电纺基质和方法与流程
背景技术：
dunbar等人的wo2016/209089公开了一种用于培养成纤维细胞和角化细胞以形成分化皮肤组织的装置。典型地利用支架、模板或基质支持皮肤细胞的生长和分化。dunbar等人的细胞培养装置包括固持基质(也称为基体)的框架。基质可以在2种取向之间移动。在第一取向中，细胞位于基质表面上，并且与装置中的透气膜不接触。一旦细胞有时间附着，典型地在约24-48小时后，就将装置倒转成第二取向，使得基质表面上的细胞现在与透气膜接触或非常接近透气膜。这种接近是诱导角化细胞分化并且形成分层表皮的原因。在dunbar等人的装置出现之前，表皮分层是通过使细胞在气-液界面处生长来实现。因此，dunbar装置通过改用透气界面而消除气液界面的需求。
虽然在生长过程中改变平台固持细胞的取向的能力对细胞分化至关重要，但本发明人现已经确定所用基质载体的性质对细胞生长和分化具有显著影响。
重要的是，成纤维细胞能够迁移到基质中并通过基质形成真皮。然而，如果基质的孔太大，则基质不能充分支撑与透气膜接触/连通的角化细胞“层”，这可能会阻止表皮充分形成。
此外，天然产生的人体皮肤具有网脊，其在真皮-表皮界面处具有轮廓，从而提供对剪切力的抵抗力。相反，当前可利用的基质上生长的皮肤缺少网脊，这使得皮肤在操作(将皮肤移植物施加到患者)过程中以及在后续程序(例如用伤口敷料覆盖)中容易受到剪切力的伤害。这种坚固性缺乏是合成皮肤产品的一个显著缺点。
因此，需要一种改进的支架或基质，其能够支持皮肤细胞的生长并实现适当的表皮分层。
技术实现要素：
本发明概括于以下段落中：
1.一种电纺纤维基质，其供分化皮肤组织生长用，通过电纺生物相容性可生物降解聚合物的溶液来制备，其中所述电纺纤维的直径是约0.3μm至约5μm，例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5μm。
2.根据段落1的基质，其中所述生物相容性可生物降解聚合物是选自群组plga、pla、pcl、phbv、pdo、pga、plcl、plla-dla、peuu、纤维素乙酸酯、peg-b-pla、evoh、pva、peo、pvp、掺混pla/pcl、明胶-pva、pct/胶原蛋白、褐藻酸钠/peo、聚葡萄胺糖/peo、聚葡萄胺糖/pva、明胶/弹性蛋白/plga、蚕丝/peo、蚕丝纤维蛋白/聚葡萄胺糖、pdo/弹性蛋白、phbv/胶原蛋白、玻糖醛酸/明胶、胶原蛋白/硫酸软骨素、胶原蛋白/聚葡萄胺糖、pdla/ha、plla/ha、明胶/ha、明胶/硅氧烷、plla/mwnt/ha、plga/ha、二氧环己酮线性均聚物(例如100二氧环己酮线性均聚物)，以及其中两种或更多种的组合。
3.根据段落1或2的基质，其中所述聚合物是聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)。
4.根据段落1至3中任一段落的基质，其中所述生物相容性可生物降解聚合物的浓度是26％至40％w/v，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39％w/v。
5.根据段落4的基质，其中生物相容性可生物降解聚合物的浓度是35％w/v。
6.根据段落2至5中任一段落的基质，其中所述plga中的聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别在90:10至50:50范围内，如85:15、80:20、75:25、70:30、65:35或60:40。
7.根据段落6的基质，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别是75:25至65:35，例如65:35。
8.根据段落1至7中任一段落的基质，其中所述溶剂包含独立地选自以下中的一种或多种：氯仿、乙醇、乙酸hfip、丙-2-醇、乙酸、四氢呋喃、dmso、dmf、乙酸乙酯、1,4-二噁烷、甲酸和水。
9.根据段落1至8中任一段落的基质，其中包含四氢呋喃的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
10.根据段落1至9中任一段落的基质，其中包含二甲基甲酰胺的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
11.根据段落1至10中任一段落的基质，其中包含dcm的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
12.根据段落1至10中任一段落的基质，其中溶剂是四氢呋喃和二甲基甲酰胺的1:1混合物，与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
13.根据段落1至12中任一段落的基质，其中所述电纺是在25至35℃范围内的温度下进行，例如30℃。
14.根据段落1至13中任一段落的基质，其中用于静电纺丝的针以其尖端10厘米从集电板(例如不锈钢集电板)定位。
15.根据段落1至14中任一段落的基质，其中使用纹理化板，例如微图案化，例如波浪形或波纹状，收集电纺纤维。
16.根据段落1至15中任一段落的基质，其中所述电纺以每小时0.4ml或更低的流速进行，例如0.1至0.4ml，例如每小时0.3、0.25、0.2、0.15或0.1ml。
17.根据段落1至16中任一段落的基质，其中所述基质的厚度为100μm或更小，例如10至100μm，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100μm。
18.根据段落1至17中任一段落的基质，其中所述基质涂有细胞外基质蛋白或其肽，例如合成肽(例如促进细胞粘附和/或分化，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和其它细胞外基质蛋白或肽片段的氨基酸序列或其片段)。
19.根据段落18的基质，其中所述细胞外基质蛋白质选自由以下组成的组：胶原蛋白iv、胶原蛋白i、层粘连蛋白和纤连蛋白，或其组合，例如胶原蛋白iv。
20.根据段落1至19中任一段落的基质，包含适于允许成纤维细胞迁移的孔隙，例如孔隙在2至30微米范围内，例如15至25微米，具体地说，15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米。
21.一种皮肤组织区段，其包括段落1至20中任一段落所定义的基质，其中能够形成真皮的细胞已迁移到所述基质中。
22.根据段落21的皮肤组织区段，其中所述细胞是成纤维细胞。
23.根据段落21或22的皮肤组织区段，其中能够分化成表皮的表皮细胞积聚在所述基质的外表面(例如“上层平坦”表面)上。
24.根据段落23所述的皮肤区段，其中在向培养物中添加表皮细胞(例如角化细胞和成纤维细胞)之前，用胶原蛋白(例如胶原蛋白iv)预涂所述基质的所述外表面。
25.根据段落23或25的皮肤组织区段，其中能够分化成表皮的所述表皮细胞是角化细胞。
26.根据段落22至24中任一段落的皮肤组织区段，其中存在分化表皮层。
27.根据段落22至26中任一段落的皮肤组织区段，其中存在真皮层。
28.根据段落27的皮肤组织区段，其中所述基质包含于所述真皮层内。
29.根据段落21至28中任一段落的皮肤组织区段，其中构成所述基质的所述生物相容性可生物降解聚合物已经开始降解。
30.根据段落21至29中任一段落的皮肤组织区段，其中所述皮肤组织包括合成网脊。
31.如段落21至30中任一段落的皮肤区段，其包含在用于培养和/或运输的装置中，例如所述装置包括：
容器，其包含第一端壁(底部)和至少一个侧壁，
可拆卸的第二端壁(顶部)，其适于与容器接合以界定腔室，和
支架，其适于接收供细胞驻留的基质，
其中第一端壁(底部)、至少一个侧壁或第二端壁(顶部)中的至少一个的至少一部分包括透气材料或适于与透气材料接合并且被穿孔以允许气体交换；和
其中所述设备能在(a)第一模式和第二模式之间配置，在第一模式中，基质被安置成不与透气材料气体连通；在第二模式中，所述基体被安置成与透气材料气体连通。
32.根据段落21至31中任一段落的皮肤区段，其中所述皮肤是患者自体的。
33.一种活体外产生根据权利要求1至32中任一项所定义的分化皮肤产品的方法，其包含以下步骤：
i)将由生物相容性可生物降解聚合物纺成的电纺基质溶解于有机溶剂中，其中所述所述基质的电纺纤维的直径是约0.3μm至约5μm，例如1至5μm，例如1、1.5、2、2.5、3、3.5、4或4.5μm；以及
ii)添加能够分化成表皮(例如角化细胞)和成纤维细胞的表皮细胞培养物，和
iii)将所述细胞和基质在包含透气层的装置或罐中培养第一时间段(例如长达一个月，例如30天、28天、21天、14天、7天、5天、4天、3天、48小时或24小时)，其中沉积有表皮细胞的基质表面定向成远离透气层，并且
iv)在第一培养时间段后，改变基质取向，使得其上沉积有表皮细胞的表面靠近透气层。
34.根据段落33的方法，其中预涂待沉积表面细胞的基质表面，以促进上皮细胞的粘附和/或分化。
35.根据段落34的方法，其中涂层是细胞外基质蛋白或其肽，例如合成肽序列(例如胶原蛋白、层粘连蛋白和其它细胞外基质蛋白质或肽片段的氨基酸序列或其片段)。
36.根据段落35的方法，其中所述细胞外基质蛋白质或其肽选自由以下组成的组：胶原蛋白iv、胶原蛋白i、层粘连蛋白和纤连蛋白，以及其组合，例如胶原蛋白iv。
37.根据段落33至36中任一段落的方法，其中所述生物相容性可生物降解聚合物是选自群组plga、pla、pcl、phbv、pdo、pga、plcl、plla-dla、peuu、纤维素乙酸酯、peg-b-pla、evoh、pva、peo、pvp、掺混pla/pcl、明胶-pva、pct/胶原蛋白、褐藻酸钠/peo、聚葡萄胺糖/peo、聚葡萄胺糖/pva、明胶/弹性蛋白/plga、蚕丝/peo、蚕丝纤维蛋白/聚葡萄胺糖、pdo/弹性蛋白、phbv/胶原蛋白、玻糖醛酸/明胶、胶原蛋白/硫酸软骨素、胶原蛋白/聚葡萄胺糖、pdla/ha、plla/ha、明胶/ha、明胶/硅氧烷、plla/mwnt/ha、plga/ha、100二氧环己酮线性均聚物，以及其中两种或更多种的组合。
38.根据段落33至37中任一段落的方法，其中所述聚合物是聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)。
39.根据段落33至38中任一段落的方法，其包括电纺基质的预先步骤。
40.根据段落39的方法，其中所述生物相容性可生物降解聚合物的浓度为26％至40％w/v，例如27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39％w/v。
41.一种根据段落40使分化皮肤组织生长的方法，其中所述生物相容性可生物降解聚合物的浓度为35％w/v。
42.根据段落33至41中任一段落的方法，其中所述plga中的聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别在90:10至50:50范围内，例如85:15、80:20、75:25、70:30、65:35或60:40。
43.根据段落42的方法，其中聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别是75:25至65:35，例如65:35。
44.根据段落39至43中任一段落的方法，其中所述溶剂包括独立地选自以下中的一种或多种：氯仿、乙醇、乙酸、六氟异丙醇、丙-2-醇、乙酸、dmso、dmf、乙酸乙酯、1,4-二噁烷、二甲基乙酰胺、甲基乙基酮、甲酸和水。
45.根据段落39至44中任一段落的方法，其中包含四氢呋喃的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
46.根据段落39至45中任一段落的方法，其中包含二甲基甲酰胺的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
47.根据段落39至46中任一段落的方法，其中包含dcm的溶剂与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
48.根据段落39至47中任一段落的方法，其中溶剂是四氢呋喃和二甲基甲酰胺的1:1混合物，与生物相容性可生物降解聚合物一起使用。
49.根据段落39至48中任一段落的方法，其中所述电纺是在25至35℃范围内的温度下进行，例如30℃。
50.根据段落39至49中任一段落的方法，其中电纺所用的针的定位使其尖端距集电板10cm(例如不锈钢集电板)。
51.根据段落39至50中任一段落的方法，其中使用纹理化板，例如微图案化，例如波浪形或波纹状，收集纤维。
52.根据段落39至51中任一段落的方法，其中所述电纺是以每小时0.4ml的流速进行，例如0.1至0.4ml，例如每小时0.3、0.25、0.2、0.15或0.1ml。
53.根据段落33至52中任一段落的方法，其中所述基质的厚度是100μm或更小，例如10至100μm，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、95或100μm。
54.根据段落33至53中任一段落的方法，其中所述皮肤组织在用于培养细胞或组织的装置中培养，例如包括：
容器，其包含第一端壁(底部)和至少一个侧壁，
可拆卸的第二端壁(顶部)，其适于与容器接合以界定腔室，
支架，其适于接收供细胞驻留的基质，
其中第一端壁(底部)、至少一个侧壁或第二端壁(顶部)中的至少一个的至少一部分包括透气材料或适于与透气材料接合并且被穿孔以允许气体交换；并且
其中所述设备能在(a)第一模式和第二模式之间配置，在第一模式中，基质被安置成不与透气材料气体连通；在第二模式中，基体被安置成与透气材料气体连通。
55.根据段落33至54中任一段落的方法，其中将所述皮肤组织运输到患者的地点，例如在段落54所定义的装置中运输。
56.根据段落55的方法，其中所述皮肤组织由医疗保健专业人员(例如外科医生)从装置中回收，例如通过从被配置成固持基质和组织的装置中的支架切除组织。
57.一种活体外使包含网脊的分化皮肤组织生长的方法，其中所述方法包括电纺生物相容性可生物降解聚合物基质，所述基质具有适于支撑分化皮肤组织在微图案化板上生长的孔隙。
58.一种活体外使包含网脊的分化皮肤组织生长的方法，所述方法包括使所述皮肤细胞在具有波浪形或波纹状表面(例如通过将基质纤维电喷涂于纹理化集电板上而形成)的基质上生长的步骤。
59.一种分化皮肤组织区段，其由或能够由段落33至58中的任一段落获得。
60.根据段落21至31或59中任一段落的皮肤区段，其用于治疗。
61.根据段落60的皮肤区段，其中所述治疗是针对选自由以下组成的组的病状或疾病：组织损伤；具有神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；置换由手术切除的癌变皮肤组织(例如肉瘤、黑色素瘤等)，置换因试图包含坏死性筋膜炎感染而切除的皮肤组织；增强皮肤品质或外观；预防或纠正皮肤病症；减少或消除疤痕组织；乳房皮肤再生(外科手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；针对皱纹和其它皮肤缺陷进行皮肤再生；促进毛囊生长、神经和其它细胞器再生；无疤痕愈合，或减少疤痕的再愈合。
62.根据段落61的皮肤区段，其用于治疗外科手术瘢痕、溃疡、坏死性筋膜炎引起的损伤、可能需要皮肤移植的任何事，例如皮肤癌外科手术、除痣、切伤或刺伤、由剪切力、擦伤、磨损、化学灼伤、牛皮癣、皮肤感染、褥疮或类似者引起的伤口。
63.一种治疗方法，其包含将根据段落21到31或60中任一段落的皮肤区段缝合到有需要的患者上。
64.根据段落63的治疗方法，其中所述治疗是针对选自由以下组成的组的病状或疾病：组织损伤；具有神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；增强皮肤品质或外观；预防或纠正皮肤病症；减少或消除疤痕组织；乳房皮肤再生(外科手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；针对皱纹和其它皮肤缺陷进行皮肤再生；促进毛囊生长、神经和其它细胞器再生；无疤痕愈合，或减少疤痕的再愈合。
65.根据段落63的治疗方法，其用于治疗外科手术瘢痕、溃疡、坏死性筋膜炎引起的损伤、可能需要皮肤移植的任何事情，例如皮肤癌外科手术、除痣、切伤或刺伤、由剪切力、擦伤、磨损、化学灼伤、牛皮癣、皮肤感染、褥疮或类似者引起的伤口。
66.一种根据段落21至31或60中任一段落的皮肤区段的用途，其用于制备供治疗用的药剂，其针对选自由以下组成的组的病状或疾病：组织损伤；具有神经和细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；增强皮肤品质或外观；预防或纠正皮肤病症；减少或消除疤痕组织；乳房皮肤再生(外科手术后)；化妆品应用，例如抗衰老；针对皱纹和其它皮肤缺陷进行皮肤再生；促进毛囊生长、神经和其它细胞器再生；无疤痕愈合，或减少疤痕的再愈合。
67.一种根据段落21至31或60中任一段落的皮肤区段的用途，其用于制造供治疗以下的药剂：外科手术瘢痕、溃疡、坏死性筋膜炎引起的损伤、可能需要皮肤移植的任何事，例如皮肤癌外科手术、痣除、切伤或刺伤、由剪切力、擦伤、磨损、化学灼伤、牛皮癣、皮肤感染、褥疮或类似者引起的伤口。
68.一种集电板，例如不锈钢集电板，用于收集基质的电纺纤维供组织生长用，其中所述集电板包括微图案化表面，例如波浪形、波纹状或波形图案。
69.根据段落68的集电板，其中所述板包括孔洞，使得所述孔洞内形成的电纺纤维片的密度低于在集电板表面上形成的电纺纤维片。
70.一种基质，其通过将基质电纺到根据段落68或69的集电板上而制成，例如其中所述基质的至少一个平坦表面具有波浪形或波纹状表面。
71.一种增强所培养的皮肤组织抵抗剪切力的方法，包括使皮肤组织在基质上生长，其中所述基质包含微图案化表面，例如波浪形、波纹状或波形图案。
72.根据段落71的方法，其中所述基质是通过将纤维电纺到根据权利要求68至70中任一项的集电板上来制备。
72.根据段落71的方法，其中所述基质在段落1至20中的任一段落中定义。
因此，在一个方面中，提供了供分化皮肤组织生长用的基质，其通过电纺可生物降解聚合物(例如聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)、二氧环己酮线性均聚物(例如100二氧环己酮线性均聚物)，或其组合)于有机溶剂中的26％至40％w/v溶液来制备。藉由电纺plga于有机溶剂中的26％至40％w/v溶液而制备的本公开基质具有允许表皮和真皮细胞分离的孔隙度，使得表皮形成于基质的一个表面上，例如基质的“顶部”(在本文中称为基质的“上平坦面”)，而真皮形成于基质的对置表面中以及对置表面上，例如基质“下面”(在本文中称为基质的下平坦面)。因此，举例来说，角化细胞停留在基质的“顶部”以形成表皮，且成纤维细胞能够迁移到基质内以产生真皮。结果是，所形成的皮肤在分别由成纤维细胞和角化细胞形成的真皮和表皮之间整合有合成基质。
在一个实施例中，plga的浓度是27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39％w/v。
在一个实施例中，plga的浓度是35％w/v。有利的是，本发明人发现电纺35％w/v溶液不仅产生最优的纤维直径和孔隙度，而且比更高浓度的plga更容易发挥作用。
在一个实施例中，plga中的聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别在90:10至60:40范围内，例如85:15、80:20、75:25、70:30或65:35。使用plga的优势在于改变聚羟基乙酸与聚乳酸的比率会改变降解速率。因此，技术人员可以按需要通过调节聚羟基乙酸与聚乳酸的比率来调节降解速率。
在一个实施例中，聚乳酸与聚羟基乙酸的比率分别是75:25到65:35，例如75:25。有利的是，预期75:25plga在3到12个月内完全降解，而较低比率(例如63:35)会以更快速率降解。
有多种聚合物(例如具有生物相容性和可生物降解性的plga)适于形成所述基质。用于缝合线的材料可以适于形成所述基质。所述基质向工程化皮肤组织提供结构完整性，同时使其生长，并且在其已移植到患者之后还生长一段时间。基质将在数周到数月的时段内降解，最终完全被患者自身基质(细胞)置换。这消除了从患者回收基质的要求。
本公开上下文中的基质是细胞粘附和生长于其上和其中的三维结构，具体地说，编织基质、纤维基质及/或纺织基质。基质是细胞聚集、粘附及/或生长于其周围的基体或模板。
在一个实施例中，基质是以片层形式提供。如本文所用的片层是指三维形状，例如适用于皮肤区段生长于其上的模板，例如约100微米深度且具有两个基本平坦面。
平坦面是指大致扁平的2d表面，其无需完全扁平，而是仅需支持生长或细胞，例如将分化成表皮的细胞。在一个实施例中，对上平坦面进行微图案化以提供纹理，最终增强分化表皮对剪切力的抗性(即，减少其在真皮上滑动并且反而使表皮保持就位)。当电纺基质纤维时，此纹理是设置于集电板上的纹理的镜像。此纹理呈波浪形或波纹状。这旨在在真皮与表皮之间的不规则界面中产生细胞生长以模拟正常皮肤中的突起，称为网脊。
如本文所用的“上平坦面”不必指基质的取向，而是指角化细胞沉积于其上的两个平坦面之一。这些细胞最终分化为表皮并且变成皮肤的上(最外)层。上平坦面通常被预涂以促进角化细胞粘附于其。培养开始时的上平坦表面通常远离透气层。举例来说，在固持基质的支架水平并且与装置基部中的透气层平行的情况下，上平坦表面将是最高的，即，指向盖子。然而，在适合的时段(例如48小时)之后，当角化细胞已经粘附到上平坦面时，接着旋转或移动基体(基质)以使上平坦面与透气层接触或接近透气层。这将通常将上平坦面放在基体(基质)的下表面上，且从而使上平坦面指向装置的基部。因此，上平坦面的取向在整个过程中变化。然而，标识上平坦面适用于所述面，不论其取向。
如本文所用的下平坦面是指与上平坦面对应的平行面。下部未必指基体面的取向。
在一个实施例中，对集电板进行纹理化，例如微图案化，例如波浪形或波纹状。微图案化的优点在于，当基质用于使皮肤组织生长时，真皮与表皮之间形成不平坦界面，借此复制天然存在于真皮与表皮之间的网脊。网脊的存在有助于赋予表皮针对剪切力的抗性，使得当施加剪切力时，例如伤口敷料或衣服在皮肤移植物上摩擦时，表皮不大可能被移位。表皮的移位可能引起皮肤移植物失效。
本公开上下文中的网脊仅为真皮与表皮之间的不平坦界面，即，合成(活体外生长)的模拟天然网脊。
在一个实施例中，基质具有100μm或更小的厚度，例如10至100μm，例如20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95μm。本发明人已发现，使用厚度大于100μm的基质倾向于增加基质上所生长的皮肤组织的血管化需求以便使移植物存活。反之，通过使基质保持100μm或更小厚度，角化细胞能够接收营养物并且仅通过扩散来移出废弃物，并且存活不需要血管系统。
在实施例中，基质形成特定形状，例如管形、叶形或类似形状，使得皮肤细胞生长成患者所需的预定义3d形状。
在一个实施例中，基质的孔径(例如最小和最大孔径)在2至30微米范围内，例如在15至25微米范围内，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米。
基质中的孔隙并非都具有均一尺寸。因此，如本文所使用的孔径将是平均孔径，例如在4到25微米范围内(4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米)，例如10到25微米，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25微米，特定地说，15至25微米。在一个实施例中，平均值是平均孔径，例如平均流动孔径(也称为毛细流动测孔术)。在一个实施例中，平均值是中值孔径。在一个实施例中，平均值是模态孔径。
影响孔径最显著的因素是纤维直径。纤维直径越大
使用测孔术时，最关键的数值之一是最大孔径，原因是这种数值通常决定了材料的重要特征。最大孔径的一种测量值是第一泡点值(fbp)。在一个实施例中，本文指定的孔径是第一泡点值。
毛细流动测孔术，也称为测孔术，是一种通过施加压力递增的气体、基于湿润液体从样品孔隙的排出量的表征技术。其广泛用于测量膜、纸、过滤和超滤介质、中空纤维、陶瓷等的最小、最大(或第一泡点)和平均流动孔径，和通孔的孔径分布。图7描绘了分析中的典型曲线。
在毛细流动测孔术中，存在于孔隙中的液体。排空孔隙所需的压力相当于从孔隙的最狭窄部分抽出液体所必需的压力。此最狭窄部分是最具挑战性的部分，且其提供移出湿润液体的最高阻力。此参数在过滤和类似应用中是非常相关的，原因是知道最小值具有重要作用。
测量出此压力允许获得孔隙直径，所述孔隙直径是通过使用扬-拉普拉斯公式(young-laplaceformula)计算：p＝4*γ*cosθ*/d，其中d是孔径，p是所测压力，γ是湿润液体的表面张力并且θ是湿润液体与样品的接触角。表面张力γ是可量测的物理特性并且依赖于所用湿润液体。接触角θ依赖于材料与湿润液体之间的相互作用。在毛细流动测孔术中，与压汞测孔术相反，湿润液体自发地进入样品孔隙，从而确保材料全部湿润，且因此，湿润液体与样品的接触角是0且前一个公式能够简化为：p＝4*γ/d。
关于如何进行分析和仪器的技术信息可在www.porometer.com获得。还参见agarwal等人，聚合物膜中的通孔的颈尺寸分布(neck-sizedistributionofthrough-poresinpolymermembranes)，膜科学杂志(journalofmembranescience)415-416(2012)608-615.
压力扫描
这是传统方法，其中压力以恒定速率连续地增加，其能根据仪器和用户的要求加以修改，且测量通过样品的气体流量。同样，用户能够调整所采集数据点的数目。它是一种快速且可再现的方法，对于品质控制工作和所有孔隙相同的样品来说，通常推荐这种方法。然而，重要的是考虑到当样品呈现复杂结构且其中大量孔隙呈现不同弯曲度时，在压力扫描期间，直径相同、但孔隙路径更长的孔隙在与其直径对应的压力下可能未被排空(如果扫描较快，则没有时间允许气流将湿润液体通过孔隙长度排出)。因此，据报道，具有较长孔隙长度的孔隙的孔径比实际孔径小。
压力步骤/稳定性
随时间分步骤提高压力，使实际压力保持一定时间，随后将其提高至下一个数值。
压力/步骤稳定性方法代表着压力扫描方法的一种替代方案，其允许更精确地测量孔径。其考虑到具有相同直径的孔隙具有不同弯曲度和孔隙长度。数据点的采集仅在压力于恒定值保持用户定义的时间之后进行，并且还仅在流经样品的气体稳定之后进行，所述稳定也由用户定义。这允许气体流动有足够的时间将湿润液体从直径相同的长弯曲孔隙中排出。因此，压力步骤/稳定性方法是研究和开发应用中最值得推荐的方法。另外，压力步骤/稳定性测量原理允许测量真实的第一泡点(fbp)，与其相反的是压力扫描方法仅允许计算所选流量下的fbp。
所测量的第一泡点(fbp)
依据astmf-316-03标准，fbp定义为检测到第一连续气泡时的压力。在实践中，fbp与最大或最高孔径相关。fbp的计算需要选择某一最小流量(例如30、50、100ml/min)，并且当它实现时记录压力。然后利用此压力计算fbp大小。问题是选择通过样品的最小流量，并且主要缺点在于，此最小流量对于每个样品来说是不同的并且不容易预先确定。如果选择某一最小流量进行计算，则在测定那个特定流量之前，样品中的最大孔隙可能已经打开一会儿。步骤/稳定性方法能够测量真实fbp。在开启最大流量之前，当施加恒定气体流量时，压力按照线性方式增加。当气流通过最大孔隙传送通过样品时，压力增幅下降并且这种特定压力是对应于样品fbp的压力。
在一个实施例中，基质用细胞外基质蛋白质或其肽(例如合成肽)涂布。
在一个实施例中，细胞外基质蛋白质选自由以下组成的组：胶原蛋白iv、胶原蛋白i、层粘连蛋白和纤维结合蛋白，或其组合。有利的是，涂层的存在产生了第二细胞信号(第一信号是皮肤组织在空气-液体或透气界面处生长)，这增强了皮肤组织的恰当分层。
在一个实施例中，细胞外基质蛋白质涂层是胶原蛋白iv。相较于胶原蛋白i、层粘连蛋白和纤维结合蛋白，发现胶原蛋白iv的优点是始终产生最优的表皮分层。
在一个方面，提供一种包含如上文所定义的基质的皮肤组织区段，其中真皮饲养细胞(例如成纤维细胞)已经迁移到所述基质中。
在一个实施例中，角化细胞停留在基质的外表面上，具体地说，预涂表面上。
在一个实施例中，角化细胞已经分化成表皮并且成纤维细胞已经形成真皮。
在一个实施例中，分化表皮位于基质的一个表面上，具体地说，基质的“上平坦面”。
在一个实施例中，向培养液中添加上皮细胞(例如角化细胞和成纤维细胞)之前，用胶原蛋白涂布基质。
在一个实施例中，皮肤组织包含合成网脊，例如如本文中在别处所述。
在一个实施例中，皮肤是患者自体的。此优点在于，当移植到患者时，自体皮肤组织无组织排斥的风险。
在一个实施例中，皮肤组织容纳于如本文所述的装置内，具体地说，wo2016/209089中所述的装置，所述文献的内容以引用的方式并入本文中。有利的是，所述装置当处于第一模式时允许皮肤组织在溶液中培养(从而允许细胞迁移、粘附及/或扩增)且然后按照第二模式、在透气界面处生长，其中皮肤组织能够分化且实现表皮分层。
在一个实施例中，其中将皮肤组织在如上文所定义的装置中运输至患者的地点。有利的是，所述装置是密封且无菌的，其适于皮肤组织生长且还适于随后运输生长过的皮肤组织。从而大大最小化皮肤组织的操作。医疗专业人员(例如外科医生)从装置中回收组织，例如通过使用手术刀从基质中切除组织，具体地说，外科医生从基质中切割所期望形状和尺寸的皮肤块。因此，不需要首先从装置回收整个皮肤组织并且然后切割成所期望的形状和尺寸。相反，能够从基质中直接切割所期望的皮肤块。此进一步最小化操作且因此降低污染及/或损伤的风险。
如本文所用的组织是指一类相似或相关的细胞，其以适于执行功能的方式(具体地说，当并入生物体中时)在一起发挥作用。组织实例包括皮肤、结缔组织、肌肉等。
如本文所用的合成组织是指活体外生长的组织。
在肽的上下文中，合成仅指肽是利用化学技术(与重组技术相反)合成。
如本文所用的结构化合成组织是指具有不同/分化组分的组织，例如真皮和表皮。
如本文所用的真皮是指表皮下方的内部皮肤细胞。在体内，真皮位于表皮与皮下组织之间。本公开的基质位于分化皮肤组织已生长之后的真皮内。在如本文所用的真皮内是指其中基质的至少一部分位于真皮的至少一部分内。
成纤维细胞能够形成真皮。它们也是表皮细胞(例如角化细胞)的饲养细胞。
表皮是皮肤组织中的外层细胞，其向感染提供屏障并且调控身体所释放的水的量。视所考虑的皮肤区域而定，表皮是由4或5个层构成。那些层按降序是：i)角化层(角质层(stratumcorneum))由10至30个多面体去核化角质细胞层构成(角质细胞分化的最终步骤)，其中手掌和足底具有最多个层。角质细胞被蛋白质包膜(角质化包膜蛋白)包围，填充有保水角蛋白，通过角化粒附着到一起且在胞外空间中被堆叠的脂质层包围。表皮的大部分屏障功能局限于此层。ii)透明/半透明层(透明层，仅存在于手掌和足底)。手掌和足底中所发现的皮肤称为“厚皮肤”，原因是其具有5个表皮层而非4个。颗粒层(颗粒层(stratumgranulosum))角化细胞失去其细胞核并且其细胞质呈现颗粒状。那些角化细胞中所含的位于板层体内的脂质通过胞外分泌释放进入胞外空间中而形成脂质屏障。那些极性脂质然后转化成非极性脂质且平行于细胞表面排列。举例来说，糖神经鞘脂变成神经酰胺并且磷脂变成游离脂肪酸。ⅲ)棘层(棘层(stratumspinosum)).角化细胞通过桥粒连接并且从高尔基体内部开始产生板层体，所述板层体富含极性脂质、糖神经鞘脂、游离固醇、磷脂和分解代谢酶。朗格罕氏细胞(langerhanscells)，免疫活性细胞，位于此层的中部。iv)基底层/生发层(基底层/生发层(stratumbasale/germinativum))主要由增殖和非增殖角化细胞构成，其通过半桥粒附着于基底膜。存在黑色素细胞，通过树突连接到此层和其它层中的多个角化细胞。基底层中还发现了默克细胞(merkelcells)，所述细胞大量存在于触敏部位，例如指尖和唇部。它们与皮肤神经密切有关并且似乎涉及轻触觉。v)马尔皮基氏层(马尔皮基氏层(stratummalpighi))是基底层与棘层。表皮与真皮(其潜在组织)通过基底膜分隔。本公开的表皮可以包含所述层中的一个或更多个。
如本文所用的表皮细胞是指能够分化成表皮(例如角质细胞)的细胞。
如本文所用的第一培养时段是指当角化细胞粘附于上平坦面时的培养时段。在第一培养时段期间，可以将一种或多种细胞类型添加到培养液中一次或多次。
如本文所用的第二培养时段是指其中粘附于上平坦面的角化细胞与透气层接触或接近的培养时段。在第二培养时段期间，可以将一种或多种细胞类型添加到培养液中一次或多次。
在本公开中，如本文所用，“添加能够分化成表皮的表皮细胞和成纤维细胞的培养物”包括其中：首先添加成纤维细胞且培养一定时段，随后添加表皮细胞(或随后添加表皮细胞与成纤维细胞的组合)；首先添加表皮细胞且培养一定时段，随后添加成纤维细胞(或随后添加表皮细胞与成纤维细胞的组合)；以及基本上同时添加表皮细胞与成纤维细胞的组合。
如本文所用的基本上同时是指其中相关细胞的添加之间不存在培养时段。
本公开中使用的细胞群需要足够的纯以符合用途。因此，也可以存在其它细胞群。
需要时，可以在任何时间将其它细胞添加到培养物中。
成纤维细胞可以在具有或不具有透气膜的细胞培养装置中、在预先步骤(例如在基质不存在下)培养，以增加数目。
在一个方面中，提供一种处理方法，其包含：
a)提供如上文所述的皮肤组织，
b)在无菌条件下从所述基质中回收所述组织，以及
c)将所述组织施加到需要处理的患者。
在一个方面中，提供一种用于收集电纺纤维片的集电板，例如不锈钢集电板，其中所述集电板包含微图案化表面，例如波浪形、波纹状或波形图案，具体地说，用于收集基质(具体地说，供分化皮肤培养用的基质模板)的电纺纤维。本公开还涉及所述板用于收集供细胞培养用的电纺基质纤维的用途。
在一个实施例中，所述板包含孔洞，使得孔洞内所形成的电纺纤维片的密度低于在集电板表面上所形成的电纺纤维片。有利的是，本发明人已发现较低密度的电纺纤维片形成优良的基质供全厚度皮肤生长用。
在一个方面中，提供一种通过将纤维电纺到如上文所定义的集电板上而产生的合成基质。本公开还涉及根据本发明的基质作为模板用于活体外培养皮肤组织(具体地说，分化皮肤组织)的用途。
在一个方面中，提供一种增强所培养皮肤组织抵抗剪切力的方法，其包含使皮肤组织在基质上生长，其中所述基质包含微图案化表面，例如波浪形、波纹状或波形图案。
在一个实施例中，通过将纤维电纺到如上文所定义的集电板上来产生基质。
在一个实施例中，所述基质是如上文所定义的基质。
附图说明
图1描绘了由一系列溶液浓度电纺而成plga的纤维直径的电子显微图像。a)20％w/v、b)25％w/v、c)30％w/v、d)35％w/v和e)40％w/v。
图2描绘了纤维直径和孔隙度对皮肤形成的影响。由不同浓度产生的电纺plga上所生长的人类皮肤细胞的横断面：a)20％w/v、b)25％w/v、c)35％w/v、d)40％w/v。所有断面用广谱细胞角蛋白染色(浅灰色区域)以标识角化细胞和用dapi染色(点)以标识细胞核。20％和25％未引起真皮形成。35和40％引起表皮下方形成真皮，如箭头所示。
图3描绘了蛋白质涂层对表皮分层的影响。未涂布的电纺plga和经人类胶原蛋白iv涂布的电纺plga上所生长的人类皮肤细胞的横断面。所有断面用广谱细胞角蛋白染色(浅灰色区域)以标识角化细胞和用dapi染色(点)以标识细胞核。胶原蛋白iv涂层的添加诱导表皮分层。
图4描绘了微图案化电纺plga片的图像。a)微图案化，b)扁平(未图案化)
图5描绘了微图案化的电纺plga相对于未图案化的电纺plga上所生长的皮肤的图像。微图案化的电纺plga(左图像)和未图案化(扁平)的电纺plga(右图像)上所生长的人类皮肤细胞的横断面，所述断面用波形蛋白染色(虚线之间的浅灰色区域)以标识真皮和用dapi(点)染色以标识细胞核。虚线表示皮肤顶层、表皮与皮肤底层(真皮)之间的界面。plga微图案化已复制网脊的形成。
图6描绘了正常人类皮肤的横断面的图像。正常人类皮肤横断面用广谱细胞角蛋白染色(虚线上方的浅灰色区域)以标识角化细胞和用dapi染色(灰色点)以标识细胞核。虚线表示皮肤顶层、表皮与皮肤底层(真皮)之间的界面。此界面不是扁平的，且以波形图案(称为网脊)为特征。
图7描绘了利用测孔术获得的曲线图的实例。
具体实施方式
如本文中可互换使用的术语“基质”、“细胞基质”、“细胞性基质”、“基体”或“细胞基体”是指任何物理结构，包括(但不限于)固体或半固体结构，例如具有孔隙的纤维网，其适于提供：
●机械或其它载体供细胞或组织粘附和增殖，和
●允许一种类型的细胞在培养过程中迁移，
例如活体外皮肤组织培养时。
如本文所用，与透气层/膜接触是指相关细胞位于所述膜/层上或接近所述膜/层，以便细胞能够出现生长及/或尤其分化。因此，接近通常意指透气层/膜与相关细胞不分隔(其间的空间填充有例如培养基、缓冲液或co2，尤其细胞培养基)。在一个实施例中，相关细胞与透气层的距离是2cm或更小，例如1cm或更小，具体地说，0.5、0.4、0.3、0.2、0.1或0.05cm。在一个实施例中，用于分化的细胞的外部搁置于透气层/膜上。
一般来说，基质将是三维的，其中细胞可能沉积于其上的第一2d和第二表面2d(具有显著表面积)与两个表面之间的深度得到3个维度(对应于最终皮肤的横断面，约100μm的某处，如上文所论述)。
本公开的基质可以由天然或合成材料构成。基质可以呈特定形状或形式，以便影响或界定增殖细胞群所呈现的三维形状或形式。此类形状或形式包括(但不限于)膜(例如二维实质上大于第三维度的形式)、带、绳、片、扁平盘片、圆柱体、球体、3维无定形形状等。
在一个实施例中，基质仅包含合成材料。在另一个实施例中，基质包含合成材料与天然材料的混合物。
在一个实施例中，用于制备本发明的基质的合成材料是生物相容的与可生物降解的(例如容易发生酶降解和水解降解)，例如可生物降解聚合物。
如本文所使用，“生物相容性”是指植入哺乳动物中时不引起哺乳动物的不利反应的任何材料。生物相容性材料当引入个体中时，对那个个体既无毒或无害，也不诱导所述材料在哺乳动物中的免疫排斥反应。
如本文所用，术语“可生物降解”或“生物可吸收”旨在描述在生物学环境中存在时间有限且在生理条件下降解而形成产物的材料，所述产物能够代谢或排出而对无损于受试者。在某些实施例中，产物代谢或排出而对受试者无持久性伤害。
在一个实施例中，基质能被受试者的身体完全吸收。
在一个实施例中，本公开的生物可吸收基质当放在生物学环境的情形时可以存在数日、数周或数月。举例来说，生物可吸收基质当放在生物学环境的情形下时，可以存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180天或更长。
在一个实施例中，基质层以与位于所述区域中的所述膜基质层下方的组织细胞的生长速率大约相同的速率被所述受试者的身体再吸收。在某些实施例中，所述细胞是上皮细胞。在某些实施例中，在施加皮肤移植物之后的约3至12个月内，基质层被所述身体基本上完全再吸收。在某些实施例中，基质在约3个月内基本上被完全再吸收。
可生物降解材料(例如聚合物)可以水解降解，可以需要细胞及/或酶作用来完全降解，例如水解、氧化、酶过程、吞噬或其它过程，包括前述的组合。
可生物降解聚合物为所属领域的技术人员已知的，并且包括(但不限于)合成聚合物、天然聚合物、合成和天然聚合物的掺合物、无机材料等。
在一个实施例中，基质的构造中并有一或多种合成聚合物。基质可由杂聚物、单聚合物或其组合制成。适于制造细胞基质的聚合物实例包括(但不限于)脂肪族聚酯、共聚(醚酯)、聚草酸亚烷酯、聚酰胺、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含有氨基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈、生物分子和其掺合物。
适合的脂肪族聚酯包括具有线性、分支或星形结构的均聚物、共聚物(无规、嵌段、分段、锥形嵌段、接枝、三嵌段等)。适用于制备脂肪族均聚物和共聚物的单体可以选自由(但不限于)以下组成的组：乳酸、丙交酯(包括l-、d-、内消旋和d,l混合物)、羟基乙酸、乙交酯、ε-己内酯、对二氧环己酮(1,4-二噁烷-2-酮)、三亚甲基碳酸酯(1,3-二噁烷-2-酮)、δ-戊内酯、β-丁内酯、ε-癸内酯、2,5-二酮吗啉新戊内酯、α,α-二乙基丙内酯、碳酸乙二酯、草酸乙二酯、3-甲基-1,4-二噁烷-2,5-二酮、3,3-二乙基-1,4-二噁烷-2,5-二酮、γ-丁内酯、1,4-二氧杂环庚烷-2-酮、1,5-二氧杂环庚烷-2-酮、6,6-二甲基-二氧杂环庚烷-2-酮、6,8-二氧杂双环辛烷-7-酮和其组合。
弹性体共聚物也特别适用于本公开基质。适合的生物可吸收生物相容性弹性体包括(但不限于)选自由以下组成的组的那些弹性体：ε-己内酯与乙交酯的弹性体共聚物(例如ε-己内酯与乙交酯的摩尔比为约35:65至约65:35，更例如45:55至35:65)；ε-己内酯与丙交酯的弹性体共聚物，包括其l-丙交酯、d-丙交酯掺合物或乳酸共聚物(例如ε-己内酯与丙交酯的摩尔比为约35:65至约65:35，例如45:55至30:70或约95:5至约85:15)；对二氧环己酮(1,4-二噁烷-2-酮)与丙交酯的弹性体共聚物，包括l-丙交酯、d-丙交酯和乳酸(例如对二氧环己酮与丙交酯的摩尔比为约40:60至约60:40)；ε-己内酯与对二氧环己酮的弹性体共聚物(例如ε-己内酯与对二氧环己酮的摩尔比为约30:70至约70:30)；对二氧环己酮与三亚甲基碳酸酯的弹性体共聚物(例如对二氧环己酮与三亚甲基碳酸酯的摩尔比为约30:70至约70:30)；三亚甲基碳酸酯与乙交酯的弹性体共聚物(例如三亚甲基碳酸酯与乙交酯的摩尔比为约30:70至约70:30)；三亚甲基碳酸酯与丙交酯的弹性体共聚物，包括l-丙交酯、d-丙交酯、其掺合物或乳酸共聚物(例如三亚甲基碳酸酯与丙交酯的摩尔比为约30:70至约70:30)和其掺合物。适合的生物可吸收弹性体实例描述于us4,045,418；us4,057,537和us5,468,253中，所述文献全部以引用的方式并入本文中。这些弹性体聚合物将具有约1.2dl/g到约4dl/g的固有粘度，优选约1.2dl/g到约2dl/g的固有粘度，并且最优选约1.4dl/g到约2dl/g的固有粘度，如在25℃下在聚合物于六氟异丙醇(hfip)中的0.1克/分升(g/dl)溶液中所测定。
适用作本公开的基质的其它材料包括(但不限于)聚乳酸-羟基乙酸(plga)、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈和其组合。不可生物降解聚合物包括聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、乙烯乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙交酯、硫酸软骨素(蛋白聚糖组分)、聚酯、聚乙二醇、聚碳酸酯、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚酯、聚醚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚己内酯、聚磷腈、聚原酸酯、聚乙交酯、赖氨酸和乳酸的共聚物、赖氨酸-rgd和乳酸等的共聚物，以及其共聚物。合成聚合物能够进一步包括选自由以下组成的群组的合成聚合物：脂肪族聚酯、聚(氨基酸)、聚(反丁烯二酸丙二酯)、共聚(醚-酯)、聚亚烷基草酸酯、聚酰胺、酪氨酸衍生的聚碳酸酯、聚(亚氨基碳酸酯)、聚原酸酯、聚氧杂酯、聚酰胺酯、含有氨基的聚氧杂酯、聚(酸酐)、聚磷腈，和其掺合物。
在一个实施例中，基质中并入聚乳酸(pla)。pla特别适合于使用细胞基质的组织工程方法，原因在于pla在人体内降解而形成容易从身体去除的乳酸，一种天然存在的化学物质。本发明的细胞基质中还可以并入聚羟基乙酸(pga)和/或聚己内酯(pcl)作为基质材料。pga和pcl的降解路径与pla相似，但pga在体内的降解比pla更快，而pcl的降解速率比pla慢。
pga已经广泛地用于组织工程。pga基质能容易操纵成各种三维结构，并且向细胞提供优良的支撑和运输手段(christensonl,mikosag,gibbonsdf等人：组织工程用的生物材料(biomaterialsfortissueengineering)：概述.《组织工程学(tissueeng.)》3(1)：71-73；论述73-76，1997)。由单独的聚羟基乙酸制成的基质，以及由pga和其它天然和/or合成生物相容性材料的组合制成的基质属于本公开的范围内。
在一个实施例中，基质包含聚(乳酸-共-羟基乙酸)(plga)，例如plga微纤维或纳米纤维。
在另一个实施例中，基质包含二氧环己酮线性均聚物，例如100二氧环己酮线性均聚物(例如dioxaprene100m)。
在一个实施例中，基质包含plga与100二氧环己酮的组合。
术语“纤维”在本文中用于指呈连续纤丝形式的材料，或离散的细长材料段，其典型地包含或由生物可降解聚合物(例如上述那些聚合物)构成。本公开的纤维直径典型地在微米范围内，例如0.5μm至5μm，例如1μm、1.5μm、2μm、2.5μm、3μm、3.5μm、4μm、4.5μm或5μm，具体地说，在1至3μm范围内。
在一个实施例中，纤维直径在0.3μm至1.5μm范围内，例如0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5μm。
术语“纤维基质”在本文中用于指纤维配置成支撑构架，例如呈纤维片形式，其然后可以用于支撑细胞或其它额外材料(也参见上文“基质”的定义)。技术人员已知的能够用于产生适合纤维的各种方法包括(但不限于)界面聚合和电纺。
在一个实施例中，利用电纺来形成本公开的基质。
术语“电纺”通常是指利用高电压电源、纺丝头(例如皮下注射针)和导电性集电板(例如铝箔或不锈钢)的技术。为了使用这些材料执行电纺工艺，通常首先将电纺液(即，用于形成纤维的所期望材料的熔体或溶液)装载到注射器中，且然后通过注射泵以设定的特定速率馈入。
当注射泵利用足够高的电压馈入液体时，固定于所得液滴表面上的电荷之间的排斥作用克服了表面张力的约束并且诱导液体射流从孔口喷出。带电射流然后经历抖动和拉伸过程，并且随后引起均一纳米纤维形成。此外，当射流伸展且蒸发溶剂时，纤维直径然后能够连续地减小到所期望的尺度，例如微米，或甚至小到纳米，且在电场的影响下，随后能够迫使纤维向接地集电极行进，所述纤维典型地以无纺垫形式沉积到所述集电极上。在本公开的上下文中，由于表面积与体积的比率高以及一维形态，因此电纺纤维能够模拟细胞外基质的架构。
用于生产本公开的纳米纤维的材料实例独立地选自下表1和表2中列出的那些材料。
表1-用于产生电纺纤维(天然聚合物)的例示性材料。
表2-用于生产电纺纤维(合成聚合物)的例示性材料。
在一个实施例中，本公开的基质由合成微纤维或纳米纤维构成，例如使用表2中列出的材料。
特定聚合物的选择和其在其指定量或浓度或范围内的使用提供控制、定制和调整聚合物降解速率且因此基质降解速率的能力。这是有用的，原因在于希望基质仍作为皮肤移植物的一部分，以便向生长的皮肤组织提供结构支撑，但一旦患者自身细胞已经与皮肤移植物同化，则最终降解且被患者身体生物吸收，由此消除日后从患者身体取出基质的需要。
可以利用聚合物(例如选自表1和2中列出的材料)的各种掺合物形成纤维，以改善其生物相容性以及其机械、物理和化学特性。
所期望的微纤维或纳米纤维基质已经制成后，在一个实施例中，则将本公开的两种或更多种纤维基质层叠在一起。通过将多种纤维基质分层，能够将各种纤维基质的优良和未预期优点组合，并且在一些情况下，引起协同效应。
举例来说，第一基质可以包含用于接收一个或多个相关细胞和/或皮肤组织的微孔，然后层叠于具有径向配向的纤维的第二基质上。在这个实例中，第一基质能够提供的益处在于通过提供相关细胞和/或皮肤组织而增强受损皮肤的修复，而第二基质能够提供的益处在于引导和增强细胞从周边迁移到层状基质的中心。将两种或更多种基质层叠还可以有助于增强基质的不透水特性。技术人员能够衍生出两种或更多种不同基质的各种组合，以便实现所期望的特性。
在一个实施例中，本公开的基质可以通过单一程序或程序组合进一步处理，从而在储存和/或分配基质的条件下能够减少在基质中生长的微生物的数目。
在一个实施例中，使用γ辐射将基质灭菌。在另一个实施例中，使用环氧乙烷(eto)将基质灭菌。在另一实施例中，使用利用过乙酸的revox将基质灭菌。
在一个实施例中，利用电离辐射(例如电子束照射)灭菌。电子束处理具有当前认可的任何灭菌方法的最短工艺循环。电子束照射时，使产品曝露于辐射数秒，处理时间大部分消耗在将产物运到辐射屏蔽件内和从辐射屏蔽件中运出。整个处理时间，包括运输时间，是5至7分钟。电子束处理涉及使用高能量电子，其典型地具有3到10百万电子伏特(mev)范围内的能量，用于单次使用的抛弃式医疗产品的辐射。电子由按照脉冲与连续电子束模式操作的加速器产生。需要这些高能级来穿透封装于其最终船运集装箱中的产品。当电子束扫描通过产品时，电子与材料相互作用并且产生次级高能物质，例如电子、离子对和游离基。这些次级高能物质负责微生物的灭活，原因是它们破坏微生物的dna链，从而使得产品无菌。技术人员了解对本公开的基质进行灭菌的其它可能方法。
用于接种本公开的基质的细胞
本公开的基质适于支持各种细胞类型的生长，例如上皮细胞及/或表皮细胞。
术语“上皮”和“上皮细胞”是指覆盖内部和外部体表(皮肤、粘液和浆液)的细胞，包括腺体和其衍生的其它结构，例如角膜、食道、喉、表皮、毛囊和尿道上皮细胞。
在一个实施例中，所用上皮细胞是皮肤细胞，例如人类皮肤细胞，例如形成表皮和真皮的细胞，例如成纤维细胞和角化细胞。
其它例示性上皮细胞包括：嗅觉上皮，其为鼻腔嗅觉区域内层的假复层上皮，并且含有感觉气味的受体；腺上皮，其是指由分泌细胞构成的上皮；鳞状上皮，其是指由扁平化板状细胞构成的上皮。
如本文所用，“成纤维细胞”应理解为天然存在的成纤维细胞(更具体地说，存在于真皮中的成纤维细胞)、经过基因修饰的成纤维细胞或源自自发突变的成纤维细胞或其前体。
如本文所用，“角化细胞”应理解为形成角质化板上皮的表皮细胞、经过基因修饰的角化细胞或源自自发突变的角化细胞或此类角化细胞的前体，所述细胞可以具有动物或人类来源。或者，对于正常皮肤角化细胞，可以将粘膜角化细胞或肠上皮细胞施加到基质。这些是例如预培育的细胞，并且在一个实施例中，第一或第二细胞传代的角化细胞，但也可以使用来自更高传代的细胞。
成纤维细胞和角化细胞是通过技术人员已知的方法获得且培育，所述细胞可以适于待产生的皮肤组织的所需特性。
在一个实施例中，可以在播种角化细胞之前、期间或之后，在基质上播种人类和动物来源的其它细胞类型及/或其它组织类型(例如哺乳动物)的其它细胞，和/或其前驱细胞，例如黑色素细胞、巨噬细胞、单核细胞、白细胞、浆细胞、神经元细胞、脂肪细胞、朗格罕氏细胞的被诱导和未诱导前驱细胞、朗格罕氏细胞和其它免疫细胞、内皮细胞、来自皮肤肿瘤的细胞或皮肤相关细胞，更具体地说，皮脂腺细胞或皮脂腺组织或皮脂腺外植体、汗腺或汗腺组织或汗腺外植体的细胞、毛囊细胞或毛囊外植体；和来自其它器官肿瘤或来自转移的细胞。所提及的细胞可以具有人类和/或动物来源(例如人类来源)。还可以将各种来源的干细胞、组织特异性干细胞、胚胎和/或成体干细胞并入皮肤模型中。
因此，根据本公开的方法和基质能够产生全厚度人体皮肤，其由两个组织特异性层构成，即，真皮等效物和表皮等效物。皮肤组织在组织学上和功能上基本上对应于原生皮肤。
术语“组织”用于指以类似方式专门化的细胞的聚集体，其统一执行特定功能。组织旨在涵盖所有类型的生物组织，包括硬组织和软组织。“组织”是嵌入其天然基质内的特定细胞的集合或聚集体，其中天然基质是由特定活细胞产生。所述术语还可以指以类似方式专门化的细胞的活体外聚集体，其在试管内(例如在人造器官中)扩增。
如本文所用，术语“皮肤组织”或“皮肤”是指包括表皮、真皮和基底膜组织的任何组织，例如全厚度皮肤。
在一个实施例中，待接种的细胞是自体的，即来源于受试者自身的身体。在另一实施例中，同种异体细胞来源于相同物种的基因不相似成员。在一些情况下，可以使用来源于不同于指定接受者的物种的异种细胞。
在一个实施例中，皮肤细胞在生理溶液存在下播种于基质上。
如本文所用，术语“生理溶液”是指与能改变某一生理环境的生理状态的一种或更多种生理条件或相似或相同的溶液。如本文所用，术语“生理溶液”也指能够支持细胞(包括(但不限于)哺乳动物、脊椎动物和/或其它细胞)生长的溶液。
在一个实施例中，生理溶液包含限定的培养基，其中每种培养基组分的浓度是已知的和/或可控的。限定的培养基典型地含有支持细胞生长所需的所有营养，包括(但不限于)盐、氨基酸、维生素、脂质、微量元素和能量来源，例如碳水化合物。限定的培养基的非限制性实例包括dmem、伊格尔基础培养基(basalmediaeagle，bme)、培养基199；f-12(汉姆)营养混合物；f-io(汉姆)营养混合物；最小必需培养基(mem)、威廉氏培养基e，和rpmi1640。
在另一个实施例中，培养基是dmem(杜尔贝科氏改进型伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeaglemedium))、m199、汉姆f12培养基或其组合。然而，还可以使用允许培育成纤维细胞的任何其它细胞培养基。
在一个实施例中，使用格林培养基(greensmedium)，其是比率为3:1的dmem:汉姆f12(lifetechnologies31765-035)。
尽管ncs和血清替代产品也适合，但优选胎牛血清(fcs)用作血清，同时缓冲液使用例如hepes缓冲液。细胞培养基、缓冲液和血清的溶液的ph值优选在6.0至8.0范围内，例如6.5至7.5，且更具体地说7.0。
所属领域的一般技术人员将了解可以根据本发明使用的其它限定培养基。在一个实施例中，采用一种或更多种限定的培养基的混合物。
在一个实施例中，培养基可以含有其它因子，例如激素、生长因子、粘附蛋白、抗生素、选择因子、酶和酶抑制剂等。生长因子例如可以有助于增强所接种细胞的增殖。
细胞基质的接种密度可变化，并且细胞基质的个别层可以具有相同或不同的接种密度。接种密度可以根据施加细胞基质的具体应用而改变。接种密度还可以根据用于制造细胞基质的细胞类型而改变。
接种到基质中或接种到基质上的细胞的数目和浓度能够通过调节悬浮中的细胞浓度或通过调节分布到基质的指定区域或体积上的悬浮数量来改变。
在一个实施例中，接种密度是约150,000个角化细胞/cm2或更高，例如200,000、250,000、300,000、350,000、400,000、450,000、500,000、550,000或600,000个角化细胞/cm2。
在一个实施例中，接种密度是约50,000个成纤维细胞/cm2或更高，例如60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000或200,000个成纤维细胞/cm2。
基质的个别层的接种密度将取决于基质的预定用途。尽管所属领域的技术人员可以了解特定应用将需要的接种密度，但可以多种接种密度接种基质的个别层。所属领域的技术人员将了解，基质的个别层的接种密度可以根据基质的预定用途而改变。
展布涉及使用仪器(例如刮刀)将接种物展布于整个海绵状基质中。通过涂刷来接种基质是通过将刷子浸入接种物中、将其取出并且用满载接种物的刷子擦遍基质来实现。这种方法的缺点在于，大量的细胞会依附于刷子，并且不能施加到栅格上。尽管如此，然而其尤其可以适用于以下情形：希望小心地控制接种物分布的栅格的图案或区域。
通过喷涂来接种基质通常涉及迫使接种物通过任何类型的喷嘴，从而将液体转变成气载小液滴。此实施例服从两个约束条件。首先，不得使溶液中的细胞经受会损伤或杀死大量细胞的剪切力或压力。其次，不需要将细胞悬浮液与对细胞或伤口床有毒或有害的推进流体混合。通常可获得的多种喷嘴满足两个约束条件。此类喷嘴可以任何传统方式连接到含有上皮干细胞接种物的储集器。
通过吸移来接种基质是利用移液管、普通的“滴眼管”或能够将少量接种物放置于本公开的基质表面上的其它类似装置完成。含水液体渗透通过多孔基质。悬浮中的细胞倾向于在基质表面被绊住并且借此持留于基质表面上。
根据本发明的另一个实施例，可以借助于配备有中空针或其它导管的皮下注射器接种细胞接种物。将细胞悬浮液施于注射器筒体中，并且将针插入基质中。按压注射器的柱塞以将一定量的溶液从筒体中喷出、通过针并且进入支架中。
利用细胞的水性悬浮液的重要优势在于其可用于极大地扩大有效接种物分布于其上的基质面积。由此得到两个不同优势。首先，如果可供自体移植使用的完整组织的量非常有限，则可以利用各种悬浮方法显著增加可以接种有限数目个可利用细胞的基质的面积或体积。其次，如果需要接种细胞的基质面积或体积被指定，则可以大大减少需要从供体部位收集的完整组织的量。特定应用的最优接种密度可以由本领域的技术人员通过常规实验来确定。
典型地，基质应该具有基本上平坦的维度并且厚度允许接种的细胞充分进入营养物培养基中。植入时，细胞基质必须让体液充分地进入以便提供营养和去除废弃物。基质厚度可以根据基质孔隙度的变化而改变。因此，基质孔隙度的增加可以允许基质采取较大厚度，原因是较大孔径使得进入外部培养基和体液改善。
因此，在一个实施例中，基质具有100μm或更小的厚度，例如100、90、80、70、60、50、40、30、20、10或5μm。通过使基质厚度保持100μm或更小，这允许使所接种的角化细胞仅通过扩散便可接收营养和去除废弃物，而不需要血管系统来存活。
接种层状基质包括将一种或多种所期望的细胞群引入所选基体材料中，以及随后使所述材料连接而产生层状基质。或者，可以使基质预连接，并且将所选细胞群在所选地点引入。接种不同于当基质放在伤口部位时细胞从伤口部位自发浸润和迁移到基质中。
在一个实施例中，所述基质是在至少一个表面上接种(例如在基质的所谓上表面接种)角化细胞。在一个实施例中，基质的所谓下表面接种成纤维细胞。在一个实施例中，基质上表面接种角化细胞且基质下表面接种成纤维细胞。在一个实施例中，基质上表面接种角化细胞且基质下表面不接种成纤维细胞(仅允许成纤维细胞从细胞培养物中迁移到基质中)。在一个实施例中，在角化细胞接种到基质上表面上之前，成纤维细胞已经迁移到基质中(例如预培养步骤)。
待附着或涂布于本公开的基质上的各种药剂
各种其他材料和/或生物分子可以附着于本公开的基质上。术语“附着”包括(但不限于)通过任何手段涂布、嵌入或并入其它材料和/或生物分子，并且附着可以指将此类组分并入整个基质或其仅一部分上。
在一个实施例中，将细胞因子涂布/附着于本公开的基质上。如本文所用，术语“细胞因子”是指由活细胞(例如干细胞)合成并且在体内(例如哺乳动物或人体)产生有益作用的物质。细胞因子包括(但决不限于)生长因子、调控因子、激素、酶、淋巴因子、肽以及其组合。细胞因子可以具有不同作用，包括(但不限于)活体内或试管内影响细胞(例如干细胞)的生长、增殖、定型和/或分化。
细胞因子的一定非限制性实例包括(但不限于)细胞介素(例如共同β链、共同γ链和il-6细胞介素家族)、血管内皮生长因子(例如vegf-a、vegf-b、vegf-c、vegf-d和vegf-e)、肾上腺髓质素、胰岛素样生长因子、表皮生长因子egf、成纤维细胞生长因子fgf、自分泌运动因子、gdf、igf、pdgf、生长分化因子9、红细胞生成素、活化素、tgf-α、tgf-β、骨形态发生蛋白质(bmp)、刺猬分子(hedgehogmolecules)、wnt相关分子，以及其组合。
在一个实施例中，可以促进组织再生的生长因子，例如egf(表皮生长因子)、igf-i(胰岛素样生长因子)、成纤维细胞生长因子家族成员(fgf)、角化细胞生长因子(kgf)、pdgf(血小板源生长因子aa、ab、bb)、tgf-β(转型生长因子家族-βl,β2,β3)、cif(软骨诱导因子)、bmp1-14(骨形态发生蛋白)中的至少一种、粒细胞-巨噬细胞群落刺激因子(gm-csf)或其组合，能够附着或涂布于本公开的基质上。
在一个实施例中，生长因子是vegf。在另一个实施例中，生长因子是pdgf。技术人员会了解到可以附着于或用于涂布本公开主题的基质的各种其它材料和生物分子，并且它们可以基于它们所施加的组织、根据具体应用来选择。
在一个实施例中，细胞外基质蛋白质，例如纤维结合蛋白、层粘连蛋白和/或胶原蛋白，进一步附着或涂布于基质上。因此，在一个实施例中，用胶原蛋白iv、胶原蛋白i、层粘连蛋白和纤维结合蛋白或其组合来涂布基质。本发明人已发现这些蛋白质有助于提供次级细胞信号，其与空气液体界面(或透气膜)处的生长结合，促使使用基质生长的皮肤细胞进行恰当分层。
在一个实施例中，使用胶原蛋白iv。胶原蛋白iv展示对产生适当表皮分层特别有效。
细胞外基质蛋白质可以呈全长蛋白质或其肽(例如合成肽)形式。
在另一实施例中，治疗剂进一步附着于基质。如本文所用，术语“治疗剂”是指当结合本公开的方法、基质和/或皮肤组织使用时展现一种或更多种有益治疗效果的多种药剂中的任一种。可以使用的治疗剂实例包括(但不限于)蛋白质、肽、药物、细胞介素、细胞外基质分子和/或生长因子。所属领域的技术人员将了解可以根据本公开使用的其它适合和/或有利治疗剂。
在一个实施例中，治疗剂为消炎剂或抗生素。能够并入基质中的消炎剂实例包括(但不限于)类固醇消炎剂，例如倍他米松(betamethasone)、曲安西龙(triamcinolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)、莫米松(mometasone)、氟替卡松(fluticasone)、倍氯米松(beclomethasone)、氟尼缩松(flunisolide)和布地奈德(budesonide)；以及非类固醇消炎剂，例如非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、布洛芬(ibuprofen)、酮基布洛芬(ketoprofen)、萘普生(naproxen)、奥沙普嗪(oxaprozin)、双氯芬酸(diclofenac)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indomethacin)、酮咯酸(ketorolac)、萘丁美酮(nabumetone)、舒林酸托麦汀甲氯芬那酸(sulindactolmetinmeclofenamate)、甲芬那酸(mefenamicacid)、吡罗昔康(piroxicam)和舒洛芬(suprofen)。
根据本公开的主题，也能够使用各种抗生素。非限制性实例包括氨基糖苷，例如阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、巴龙霉素(paromomycin)、链霉素(streptomycin)或托普霉素(tobramycin)；碳青霉烯(carbapenem)，例如厄他培南(ertapenem)、亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)；氯胺苯醇(chloramphenicol)；氟喹诺酮(fluoroquinolone)，例如环丙沙星(ciprofloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、格帕沙星(grepafloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)或曲伐沙星(trovafloxacin)；糖肽(glycopeptide)，例如万古霉素(vancomycin)；林可酰胺(lincosamide)，例如克林达霉素(clindamycin)；大环内酯/酮内酯(macrolides/ketolide)，例如阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)或泰利霉素(telithromycin)；头孢菌素(cephalosporin)，例如头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑林(cefazolin)、头孢氨苄(cephalexin)、头孢金素(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢拉定(cephradine)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢尼西(cefonicid)、头孢替坦(cefotetan)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢地尼(cefdinir)、头孢托仑(cefditoren)、头孢克肟(cefixime)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布坦(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)或头孢吡肟(cefepime)；单环β-内酰胺(monobactam)，例如氨曲南(aztreonam)；硝基咪唑，例如甲硝哒唑(metronidazole)；噁唑烷酮，例如利奈唑胺(linezolid)；青霉素，例如阿莫西林(amoxicillin)、阿莫西林/棒酸盐(amoxicillin/clavulanate)、氨苄青霉素(ampicillin)、氨苄青霉素/舒巴坦(ampicillin/sulbactam)、巴坎西林(bacampicillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、二甲氧苯青霉素(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素g(penicilling)、青霉素v(penicillinv)、哌拉西林(piperacillin)、哌拉西林/三唑巴坦(piperacillin/tazobactam)、替卡西林(ticarcillin)或替卡西林/棒酸盐；链阳霉素(streptogramin)，例如喹奴普丁/达福普汀(quinupristin/dalfopristin)；磺酰胺/叶酸拮抗剂，例如磺胺甲基异噁唑/甲氧苄啶(sulfamethoxazole/trimethoprim)；四环素，例如地美环素(demeclocycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)或四环素；唑抗真菌剂，例如克霉唑(clotrimazole)、氟康唑(fluconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、咪康唑(miconazole)或伏立康唑(voriconazole)；多烯抗真菌剂，例如两性霉素b(amphotericinb)或耐丝菌素(nystatin)；棘白菌素(echinocandin)抗真菌剂，例如卡泊芬净(caspofungin)或米卡芬净(micafungin)，或其它抗真菌剂，例如环吡酮(ciclopirox)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)或特比萘芬(terbinafine)。
在一个实施例中，将各种镇痛剂和/或麻醉剂附着于或并入本公开的基质中。如本文所用，术语“镇痛剂”是指用于减轻疼痛的药剂且在一些实施例中，能够与术语“消炎剂”互换使用，因此术语镇痛剂可以包括本文所述的例示性消炎剂。例示性镇痛剂包括(但不限于)：扑热息痛(paracetamol)和非类固醇消炎剂、cox-2抑制剂，和鸦片剂，例如吗啡(morphine)和吗啡模拟剂。
如本文所用，术语“麻醉剂”是指用于促使受试者产生可逆感觉丧失的药剂并且从而能够用于减轻疼痛。能够根据本公开主题使用的例示性麻醉剂包括(但不限于)局部麻醉剂，例如普鲁卡因(procaine)、阿美索卡因(amethocaine)、可卡因(cocaine)、利多卡因(lidocaine)、丙胺卡因(prilocaine)、布比卡因(bupivicaine)、左布比卡因(levobupivicaine)、罗比卡因(ropivacaine)、甲哌卡因(mepivacaine)和狄布卡因(dibucaine)。
本公开的基质和皮肤组织的用途
本公开提供了利用本文所述方法(例如利用本公开的基质)所制备的组织(例如上皮、表皮、分层上皮、分层表皮和真皮、分厚度皮肤或全厚度皮肤)用于治疗有需要的受试者的组织损伤的用途。
术语“受试者”在本文中用于指人类和动物受试者，但通常希望指需要治疗的人类患者。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”包括(但不限于)抑制组织损伤的进展、遏制组织损伤的发展、减小组织损伤的严重程度、改善或缓解与组织损伤有关的症状，以及修复、再生和/或引起受损组织或与受损组织有关的一种或多种症状的消退。
本公开提供一种治疗有需要的受试者的组织损伤的方法，包含：
a)提供皮肤组织，例如上皮、分层上皮、表皮、分层表皮、分层表皮和真皮、分厚度皮肤或全厚度皮肤，其已经生长，例如在如本文所述的方法中生长，例如使用本公开基质的方法，
b)在无菌条件下从所述基质中回收所述组织，以及
c)将所述组织施加到所述患者。
在各种实施例中，组织损伤是伤口、慢性伤口、手术伤口、溃疡、未愈合伤口、疤痕、手术疤痕、烫伤或烧伤。在各种实施例中，烧伤是一度烧伤、二度烧伤、三度烧伤、深度真皮烧伤或全厚度烧伤。
在各种实施例中，组织损伤是位于粘膜表面上的上皮。在各种实施例中，上皮位于皮肤、肺、胃肠道(例如食管或口腔)、生殖道或泌尿道(例如尿道)上或其中。
其它治疗实例包括(但不限于)：具有神经及细胞器的皮肤再生；伤口愈合，例如促进/增强伤口愈合，包括溃疡，例如糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；大疱性表皮松解症；增强皮肤品质或外观；预防或修复皮肤病症；减轻或消除疤痕组织；乳房皮肤再生(外科手术之后)；化妆品应用，例如抗老化；针对皱纹和其它皮肤缺陷进行的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其它细胞器再生；无疤痕愈合，或减少疤痕的再愈合。
在一个实施例中，本公开提供了适用于受损、丧失和/或退化组织再生的基质、皮肤组织和方法。举例来说，本发明的基质、方法或皮肤组织可以用于起始、增强、支持、促进和/或引导受损、丧失和/或退化组织的再生，具体地说，受损皮肤的再生。
如本文所用，“再生(regeneration)”、“再生(regenerate)”、“再生(regenerative)”是指起始、增强、调节、促进、支持和/或引导虚弱、受损、丧失和/或退化组织的生长、再生长、修复、功能化、图案化、连接性、强化、活力和/或天然伤口愈合过程的任何过程或品质。这些术语还可以指起始、增强、调节、促进、支持和/或引导虚弱、疲劳和/或正常组织的生长、强化、功能、活力、韧性、效能和/或健康的任何过程或品质。
如本文所用，术语“伤口”用于泛指皮肤和皮下组织的损伤，其起始方式不同(例如长时间卧床休息所致的压疮和创伤诱导的伤口)并且特征不同。视伤口深度而定，伤口通常归类为四种等级之一：i级：伤口限于上皮；ii级：伤口延伸到真皮内；iii级：伤口延伸到皮下组织；和iv级(或全厚度伤口)，其为骨骼暴露的伤口(例如骨压点，例如大转子或骶骨)。
如本文所用，术语“部分厚度伤口”是指涵盖i-iii级的伤口，例如烧伤伤口、压疮、静脉淤滞性溃疡和糖尿病性溃疡。如本文所用，术语“深度伤口”用于描述iii级和iv级伤口。
在一个实施例中，提供了一种利用本文所述方法制备的皮肤组织，例如上皮、表皮、分层上皮、分层表皮和真皮、分厚度皮肤或全厚度皮肤，其通过覆盖受试者身体的受损、受伤、有伤口、病变、已去除或缺失皮肤组织而促进皮肤移植。
如本文所用，“移植物”是指植入个体中的细胞、组织或器官，典型地以置换、矫正或以其它方式克服缺陷。因此，“皮肤移植物”是可以植入个体中(例如缝合到个体)的皮肤组织。移植物可以进一步包含本公开的基质，例如其中所述基质整合到皮肤移植物中。组织或器官可以由来源于同一个体的细胞组成；此移植物在本文中通过以下可互换术语提及：“自体移植物”、“自体移植体”、“自体植入体”和“自体移植物”。包含来自同一物种的不同基因个体的细胞的移植物在本文中通过以下可互换术语提及：“同种移植物”、“同种异体移植体”、“同种异体植入体”和“同种异体移植物”。“异种移植物”、“异种移植体”或“异种植入体”是指从一位个体到不同物种的另一个体中的移植物。
在一个实施例中，使用受试者自体的细胞制备组织。举例来说，在各种实施例中，使用受试者自体的成纤维细胞、角化细胞或成纤维细胞和角化细胞制备组织。在一个替代实施例中，使用对于受试者来说异源的细胞制备组织。在另一实施例中，使用细胞组合来制备组织，其中一些细胞对于个体来说是自体的并且一些细胞对于受试者来说是异源的。
应了解，可以使用所属领域中已知的任何方法分离出受试者自体细胞。举例来说，可以通过消化样品组织并且从消化组织中分离成纤维细胞和/或角化细胞而从取自受试者的皮肤样品或皮肤活检体分离自体细胞。
在一个实施例中，组织是自体移植物，例如皮肤自体移植物。在各种实施例中，组织是表皮自体移植物、分厚度皮肤自体移植物或全厚度皮肤自体移植物。在另一实施例中，组织为同种异体移植物。
应了解，使用患者自体细胞制备的组织(例如自体移植物)的应用对于减轻或预防组织的免疫排斥以及减少进行中的免疫疗法或另一辅助疗法的需求来说是非常理想的。
在一个实施例中，组织进一步包含基质。在另一个实施例中，组织在施加到患者之前与基质分离。
一般来说，组织施加到患者是通过外科手术来实现。在一个实施例中，在无菌条件下回收是在外科手术期间或即将进行外科手术之前，例如在手术室。
一般来说，将组织施加到患者是在组织损伤部位或邻近处进行。在各种实施例中，施加组织以至少部分地覆盖组织损伤部位或完全地覆盖组织损伤部位。
在一个实施例中，施加组织以暂时覆盖组织损伤部位。在一个替代实施例中，施加组织以持久性覆盖组织损伤部位。
其它非医学用途
体表施加的医药、营养药物或化妆品产品的功效和安全性典型地是利用动物皮肤或活动物、人尸皮肤或合成人皮肤模型进行测试。
动物和人类皮肤之间的形态差异意味着用于产品测试的所切除动物皮肤或活动物不是最优的。此外，关于使用活动物或动物皮肤测试化妆品产品的伦理担忧相当多，包括一些国家禁止此类测试。出于这些原因，强烈希望鉴别出用于测试此类产品的动物模型的替代物。
当使用人尸皮肤进行产品测试时，观察到不一致且高度可变的结果。
因此，细胞或组织，例如使用本文所述的装置或方法制备的皮肤组织，适用于医药、营养药物或化妆品产品的试管内测试。
在各种实施例中，使用本文所述装置或方法制备的细胞或组织用于测试化合物的透皮渗透性，测试化合物穿越表皮、真皮或基底膜的渗透性，测试活性成分治疗或预防病状(例如皮肤病状)的功效，或测试化合物的毒性。
更具体地说，根据本公开产生的皮肤组织适于测试产品，例如有效性、不需要的副作用，例如刺激、毒性和发炎或过敏效应，或物质相容性。这些物质可以是预定潜在用作药剂(例如用作皮肤药剂)的物质，或与皮肤形成接触的化妆品或甚至消费品(例如洗衣剂)的成分的物质等。
本公开的皮肤组织还可用于例如研究物质的吸收、运输和/或渗透。其还适于研究其它药剂(物理量)，例如光或热、放射性、声音、电磁辐射、电场，例如用于研究光毒性，即，不同波长的光对细胞结构的损伤效应。所述皮肤组织还可用于研究伤口愈合且还适于研究气体、气溶胶、烟雾和粉尘对细胞结构或代谢或基因表达的影响。
在一个实施例中，本公开的皮肤组织可以用于研究影响皮肤的疾病机理，例如皮肤癌、牛皮癣、皮炎等。
在各种实施例中，所述细胞或组织用于确定所关注的化合物是否是皮肤刺激物，例如确定所关注的化合物是否诱导皮疹、发炎或接触性皮炎。
能够确定物质或药剂对人类皮肤的影响，例如根据人类或动物皮肤模型系统中的细胞对物质(例如细胞介素或介体)的释放和对那些细胞的基因表达、代谢、增殖、分化和重组的影响。使用量化细胞损伤的方法，更具体地说，使用活体染料，例如四唑鎓衍生物，可以例如检测对皮肤细胞的细胞毒性效应。使用皮肤组织测试物质或药剂可以包含组织学方法以及免疫学和/或分子生物学方法。
如本文所用，“测试药剂”是针对其诊断、治愈、缓和、治疗或预防受试者的疾病的能力加以评估的任何物质，或旨在改变受试者的身体的结构或功能的任何物质。测试药剂包括(但不限于)化合物、生物药剂、蛋白质、肽、核酸、脂质、多糖、补充剂、信号、诊断剂和免疫调节剂。测试药剂可以进一步包括电磁和/或机械力。
在另一个实施例中，根据本公开产生的皮肤组织可以作为模型系统用于研究皮肤病和开发皮肤病的新疗法。举例来说，患有某种遗传或后天皮肤病的患者的细胞可以用于确立患者特异性皮肤模型系统，所述系统又可以用于研究和评估某些疗法和/或药剂的有效性。
在一个实施例中，皮肤组织中可以繁殖有微生物，更具体地说，病原性微生物。具有病原性或寄生性微生物(尤其包括人类病原性微生物)的群体。
如本文所用，“微生物”通常指真菌、细菌和病毒。微生物优选地选自真菌或病原性和/或已知感染皮肤的寄生细菌。这些包括(但不限于)以下属的菌种：白色念珠菌(candidaalbicans)、发疮小芽胞癣菌(trichophytonmentagrophytes)、糠秕疹小芽孢菌(malasseziafurfur)和金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)。
使用相应繁殖的皮肤组织，可以研究微生物群体的过程，更具体地说，微生物本身的感染过程，和皮肤对那种群体的反应。另外，能够研究物质在施加之前、期间或之后对群体本身的影响或所述群体对皮肤组织的影响。
在各种实施例中，细胞包含成纤维细胞、角化细胞或免疫细胞，或其任何两种或更多种的组合。在一个实施例中，细胞包含成纤维细胞和角化细胞。在各种实施例中，组织是选自包含的群组：表皮、分层表皮和真皮、分层表皮和真皮、分厚度皮肤或全厚度皮肤。
如本文所用，分厚度皮肤是指表皮或真皮层(例如真皮层)。
在各种实施例中，化合物是医药化合物、化妆品化合物或营养药物化合物。
在各种实施例中，用于测试的化合物是单独或与医药学或化妆品可接受的载体、赋形剂或稀释剂混合施加至组织。
在各种实施例中，用于测试的化合物是以无菌乳膏、凝胶、浇泼剂或点滴配制物、悬浮液、洗剂、软膏、扑粉、浸液、喷雾剂、含药敷料、洗发剂、套环或皮肤贴片形式体表施加至组织。
在本说明书的上下文中，“包含”意指“包括”。
在技术上适当时，本发明的实施例可加以组合。
本文中描述了包含某些特征/元件的实施例。本公开还涉及由或主要由所述特征/元件组成的单独实施例。
技术参考文献，例如专利和申请，通过引用并入本文。
本文中具体且明确叙述的任何实施例可以单独或与一个或多个其它实施例组合形成权利要求的基础。
本公开的背景章节包括技术上相关的公开内容，其可以用作修正权利要求书的基础。
本申请要求g1622340.6的优先权，所述文献以全文引用的方式并入本文中。对本公开的校正可以是基于优先的公开内容。
现将参考以下实例来描述本发明，这些实例仅具说明性且不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
实例
在实例1至3中，使用实例4至7中所述的方法使细胞在本公开的基质上生长。
实例1-确定最优纤维直径和孔隙度
纤维直径和孔隙度对于实现成纤维细胞与角化细胞的混合物自组织化进入含有表皮和真皮层的全厚度皮肤具有重要作用。纤维直径和孔隙率必需是最优的，以便当角化细胞和成纤维细胞添加到表面时，角化细胞停留在顶部并且形成表皮，并且成纤维细胞能够迁移到合成基质中以产生真皮。结果是，所形成的皮肤在分别由成纤维细胞和角化细胞形成的真皮和表皮之间整合有合成基质。
因此，本发明人首先测试plga溶液的一系列不同浓度(20％w/v、25％w/v、30％w/v、35％w/v和40％w/v)用于电纺纤维片。图1描绘了plga电纺纤维的图像。所有不同plga浓度均使用72:25plga(聚乳酸与聚羟基乙酸的比率72:25)。电纺参数如下：
●将plga溶解于1:1二甲基甲酰胺:四氢呋喃中。
●湿度小于50％。温度30℃。
●注射器末端的针尖距离不锈钢集电板10cm。
●流量0.4毫升/小时。
●电纺进行5小时。外施电压8kv。
●不锈钢集电板含有孔洞，使得在“空气”形成的电纺plga垫的密度低于在不锈钢集电极上形成的电纺plga垫。本发明人发现低密度电纺plga特别适用作供全厚度皮肤生长的合成支架。
接着，电纺plga片用作供人类皮肤细胞生长用的支架。
使用20％和25％plga溶液产生成纤维细胞不能够迁入其中、而是都停留在表面上的电纺plga片(图2a和2b)。使用35％和40％溶液产生成纤维细胞能够迁入其中且角化细胞停留在顶部而形成表皮的电纺plga片(图2c和2d)。由于40％溶液在技术上较难以发挥作用(因为其粘性极大)，因此最优选择35％溶液。
实例2-涂布plga基质的蛋白质和其对表皮分层的影响
在空气-液体或透气界面生长的角化细胞形成分层表皮，其对人类皮肤的屏障功能是至关重要的。反之，未涂布电纺plga上的在空气-液体或透气界面生长的角化细胞不分层；实际上形成不分层的无组织化表皮。未涂布plga参见图3。因此，需要第二细胞信号与空气-液体或透气界面的结合，以便实现适当的表皮分层。
因此，本发明人测试电纺plga上的多种不同蛋白质涂层：胶原蛋白iv(10μg/cm2)、胶原蛋白i(10μg/cm2)、层粘连蛋白(2μg/cm2)、纤维结合蛋白(5μg/cm2)。当细胞在空气-液体或透气界面处生长且都是活替代物时，所有涂层都显示引起恰当的表皮分层。然而，胶原蛋白iv涂层始终产生最佳表皮分层。涂布的plga参见图3。
实例3-微图案化电纺plga
图6描绘了正常人类皮肤的横断面。虚线表示皮肤顶层、表皮与皮肤底层(真皮)之间的界面。此界面不是扁平的，且以波形图案(称为网脊)为特征。网脊是真皮-表皮界面处的轮廓，其向剪切力提供抗性且潜在地提供角化细胞干细胞的小生境。
本发明人确定，如果所培养的皮肤组织能够复制这些网脊，则将是有益的，因为皮肤移植物典型地经历多次剪切力，例如来自伤口敷料或来自皮肤移植物上摩擦的衣服。
为了复制网脊，本发明人开发了微图案化电纺plga片。参见图4。plga的微图案化是通过使用微图案化集电板(例如不锈钢板)实现。
当微图案化plga片用作支持皮肤组织生长的基质时，其成功地促使表皮和真皮层复制网脊形成。参见图3。
实例4-使用本公开的基质使全厚度皮肤生长的方法
使灭菌基体(电纺plga或与皮肤细胞生长相容的任何其它真皮替代品)附着于不锈钢支架。基体任选地用胶原蛋白iv(胶原蛋白ivsigma-aldrichc5533，以10ug/cm2使用)涂布2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次。
将附着有基体的支架放入透气界面(gpi)设备中，使得涂有胶原蛋白iv的一侧朝向开口。
向设备中添加250ml格林培养基(greensmedium)(dmem:hamsf12(lifetechnologies31765-035)3:1、10％fcs，10ng/mlegf(sigma-aldriche9644)、0.4μg/ml氢皮质酮(hydrocortisone)(sigma-aldrichfi0396)、0.1nm霍乱毒素(choleratoxin)(sigma-aldrichc8052)、180μm腺嘌呤(sigma-aldricha2786)、5ug/ml胰岛素(sigma-aldrichi9278)、5μg/ml脱铁运铁蛋白(apotransferrin)(sigma-aldricht2036)、2nm3,3,5-三碘甲状腺原氨酸(sigma-aldricht2752)、1x青霉素/链霉素、0.625μg/ml两性霉素b(sigma-aldricha2942))。
使成纤维细胞和角化细胞脱离培养皿且计数。将300,000个角化细胞和100,000个纤维母细胞/cm2添加到gpi设备中。将盖子放上以密封gpi设备。将所述设备在37℃、5％co2下培育48小时。
使gpi设备颠倒，从而确保支架移动到设备的相反末端，并且使基体与透气膜直接接触或接近透气膜。将所述设备在37℃、5％co2下培育14天。
打开gpi设备，弃去所有液体，并且去除支架。用手术刀围绕边缘切割，用于使皮肤脱离支架。
2.结果
所述方法将产生适于移植到患者的包括真皮和分层表皮的全厚度皮肤。
实例5-使用本公开的设备和方法制备全厚度皮肤
1.方法
使灭菌基体如实例1所述附着到不锈钢支架。基体任选地用胶原蛋白iv(胶原蛋白ivsigma-aldrichc5533，以10ug/cm2使用)涂布2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次。
将附着有基体的支架放入透气界面(gpi)设备中，使得涂有胶原蛋白iv的一侧背对开口。
如实例4所述，添加250ml格林培养基。
将100,000个成纤维细胞/cm2添加到gpi设备中。将盖子放在gpi设备上并且密封。将设备在37℃、5％co2下培育至少48小时。
使gpi设备颠倒，从而确保支架移向设备的相反末端。
通过注入口将300,000个角化细胞/cm2添加到gpi设备中，使得角化细胞沉降在基体的未接种一侧上。将所述设备在37℃、5％co2下培育48小时。
第二次将gpi设备颠倒，从而确保支架移向设备的相反末端并且使基体与透气膜直接接触。将所述设备在37℃、5％co2下培育14天。
打开gpi设备，弃去所有液体，并且去除支架。用手术刀围绕边缘切割，用于使皮肤脱离支架。
2.结果
所述方法将产生适于移植到患者的包括真皮和分层表皮的全厚度皮肤。
实例6-使用本公开的设备和方法制备分层表皮
1.方法
使灭菌基体如实例4所述附着到不锈钢支架。基体任选地用胶原蛋白iv(胶原蛋白ivsigma-aldrichc5533，以10ug/cm2使用)涂布2小时，然后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤三次。
将附着有基体的支架放入透气界面(gpi)设备中，使得涂有胶原蛋白iv的一侧朝向开口。
如实例4所述，添加250ml格林培养基。
将300,000个角化细胞/cm2添加到gpi设备中，使得角化细胞沉降在基体的未接种一侧上。将盖子放在gpi设备上并且密封。将所述设备在37℃、5％co2下培育48小时。
第二次将gpi设备颠倒，从而确保支架移向设备的相反末端并且使基体与透气膜接触。将所述设备在37℃、5％co2下培育14天。
打开gpi设备，弃去所有液体，并且去除支架。用手术刀围绕边缘切割，用于使分层表皮脱离支架。
2.结果
所述方法将产生适于移植到患者的分层表皮。
实例7-使用本公开的方法、利用透气界面(gpi)制备的皮肤与使用现有技术方法、利用空气-液体界面(ali)制备的皮肤的比较。
1.制备全厚度皮肤
制备粘附的细胞
将去表皮的无细胞真皮(de-epidermisedacellulardermis，ded)放在聚苯乙烯组织培养皿中。将具有10mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环安放在ded上并且填充格林培养基。将300,000个角化细胞和100,000个成纤维细胞添加到环中心。24小时内更换培养基两次。
使用空气-液体界面(ali)制备全厚度皮肤
如下使用现有技术方法利用空气-液体界面制备全厚度皮肤。
在48小时之后，从ded去除环，并且将包含所粘附的成纤维细胞和角化细胞的ded转移到包含格林培养基的组织培养皿中的不锈钢支架上。支架由孔洞网格组成，从培养皿的基部凸起7mm，培养基能够通过所述基部接触ded。维持培养基在培养皿中的液位，使得搁置于金属支架上的ded的基部与培养基接触，且使已接种角化细胞和成纤维细胞的ded顶表面暴露于空气，从而产生空气-液体界面。
将细胞在空气-液体界面培养14天，其中每两到三天更换完全培养基。
使用透气界面制备全厚度皮肤
使用透气界面(gpi)如下制备全厚度皮肤。
48小时之后，从ded去除环，并且将ded转移到包含透气膜的设备中。将ded放在装置中，使得所粘附的成纤维细胞和角化细胞与位于设备底部的透气膜接触。
将细胞在透气界面培养14天。
14天之后，收集组织进行分析，以评估与空气-液体界面接触或与透气膜接触而形成的皮肤的品质。
2.全厚度皮肤的比较
使用gpi所产生的皮肤的厚度和外观与使用ali所产生的皮肤相似。
每种皮肤的样品用抗体染色：细胞角蛋白19，角化细胞干细胞标记物；细胞角蛋白14；基底角化细胞标记物；以及细胞角蛋白10，基底上角化细胞标记物；并且用荧光显微术进行检查。每个冷冻皮肤样品的五微米厚度横断面用丙酮固定并且用0.25％酪蛋白溶液阻断。含有1％胎牛血清(foetalbovineserum，fbs)的tris缓冲生理盐水(trisbufferedsaline，tbs)溶液中的针对细胞角蛋白10、细胞角蛋白14或细胞角蛋白19的初级抗体覆盖样品断面。在室温下培育样品一小时。样品用tbs洗涤一次，然后摇荡三次，每次五分钟。在含有核染色剂4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(dapi)的具有1％fbs的tbs中，对结合有alexa488染料的各种一级抗体具有特异性的二级抗体覆盖样品断面。在室温下培育样品30分钟。样品用tbs洗涤一次，然后摇荡两次，每次15分钟。用prolonggold封固溶液覆盖样品并且将盖玻片放在顶部。使用荧光显微镜获得dapi染色剂和各种alexa488染色剂的所有样品的图像。
在空气-液体界面(ali)处生长的皮肤和在透气界面(gpi)处生长的皮肤证实分层表皮的形成。
两种样品类型中均存在多个角化细胞层。表皮中的角化细胞核的形状从基底区域中的圆形变化成上部区域中的扁平状，这表明在ali和gpi生长的皮肤中已经形成分层表皮。
在ali或gpi处生长的皮肤证明了细胞角蛋白10(基底上角化细胞标记物)在表皮顶层中的表达，这表明角质层已成功地形成，这又表明角化细胞分化和表皮分层过程已经成功完成。
在ali或gpi处生长的皮肤展示细胞角蛋白14(基底角化细胞标记物)在角质层下方的角化细胞层中的表达，这表明这些角化细胞处于形成分层表皮所需的增殖状态。在ali和gpi处生长的皮肤含有染色对于细胞角蛋白19(角化细胞干细胞标记物)呈阳性的角化细胞。角化细胞干细胞的存在表明表皮持续更新所必需的所有角化细胞的细胞类型都存在。
ali处产生的皮肤与gpi处生长的皮肤的比较表明，gpi可以产生较大数目个存在于表皮中的角化细胞干细胞，从而潜在地产生更好的分层表皮。
这个实例证明，本发明的方法能够制备具有分层表皮和与使用现有技术方法所产生的皮肤类似的特征的全厚度皮肤。
实例8-使用本公开的方法和设备制备皮肤组织
对使用(1)本文所述设备和(2)现有技术设备(均利用gpi)制备的皮肤组织与使用(3)现有技术方法(利用ali)制备的皮肤组织进行比较。
1.方法
电纺plga在37℃下用胶原蛋白iv溶液(10ug/cm2)涂布2小时以形成基体。将成纤维细胞和角化细胞接种到所涂表面上之前，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤所涂plga三次。方法(1)使用100cm2基体，方法(2)使用6cm2基体且方法(3)使用1cm2基体。
方法(1)：使用本文所述的gpi设备制备皮肤
将涂有胶原蛋白的电纺plga夹持于本发明的gpi设备的支架中，使得所涂侧与支架的顶表面齐平。
将支架放在gpi设备的底部，使得电纺plga的所涂侧朝上。
用300ml格林培养基填充gpi设备。实例1中描述格林培养基的组成。
将13,000,000个角化细胞和2,500,000个成纤维细胞添加到gpi设备中，以便角化细胞和成纤维细胞可以附着到经涂布的电纺plga。
将盖子(包含gpi)放在gpi设备上并且密封gpi设备。
48小时之后，颠倒gpi设备以使支架移向设备的相对末端(盖子)。在此位置，使所粘附的成纤维细胞和角化细胞与盖子中的gpi接触。
培养细胞14天，且在那个时间段期间不需要更换培养基。
在14天之后，收集皮肤组织用于分析。
方法(2)：使用现有技术gpi设备制备皮肤
将具有25mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环安放在5cm直径培养皿内部的经涂布的电纺plga上并且填充格林培养基。将750,000个角化细胞和200,000个成纤维细胞添加到环中心。24小时内更换培养基两次。
48小时之后，从所涂布的电纺plga去除环，并且将所涂布的电纺plga从培养皿转移到具有20ml格林培养基的g-rex10设备(wilsonwolf)中，以便所粘附的成纤维细胞和角化细胞与位于g-rex10底表面的gpi接触。
培养细胞14天，且在那个时间段期间不需要更换培养基。
在14天之后，收集皮肤组织用于分析。
方法(3)：使用ali制备皮肤
将具有10mm直径孔隙和10mm深度的不锈钢环安放在六孔培养板内部的经涂布的电纺plga上并且填充格林培养基。
将130,000个角化细胞和34,000个成纤维细胞添加到环中心。24小时内更换培养基两次。
在48小时之后，从经涂布的电纺ded去除环，并且将包含所粘附的成纤维细胞和角化细胞的经涂布的电纺plga转移到包含格林培养基的组织培养皿中的不锈钢支架上。支架由孔洞网格组成，从培养皿的基部凸起7mm，培养基能够通过所述基部接触经涂布的电纺plga。维持培养基在培养皿中的液位，使得搁置于金属支架上的经涂布的电纺plga的基部与培养基接触，且使已接种角化细胞和成纤维细胞的经涂布的电纺plga的顶表面暴露于空气，从而产生空气-液体界面。
将细胞在ali培养14天，其中每两到三天更换完全培养基。
在14天之后，收集皮肤组织用于分析。
分析
每种皮肤的样品用针对以下的抗体染色：全细胞角蛋白(评估表皮品质的所有角化细胞标记物)，以及波形蛋白(评估真皮品质的成纤维细胞标记物)，并且用荧光显微术进行检查。
每个冷冻皮肤样品的五微米厚度横断面用丙酮固定并且用0.25％酪蛋白溶液阻断。含有1％胎牛血清(fbs)的tris缓冲生理盐水(tbs)溶液中的针对全细胞角蛋白或波形蛋白的初级抗体覆盖样品断面。在室温下培育样品一小时。样品用tbs洗涤一次，然后摇荡三次，每次五分钟。在含有核染色剂4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(dapi)的具有1％fbs的tbs中，对结合有alexa488染料的各种一级抗体具有特异性的二级抗体覆盖样品断面。在室温下培育样品30分钟。样品用tbs洗涤一次，然后摇荡两次，每次15分钟。用prolonggold封固溶液覆盖样品并且将盖玻片放在顶部。使用荧光显微镜获得dapi染色剂和各种alexa488染色剂的所有样品的图像。
2.结果
方法(1)、(2)和(3)都产生了包含真皮层和位于真皮层顶部的分层表皮的全厚度皮肤。如根据成纤维细胞标记物波形蛋白的阳性染色所证明，真皮层是所产生皮肤的底层。对于所有三种方法产生的皮肤组织来说，真皮层具有单一细胞厚度。
对于所有三种方法产生的皮肤组织来说，分层表皮层形成于真皮层上。如根据角化细胞标记物全细胞角蛋白的阳性染色所证明，表皮包含多层角化细胞。在皮肤样品的全细胞角蛋白染色时，从细胞角蛋白的分层观察到表皮的分层。基底层中的角化细胞呈圆形，在介入层变得扁平化，直到角质层形成顶层。
角化细胞的细胞核的形态学(通过表皮各层中的dapi染色所示)也证明了表皮分层。在表皮的基底层中，角化细胞的细胞核呈圆形，这表明健康的基底角化细胞能够增殖。向上移动通过表皮层，角化细胞的细胞核扁平化，这表明它们已经历实现分层所需的分化过程。在角化细胞已完成其分化过程的顶层中，细胞核非常薄或已完全消失，从而产生由死亡角化细胞组成的角质层。
实例9测孔术分析
通过测孔仪(比利时)进行完整的测孔术分析，结果展示于下表中。所用流体是galpore16。流体张力是16dyn/cm。流体角度0。第一泡点方法是第一流量。泡点压力(巴)0.08503和0.02002。泡点流量(l/min)0.04977和0.004977。平均流动孔隙压力(巴)是0.1419和0.1157。最小孔隙压力(巴)0.2181和0.1962。样品面积是298.6mm2。气体是空气。温度是23℃。形状因子是1。初始压力是0巴。最终压力0.5巴。湿测量值100。干测量值25％。压力斜率360秒/巴。
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