1b。
表1a.所有无定形药物物质以及通过喷雾干燥获得的药物物质-wpi的共无定形形式(包括ind与wpi组分的共无定形形式和用酶消化的ind-wpi的共无定形形式)和药物物质-wph混合物的tga数据。
表1b：通过喷雾干燥获得的ind、cel和car与各蛋白质的所有共无定形形式的tga数据。
每种sd药物物质-蛋白质混合物显示单一的tg(玻璃化转变温度)，这表明已经实现单相共无定形体系。与无定形药物本身相比，所有共无定形混合物显示出tg值的增加，表明在混合物中具有更好的混溶性。
实施例3：不同形式的ind的固有溶出速率
如图2所示，无定形球磨ind的固有溶解速率(0.1333mgcm-2min-1)(idr)是结晶ind的idr(0.0787mgcm-2min-1)的1.7倍。相比之下，对于共无定形ind-wpi和ind-wph混合物，观察到idr显著更多地增加。在喷雾干燥的ind-wpi(1.494mgcm-2min-1)的情况下，与结晶ind相比溶出速率增加19倍，与球磨无定形ind相比增加11倍。喷雾干燥的ind-wph(1.3066mgcm-2min-1)与结晶ind相比增加4倍，与球磨无定形ind相比增加约2倍。与喷雾干燥的ind-wph相比，喷雾干燥的ind-wpi的溶出也增加1倍。有关线性方程和固有溶出速率，参见表2a。此外，表2b给出了另外的共无定形混合物的线性方程和固有溶解速率。
表2a.结晶(c)和无定形(a)的药物物质、以及喷雾干燥(sd)和球磨(bm)的共无定形药物物质与乳清蛋白分离物(wpi)和乳清蛋白水解物(wph)的固有溶出试验的线性方程。
表2b.对所有共无定形ind-蛋白质、cel-蛋白质和car-蛋白质混合物进行固有溶出试验的线性方程。通过喷雾干燥(sd)制备所有混合物。
图11(i)和(ii)示出了ind与各种蛋白质的共无定形形式的固有溶出速率(idr)，其中通过喷雾干燥制备共无定形形式。喷雾干燥的ind-wpi(1.494mgcm-2min-1)与结晶ind相比溶出速率增加19倍，与球磨无定形ind相比增加11倍。喷雾干燥的ind-wph(1.3066mgcm-2min-1)比结晶ind增加4倍，比球磨无定形ind增加约2倍。与喷雾干燥的ind-wph相比，喷雾干燥的ind-wpi的溶解速率也增加1倍。sdind-卵清蛋白、sdind-明胶、sdind溶菌酶、sdind-肌红蛋白、sdind-胶原蛋白和sdind-酪蛋白的溶出速率分别比cind高3.5倍、7.9倍、13.5倍、11.6倍、3.7倍、2.8倍，分别比aind高2倍、4.4倍、8倍、6.8倍、2.2倍、1.7倍。另一方面，sdind-卵、sdind-大米和sdind-大豆比cind高4.5倍、2.5倍、2.3倍，比aind高2.6倍、1.5倍、1.4倍。
基于蛋白质的等电点(pi)，即两性离子分子具有相等数量正电荷和负电荷时的ph值，蛋白质与酸性药物ind(pka：4.5)、中性药物cel(pka：11.1)和碱性药物car(pka：7.8)配对，然后测定固有溶出速率(idr)(图13(i)、13(ii)、13(iii))。溶菌酶、肌红蛋白、胶原蛋白和酪蛋白的pi分别为10.7、7.4、5.8和4.6。wpi的pi约为5，这是因为wpi是α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和bsa的混合物，它们的pi分别为5.0、5.2和5.2。对于与ind的共无定形混合物，sdind-溶菌酶(1.0676mgcm-2min-1)具有最高idr，其次是sdind-肌红蛋白(0.9113mgcm-2min-1)，sdind-胶原蛋白(0.2924mgcm-2min-1)和sdind-酪蛋白(0.2224mgcm-2min-1)。这表明，在ph7.2下，带负电荷的ind在与具有高pi的共成形蛋白质配对时达到更高的idr，表明带负电荷的ind与带净正电荷的蛋白质之间的静电吸引力对溶出速率具有积极影响。
在car的情况下发现了类似的模式，car在ph7.2下带正电荷并且随着用于形成共无定形混合物的蛋白质的pi降低而显示出更高的idr。相比于与带有净正电荷的蛋白质即溶菌酶和肌红蛋白混合的car，sdcar-酪蛋白(0.1925mgcm-2min-1)、sdcar-胶原蛋白(0.1694mgcm-2min-1)和sdcar-wpi(0.1948mgcm-2min-1)显示出更高的idr。sdcar-酪蛋白比sdcar-溶菌酶(0.0737mgcm-2min-1)高2.6倍，比sdcar-肌红蛋白(0.092mgcm-2min-1)高2.1倍，而sdcar-胶原蛋白分别比sdcar-溶菌酶和sdcar-肌红蛋白高2.3和1.8倍。这表明与静电排斥相比，药物分子和共成形蛋白之间的静电吸引对所得idr具有积极影响。有趣的是，在ph7.2时为中性的cel在与作为共成形体的具有净负电荷的蛋白质组合时也表现出更高的idr。sdcel-酪蛋白(0.9714mgcm-2min-1)显示最高idr，然后是sdcel-胶原蛋白(0.6629mgcm-2min-1)、sdcel-肌红蛋白(0.2628mgcm-2min-1)和sdcel-溶菌酶(0.2019mgcm-2min-1)。这可能是由于cel在ph7.2带中性电荷以及cel的其他附加性质。
在所有情况下，当使用wpi作为共成形体时，发现idr高于用其他蛋白质时观察到的idr，这与pi无关且不依赖于药物的性质(酸性、碱性或中性)。为了进一步观察具有不同电荷的药物与具有不同净电荷的蛋白质的idr之间的相关性，将不同药物-蛋白质组合的idr相对于蛋白质的pi作图(图15i-iii)。除了用作与ind的共成形体的wpi之外，蛋白质的pi与所得的共无定形混合物的idr之间存在良好的相关性。这可以通过wpi的组成和性质来解释。如上所述，wpi由多种蛋白质的混合物组成，与由单一蛋白质和药物组成的共无定形混合物相比，这可导致所得共无定形混合物的异质性更高。这可能对药物的溶出速率产生积极影响。此外，据信wpi蛋白质的某些性质使它们特别适合与药物分子形成稳定的相互作用，这导致药物的溶出速率增加。
图14(i)示出ind与wpi一起喷雾干燥和ind与代表几种蛋白质的混合物的其他蛋白质一起喷雾干燥的共无定形形式。卵蛋白分离物(卵)是主要由卵清蛋白、卵类粘蛋白、卵粘蛋白和溶菌酶组成的混合物，而大米蛋白分离物(大米)由谷蛋白、球蛋白、白蛋白和醇溶蛋白组成。另一方面，大豆蛋白分离物(大豆)是球状蛋白、伴大豆球蛋白和大豆球蛋白的混合物，明胶基本上是变性和水解的胶原蛋白。发现sdind-卵的idr比sdind-大豆高1.1倍，比sdind-大米高1.1倍。此外，sdind-明胶显示出固有溶出比sdind-卵高1.8倍。从所有ind-蛋白质混合物中，sdind-wpi再次显示出最高的固有溶出，其比sdind-明胶高2.4倍。总的来说，sdind-wpi的溶出速率最高，其次是sdind-明胶、sdind-卵、sdind-大米和sdind-大豆。图17示出这些蛋白质的等电点(pi)与观察到的idr没有直接的相关性，很可能是由于蛋白质是几种其他蛋白质的组合。然而，sdind-wpi的溶出速率最高。当单独地与药物分子使用时(表2a)，包括wpi的每种蛋白质，尤其是α-乳清蛋白，显示出相对高的idr，并且当与wpi混合时，产生甚至更高的idr。与许多其他蛋白质相比，sdind-明胶也显示出高溶出速率，但sdind-wpi和sdind-wph均导致更高的溶出速率。
图14(ii)示出了sdind-蛋白质共无定形混合物，其中基于共成形蛋白的分子量(mw)选择共成形蛋白，bsa具有最高的mw(约66500)，然后是卵清蛋白(约45000)，酪蛋白(约23000)和wpi(约15000)。这四种蛋白质，即bsa、卵清蛋白、酪蛋白和wpi也分别具有5.2、4.8、4.6和约5的相似pi。有趣的是，发现sdind-bsa的溶出速率比sdind-卵清蛋白高约1.05倍，比sdind-酪蛋白高1.3倍，尽管它们相对而言是相似的。这可能表明蛋白质的mw对所得的共无定形混合物的溶解速率具有轻微影响，而这可能是由于与高mw蛋白质形成的相互作用的高度多样性。图16(i)也说明了这种趋势。在这里，sdind-wpi再次成为异常值，导致idr更高，而与其较低的mw无关。
实施例3：不同形式的car、par和fur的固有溶出速率
图3描绘了不同形式的car(图3a)、par(图3b)和fur(图3c)的idr。有关线性方程，请参见表2。
图3表明球磨无定形car(0.0214mgcm-2min-1)、par(0.201mgcm-2min-1)和fur(0.514mgcm-2min-1)的idr分别比结晶car(0.0117mgcm-2min-1)，par(0.1632mgcm-2min-1)和fur(0.1024mgcm-2min-1)的idr高1.8、1.2和1.5倍。
此外，共无定形药物物质-wpi/wph混合物的idr大大增加。喷雾干燥(sd)car-wpi和sdcar-wph(分别为0.194mgcm-2min-1和0.0794mgcm-2min-1)的idr显示与结晶car相比增加接近17(wpi)和7(wph)倍，并且与球磨无定形car相比增加接近9(wpi)和3.7(wph)倍。
在sdpar-wpi和sdpar-wph(0.5433mgcm-2min-1和0.4664mgcm-2min-1)的情况下，溶出速率与结晶par相比增加3.3(wpi)和2.8(wph)倍，与单独的球磨无定形par相比增加2.7(wpi)和2.3(wph)倍。
对于sdfur-wpi和sdfur-wph(0.4115mgcm-2min-1和0.2359mgcm-2min-1)，观察到溶出速率与结晶fur相比增加4(wpi)和2.3(wph)倍，与单独的无定形(bm)fur相比增加2.6(wpi)和1.5(wph)倍。从图2和图3可以得出结论，喷雾干燥的药物-wpi混合物与其结晶或无定形对应物相比具有最高的溶出速率。
实施例4：具有不同wpi组分的无定形ind的固有溶出速率
图4示出wpi的idr(3.8317mgcm-2min-1)分别比其组分α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和bsa高3.4、11和13.4倍。sdind-wpi比使用胰蛋白酶的sdind-wpi高6倍，比使用胃蛋白酶的sdind-wpi高13.2倍，比使用胰蛋白酶+胃蛋白酶(首先添加胰蛋白酶)的sdind-wpi高6.6倍。sdind-wpi比使用胃蛋白酶+胰蛋白酶(首先添加胃蛋白酶)的sdind-wpi高1.25倍。因此，可以得出结论，与用酶消化的共无定形形式相比，wpi的完整天然形式提供最高的溶出速率。
实施例5：粉末溶解研究
如图5所示，我们可以看到，与bmind-wpi相比，共无定形sdind-wpi显示出更高的溶出速率。无定形ind本身显示出比pmind-wpi溶出更多。ind在其无定形状态下的溶解度是结晶ind值的两倍以上。这是由于化合物在无定形形式中的溶解度高于在更稳定的结晶中的溶解度，因为吉布斯自由能更高。仅来自无定形药物的溶出速率增加是由于共无定形化时分子相互作用增加。
实施例6：稳定性研究
图6描绘了wpi和wph分别与ind、car、fur和par的共无定形形式的物理稳定性。通过xrpd重结晶显示无定形ind、car、fur和par在不到一周内稳定。相反，发现共无定形喷雾干燥的药物物质-蛋白质混合物可稳定数月。发现sdind-wpi和sdind-wph稳定超过20个月(图19)，而大多数其他sdind-蛋白质共无定形形式，例如sdind-明胶，sdind-bsa和sdind-胶原蛋白仅稳定2至3个月(详见下表3的稳定性研究)。wpi和wph与药物car和fur的共无定形制剂也分别稳定长达8个月和18个月。sdcel-wpi的共无定形形式也稳定了8个月以上。因此，wpi和wph对所有研究的药物而言是具有最佳稳定性的共无定形混合物的蛋白质和共成形物。它也比使用pvp(一种常用的无定形制剂的共成形物)和药物制备的固体分散体更稳定，即使在较高的药物浓度(药物负载量)下也是如此。这表明，与其他蛋白质和蛋白质混合物相比，wpi和wph不仅在与难溶性药物组合形成共无定形混合物或固体分散体时在溶出方面表现优异。与其他蛋白质和蛋白质混合物相比，wpi和wph在物理稳定性方面也表现出优异性，针对wpi和wph所观察到的稳定性提高了数倍。
表3.示出sd药物-蛋白质混合物保持共无定形的月份数的稳定性数据。使用xrpd得出这些数据。在重结晶时，混合物在衍射图中显示各药物的峰。仅对显示结晶峰的样品停止稳定性研究。
实施例7：体内研究
图7描述了口服施用于大鼠后fur和wpi的共无定形(喷雾干燥)形式的生物利用度。sdwpi:fur(75％wpi，25％fur)显示出最高的生物利用度(11.4％)，紧随其后的是sdwpi:fur(50％wpi，50％fur)(11.3％)和sdwpi:fur(25％wpi，75％fur)(10.6％)。这表明生物利用度随着wpi含量的增加而增加。sdwpi:fur样品的生物利用度显著高于sdpvp:fur(6.3％)和物理混合物。结晶fur按照预期显示出最低的生物利用度(4.7％)，其次是无定形fur(5.1％)，两者均显著低于sdwpi:fur样品。通过改变wpi的含量同时保持fur的含量恒定来改变wpi和fur的比例。
图8描绘了口服施用于大鼠的最大浓度(cmax)。cmax值的图形与生物利用度结果一致。共无定形形式中wpi量的增加导致cmax水平增加。
实施例8：用于体内实验的化合物的固有溶出速率
图9描绘了用于体内实验的组合物的idr。发现sdwpi-fur(75％wpi，25％fur)的idr具有最高的溶出速率。它比结晶fur高5.67倍，比无定形fur高3.7倍。其次是sdwpi-fur(50％wpi，50％fur)，比结晶高4倍，比无定形fur高2.6倍。有趣的是，发现传统上使用的sdpvp/fur(75％pvp，25％fur)仅比sdwpi-fur(25％wpi，75％fur)高1倍。无定形fur比pmwpi-fur(50％wpi，50％fur)高0.69倍。相关线性方程见表4。
表4.用于体内研究的所有混合物的固有溶出测试的线性方程。c：结晶，a：无定形，pm：物理混合物，sd：喷雾干燥。
总体结论：
从上面的例子中，我们可以得出结论，各种蛋白质，特别是wpi，是用于结晶药物物质的共无定形化的有希望的新的赋形剂。与药物的结晶或单无定形形式相比，但最值得注意的是与开发用于改善溶出速率和难溶性药物的溶解度的其他竞争性技术相比，药物ind、car、fur、par和cel的共无定形形式显示出显著更高的溶出速率。与单一无定形药物物质和(与pvp的)固体分散体和物理混合物相比，也观察到所有具有wpi的制剂具有改善的生物利用度和pk分布。此外，与其单无定形对应物相比，共无定形药物物质-wpi形式也显示出增加的物理稳定性。