配体离子载体共轭物的制作方法
本申请依据35u.s.c.§119(e)，要求2016年11月16日提交的美国临时申请系列号62/422,922和2017年3月29日提交的美国临时申请系列号62/478,063的优先权，其二者均通过引用以其整体并入本文。
政府权利
这项发明是由国家卫生研究院(nationalinstitutesofhealth)和国家癌症研究所(nationalcancerinstitute)通过拨款p30ca023168颁发的政府支助作出的。美国政府在这项发明中有一定的权利。
在此描述的本发明涉及配体离子载体共轭物，其还可包括连接的治疗剂或连接的成像剂，以及包含共轭物的药物组合物。还描述了使用所述共轭物用于增加治疗剂或成像剂的内体积累和逃逸的方法，所述治疗剂或成像剂通过内吞作用或类似的过程被内化。还描述了通过微rna与叶酸的直接连接(folamir)，其介导共轭微rna递送到过度表达叶酸受体的细胞中，将微rna递送至肿瘤组织。
背景
许多疾病可以用药物或生物制剂来治疗(生物制剂的示例性实例包括核苷酸，如sirna、mirna等；氨基酸，包括自然界中未出现的合成氨基酸；蛋白质，包括酶、肽、适体、抗原等；和抗体，如糖蛋白、免疫球蛋白等)。这些药物或生物制剂可以用靶向配体(如叶酸受体结合配体)递送进入其靶细胞，但它们的疗效可能受到药物或生物制剂不能从内体释放(例如在叶酸介导的内吞作用后)的抑制。因此，发现新的方法将被捕获的货物“内体释放”到细胞质中，将有助于提高靶向药物或生物制剂的疗效。已发现，利用已知的对健康组织毒性低的离子载体，利用配体离子载体共轭物来创造渗透压以破裂含有货物的内体，可促进内体的释放。不受理论的束缚，相信尼日利亚菌素(一种使流出的h+离子偶合于流入的k+离子的离子载体和反向转运体)，如果释放到细胞中，会导致内体内渗透失衡，导致内体膨胀和/或破裂，并将内体的内容物释放到细胞质中。应该意识到，转运钾离子的其它k+离子载体如盐霉素也可用于内体释放。
为了诱导内体膨胀，渗透活性离子可以进入内体，并促进伴随的渗透驱动的水的流入。这种水的流入会迫使内体扩大，最终导致其破裂。然而，如果渗透活性离子的流入伴随着另一种渗透活性离子的流出，则不会发生水流净变化，而内体也不会膨胀。因此，对于发生内体膨胀，渗透活性离子(如na+、k+、li+、ca++、mg++)应进入内体以交换h+，而后者是自然界中唯一无渗透活性的阳离子。此外，由于会自发地按其浓度梯度向下流动到内体的唯一渗透活性的离子是k+，可用于导致内体膨胀的离子载体是可将k+离子交换成h+离子的离子载体。
na+/h+交换剂(反向转运体)是天然内体转运蛋白，其功能是修饰内体ph。它可以起到通过将钠离子移出内体以交换h+来对抗k+离子载体-引起的内体膨胀的作用，导致内体收缩。因此，k+离子载体的作用可能被自然发生的na+/h+交换剂(反向转运体)所减弱，但同时加入na+/h+交换剂的抑制剂，如阿米洛利或hoe694等，则会使其作用增强。
叶酸受体在许多人癌症如卵巢、肺、乳腺、子宫内膜、脑、肾和结肠癌的细胞膜上和在激活的巨噬细胞(其是炎性疾病如类风湿关节炎、动脉粥样硬化、骨关节炎、糖尿病、牛皮癣等的原因)中过表达。叶酸对叶酸受体具有高的结合亲和力(kd=10-10m)，并且能够以选择性的方式将可释放的货物递送到叶酸受体，避免场外毒性(off-sitetoxicity)。与这些受体结合的配体成为内体的一部分，其在膜凹入内陷、内化并从表面分离后形成。
即使向能够内吞或类似过程的受体递送的药物货物选择性地递送到患病细胞，但递送货物至细胞质或细胞核的途径可被称为“内体”的内陷质膜完全或部分阻断。较高分子量的药物，如肽、sirna、反义寡核苷酸、蛋白质、适体、寡糖和多糖，一旦通过配体-靶向内吞途径内化，就无法逃避内体。因此，被捕获的货物停留在内体中，最后通过内体中存在的酸和酶的作用分解成较小的碎片，然后以失活的形式释放出来。本发明的共轭物增加了治疗剂或成像剂在靶细胞中的内体积聚和逃逸二者。
概述
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种靶向微rna递送系统，该系统包括共价连接的叶酸和微rna或其模拟物的共轭物，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的几个实施方案在以下条款中描述：
1.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，每个离子载体使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和/或包含sirna、irna或微rna的治疗剂(ta)；
其中(l)任选地包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和(a)和/或(ta)各自共价连接于(l)。
1a.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l);
一个或多个离子载体(a)，每个离子载体使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和
包含sirna、irna或微rna的治疗剂；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和每个(a)共价连接于(l)。
2.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(l)包含至少一个可释放的接头。
3.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)共价连接于(l)。
4.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含sirna。
5.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含irna。
6.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含微rna。
7.前述条款的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(b)是叶酸。
8.前述条款1-6的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(b)是psma结合配体。
9.前述条款的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(a)是na+/h+交换剂的抑制剂。
10.条款9的共轭物或其药学上可接受的盐，其中离子载体(a)包含尼日利亚菌素或盐霉素。
11.前述条款的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(l)包含约7-约45个原子的链。
12.条款1或1a的共轭物，其具有选自以下的结构式：
或其药学上可接受的盐。
13.条款1的共轭物，其具有以下结构式：
或其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，其包含至少一种条款1-13的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种药物组合物，其包含至少一种条款1-13的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐，和另外的治疗剂。
16.一种增加治疗剂或成像剂的内体积累和逃逸的方法，该方法包括与治疗剂或成像剂一起给予有效量的条款1-13的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐的步骤。
17.条款16的方法，其中治疗剂或成像剂靶向癌症。
18.条款17的方法，其中癌症选自卵巢、肺、乳腺、子宫内膜、脑、肾、前列腺和结肠癌。
19.条款16的方法，其中治疗剂靶向炎症部位。
20.条款19的方法，其中炎症部位由选自类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病、移植物抗宿主病、多发性硬化、骨髓炎、牛皮癣、克罗恩氏病、斯耶格伦氏综合征、红斑狼疮和溃疡性结肠炎的炎性疾病引起。
21.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，其使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；选自sirna、irna和微rna的rna；或成像剂(ia)；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和(a)、rna和/或(ia)各自共价连接于(l)。
22.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，每个离子载体使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和
包含cy5的荧光染料；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和每个(a)共价连接于(l)。
23.条款21或22的共轭物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
23.条款21的共轭物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
附图简述
图1显示出使用叶酸共轭物在体外靶向沉默mir-34a海肾荧光素酶(renilla)感受器。对各时间点的数据点标准化为叶酸-nc(阴性对照：混杂mirna)。(fol-db-mir34a：叶酸-dbco-mir34a；fol-ss-nigmir34a：叶酸-ss-dbco-尼日利亚菌素-mir34a；fol-db-nigmir34a：叶酸-dbco-尼日利亚菌素-mir34a)。
图2显示标准化为阴性对照的荧光素酶相对光单位对比时间(以小时为单位)的变化的作图。数据表明，fol-nig-siluc在mda-mb-231细胞中诱导早期荧光素酶敲减。来自mda-mb-231感受器细胞的荧光素酶活性水平标准化为fol-阴性对照(fol-nc：叶酸-dbco-阴性对照(混杂rna)或fol-nig-nc：叶酸-尼日利亚菌素-dbco-阴性对照(混杂rna))。均值±s.d.，技术重复=3，n=3，**p<0.01。箭头指示用新剂量的叶酸共轭物(50nm)替代介质。fol-siluc2：叶酸-dbco-siluc2；fol-nig-siluc2：叶酸-尼日利亚菌素-dbco-siluc2。
图3a-b显示用叶酸-cy5(50nm)处理的稳定表达rab5b-gfp的mda-mb-231细胞在处理后3h的活细胞图像。
图4a-b显示用叶酸-尼日利亚菌素-cy5(50nm)处理的稳定表达rab5b-gfp的mda-mb-231细胞在处理后3h的活细胞图像。
图5a-f显示细胞在培养中folamir摄取的特异性。图5a显示一种提议的folamirs的作用机理。图5b显示携带不可释放配体的folamir-34a共轭物(folamir-34a)、携带可释放配体的folamir-34a共轭物(folamir-ss-34a)(红色显示二硫键)和携带不可释放叶酸配体和nir部分(以绿色显示)的mir-34a共轭物(nir-folamir-34a)的结构。叶酸部分以蓝色显示，而mirna以红色显示。图5c显示在fr阳性mda-mb-231乳腺癌细胞中和在fr阴性a549肺癌细胞中叶酸受体α(frα)的鉴定。直方图表示作为未染色(a)、frα(c)和同种型对照(b)染色细胞的百分比的叠加的流式细胞术数据。图5d显示与fr阴性a549肺癌细胞比较，fr阳性mda-mb-231乳腺癌细胞的nir-folamir-34a摄取。直方图表示作为未染色(用a表示)和nir-folamir-34a(50nm)染色细胞(用b表示)的百分比的叠加的流式细胞术数据。图5e显示与fr阴性a549肺癌细胞比较，fr阳性mda-mb-231乳腺癌细胞的叶酸-异硫氰酸荧光素(fol-fitc)摄取。比例尺：50µm。图5f显示在体外使用folamir靶向沉默mir-34a海肾荧光素酶感受器。
图6a-e显示对folamirs的细胞反应。图6a显示在体外使用folamir靶向沉默mir-34a海肾荧光素酶感受器。对各时间点的数据点标准化为folamir-nc(阴性对照：混杂mirna)。图6b显示mda-mb-231癌细胞的增殖和存活为folamir处理(50nm)的函数。对于每个时间点，数据点被标准化为folamir-nc。误差条表示平均值±s.d。每个实验对应于n=3，每次处理至少有4个技术复制。图6c显示了mda-mb-231对folamir-34a的剂量反应。处理后96小时测量海肾荧光素酶值。数据点被标准化为folamir-nc。误差条表示平均值±s.d。每个实验对应于n=3，每次处理至少有4个技术复制，采用单向anova进行统计分析，并进行事后bonferrini校正(**,p<0.01；****,p<0.0001)。图6d显示了来自人mda-mb-231细胞的nir-folamir-34a结合(50nm，4℃)被递增浓度的叶酸葡糖胺共轭物替换。直方图表示作为未染色的和nir-folamir-34a染色细胞的百分比的重叠的流式细胞术数据。图6e显示了体外folamir-34a竞争试验。
图7a-g证明folamir-34a抑制mda-mb-231肿瘤的生长。图7a显示，在静脉内注射5nmol的nir-folamir-34a、nir-folamir-ss-34a或nir-folamir-nc后，植入mda-mb-231感受器异种移植物的雌性nu/nu同系小鼠的代表性活体成像。左侧显示荧光分布，而右侧显示mir-34a海肾荧光素酶感受器信号。图7b显示出nir-folamir-34a递送对mda-mb-231海肾荧光素酶感受器活性的影响；所有的数据标准化为第0天的海肾荧光素酶信号，数据显示为均值±s.e.m.，n=3，用双向anova进行统计分析，并进行事后bonferroni校正(**,p<0.01)。图7c显示荧光可见的mb-231乳腺瘤和全身器官的总图像(t，肿瘤；int，肠；s，脾；k，肾；lv，肝；hlu，心肺)。图7d显示在用nir-folamir共轭物注射后72小时，由qrt-pcr测得的切除的mda-mb-231肿瘤的mir-34a水平(n=3；误差条表示平均值±s.d，用单向anova进行统计分析，并进行事后bonferroni校正，**,p<0.01)。图7e显示得自活体动物的nir表观荧光定量。雌性nu/nu同系小鼠在左肩上植入a549细胞和在右肩上植入mda-mb-231感受器异种移植物，并在静脉内注射5nmolnir-folamir-34a后，在≥100倍摩尔过量的叶酸-葡糖胺(每组n=3)的存在(右)或不存在(左)下进行活体成像。误差条表示平均值±s.d.，用单向anova进行统计分析，**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)。图7f显示获自图7e的器官和肿瘤的荧光分布：a549:fr阴性肿瘤；mb231(mda-mb-231):fr阳性肿瘤；int，肠；s，脾；k，肾；lv,肝；hlu，心肺)。图7g显示folamir-34a处理后的肿瘤大小(n=5，误差条表示平均值±s.e.m.，用双向anova进行统计分析，**,p<0.01；***,p<0.001)。箭头表示处理时间(1nmoli.v.注射)。用游标卡尺测量肿瘤，肿瘤体积由下式计算：体积(mm3)=宽度×(长度2)×2-1。
图8a-d显示，鼠kraslsl-g12d/+；p53flx/flx肺腺癌表达fr(叶酸受体)。图8a显示荧光成像配体otl38(ontargetlaboratories,llc.,westlafayette,in；与荧光近红外(nir)染料共轭的叶酸受体-α(frα)-靶向配体)优先保留在肺肿瘤中，并从正常健康组织中清除。kraslsl-g12d/+；p53flox/flox小鼠肿瘤诱导后8周注射5nmol的otl38，注射24小时后处死。使用无诱导健康小鼠作为对照。rc，右尾叶；rm，右内侧叶；ra，右副叶；rcr，右颅叶；l，左叶。图8b显示用otl38处理的小鼠肺右叶组织学观察。左，用匹配的h&e染色玻片的全器官视野的nir成像。右，肿瘤与健康组织的高倍率图像。h&e图像表示在明视野和近红外图像中显示的组织类型。比例尺：50μm；插入物：20μm。低倍图像上显示的编号框与高倍图像上的数字相关。图8c显示在≥100-倍摩尔过量叶酸-葡糖胺(每组n=3)存在或不存在时，用otl38(5nmoles)处理的小鼠肺叶的全器官视图。图8d显示了来自图8c的组织的代表性组织学视图。图8b、d显示出低倍放大h&e染色组织及其对应的肿瘤组织的高倍放大图像。在左侧，全器官nir图像视图，具有匹配高倍放大nir图像。h&e图像表示在近红外图像中显示的组织类型。低倍放大h&e图像中的方块与高倍放大显示的图像相关。10比例尺：20μm。
图9a-f证明经folamir靶向替代mir-34a对鼠肺腺癌模型具有有益影响。图9a显示folamir-34a处理后mri-测量的肿瘤负荷(n=4或5，误差条表示平均值±s.e.m.，用双向anova进行统计分析，并进行bonferroni事后检验，**,p<0.01)。箭头表示处理时间(1nmol静脉内注射；总10)。图9b显示了在(第8天)和处理期结束(第29天)之间用folamirs处理的小鼠的代表性mri图像和3d渲染。图9c显示肿瘤/全肺在指定时间的比值，显示肿瘤所占肺体积的百分比。误差条表示平均值±s.d.，用单向anova进行统计分析，*,p<0.05。图9d显示来自各处理组的动物的左叶的代表性h&e染色组织。比例尺=1mm。图9e显示肿瘤总负荷是从每只处理的动物获得的三块切片平均的肿瘤总面积相对于肺总面积来计算的(条形图表示中值，folamir-nc:n=4，folamir-34a:n=5；未配对t-检验)。图9f显示mir-34靶向基因，met、myc和bcl-2用qrt-pcr评价，标准化为肌动蛋白(actin)，并相对于folamir-nc处理的肿瘤作图(误差条表示中值，未配对t-检验：*p<0.05)。
图10显示对mirna模拟转染的mir34a海肾荧光素酶感受器反应。瞬时表达mir-34a海肾荧光素酶感受器的mda-mb-231乳腺癌细胞和a549肺癌细胞被用来监测mir-34a递送和活性。mda-mb-231和a549细胞用50nm的mir-34a模拟物使用lipofectaminernaimax(lifetechnologies)转染，处理后96小时测量海肾荧光素酶信号。
图11a-b显示mda-mb-231mir-34a感受器细胞的评价。图11a显示了内源性mir-34a在mda-mb-231细胞中的mir-34a感受器特异性和沉默活性。误差条表示平均值±s.d.，实验按一式三份进行。图11b显示了基于海肾荧光素酶活性的mb-231克隆的选择。使用每克隆1x104个细胞读出海肾荧光素酶的读数，海肾荧光素酶水平使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)测量。
图12显示肿瘤对folamir34a的剂量增加的生长反应。folamir-34a处理后的肿瘤尺寸(n=5，误差条表示平均值±s.e.m.，用双向anova进行统计分析，***,p<0.001)。箭头表示处理时间(静脉内注射)。用游标卡尺测量肿瘤，肿瘤体积由下式计算：体积(mm3)=宽度×(长度2)×2-1。
图13a-b显示在用folamir处理的肿瘤中的mir34a拷贝数。在最后注射后24小时，用qrt-pcr从(图13a)乳腺癌异种移植肿瘤(图13b)和肺腺癌kraslsl-g12d/+;p53flx/flx肿瘤测量的mir-34a水平(n=5；误差条表示平均值±s.d，用单向anova或student’st-检验进行统计分析)。
图14a-b显示出血清细胞因子和最大耐受剂量研究。图14a显示，对从folamir处理的荷载mda-mb-231肿瘤的nu/nu小鼠获得的血清评价相关的细胞因子：肿瘤坏死因子(tnf)α，和白细胞介素(il)-6(n=5)。来自脂多糖(lps)处理的小鼠的血清作为阳性检测对照包括在内(n=2；用单向anova进行统计分析，并进行事后bonferroni校正)。图14b显示了静脉内给予递增剂量的folamir-34a之前和之后的体重。用双向anova进行统计分析，并进行事后bonferroni校正。
详细描述
为了促进对本公开内容的原理的理解，现在将对附图中所示的实施方案进行参考，并使用特定的语言来描述这些实施方案。尽管如此，仍应明白，并无意对本公开内容的范围进行任何限制。
在本公开内容中，术语“约”可以允许一个数值或范围内的某种程度的变化，例如，在规定值的20%内，在10%内，在5%内，或在1%内，或在一个范围的规定限度内。
在本公开内容中，术语“基本上”可允许一个数值或范围内的某种程度的变化，例如，在规定值的70%内，在80%内，在90%内，在95%内或在99%内，或在一个范围的规定限度内。
本发明的几个实施方案通过以下编号的条款来描述，并且这些实施方案与在此详细描述部分中描述的实施方案的任何组合都是预期的。
1.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，所述离子载体的每一个使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和/或治疗剂(ta)包含sirna、irna或微rna；
其中(l)任选地包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和(a)和/或(ta)各自共价连接于(l)。
1a.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，所述离子载体的每一个使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和
包含sirna、irna或微rna的治疗剂；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和每个(a)共价连接于(l)。
2.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(l)包含至少一个可释放的接头。
3.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)共价连接于(l)。
4.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含sirna。
5.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含irna。
6.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中治疗剂(ta)包含微rna。
7.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(b)是叶酸。
8.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(b)是psma结合配体。
9.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(a)是na+/h+交换剂的抑制剂。
10.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中离子载体(a)包含尼日利亚菌素或盐霉素。
11.条款1或1a的共轭物或其药学上可接受的盐，其中(l)包含约7-约45个原子的链。
12.条款1或1a的共轭物，其具有选自以下的结构式：
或其药学上可接受的盐。
13.条款1的共轭物，其具有以下结构式：
或其药学上可接受的盐。
14.一种药物组合物，其包含条款1-13的任一项的至少一种共轭物或其药学上可接受的盐，和至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
15.一种药物组合物，其包含条款1-13的任一项的至少一种共轭物或其药学上可接受的盐，和另外的治疗剂。
16.一种增加治疗剂或成像剂的内体积累和逃逸的方法，该方法包括与治疗剂或成像剂一起给予有效量的条款1-13的任一项的共轭物或其药学上可接受的盐的步骤。
17.条款16的方法，其中治疗剂或成像剂靶向癌症。
18.条款17的方法，其中癌症选自卵巢、肺、乳腺、子宫内膜、脑、肾、前列腺和结肠癌。
19.条款16的方法，其中治疗剂靶向炎症部位。
20.条款19的方法，其中炎症部位由选自类风湿性关节炎、骨关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病、移植物抗宿主病、多发性硬化、骨髓炎、牛皮癣、克罗恩氏病、斯耶格伦氏综合征、红斑狼疮和溃疡性结肠炎的炎性疾病引起。
21.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，其使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；选自sirna、irna和微rna的rna；或成像剂(ia)；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和(a)、rna和/或(ia)各自共价连接于(l)。
22.一种共轭物或其药学上可接受的盐，其包含：
靶向细胞表面受体的配体(b)；
一个或多个接头(l)；
一个或多个离子载体(a)，所述离子载体的每一个使流出的质子(h+离子)与流入的钾离子(k+离子)偶合；和
包含cy5的荧光染料；
其中(l)包含至少一个可释放的接头；(b)共价连接于(l)；和每个(a)共价连接于(l)。
23.条款21或22的共轭物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
23.条款21的共轭物，其具有下式
或其药学上可接受的盐。
如本文所用的，术语“核苷酸”被赋予其通常的和习惯的含义，并可以包括核糖核酸。糖核酸的缩写(例如a、g、c、u)被赋予其通常的和习惯的含义。在某些实施方案中，在此提供的共轭物可包含rna序列(即微rna或“mirna”)。在某些实施方案中，核糖核酸用在序列中紧跟在字母“r”后面的其习惯上的一个字母缩写来表示(例如，ra、rg、rc)。在某些实施方案中，rna序列可包括修饰的核苷酸。在这样的实施方案中，核糖核酸用一个在序列中紧跟在一个表示修饰的字母的字母缩写来表示。应该意识到，常见的修饰包括，但不限于甲基(m)、乙基(e)、氨基(a)、脱氨基(o)等。例如，甲基化胞苷在本文描述的序列中可用mc表示。应该意识到，本公开内容还考虑了本领域已知的其它修饰。
如本文所用的，术语“共轭物”意指配体-离子载体(配体-离子载体意指在配体和离子载体之间有或没有接头)共轭物，或具有连接的治疗剂或成像剂的配体-离子载体(配体-离子载体意指在配体和离子载体之间有或没有接头)共轭物，或共轭物的药学上可接受的盐或其溶剂合物；和共轭物可以电离形式(包括质子化形式)存在于溶液或悬浮中。
如本文所用的，术语“离子载体”也意指一簇离子载体，例如，在树突状结构中。类似地，治疗剂，或与配体-离子载体共轭的成像剂共轭物可以是一簇药剂，例如在树突结构中。
如本文所用的，术语“可释放的”意指特定的部分通过可释放的接头共价连接于接头(l)。
如本文所用的，术语药物、治疗剂、化疗剂等包括其可以靶向形式结合到共轭物或单独使用的类似物。
如本文所用的，术语“内吞作用”具有其领域-认可的意义，包括几个类似的过程，如psma内化的过程。
应该意识到，治疗剂或成像剂可包括由合成化学制备的药剂、从天然源分离出来的药剂、生物合成剂、或大分子结构，如脂质体或含有治疗剂的树状大分子，或成像剂。
在某些实施方案中，治疗剂是生物的，例如多肽、肽、寡核苷酸、核苷酸、sirna、irna、微rna、核酶、反义寡核苷酸、蛋白、糖蛋白、抗体、抗原、合成氨基酸、适体、寡糖或多糖。在某些实施方案中，治疗剂包含sirna、irna或微rna。
当所述药剂是成像剂(ia)时，所述药剂可包括荧光剂、x-射线造影剂，例如碘比醇(iobitridol)、pet成像剂、近ir染料(nir染料)或放射性核素，例如，镓、铟、铜、锝或铼的同位素。荧光剂包括荧光素、5-氨基-荧光素、6-氨基-荧光素、异氰酸荧光素(fitc)、nhs-荧光素、俄勒冈绿色荧光剂，包括但不限于俄勒冈绿488、俄勒冈绿514等，alexafluor荧光剂，包括但不限于alexafluor488、alexafluor647等荧光素，及相关类似物，bodipy荧光剂，包括但不限于bodipyf1、bodipy505等，若丹明荧光剂，包括但不限于5-羧基四甲基若丹明(5-tamra)、若丹明b、若丹明6g、tritc、德克萨斯红、若丹明123、磺酰若丹明101、四甲基若丹明等，dylight荧光剂，包括但不限于dylight647、dylight680、dylight800等，cw800、藻红蛋白，及其它。根据本教义可使用的代表性近红外染料包括但不限于ls288、ir800、sp054、s0121、kodak、ird28、s2076、s0456，及其衍生物。
某些同位素-标记的共轭物，例如，结合了放射性同位素的那些，可能在药物和/或底物组织分布研究中是有用的。放射性同位素氚(即，3h)，和碳-14(即，14c)尤其可用于这一目的，因为它们易于合并，而且检测手段已准备就绪。
用正电子发射同位素替代，例如11c、18f和13n，可用于正电子发射断层扫描(pet)的研究，以检查底物受体的占位情况。同位素-标记的共轭物通常可以通过本领域技术人员已知的传统技术或类似于所附实施例中所描述的那些方法，使用适当的同位素-标记的试剂代替以前使用的无标记试剂来制备。
用于释放“有效载荷”的可释放接头的制备和使用已经有了详细的记录。配体和离子载体的结合可以使用类似于使用可释放接头的药物的单共轭或双共轭的程序，例如特别是在wo2003/097647、wo2004/069159、wo2006/012527、wo2007/022493、wo2007/022494、wo2009/002993、wo2010/033733和wo2010/045584中所描述的程序。上述每一项专利申请的公开内容均通过引用纳入本文。这些同样的参考文献还描述了可以用来将治疗剂或成像剂连接到配体-离子载体共轭物，或制备单独的配体-治疗剂或配体-成像剂化合物的方法。
在示例性实施例中，尼日利亚菌素、离子载体和氢离子/钾离子反向转运体，包括游离羟基和羧酸官能团通过结合于羟基或羧酸基的可释放的接头与配体化学连接，如在实施例中所示。在一个示例性实施例中，在叶酸-尼日利亚菌素酯共轭物中，叶酸配体经由含有二硫键的接头，通过羧酸官能团与尼日利亚菌素结合。对于叶酸-s,s-尼日利亚菌素-s,s-若丹明双共轭物，采用了一种类似的共轭方法。在另一个示例性实施例中，叶酸配体通过二硫键轭合于羟基，形成叶酸-尼日利亚菌素共轭物。
用两个rna寡核苷酸可以构建mirna双链体：表示为mir-34a-5p导引链和mir-34a-3p信使链。在某些实施方案中，mir-34a-3p信使链包含在5′端用叠氮化物接头和在位置1、2、4、6、8、10、12、14、16和18用2′-o-甲基rna碱基(标记为m)双重修饰的20ntrna寡聚物，而mir-34a-5p导引链包含在5′端含有磷酸基和在位置20和21的3′上含有2′-o-甲基rna碱基的22ntrna寡聚物。
应该意识到，慢病毒-和脂质体-介导的肿瘤抑制性mirna(mir-34a)在非小细胞肺癌(nsclc)小鼠模型中减轻肿瘤负担。还应该意识到，除了载体-和病毒-介导的mirna递送外，对全身注射裸寡核苷酸也进行了测试，而且可能存在问题。不受理论的束缚，可能与静脉递药相关的药动学和稳定性限制可能需要依靠局部递送或达到通常仅见于肾脏和肝脏的高寡核苷酸浓度。在某些实施方案中，局部递送可以是一种选择。在某些实施方案中，使用本公开内容的共轭物，可以实现达到局部递送(如微转移病灶)以外部位的递送。
在某些实施方案中，克服非靶向传递的挑战，可以通过应用在肿瘤细胞上特异性地过度表达的细胞表面受体的共轭物来实现。在某些实施方案中，可应用本公开内容的共轭物以提供mirna模拟递送，而不是通过局部递送可达到的部位。在某些实施方案中，一种与细胞表面受体结合的配体可以与功能活跃的mirna轭合，由此产生的分子可用于特异性靶向肿瘤细胞的mirna。在某些实施方案中，靶受体可以是叶酸受体(fr)。已知叶酸受体在癌细胞上过度表达(相对于正常细胞)，受体的表达水平必须足以能够将治疗量的mirna递送到癌细胞中。已知叶酸受体(fr)在许多上皮癌上过度表达，包括乳腺、肺、卵巢、肾和结肠的癌症，以及各种血液系统恶性肿瘤，如急性髓系白血病。相反，fr在正常组织中的存在似乎在数量上是有限的，对靶向药物应用没有影响，或者是血液传播的叶酸无法达到的。
在某些实施方案中，结合配体可以是fr配体，维生素b9(叶酸)，其以高结合亲和力与fr结合，对fr是选择性的，并且包含用于不干扰与受体结合的成像或治疗剂的易轭合的可衍生官能团。在某些实施方案中，本文提供用于递送小rnas例如mirna或sirna的fr/叶酸-共轭疗法。
以叶酸为靶标的成功递送，其有效载荷如小型放射性药物和含大dna制剂，在临床前和临床层面都已得到了证明。然而，叶酸-介导的小rnas的递送滞后于认为循环中的rnas需要受到保护的假设。为了达到这种保护水平，在小rna传输领域继续采取的各种策略已经将叶酸结合到媒介(树状大分子、共聚物、脂质体)中。这些复合物可能有很大的尺寸，这往往会导致靶组织的渗透受阻，因为在大多数实体瘤中发现了密集的细胞外基质。在此，发明人为将mirna模拟物直接连接到叶酸配体(发明人称之为folamirs配体)的共轭物提供了证据。不受理论的束缚，可能的是本文描述的叶酸比更大的mirna包被媒介更容易灌注实体瘤。一个可能的困难是，天然形式的小rnas在血液中是相对不稳定的。在某些实施方案中，本公开内容的共轭物包含mirna模拟物的一条信使链，它被2′-o-甲基rna碱基最小地修饰，它可以稳定rna，并可能在不损害argonaute负载的情况下增加核酸酶的抵抗力。
应该意识到，连接若丹明的叶酸在静脉内注射后不到5分钟便使实体瘤饱和。叶酸-轭合的分子进入肿瘤的速度表明，本文描述的folamirs只需要在循环中存活很短的一段时间。
在某些实施方案中，本公开内容提供一种特异性和快速地递送功能性和几乎不受保护的mirna到肿瘤组织的方法。本文证明mirna-34a(mir-34a)可以选择性地靶向肿瘤，进入致瘤细胞，可下调靶基因，并可抑制肿瘤在体内的生长。在某些实施方案中，通过将mir-34a直接共轭到叶酸(folamir-34a)介导的快速肿瘤摄取可能是有益的。
在此描述的本发明也包括包含在此描述的配体-离子载体共轭物和还包含至少一种药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。配体-离子载体共轭物优选地经胃肠外，例如例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或鞘内给予患者(即，有需要的受试者)。或者，配体-离子载体共轭物可通过其他有医学意义的过程(如吸入、鼻腔给药、颊吸收、透皮、直肠或阴道栓剂)经口(口服)给予患者(如，人或动物)，并可使用任何有效剂量和适当的剂型，包括延长释放剂型。
胃肠外剂型的实例包括在等渗盐水溶液、葡萄糖溶液或其它熟知的药学上可接受的液体载体(例如液体醇、二醇类、酯、酰胺或和脂质体的悬浮液)中的配体-离子载体共轭物的水溶液。根据本发明的胃肠外剂型可以呈包含配体-离子载体共轭物的剂量的可重新构成的冻干粉的形式。在一个实施方案中，本领域已知的许多延长释放剂型中的任何一种都可以，例如在美国专利号4,713,249；5,266,333；和5,417,982(其公开内容通过引用并入本文)中描述的可生物降解的碳水化合物基质中给予，或者作为选择，可以使用慢泵(例如渗透泵)。
配体-离子载体共轭物可在治疗剂或成像剂被内吞作用内化之前、之后或同时给予患者，或由相关医学专业人员确定的。
实施例
以下实施例进一步说明了本发明的具体实施方案；但是，以下示例性实施例不应以任何方式解释以限制本发明。在此使用的缩写包括：dcc，二环己基碳二亚胺；py，2-吡啶基；rt，室温。
制备实施例
材料
用于肽合成的氨基酸从aapptec,usa购得。n-羟基苯并三唑(hobt)、1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]六氟磷酸吡啶鎓3-氧化物(hatu)和苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷子基)六氟磷酸鏻)(pybop)从sigma-aldrich获得。固相肽合成(spps)使用标准肽合成仪器(chemglass,vineland,nj)执行。除非另外指明，所有的其它化学品从sigma-aldrich购得。所有的叶酸共轭物通过制备性反相(rp)-hplc(agilent)纯化，lc/ms分析使用与uv二极管阵列探测器偶联的agilent质谱仪获得。
叶酸-eda共轭物的合成
在肽合成容器中，先后用二氯甲烷(3ml)和二甲基甲酰胺(3ml)加载并溶胀乙二胺、聚合物-结合的(200-400目)-树脂(1.000g,0.17mmol,1.eq.)1h。然后向容器中引入在dmf中的fmoc-glu-otbu溶液(0.1808g,0.425mmol,2.5.eq.)、n,n-二异丙基乙胺(dipea-i-pr2net,0.2202g,1.7mmol,10.eq.)和(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基六氟磷酸鏻(pybop,0.2212g,0.43mmol,2.5.eq.)。鼓泡通入氩气4h，抽去偶合溶液，用dmf(3x10ml)和异丙醇(i-proh)(3x10ml)冲洗树脂。进行kaiser试验以评估反应的完成情况。在每种氨基酸偶联之前，用dmf(3x10ml)中的20%哌啶进行fmoc脱保护作用。重复上述序列以完成与三氟乙酰基蝶酸(tfa.pteroic-acid)的反应。最后用50%氢氧化铵在dmf3x10ml(5min)中清洗，以裂解蝶酸上的三氟乙酰基保护基团，并用i-proh(3x10ml)和dmf(3x10ml)先后洗涤。在氩气下干燥树脂30min。使用由95%cf3cooh、2.5%h2o和2.5%三异丙基硅烷组成的裂解混合液从树脂中裂解叶酸-eda肽。引入10ml的裂解混合液并鼓泡通入氩气1.5h。裂解混合液被抽吸到一个干净的烧瓶中。用更多的裂解混合液洗涤树脂3次。合并的混合液在减压下浓缩至较小体积(~5ml)并通过加入冷乙醚来沉淀。沉淀经离心收集，用乙醚洗涤(3次)并在高真空下干燥。粗反应混合物经rp-hplc纯化(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，35分钟，13ml/min)并以65%产率提供叶酸-eda。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，12分钟)rt=3.26min(m+h+=484.0)。
叶酸-dbco共轭物的合成
向搅拌的叶酸-eda(0.0100g,0.0206mmol,1eq.)和nhs-dbco(0.0091g,0.0227mmol,1.1eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0039g,0.0309mmol,1.5eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。在叶酸-eda完全转化后，用rp-hplc纯化粗反应混合物。(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)并以85%产率提供叶酸-dbco。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，12分钟)rt=4.62min(m+h+=771.0)
叶酸-ss-dbco共轭物的合成
向搅拌的叶酸-eda(0.0100g,0.0206mmol,1eq.)和nhs-ss-dbco(0.0128g,0.0227mmol,1.1eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0039g,0.0309mmol,1.5eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。在叶酸-eda完全转化后，用rp-hplc纯化粗反应混合物。(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)并以82%产率提供叶酸-ss-dbco。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，12分钟)rt=5.4min(m+h+=934.0)
叶酸-cys共轭物的合成
在肽合成容器中，先后用二氯甲烷(3ml)和二甲基甲酰胺(3ml)加载并溶胀h-cys(trt)-2-cl-trt-树脂(100-200目，0.200g,0.088mmol,1eq.)1h。然后向容器中加入fmoc-orn(boc)-oh溶液(0.080g,0.176mmol,2.0eq.)在dmf中，i-pr2net(0.0684g,0.528mmol,6.0eq.)，和pybop(0.1832g,0.35mmol,4.0eq.)。鼓泡通入氩气4h，抽干偶合的溶液，并用dmf(3x10ml)和i-proh(3x10ml)洗涤树脂。进行kaiser试验以评估反应的完成情况。在每种氨基酸偶联之前，用dmf(3x10ml)中的20%哌啶进行fmoc脱保护作用。重复上述序列以完成与fmoc-glu-otbu(0.0749g,0.176mmol,2.0eq.)的反应和三氟乙酰基蝶酸(0.0359g,0.088mmol,1.0eq.)偶联步骤。最后用用2%肼在dmf3x10ml中洗涤树脂(5min)，以裂解蝶酸上的三氟乙酰基保护基团，并用i-proh(3x10ml)和dmf(3x10ml)先后洗涤。在氩气下干燥树脂30min。使用由92.5%cf3cooh、2.5%h2o、2.5%乙二硫醇和2.5%三异丙基硅烷组成的裂解混合液从树脂中裂解叶酸-cys肽。引入10ml的裂解混合液并鼓泡通入氩气1.5h。裂解混合液被抽吸到一个干净的烧瓶中。用更多的裂解混合液洗涤树脂3次。合并的混合液在减压下浓缩至较小体积(~5ml)并在乙醚中沉淀。沉淀经离心收集，用乙醚洗涤(3次)并在高真空下干燥。粗反应混合物经rp-hplc纯化(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，35分钟，13ml/min)并提供叶酸-cys72%产率。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，12分钟)rt=3.73min(m+h+=659.0)。
尼日利亚菌素的吡啶二硫酰胺衍生物的制备
使尼日利亚菌素游离酸(0.035mmol)、py-ss-(ch2)2nh2(0.052mmol)、hatu(0.052mmol)，和dipea(0.069mmol)溶于无水ch2cl2(2.0ml)并在氩气、室温下搅拌过夜。通过lcms监测反应的进展。在尼日利亚菌素游离酸完全转化后，粗反应混合物经r-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，35分钟，13ml/min)纯化并以55%产率提供尼日利亚菌素-ss-酰胺衍生物。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，12分钟)rt=7.53min(m+na+=910.5)
尼日利亚菌素的叶酸-吡啶二硫酰胺衍生物的制备
向搅拌的叶酸-cys(0.004g,0.007mmol,1.5eq.)和尼日利亚菌素的吡啶二硫酰胺衍生物(0.004g,0.005mmol,1.0eq.))的dmso溶液中滴加入dipea。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。叶酸-cys完全转化后，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-40%b，35分钟，13ml/min)纯化并以65%产率提供尼日利亚菌素的叶酸-吡啶二硫酰胺衍生物。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，12分钟)rt=4.2min(m+h+=1441.0)
尼日利亚菌素的叶酸-dbco-吡啶二硫酰胺衍生物(非-可释放的共轭物)的制备
向搅拌的尼日利亚菌素(0.010g,0.0069mmol,1eq.)和nhs-dbco(0.003g,0.0076mmol,1.5eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0013g,0.010mmol,1.5eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。叶酸-ss-尼日利亚菌素完全转化后，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)纯化并提供叶酸-dbco-尼日利亚菌素65%产率。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，12分钟)rt=5.38min(m+h+=1728.4)
尼日利亚菌素的叶酸-ss-dbco-吡啶二硫酰胺衍生物(可释放的共轭物)的制备
向搅拌的尼日利亚菌素的叶酸-吡啶二硫酰胺衍生物(0.010g,0.0069mmol,1eq.)和nhs-ss-dbco(0.005g,0.010mmol,1.5eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0013g,0.010mmol,1.5eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。叶酸-ss-nig，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)纯化并以65%产率提供叶酸-ss-dbco-尼日利亚菌素。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，12分钟)rt=6.52min(m/2+h+=945.4)
叶酸-尼日利亚菌素-mir-34a共轭物的制备
叶酸-尼日利亚菌素dbcomir-34a共轭物：
+
叶酸-尼日利亚菌素-ss-dbcomir-34a共轭物：
mirna双链体使用两个rna寡核苷酸构成：分别表示为mir-34a-5p导引链和mir-34a-3p信使链(均由integrateddnatechnologies制备)。mir-34a-3p信使链包含在5′端上用叠氮化物接头和在3′端上用2′-o-甲基rna碱基双重修饰的20ntrna寡聚物(mcmaramcrcmargmcrumaramgramcramcrumgrcc)，而mir-34a-5p导引链包含在3′端上具有最小修饰(2′-o-甲基rna碱基)的22ntrna寡聚物(rumgmururgrgrurcrgrarururcrurgrurgrarcrgrgru/5phos)。用相同的修饰合成的混杂mirna(阴性对照)被用来形成对照双链体。在叶酸-dbco-尼日利亚菌素或叶酸-ss-dbco-尼日利亚菌素共轭物和叠氮化物修饰的反义mir-34a(或混杂)之间进行双正交点击反应。在室温下，以1:10的摩尔比(叠氮化物寡核苷酸：叶酸共轭物)在水中进行点击反应8小时，然后冷却至4℃经4小时。根据制造商的指示，使用oligocleanandconcentrator(zymoresearch)从反应中去除未共轭的叶酸。使用15%tae非变性page和maldi谱分析验证了共轭作用。轭合后，将mir-34a-5p导引链退火至叶酸共轭物。简言之，叶酸-mir-34a-3p和mir-34a-5p在以下退火缓冲液中以等摩尔比(1:1，终浓度各5μm)混合：10mmtris缓冲液ph7(sigma)，补充有50mmnacl(sigma)，和1mmedta(sigma)，并于95℃孵育5分钟，然后在1小时内，缓慢冷却至室温，然后于-80℃贮存。
叶酸-尼日利亚菌素-dbco-sirna共轭物的制备
叶酸-尼日利亚菌素dbco-siluc2共轭物：
+
叶酸-尼日利亚菌素-ss-dbco-siluc2共轭物：
+
sirna双链体使用两个rna寡核苷酸构建：表示为siluc2有义链(ggacgaggacgagcacuucuu)和siluc2反义链(gaagugcucguccucguccuu)(integrateddnatechnologies)。在叶酸-尼日利亚菌素-dbco或叶酸-尼日利亚菌素-ss-dbco和叠氮化物修饰的反义sirna(或混杂)之间进行双正交点击反应。在室温下，以1:10的摩尔比(叠氮化物寡核苷酸：叶酸-尼日利亚菌素-dbco)在水中进行点击反应8小时，然后冷却至4℃经4小时。根据制造商的指示，使用oligocleanandconcentrator(zymoresearch)从反应中去除未共轭的叶酸。使用15%tae非变性page和maldi谱分析验证了共轭作用。轭合后，将siluc2有义链退火至叶酸-尼日利亚菌素-dbco-sirna反义共轭物。简言之，叶酸-siluc2反义和siluc2有义链在以下退火缓冲液中以等摩尔比(1:1，终浓度各5μm)混合：10mmtris缓冲液ph7(sigma)，补充有50mmnacl(sigma)，和1mmedta(sigma)，并于95℃孵育5分钟，然后缓慢冷却至室温，然后于-80℃贮存。
叶酸-cy5染料共轭物的制备
向搅拌的叶酸-eda(0.0008g,0.0016mmol,1eq.)和nhs-cy5(0.001g,0.001mmol,1.1eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0004g,0.0032mmol,2eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。在叶酸-eda完全转化后，用rp-hplc纯化粗反应混合物(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)并以85%产率提供叶酸-cy5染料共轭物。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，12分钟)rt=2.40min(m+h+=949.2)
尼日利亚菌素染料共轭物的叶酸-cy5-吡啶二硫酰胺衍生物的制备
向搅拌的尼日利亚菌素的叶酸-吡啶二硫酰胺衍生物(0.0023g,0.0016mmol,1eq.)和nhs-cy5(0.001g,0.0016mmol,1eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0004g,0.0032mmol,2.eq.)。于室温下继续搅拌反应混合物。通过lcms监测反应的进展。叶酸-ss-nig完全转化后，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)纯化并以65%产率提供叶酸-尼日利亚菌素-cy5。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-100%b，12分钟)rt=7.05min(m+h+=1906.0)
叶酸-nir染料共轭物的合成：
向搅拌的叶酸-cys(0.010g,0.015mmol,1eq.))和马来酰亚胺-nir染料(0.019g,mmol,1.1eq.))的dmso溶液中滴加入dipea(0.0029g,0.0228mmol,1.5eq.)。反应混合物在室温下继续搅拌。反应过程用lc-ms监测。叶酸-cys完全转化后，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，35分钟，13ml/min)纯化并以85%产率提供叶酸-nir。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-30%b，12分钟)rt=3.30min(m+h+=1179.0)。
叶酸-dbco-nir染料共轭物的合成：
向搅拌的叶酸-nir染料(0.0050g,0.0027mmol,1eq.)和nhs-dbco(0.0016g,0.0041mmol,1.5eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0054g,0.0041mmol,1.5eq.)。反应混合物在室温下继续搅拌。反应过程用lc-ms监测。叶酸-nir染料完全转化后，粗反应混合物经rp-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)纯化并以86%产率提供叶酸-dbco-nir。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，12分钟)rt=4.75min(m/2+h+=1043.0)。
叶酸-ss-dbco-nir共轭物的合成：
向搅拌的叶酸-nir染料(0.0050g,0.0027mmol,1eq.)和nhs-ss-dbco(0.0023g,0.0041mmol,1.5eq.)的dmso溶液中滴加入dipea(0.0054g,0.0041mmol,1.5eq.)。反应混合物在室温下继续搅拌。通过lcms监测反应的进展。叶酸-nir染料完全转化后，粗反应混合物经r-hplc(流动相a=10mm乙酸铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，35分钟，13ml/min)纯化并以84%产率提供叶酸-ss-dbco-nir。lc-ms(a=10mm碳酸氢铵，ph=7；有机相b=乙腈；方法：0%b-50%b，12分钟)rt=4.991min(m/2+h+=1125.0)。
叶酸-mirnas(folamirs)的制备
mirna双链体使用以下两个rna寡核苷酸构建：表示为mir-34a-5p导引链和mir-34a-3p信使链(二者均由integrateddnatechnologies制备)。mir-34a-3p信使链包含在5′端上用叠氮化物接头和在3′端上用2′-o-甲基rna碱基双重修饰的20ntrna寡聚物(mcmaramcrcmargmcrumaramgramcramcrumgrcc)，和mir-34a-5p导引链包含在3′端上具有最小修饰(2′-o-甲基rna碱基)的22ntrna寡聚物(rumgmururgrgrurcrgrarururcrurgrurgrarcrgrgru/5phos)。用相同的修饰合成的混杂mirna(阴性对照)被用来形成对照双链体。在叶酸-dbco或叶酸-ss-dbco和叠氮化物修饰的反义mir-34a(或混杂)之间执行双正交点击反应。在室温下，以1:10的摩尔比(叠氮化物寡核苷酸：叶酸dbco或叶酸-ss-dbco)在水中进行点击反应8小时，然后冷却至4℃经4小时。根据制造商的指示，使用oligocleanandconcentrator(zymoresearch)从反应中去除未共轭的叶酸。
使用15%tae非变性page和maldi谱分析验证了共轭作用。对于叶酸-nir化合物共轭，使用licorodysseyclx(licor)进行另外的验证。
共轭后，将mir-34a-5p导引链退火至叶酸和nir-叶酸共轭物。简言之，叶酸-mir-34a-3p和mir-34a-5p在以下退火缓冲液中以等摩尔比(1:1，终浓度各5μm)混合：10mmtris缓冲液ph7(sigma)，补充有50mmnacl(sigma)，和1mmedta(sigma)，并于95℃孵育5分钟，然后在1小时内，缓慢冷却至室温，然后于-80℃贮存。
血清中的稳定性测定
双链体rna寡核苷酸和folamir共轭物在50%胎牛血清(sigma)/水中，于37 ℃孵育指定的时间。收集rna样品并使用15%tae聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)分析。
方法实施例
细胞系
为了监测folamir-34a共轭物在细胞mda-mb-231中的活性，生成表达mir-34a海肾荧光素酶感受器(mb-231感受器)的细胞。首先，通过在mda-mb-231乳腺癌细胞中瞬时表达mir-34a感受器或突变的感受器以及mir-34a模拟物或阴性对照(混杂rna)监测mirna感受器的特异性。为此，将1x104个细胞接种在96-孔板中，并用25ng质粒和6nmmirna模拟物，使用lipofectamine2000(lifetechnologies)共转染。转染后48小时，使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)测定海肾荧光素酶活性。结果表明，mir-34a在mb-231细胞内具有内源性活性，而外源性mir-34a的传递促进了海肾荧光素酶感受器的进一步沉默。这些结果表明，mir-34a感受器是对mir-34a特异性的，而mb-231细胞内的mir-34a的内源性水平不足以使mir-34a感受器完全沉默，从而为用外源mir-34a增加敲减留下了一定的空间。获得了稳定的克隆，并对其进行了海肾荧光素酶活性测试。在15个单稳定的克隆中，克隆5由于高的海肾荧光素酶水平及其监测mir-34a活性的能力而被选择作进一步的实验。(图1)
体外海肾荧光素酶活性
mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞(htb-26，通过mycoalert支原体检测试剂盒-lonza测试支原体污染为不含支原体)在补充有10%胎牛血清(sigma)、100uml−1青霉素和100μgml−1链霉素(hyclone,gehealthcarelifesciences)的无叶酸rpmi1640培养基(lifetechnologies)中生长，并于37℃，在5%co2中维持。为了进行荧光素酶报告实验，在载体(psicheck,promega)中，将相对于mir-34a的反义序列插入海肾荧光素酶的3′非翻译区中，构建了mir-34a感受器质粒。在mda-mb-231细胞中，通过瞬时转染mir-34a感受器或突变的mir-34a感受器，证实了mir-34a特异性沉默。使用lipofectaminernaimax(lifetechnologies)，用mir-34a模拟物转染mir-34a感受器表达细胞，以证实由外源mirna介导的沉默。为获得稳定的克隆，将mda-mb-231细胞接种在密度为1x106个细胞/孔的六孔板中，用lipofectamine2000(lifetechnologies)转染2ug的mir-34a感受器质粒。使用潮霉素b(500μg/ml；hyclone,gehealthcarelifesciences)作为筛选标记，选择稳定的克隆。对单个克隆进行了海肾荧光素酶表达的评价，选择具有最高的海肾荧光素酶表达的克隆。将mb-231感受器细胞接种到96-孔板中，其含有在无叶酸和血清的rpmi培养基中的叶酸-dbco-mir-34a、叶酸-尼日利亚菌素-dbco-mir34a、叶酸-尼日利亚菌素-ss-dbco-mir34a和folamir-nc(阴性对照)，最终浓度为50nm。包括作为对照的未处理的和未共轭的双链体mirna。按照制造商的说明，使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)，在孵育12-48小时后获得海肾荧光素酶值。对于每个时间点，将海肾荧光素酶水平标准化为folamir-nc。对于每种条件进行一式三份技术实验3次。
mir34a-海肾荧光素酶基因敲减活性
用叶酸-尼日利亚菌素-dbco-mir-34a或叶酸-尼日利亚菌素-ss-dbco-mir-34a处理的mb-231感受器细胞(在转染试剂的不存在下)在48h处理后，显示出海肾荧光素酶活性下降至80%(图1)。然而，缺乏叶酸-dbco-mir-34a的尼日利亚菌素在48h时仅显示出30%基因敲减活性，这证实了尼日利亚菌素有助于mir-34a从内体释放。令人惊讶的是，根据数据，可释放的和不可释放的叶酸-尼日利亚菌素-mir-34a有效地进入细胞并保持活性，表明共轭叶酸不会干扰将mir-34a-5p加载到argonaute中。
sirna基因敲减分析
对于sirna靶向分析，将mda-mb-231细胞接种在密度为1x106个细胞/孔的六孔板中，并使用lipofectamine2000(lifetechnologies)，用2ug的pmirglo质粒(promega)转染。24小时后，将细胞再次接种在包含fol-dbco-siluc2、fol-尼日利亚菌素-dbco-siluc2、fol-dbco-nc(阴性对照)、fol-尼日利亚菌素-dbco-nc的六孔板中的无叶酸和血清的rpmi培养基中，最终浓度为50nm。包括作为对照的未处理的和未共轭的双链体mirna。对于每个时间点，按照制造商的说明，使用dualluciferasereporterkit(promega)获得海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶值。对于每个时间点，萤火虫/海肾荧光素酶比率被标准化为fol-dbco-nc或fol-尼日利亚菌素-dbco-nc。对于每种条件进行一式三份技术实验3次。采用方差双向分析(anova)和bonferroni事后检验以检测统计学上的显著性。
sirna基因敲减分析结果和讨论
进行荧光素酶靶向分析，借此mda-mb-231细胞与共轭于叶酸的荧光素酶(siluc2)的sirna(fol-dbco-siluc)或携带尼日利亚菌素分子的修饰的叶酸配体(fol-尼日利亚菌素-dbco-siluc)一起培养。这些基于细胞的实验表明，处理后18小时，经fol-尼日利亚菌素-dbco-siluc处理的细胞的荧光素酶活性迅速下降，24h后达到40%(图2)。然而，fol-dbco-siluc中的荧光素酶活性甚至在长达32h时也没有降低。有趣的是，在fol-nc(阴性对照)处理的细胞或在fol-siluc处理的细胞上没有观察到荧光素酶活性的降低，这表明它对于尼日利亚菌素的存在是特异性的。
fol-siluc2及其尼日利亚菌素配对物之间的荧光素酶抑制作用的差异表明，尼日利亚菌素在叶酸-siluc2共轭物从内体到细胞质的逃逸过程中起着促进作用。
内体逃逸试验：活细胞共聚焦实验
活细胞成像
在活细胞成像中，细胞被平铺在带有玻璃底部的两孔槽式玻片上(lab-tektmchamberedcoverglass,thermofisherscientific,denmark)。简单地说，用聚-d-赖氨酸(0.1mg/ml；sigma-aldrich)预处理槽式玻片5分钟，用pbs洗涤，然后让空气干燥5分钟。在实验前一天，将稳定表达rab5b-gfp的mda-mb-231细胞以3x104个细胞/孔的密度平铺并于37 ℃，在5%co2下维持在不含叶酸的rpmi1640培养基(lifetechnologies)中，其补充有10%胎牛血清(sigma)、100 u ml−1青霉素和100 μg ml−1链霉素(hyclone,gehealthcarelifesciences)。实验当天，用补充有10mm4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes，sigma-aldrich)的培养基代替该培养基，并将玻片放置在带有共振扫描仪和压电驱动器(piezoz-drive)的nikona1rsi共焦显微镜(nikoninstrumentsinc.)中，其配备有一台tokaihit活体成像室(inu-tiz-f1；tokaihitcorp.,japan)，温度设置为37 ℃。图像采集是在单个焦平面上进行的，在加入叶酸-cy5共轭物(50nm)后，使用nis-elements软件4.5(nikoninstrumentsinc.,日本)开始。图像使用imagej2.0.0(nih)进一步分析。
活细胞成像
使用50nm叶酸-cy5染料共轭物或叶酸-尼日利亚菌素-cy5染料共轭物，在稳定表达rab5b-gfp的mda-mb-231细胞中进行初始内体逃逸实验。在整个24小时内每小时进行一次观测。细胞在3h时的代表性图像在图3和4中呈现。当用叶酸-尼日利亚菌素-cy5染料共轭物处理细胞内观察到显著更大的内体时，叶酸-cy5共轭物的命运在内化后3小时内明显不同。3h后，用叶酸-尼日利亚菌素-cy5处理的内体比它们的叶酸-cy5染料共轭物更大，并开始聚集并形成羽毛状(plume)。3h后，膨胀的内体聚集成较大的结构，而仅用叶酸-cy5染料3处理的内体在整个实验过程中保持相对不变。图3显示，叶酸-cy5处理的mda-mb-231细胞在处理后3h内主要从细胞膜和内体产生点状的cy5荧光信号。然而，在叶酸-尼日利亚菌素-cy5处理的细胞中，胞浆中cy5的荧光信号形成大的内体和混浊的分散体(图4)。
实验设计：
使用先验功率分析(prioripoweranalysis)来估计要求统计学显著性为0.05、α<0.5和80%功率的样本大小。根据功率计算，包括在每个处理组中的建议的动物数量为6只。然后从小型试点研究确定预期的效果大小。由于用folamir-34a处理三只动物后，观察到肾组织的报告基因活性强烈和显著减少(图7a,b)，其余三只动物未接受处理。在这种情况下，0.5的功率可以用三只α<0.5的动物准确地预测显著性。对于所有的其它研究，使用了最初计算出的六只动物。
流式细胞术
如前所述生长的fr阳性人mda-mb-231细胞和fr阴性人a549细胞经胰蛋白酶化分离后，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs；ph7.4)冲洗两次，并在无血清培养基中再悬浮至1x107个细胞/ml的密度。用台盼蓝拒染法测定细胞活力，只有在细胞存活率>80%时，才能使用所述细胞。然后，按照标准方案进行流式细胞术分析。简言之，用pe抗-folr1抗体(cat.908303,biolegend)培养1x106个细胞或匹配同种型抗体(cat.400213,biolegend)作为对照，通过使用lsrfortessa流式细胞仪(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)的流式细胞分析法来分析。使用flowjo软件v10(treestar,inc,or,usa)分析数据。首先通过将mda-mb-231和a549细胞与folamir-34a-nir(50nm)一起培养，然后进行如上所述的流式细胞术分析，其次通过用叶酸-异硫氰酸荧光素(fitc)培养至50nm最终浓度的细胞的显微分析来确认fr的功能。细胞在不同时间点使用配备1.25x物镜的olympusix73显微镜、olympusdp80摄像机和cellsens1.11进行评估。
体外folamir递送
mda-mb-231三阴性乳腺癌细胞(htb-26)和a549非-小细胞肺癌细胞(ccl-185)，二者均通过mycoalert支原体检测试剂盒(mycoalertmycoplasmadetectionkit)(lonza)测试支原体污染来确定无支原体，在补充有10%胎牛血清(sigma)、100 u ml-1青霉素和100 µg ml-1链霉素(hyclone,gehealthcarelifesciences)的不含叶酸的rpmi1640培养基(lifetechnologies)中生长，并于37 ℃、5%co2中维持。
mda-mb-231和a549细胞用500ng的mir-34a海肾荧光素酶感受器转染并与一起培养。处理后96小时测量海肾荧光素酶信号。对各时间点的数据点被标准化为folamir-nc(阴性对照:混杂mirna)。误差条表示平均值±s.d。每个实验对应于n=3，每次处理至少有4个技术复制,采用单向anova进行统计分析，并进行事后的bonferrini校正(**,p<0.01)。
为了荧光素酶报告基因实验，将相对于mir-34a的反义序列插入海肾荧光素酶的3′非翻译区中，构建了mir-34a感受器质粒。在mda-mb-231细胞中，通过瞬时转染mir-34a感受器或突变的mir-34a感受器，证实了mir-34a特异性沉默。使用lipofectaminernaimax(lifetechnologies)，用mir-34a模拟物转染mir-34a感受器表达细胞，以证实由外源mirna介导的沉默。为获得稳定的克隆，将mda-mb-231细胞接种在密度为1x106个细胞/孔的六孔板中，并用2µg的mir-34a感受器质粒转染。使用潮霉素b(500μg/ml；hyclone,gehealthcarelifesciences)作为筛选标记，选择稳定的克隆。对单个克隆进行了海肾荧光素酶表达的评价，选择具有最高的海肾荧光素酶表达的克隆。
将mb-231感受器细胞接种到96-孔板中，其含有在无叶酸和血清的rpmi培养基中的folamir-34a、fol-ss-34a和folamir-nc(阴性对照)，最终浓度为50nm。包括作为对照的未处理的和未共轭的双链体mirna。按照制造商的说明，使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)，在孵育24、48、72、96和120h后获得海肾荧光素酶值。对于每个时间点，将海肾荧光素酶水平标准化为folamir-nc。对于每种条件进行一式三份技术实验3次。
已报道mda-mb-231乳腺癌细胞表达质膜上可检测到的fr水平，使该细胞系成为评价folamir活性的合理模型。为了验证fr的表达，对mda-mb-231细胞和a549细胞(fr阴性对照)进行了流式细胞术分析并比较。mda-mb-231细胞被证实表达可检测水平的frα(图5c)。
用流式细胞术分析nir-叶酸-34a的细胞摄取(图5d)和使用荧光显微镜分析叶酸-异硫氰酸荧光素(fol-fitc)共轭物的摄取情况(图5e)，证实了这些结果。两种叶酸共轭物均由fr阳性细胞系mda-mb-231而不是由fr阴性a549细胞系吸收。这一观察在mda-mb-231和a549细胞系处理后功能得到证实，后者瞬时表达带folamirs的mir-34a海肾荧光素酶感受器。该感受器是海肾荧光素酶基因，然后是一个单独的mir-34a互补结合位点，从而允许监测由mir-34a介导的海肾荧光素酶的转录后调控。这两个细胞系中的感受器对转染的mir-34a模拟物都有反应(图10)；然而，在folamir-34a暴露后，mda-mb231细胞中的感受器仅被下调(图5f)，提示folamir靶向作用依赖于fr表达细胞。总之，这些结果提示mda-mb-231是fr阳性细胞系，并为通过fr相互作用特异性摄取folamir共轭物提供了初步证据。
为监测folamir-34a活性，产生了mda-mb-231细胞以稳定地表达mir-34a海肾荧光素酶感受器(mb-231感受器)或对mir-34a没有反应的感受器的突变版本。产生多个克隆，而具有最高水平的海肾荧光素酶(图11)的克隆被用来评估folamir-34a活性。当folamir-34a或folamir-ss-34a被加入到mb-231感受细胞(在转染试剂的不存在下)时，在暴露72小时后海肾荧光素酶活性下降(图6a)。海肾荧光素酶活性在暴露后120小时后回升，这可能是由于细胞内复制引起的folamir-34a稀释或folamir-34a的降解所致。
单一folamir-34a处理后，mb-231传感器细胞的增殖减少(图6b)，这与海肾荧光素酶活性的降低相关。令人惊讶的是，可释放的和不可释放的folamirs都能有效地进入细胞，并根据数据保持活性，表明共轭叶酸不会干扰将mir-34a-5p加载到argonaute中。
fr依赖性反应
fr阳性人mda-mb-231细胞和fr阴性人a549细胞用500ng的mir-34a感受器质粒，使用lipofectamine2000(lifetechnologies)转染。24小时后，将4000细胞/孔接种到包含在无叶酸和血清的rpmi培养基中的folamir-34a和folamir-nc的96-孔板中(阴性对照)，最终浓度为50nm或100nm。用lipofectaminernaimax(lifetechnologies)转染的细胞被用作对照，以监测mir-34a海肾荧光素酶感受器对mir-34a模拟物的反应。包括作为对照的未处理的和未共轭的双链体mirna。按照制造商的说明，使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)，在培养96小时后获得海肾荧光素酶值。对于每个时间点，将folamir-34a处理的细胞的海肾荧光素酶水平标准化为folamir-nc，并将未共轭的双链体mirna处理的细胞标准化为未处理的。对于每种条件进行一式三份技术实验3次。海肾荧光素酶活性的剂量依赖性减少仅在用folamir-34a处理的细胞中观察到(图6c)。
体外fr结合竞争试验
体外fr结合竞争试验如前面在vanderheijden,j.w.etal.(“叶酸受体β在类风湿性关节炎患者滑膜组织中作为新型叶酸拮抗剂给巨噬细胞的潜在传递途径(folatereceptorβasapotentialdeliveryroutefornovelfolateantagoniststomacrophagesinthesynovialtissueofrheumatoidarthritispatients)”,arthritisrheum.60,12–21(2009))和gent,y.y.etal.(“新叶酸受体配体[18f]氟代-peg-叶酸在大鼠关节炎模型中用于巨噬细胞靶标的评价(evaluationofthenovelfolatereceptorligand[18f]fluoro-peg-folateformacrophagetargetinginaratmodelofarthritis)”,arthritisres.ther.15,r37(2013))中所述执行。简言之，如前文所述生长的fr阳性人mda-mb-231细胞和fr阴性人a549细胞(通过胰蛋白酶化作用分离，用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(pbs；ph7.4)冲洗两次并在无血清培养基中再悬浮至1x107个细胞/ml的密度。其次，在1-100倍摩尔过量的叶酸葡糖胺共轭物的存在或不存在下，将100µl的细胞悬液与folamir-34a-nir共同培养至50nm的最终浓度。将细胞于4℃培养20分钟，用冰冷的pbs洗涤两次并通过使用lsrfortessa流式细胞仪(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)的流式细胞术分析folamir-34a-nir结合的替换。数据使用flowjo软件v10(treestar,inc,ashland,ore)分析。
在1-100倍摩尔过量的叶酸葡糖胺共轭物的存在或不存在下，使用mda-mb-231感受器细胞与folamir-34a或folamir-nc共同培养至50nm的最终浓度，以验证功能竞争。包括作为对照的未处理的和未共轭的双链体mirna。按照制造商的说明，使用renillaglo荧光素酶试剂盒(promega)，在培养96小时后获得海肾荧光素酶值。对于每个时间点，将folamir-34a处理的细胞的海肾荧光素酶水平标准化为folamir-nc，并将未共轭的双链体mirna处理的细胞标准化为未处理的。对于每种条件进行一式三份技术实验3次。
叶酸葡糖胺共轭物(叶酸-葡糖胺)的量的增加导致细胞-特异性nir-folamir-34a信号的剂量依赖性减少，提示叶酸-葡糖胺与nir-folamir-34a竞争(图6d)。更重要的是，叶酸-葡糖胺处理以剂量依赖性的方式消除了nir-folamir-34a对mir-34a海肾荧光素酶感受器的沉默效应(图6e)。这些结果支持folamirs可向过度表达fr的细胞递送功能mirnas，且递送依赖于fr表达。
图6d、e显示在叶酸葡糖胺共轭物浓度增加的情况下对folamir-34a(50nm,96h)的mir-34a海肾荧光素酶感受器反应。对于每种实验条件，数据点被标准化为folamir-nc(阴性对照:混杂mirna)。实验对应于n=3，每次处理至少有4次技术复制，采用单向anova进行统计分析，并进行事后bonferrini校正(*p<0.05)。
细胞增殖分析
使用磺酰若丹明b(srb,sigma)测定作为96孔板细胞增殖的代替物。简言之，folamir处理后，细胞用10%三氯乙酸固定于完全培养基中，用0.4%(wt/vol)srb在1%乙酸中染色1h。用1%乙酸洗涤4次除去未结合的染料。最后，用10mm未缓冲的tris碱(trisbase)提取蛋白-结合的染料，使用glomaxmulti+分光光度计(promega)获得510 nm处的吸光度。在每个时间点，将吸光度值(细胞质量的代替物)标准化为在folamir-nc存在下培养的细胞的吸光度值。
腹侧肿瘤的建立
对于单剂量研究，通过皮下注射悬浮于200 µl的matrigel(corning)中的5x106个mda-mb-231感受器细胞，在雌性nu/nu(nu-foxn1nu；charlesriver)同系小鼠(6周，n=5)中诱导皮下肿瘤。为了纵向研究，采用亲代mda-mb-231细胞。由于观察到啮齿类动物血浆和组织中5-甲基-四氢叶酸的含量很高，在肿瘤植入前两周和在实验系列中，在喂饲叶酸缺乏饮食(envigo,td.95247)的小鼠中叶酸的自然存在形式(人类的大约10倍)被维持。叶酸-缺乏饮食已证明可将叶酸水平降低到人体所见的生理水平。为测定肿瘤生长，用游标卡尺测量各个肿瘤，肿瘤体积由下式计算：肿瘤体积(mm3)=宽度×(长度2)x2-1。如果肿瘤在处理时未达到150cm3，动物将被排除在外。对于单次给药试验，在采集发光和荧光信号(第0天)后，给动物静脉内注射(i.v.)5nmol的folamirs。对于多次给药试验，通过将肿瘤平均大小的差异降到最小，将动物随机分成实验组。
当肿瘤体积达到~200 mm3时，每三天经i.v.注射指定摩尔浓度的folamir来处理动物。所有实验方案均由purdue动物护理和使用委员会(purdueanimalcareandusecommittee)批准，并符合nih动物使用指南。
生物发光与红外成像
根据制造商的体内监测肿瘤生物发光的规程，使用ivisluminaii(caliper)或光谱ami(spectralinstruments)，给予redijectcoelenterazineh生物发光底物(perkinelmer)。在注射底物后20分钟开始，在多个点采集发光值，并且仅报告最大平均辐射值。在745nm激发和icg发射滤光器上使用ivisluminaii(caliper)进行红外成像。通过在以下时间点执行的全-动物成像进行对肿瘤发光和荧光的无创纵向监测：0、24、48和72小时(每个实验组n=3只动物)。使用800nm通道，在licorodysseyclx(licor)中获取了器官的整体图像。
血清细胞因子
得自多次给药实验(末次注射后24小时)的血清样品被用于测试il-6和肿瘤坏死因子(tnfα)浓度，即按照厂家的指示，使用小鼠特异性细胞因子multi-analyteelisarraykit(qiagen)。简言之，血清样品在冰上解冻，在分析前，于4℃下以1000 xg离心10 min来清除碎屑。所有的样品或标准品与分析缓冲液一起加入到96-孔板中。轻轻摇动板并于室温下培养2 h。
除去上清液并洗涤孔。加入检测抗体并于室温下培养板1 h。清洗板并于室温下与抗生物素蛋白-hrp溶液一起培养30 min。洗涤各孔，加入显影液，使用glomax荧光板读出仪(promega)采集数据。在450nm和570nm处获得吸光度值。从450nm读数中减去570nm读数。用细胞因子标准曲线计算血清样品中的细胞因子浓度(pg/ml)。检测的限度如下：il-658.8pg/ml，和tnfα30.5pg/ml。lps处理的nu/nu小鼠(nu-foxn1nu；charlesriver)被用作阳性对照。小鼠接受腹膜内注射500ngkg-1脂多糖(lps,l6529,sigma)，注射后2小时收集血清。
最大耐受剂量(mtd)研究
对balb/c小鼠(8周龄)静脉内注射一次33.3、10或1nmol的folamir-34a。动物给药后观察2周。观察小鼠的体重变化和临床观察结果(快速减肥、腹泻、毛皮粗糙、弯曲姿势、嗜睡、呼吸困难、神经体征等)。小鼠被允许自由进食和饮水。研究结束时进行了尸检。收集全血、血清和器官组织以供进一步分析。
乳腺癌异种移植物模型中folamirs在体内的活性
每个nir-fol标记的mirna(nir-folamir)单次5nmol剂量通过尾静脉内注射被递送到具有可触觉的mb-231感受器细胞异种移植物的动物体内。测定荧光分布和荧光素酶活性，以监测肿瘤细胞靶向特异性，并分别作为摄取和细胞间靶标抑制的替代物。
注射后24小时，nir-folamir主要保留在肿瘤组织中，并且重要的是，从生物体的其他部分清除(图7a，left-nir)，包括肝(图7c，lv)。然而，只有不可释放的nir-folamir-34a在体内诱导了海肾荧光素酶敲减(图7a，右-荧光素酶，在图7b中定量)。重要的是，一次注射后，nir-folamir-34a处理后，海肾荧光素酶水平降低了大约50%，这甚至比培养细胞中所观察到的感受器活性下降的幅度还要大(图6a、c、e)。每毫微克总rna约有3.5x106个mir-34a拷贝存在于用nir-folamir-34a处理的肿瘤中(图7d)。
相比之下，从用nir-folamir-ss-34a处理的小鼠收获的肿瘤中mir-34a的拷贝数与阴性对照动物相似，提示可释放的叶酸-共轭物可能在循环中降解或过早减少。为了解决这一可能性，folamir共轭物暴露在50%的血清中。folamir-ss-34a在血清的存在下高度不稳定，而folamir-34a则维持了6小时以上的完整状态。
folamir-34a似乎比未轭合的mir-34a更稳定，提示叶酸保护mirna不受血清核酸酶的影响。为了确定folamirs在体内是否与fr特异性结合，在100-倍摩尔过量的叶酸-葡糖胺的存在或不存在下，在裸小鼠体内静脉内注射5nmol的nir-folamir-34a，所述小鼠荷载有在右侧肩部上植入的fr阳性人mda-mb-231感受器细胞和在左侧肩部上植入的fr阴性人a549细胞。所述结果表明，fr阳性mda-mb-231肿瘤积聚了folamir共轭物，而非fr阴性a549肿瘤(图7e、f)，和该fr依赖性积聚可被过量的叶酸-葡糖胺阻断(图7e、f)。
其次，进行了多次给药的研究，以评价folamir-34a的疗效。mb-231异种移植物动物每三天使用减少剂量的folamir-nc或folamir-34a(0.1、0.5和1nmol)处理，总共7个剂量。给予对照叶酸-共轭物的动物中的肿瘤增长了约3.5倍，而用folamir-34a处理的动物肿瘤大小在给药20天期间略有增加(~1.5倍)(图7g和图12)。低至0.1nmole的剂量产生肿瘤生长的显著减少。切除肿瘤组织中mir-34a的拷贝数约为从给予对照的小鼠摘除的肿瘤的1.5倍(图13a)。重要的是，没有证据表明，在用folamir-34a处理的动物中，整个器官毒性或血清细胞因子il-6或tnf-α升高(图14a)。这些结果得到了对免疫活性鼠进行的最大耐受剂量(mtd)研究的支持，在该研究中，未发现给予高达33.3nmol测试的最大剂量的folamir-34a的小鼠出现毒性的病理体征或体重的显著变化(图14b)，表明mtd>33.3nmol。
kras;p53小鼠中肿瘤形成的诱导
在kraslsl-g12d/+；trp53flx/flx(fvb.129背景)双突变体小鼠(6至10周龄)中的肿瘤形成的诱导是基于dupage,etal.(dupagem,dooleyal,jackst.使用cre重组酶递送的腺病毒或慢病毒的条件小鼠肺癌模型(conditionalmouselungcancermodelsusingadenoviralorlentiviraldeliveryofcrerecombinase).nat.protoc.2009;4:1064–1072)的方法进行的。简言之，cre重组酶经气管内传递腺病毒颗粒(106pfu)后，可获得肺特异性转基因激活。在实验前，肿瘤被允许预先形成8周。
使用磁共振成像(mri)监测肿瘤进展
使用7.0teslabrukerbiospec70/30usrscanner(扫描仪)(billerica,ma)和在purduemri设备上的40mm小鼠体积卷(volumecoil)获得了诱导和非诱导动物的mri扫描(健康组织扫描)。使用在o2中2.5%v/v异氟烷麻醉动物5分钟，然后移至加热的动物床，其中麻醉被设置为2%。通过压力传感器监测呼吸频率。使用以下参数获得低分辨率多平面监测扫描：tr=4s，te=1.5ms，fov=30x30mm2，扫描层厚=1mm，数据矩阵=256x256，每平面7帧(轴向、冠状和矢状面)，每只小鼠的大约扫描时间=1分钟。监测扫描被用来对齐小鼠的脊柱，利用以下参数收集肺部的高分辨率图像：tr=4s，te=1.5ms，fov=30x30mm2，扫描层厚=0.5mm，数据矩阵=256x256，每平面30帧(轴向和冠状)，每只小鼠的大约扫描时间=5分钟。
肿瘤负荷的定量按照krupnicketal(“磁共振成像对小鼠肺肿瘤的定量监测(quantitativemonitoringofmouselungtumorsbymagneticresonanceimaging)”,nat.protoc.,2012,7,128–142.)描述的手动分割方案进行。mri对肿瘤负荷的分析利用了肿瘤组织(亮)和正常肺组织(暗)在mr图像强度上的巨大差异，并利用平均肺图像强度作为肿瘤负担的代替物。简言之，使用imagej2.0.0手动分割肺mr图像，并计算在同一动物体内标准化为肝脏的平均肺图像强度。为了确定动物体内肿瘤的进展，平均肺图像强度被标准化为第一天的处理。此外，使用itk-snap和paraview5.2软件(kitware,ny,usa)进行三维重建，计算每只动物的肿瘤和全肺体积。在显示肿瘤占肺体积百分比的指定时间获得肿瘤/全肺比率。
kras;p53小鼠中的叶酸摄取研究
为了叶酸摄取研究，将5摩尔的otl38(由ontargetlaboratories,llc,westlafayette,in提供)，一种当前临床试验中的由束缚于荧光近红外(nir)染料的叶酸组成的荧光成像共轭物(临床试验标识符：nct02769533)通过尾静脉全身递送进入健康和荷瘤小鼠(n＝3；在转基因活化后8周)。注射后24小时处死动物，用生理盐水灌注。在licorodysseyclx(licor)中使用800nm通道获取全器官图像。根据标准程序将肺固定在10%缓冲的福尔马林中，并包埋在石蜡中。切片用苏木精和伊红(h&e)染色，并使用配备1.25x物镜、olympusdp80摄像机和cellsens1.11的olympusix73显微镜进行评估。使用imagej2.0.0计算肿瘤负荷，其代表相对于从每只动物的三个独立切片获得的总肺面积的肿瘤面积。在licorodysseyclx(licor)中并使用配备20x物镜、icg带通滤光片(ex:780-800；ex:810-860；semrock,brightline)、氙/汞光源(nikon,japan)、photometricsquantememccd照相机和nis-elements(nikon,japan)的nikontis显微镜，在800nm通道中评估未染色的固定切片。
由于该模型尚未验证fr表达，首先，评估该模型的肺腺癌的叶酸受体表达以及叶酸共轭物的肿瘤-特异性摄取和保留。荧光成像配体otl38，与荧光近红外(nir)染料共轭的叶酸受体-α(frα)-靶向配体，经静脉内给予负荷肺肿瘤的小鼠或健康个体。
叶酸共轭物优先保留在肺肿瘤中，并从正常健康组织中清除，如在大体器官水平(图8a)和在组织学水平(图8b)观察到的。更高的放大图像表明，近红外信号不是健康和恶性组织间细胞密度差异的伪影(artifact)；在otl38给予后的肿瘤中可以观察到明确的点状信号，正如以前由于受体介导的otl-38内吞作用而观察到的那样(见图8b中的插图)。为确定肺腺癌中otl38的保留是否是由其与fr的相互作用所介导，采用体内阻断分析。在100-倍摩尔过量的叶酸-葡糖胺的存在或不存在下，在负荷肺肿瘤小鼠中，静脉内注射otl38(5nmol)。过量的叶酸-葡糖胺(图8c、d)减少了otl38在肺肿瘤中的优先滞留，表明肿瘤中otl-38的积聚依赖于fr。这些数据证实kraslsl-g12d/+；trp53flx/flx肿瘤特异性摄取和保留otl-38，提示folamir-34a同样应在肿瘤组织中积聚。
在kras;p53小鼠中的folamir处理
对于多次给予folamir-34a的实验中，通过将荷瘤动物(8周)的mri测量的肿瘤负荷的差异降到最低而被随机分成实验组。每3天经静脉内注射1nmolfolamir(共10次注射)处理动物，如上所述使用7.0teslabrukerbiospec70/30usr扫描仪(billerica,ma)每周监测肿瘤进展，持续4周。最后注射后24小时处死动物，用生理盐水灌注。根据标准程序，收集肺并固定在10%缓冲的福尔马林中并用石蜡包埋。
切片用苏木精和曙红(h&e)染色并如前面所描述的那样进行评价。小鼠在从肿瘤诱导后6周开始喂饲叶酸缺乏饮食(envigo,td.95247)，并在实验系列期间维持。所有实验方案均获purdue动物护理及使用委员会批准，并符合国家卫生研究院(nih)动物使用指引。
fr的体内阻断
在雌性nu/nu(nu-foxn1nu；charlesriver)同系小鼠(6周，n=3)中注射5x106个fr阳性人mda-mb-231感受器细胞(右侧)和fr阴性人a549细胞(左侧)(悬浮于200 µlmatrigel(corning)中)后，诱导皮下肿瘤。允许肿瘤形成，并将携带类似大小的a549和mda-mb-231肿瘤的小鼠纳入实验。对于kras;p53小鼠模型，允许肿瘤在转基因活化后8周形成(n=3)。使用mri监测肿瘤形成。在500nmole(≥100-倍摩尔过量)的叶酸葡糖胺存在或不存在下，通过尾静脉共同给异种移植模型5nmolefolamir-34a-nir或kras;p53小鼠模型5nmoleotl38，在小鼠(n=3)中进行竞争研究。使用叶酸葡糖胺共轭物是因为它在低ph值下的溶解度比叶酸高，并且可以防止在肾脏中沉淀。如上所述进行体内整体动物成像和离体组织分布研究。
使用定量pcr(qpcr)的rna分离及mirna表达分析
在rnalater(lifetechnologies)中收集来自nu/nu小鼠(nu-foxn1nu；charlesriver)的mda-mb-231衍生的肿瘤和源自kraslsl-g12d/+；trp53flx/flx小鼠的肺肿瘤并于-80℃贮存。将肿瘤组织(50mg)置于2ml收集管中，收集管中含有700µlqiazol裂解试剂(qiagen)和1.4mm陶瓷珠。使用珠磨(fisherscientific)以4ms-1裂解样品3分钟。总rna是根据制造商的指示使用rneasyminikit(qiagen)来提取的。接着，利用miscriptiirtkit(qiagen)和miscripthiflexbuffer，使用1µg总rna产生cdna。对于mir-34a标准产生，mir-34a模拟物(lifetechnologies)被用于cdna合成。用mirna引物分析(qiagen)执行qrt-pcr。使用quantstudio6flex实时pcr仪(lifetechnologies)，在以下循环步骤中使用miscriptsybrgreenpcrkit(qiagen)进行反应：于95℃15 min；于95℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，40个循环；解链曲线从95℃至60℃，1.6℃s-1。每次生物复制(至少3次)进行了三次技术重复。使用覆盖1x108个拷贝-1x103个拷贝的标准曲线确定mir-34a拷贝数。
统计学
在两组分析中，采用双尾student’st-检验以检查组差异。使用prism统计包(第7版,graphpad软件)，采用具有事后bonferroni校正的双向或单向方差分析(anova)对多组进行比较。误差条代表均值±s.d.或者均值±s.e.m.，如图例中所示。统计学意义的p值在图和/或图例中表示为***,p<0.005；**,p<0.01；*,p<0.05。
为了确定kraslsl-g12d/+；trp53flx/flx肿瘤是否对folamir-34a有反应，荷瘤动物每三天给予静脉内注射1nmole的folamir-34a，总共10个给药剂量。在研究过程中，通过mri对肿瘤生长进行监测，从mri数据中产生的体积测量结果表明，与给予对照叶酸-共轭物的动物相比，folamir-34a降低了肿瘤生长(图9a、b、c)。给予folamir-34a的动物的肿瘤大小无统计学变化，而在folamir-nc处理的小鼠中，肿瘤大小较给药第一天增加了1.5-倍。在研究终止时，在组织学水平上观察到相似的反应(图9d、e)。肿瘤负荷的量化显示，与folamir-nc处理的小鼠相比，从folamir-34a处理的小鼠收获的肺部肿瘤负荷的1.8倍减少，具有统计学意义。与md-mba-231异种移植物中观察到的mir-34a拷贝数增加相似，切除的肺肿瘤组织中的mir-34a的拷贝数为从给予对照的小鼠中提取的肿瘤的~3倍(图13b)。为了验证mir-34a用于抑制mir-34a靶的内源性靶基因转录物水平，对bcl-2、met和myc进行了定量。bcl-2和myc二者在从给予folamir-34a的小鼠收获的肿瘤中统计学下调，证实了mir-34a对内源性靶基因的活性(图9g)。
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