本申请要求2016年12月21日提交的美国临时申请号62/437,524的权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。
背景技术：
大多数患有晚期实体肿瘤的患者不可用标准疗法治愈。此外，传统治疗选项经常具有严重副作用。已进行众多尝试来利用患者的免疫系统排斥癌性细胞，这是一种总称为癌症免疫疗法的方法。然而，若干障碍使得相当难以实现临床有效性。尽管已鉴定数百个所谓肿瘤抗原，但这些肿瘤抗原经常源于自身，因此可引导癌症免疫疗法对抗健康组织，或具有不良免疫原性。此外，癌细胞使用多种机理来致使它们自身不可见或阻碍由癌症免疫疗法达成的免疫攻击的启动和传播。
继承性t细胞疗法(act)是一种用以治疗甚至晚期阶段的转移性癌症的强力方法(rosenberg,natrevclinoncol8(10)(2011))。对于act，对抗原特异性t细胞进行分离或工程改造，并且在体外扩增，随后再输注至患者中(gattinoni等,natrevimmunol6(5)(2006))。在临床试验中，已由act与全身照射联合在一些癌症患者中实现空前的响应率。然而，大多数患者不对这个治疗起响应(dudley等,jclinoncol26(32)(2008)；rosenberg等,clincancerres17(13)(2011))。不由全身照射加以抵抗的肿瘤诱导免疫抑制已牵涉于对疗法的这个抗性中(leen等,annurevimmunol25(2007))。近来，已显示在活化的t细胞上上调的抑制性受体和它们的在肿瘤环境内表达的相应配体促成t细胞疗法失败(abate-daga等,blood122(8)(2013))。鉴于新近研究已确认在肿瘤的情况下pd-1在肿瘤抗原特异性细胞上表达(gros等,jclininvest(2014))，所以在抑制性受体之中，程序化死亡受体-1(pd-1)起主要作用。pd-1与它的配体pd-l1的相互作用会抑制tcr信号传导和t细胞活化，因此阻止在靶标识别后的有效活化(gros等,jclininvest(2014)；yokosuka等,jexpmed209(6)(2012)；ding等,cancerres(2014)；karyampudi等,cancerres(2014))。这些机理的临床重要性由将act或经基因修饰t细胞与基于抗体的pd-1阻断组合，从而导致抗肿瘤活性显著改进的治疗研究加以强调(john等,clincancerres19(20)(2013)；goding等,jimmunol190(9)(2013))。全身性施加pd-1或pd-l1阻断抗体具有潜在靶向具有任何反应性的t细胞，因此诱导全身性副作用的缺点(topalian等,nengljmed366(26)(2012)；brahmer等,nengljmed366(26)(2012))。
鉴于pd-l1介导的t细胞抑制，所以仍然有需要提供有可能使act的安全性和功效改进，并且克服以上缺点的改进手段。本文描述被设计来解决这个需要的包含pd-1融合蛋白和经修饰t细胞受体的经工程改造t细胞。
技术实现要素：
本文提供用于治疗疾病的用以进行t细胞工程改造的融合蛋白及其组合、t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)、包含pd-1和共刺激性结构域的融合蛋白、被工程改造来表达一种或多种tfp和包含pd-1和共刺激性结构域的融合蛋白的t细胞及其使用方法。
在一个方面，本文提供一种编码包含以下的t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的经分离重组核酸分子：tcr亚单位和包含pd-1多肽或其片段的人或人源化抗体结构域。
在一个方面，本文提供一种组合物，其包含编码包含以下的第一融合蛋白的第一经分离重组核酸分子：tcr亚单位，其包含tcr细胞外结构域的至少一部分和包含来自cd3亚单位的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的tcr细胞内结构域；以及第一靶标结合结构域，其中所述tcr亚单位和所述第一靶标结合结构域操作性地连接，并且其中所述第一融合蛋白在t细胞中表达时并入tcr中；以及编码具有第二靶标结合结构域的第二融合蛋白的第二经分离重组核酸分子，其中所述第二靶标结合结构域包含pd-1多肽，其通过它的c末端来可操作地连接于共刺激性多肽的细胞内结构域的n末端，其中所述pd-1多肽包含pd-1的细胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，第一靶标结合结构域是人或人源化抗体结构域。
在一个方面，本文提供一种组合物，其包含编码包含以下的第一t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)的第一经分离重组核酸分子：tcr亚单位，其具有tcr细胞外结构域的至少一部分和包含来自cd3亚单位的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的tcr细胞内结构域；以及包含第一抗原结合结构域的第一人或人源化抗体结构域，以及任选地，包含第二抗原结合结构域的第二人或人源化抗体结构域；其中所述tcr亚单位、所述第一抗体结构域和所述第二抗体结构域操作性地连接，并且其中所述第一tfp在t细胞中表达时并入tcr中；以及编码具有第二靶标结合结构域的第二融合蛋白的第二经分离重组核酸分子，其中所述第二靶标结合结构域包含pd-1多肽，其通过它的c末端来可操作地连接于共刺激性多肽的细胞内结构域的n末端，其中所述pd-1多肽包含pd-1的细胞外结构域和跨膜结构域。在一些实施方案中，抗体结构域能够特异性结合选自由以下组成的组的肿瘤相关抗原：ror-1、bcma、cd19、cd20、cd22、间皮素(mesothelin)、magea3、egfrviii、muc16、nkg2d、il-13rα2、l1cam和ny-eso-1及其组合。在一些实施方案中，共刺激性多肽选自由以下组成的组：ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd28、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、cd226、fcγri、fcγrii和fcγriii。
在一个方面，本文提供一种病毒载体，其包含本文所述的第一核酸分子和第二核酸分子。在一些实施方案中，第一经分离重组核酸分子和第二经分离重组核酸分子含于单一操纵元中。
在一些实施方案中，第一经分离重组核酸分子和第二经分离重组核酸分子含于两个单独转录的操纵元中。
在一些实施方案中，操纵元包含e1a启动子。在一些实施方案中，操纵元各自包含e1a启动子。在一些实施方案中，病毒载体是dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、劳斯肉瘤(roussarcoma)病毒(rsv)载体或逆转录病毒载体。
在一个方面，本文提供一种病毒载体，其包含本文所述的第一经分离重组核酸分子。
在一个方面，本文提供一种病毒载体，其包含本文所述的第二经分离重组核酸分子。
在一个方面，本文提供一种包含本文所述的病毒载体的混合物。
在一个方面，本文提供一种经转导t细胞，其包含本文所述的组合物或本文所述的病毒载体或本文所述的混合物。
在一个方面，本文提供一种经转导t细胞，其包含一种或多种本文所述的病毒载体。在一些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白各自可在t细胞的表面上检测。
在一个方面，本文提供一种包含多种多肽的经分离t细胞，第一多肽包含tcr亚单位，其包含tcr细胞外结构域的至少一部分、包含来自cd3ε或cd3γ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域的tcr细胞内结构域；以及第一靶标结合结构域，其中所述tcr亚单位和所述第一靶标结合结构域操作性地连接，并且其中第一融合蛋白在t细胞中并入tcr中；并且第二融合蛋白具有第二靶标结合结构域，其中所述第二靶标结合结构域包含pd-1多肽，其通过它的c末端来可操作地连接于共刺激性多肽的细胞内结构域的n末端，其中所述pd-1多肽包含pd-1的细胞外结构域和跨膜结构域。
在一些实施方案中，第一靶标结合结构域选自由以下组成的组：cd16、bcma、msln、nkg2d、ror1、cd19、cd20、cd22和前列腺特异性癌症抗原(psca)。在一些实施方案中，共刺激性多肽选自由以下组成的组：ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、icos(cd278)、4-1bb(cd137)、gitr、cd28、cd30、cd40、baffr、hvem、cd7、light、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、cd226、fcγri、fcγrii和fcγriii。在一些实施方案中，第二融合蛋白的共刺激性多肽是cd28。
在一些实施方案中，所编码第一抗原结合结构域通过第一接头序列来连接于第一tfp的tcr细胞外结构域，并且所编码第二抗原结合结构域通过第二接头序列来连接于第一tfp的tcr细胞外结构域。在一些实施方案中，第一接头序列和第二接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。
在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含tcr细胞外结构域。在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含tcr跨膜结构域。在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含tcr细胞内结构域。在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含(i)tcr细胞外结构域，(ii)tcr跨膜结构域，和(iii)tcr细胞内结构域，其中(i)、(ii)和(iii)中的至少两者来自同一tcr亚单位。
在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含tcr细胞内结构域，其包含选自cd3ε、cd3γ或cd3δ的细胞内信号传导结构域的刺激性结构域或具有至少一个对其进行的修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一tfp的tcr亚单位包含细胞内结构域，其包含选自4-1bb的功能性信号传导结构域和/或cd3ζ的功能性信号传导结构域的刺激性结构域或具有至少一个对其进行的修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含抗体片段。在一些实施方案中，第一人或人源化抗体结构域、第二人或人源化抗体结构域或两者包含scfv或vh结构域。在一些实施方案中，所编码第一tfp包括tcr亚单位的细胞外结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分、其功能性片段及其具有至少1个但不超过20个修饰的氨基酸序列：tcrα链、tcrβ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位。
在一些实施方案中，所编码第一tfp包括跨膜结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段及其具有至少1个但不超过20个修饰的氨基酸序列：tcrα链、tcrβ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位。在一些实施方案中，所编码第一tfp包括跨膜结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域、其功能性片段及其具有至少1个但不超过20个修饰的氨基酸序列：tcrα链、tcrβ链、tcrζ链、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含编码共刺激性结构域的序列。在一些实施方案中，共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域及其具有至少1个但不超过20个对其进行的修饰的氨基酸序列：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含编码细胞内信号传导结构域的序列。在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含前导序列。
在一些实施方案中，至少1个但不超过20个对其进行的修饰包括对介导细胞信号传导的氨基酸的修饰或对应答于配体与第一tfp结合加以磷酸化的氨基酸的修饰。
在一些实施方案中，经分离核酸分子是mrna。
在一些实施方案中，第一tfp包括tcr亚单位的免疫受体酪氨酸基活化基序(itam)，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的itam或其部分、其功能性片段及其具有至少1个但不超过20个对其进行的修饰的氨基酸序列：cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位、cd3δtcr亚单位、tcrζ链、fcε受体1链、fcε受体2链、fcγ受体1链、fcγ受体2a链、fcγ受体2b1链、fcγ受体2b2链、fcγ受体3a链、fcγ受体3b链、fcβ受体1链、tyrobp(dap12)、cd5、cd16a、cd16b、cd22、cd23、cd32、cd64、cd79a、cd79b、cd89、cd278、cd66d。在一些实施方案中，itam替代cd3γ、cd3δ或cd3ε的itam。在一些实施方案中，itam选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组，并且替代选自由cd3ζtcr亚单位、cd3εtcr亚单位、cd3γtcr亚单位和cd3δtcr亚单位组成的组的不同itam。
在一些实施方案中，核酸包含核苷酸类似物。在一些实施方案中，核苷酸类似物选自由以下组成的组：2’-o-甲基、2’-o-甲氧基乙基(2’-o-moe)、2’-o-氨基丙基、2’-脱氧、t-脱氧-2’-氟代、2’-o-氨基丙基(2’-o-ap)、2’-o-二甲基氨基乙基(2’-o-dmaoe)、2’-o-二甲基氨基丙基(2’-o-dmap)、t-o-二甲基氨基乙基氧基乙基(2’-o-dmaeoe)、经2’-o-n-甲基乙酰胺基(2’-o-nma)修饰、锁定核酸(lna)、亚乙基核酸(ena)、肽核酸(pna)、1’,5’-失水己糖醇核酸(hna)、吗啉代、甲基膦酸酯核苷酸、硫代膦酸酯核苷酸和2’-氟代n3-p5’-亚磷酰胺。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含前导序列。
在一个方面，本文提供由本文所述的核酸分子编码的多种经分离多肽分子。在一些实施方案中，载体是在体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列进一步编码poly(a)尾部。在一些实施方案中，载体中的核酸序列进一步编码3’utr。
在一个方面，本文提供一种药物组合物，其包含多种核酸、本文所述的载体、本文所述的混合物或本文所述的t细胞。
具体实施方式
在一个方面，本文描述用于对t细胞进行工程改造以达成继承性t细胞疗法的融合蛋白的组合。本文公开的经工程改造t细胞包含对具有能够结合靶标细胞的多肽的经修饰t细胞受体(tcr)的表达，即细胞能够特异性结合特征在于具有抗原例如肿瘤相关抗原的细胞。所述经修饰t细胞受体详细描述于例如共同待决的于2016年5月18日提交的国际非临时申请序列号pct/us2016/033146中，所述申请以引用的方式并入本文。
本文公开的经工程改造t细胞也包含含有pd-1的细胞外结构域和跨膜结构域的pd-1融合蛋白，其通过它的c末端来可操作地连接于共刺激性多肽的细胞内结构域的n末端。以下描述共刺激性多肽的适合实例。在一个实施方案中，共刺激性多肽是cd28多肽，因此提供“pd1cd28融合蛋白”或“pd1cd28转换受体”。融合蛋白的其他非限制性实例包括pd141bb转换受体或pd1x转换受体，其中x是dap10、dap12、cd30、light、ox40、cd2、cd27、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)或icos(cd278)。
在一个实施方案中，表达经修饰tcr的t细胞能够结合表达肿瘤相关抗原(在本文中也是“taa”)的肿瘤细胞，所述肿瘤相关抗原的非限制性实例是间皮素(msln)、b细胞成熟muc16抗原(bcma)、cd19、cd20、cd22、前列腺特异性癌症抗原(psca)、5t4、8h9、ανβθ整合素(integrin)、αvβ6整合素、α胎蛋白(alphafetoprotein，afp)、b7-h6、ca-125碳酸酐酶9(ca9)、cd19、cd20、cd22、cd30、cd33、cd38、cd44、cd44v6、cd44v7/8、cd52、cd123、cd171、癌胚抗原(cea)、epcam(上皮细胞粘附分子)、e-钙粘着蛋白(e-cadherin)、ema(上皮膜抗原)、egfrvlll、上皮糖蛋白-2(egp-2)、上皮糖蛋白-40(egp-40)、erbb1/egfr、erbb2/her2/neu/egfr2、erbb3/her3、erbb4、上皮肿瘤抗原(eta)、叶酸结合蛋白(fbp)、胎儿乙酰胆碱受体(achr)、叶酸受体-α、g250/caix、神经节苷脂2(gd2)、神经节苷脂3(gd3)、高分子量黑素瘤相关抗原(hmw-maa)、il-13受体α2(il-13rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、k-轻链、路易斯y(lewisy，ley)、l1细胞粘附分子、黑素瘤相关抗原(mage-a1)、间皮素、粘蛋白-1(mucin-1，muc1)、粘蛋白-16(muc16)、粘蛋白-18(muc-18)、天然杀伤组2成员d(nkg2d)配体、神经细胞粘附分子(ncam)、ny-eso-1、癌胚抗原(h5t4)、前列腺干细胞抗原(psca)、前列腺特异性膜抗原(psma)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)、由mabige靶向的taa、肿瘤相关糖蛋白-72(tag-72)、酪氨酸酶和血管内皮生长因子(vegf)受体。所述t细胞将包含经修饰t细胞受体，其包含能够特异性结合肿瘤相关抗原的scfv或vh结构域。
在另一实施方案中，tcr包含cd16多肽或其fc结合片段，其替代对靶标抗原具有特异性的scfv或vh结构域。被工程改造来表达所述tcr的t细胞在以下情况下适用于靶向具有表面抗原表达的许多不同类型的肿瘤细胞：当与针对所述抗原的抗体组合时，因为cd16部分能够结合igg1形式抗体。
在另一实施方案中，tcr包含具有超过一个对细胞表面抗原或肿瘤相关抗原具有特异性的scfv或vh结构域的tfp。所述tfp被称为“双特异性”tfp，因此使得表达经工程改造tcr的t细胞能够结合超过一种类型的癌细胞或单一癌细胞上超过一种肿瘤相关抗原。
在另一实施方案中，tcr包含nkg2d多肽或其片段。
在一些实施方案中，tfp包括tcr亚单位的细胞外结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分或其功能性片段或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：t细胞受体的α或β链、cd3δ、cd3ε或cd3γ。在其他实施方案中，所编码tfp包括跨膜结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域或其功能性片段或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：tcr的α、β链或tcr亚单位cd3ε、cd3γ和cd3δ。
在一些实施方案中，所编码tfp包括跨膜结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域或其功能性片段或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：tcr的α、β或ζ链或cd3ε、cd3γ和cd3δ、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd28、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137和cd154。
在一些实施方案中，所编码抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域通过接头序列来连接于tcr细胞外结构域。在一些情况下，所编码接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。在一些情况下，所编码接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，所编码长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，所编码接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，所编码短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含编码共刺激性结构域的序列。在一些情况下，共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：ox40、cd2、cd27、cd28、cds、icam-1、lfa-1(cd11a/cd18)、icos(cd278)和4-1bb(cd137)。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含前导序列。
本文也提供由任何先前所述核酸分子编码的经分离多肽分子。
在一些实施方案中，所编码抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域或其片段通过接头序列来连接于tcr细胞外结构域。在一些情况下，所编码接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至4。在一些情况下，所编码接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，所编码长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，所编码接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，所编码短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含编码共刺激性结构域和/或衔接分子诸如dnax的序列。在一些情况下，共刺激性结构域是从选自由以下组成的组的蛋白质获得的功能性信号传导结构域或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：1类mhc分子、btla和toll样受体以及dap10、dap12、cd30、light、ox40、gitr、cd2、cd27、cd7、cd28、cds、icam-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1，也称为cd11a/cd18)、nkg2c、icos、baffr、hvem、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、4-1bb(cd137)和与cd83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，经分离核酸分子进一步包含前导序列。
本文也提供由任何先前所述核酸分子编码的经分离多肽分子。
在一些实施方案中，经分离tfp分子包含tcr细胞外结构域，其包括选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分或具有对其进行的至少1个、2个或3个修饰但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列：t细胞受体的α或β链、cd3δ、cd3ε或cd3γ。
在一些实施方案中，抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域或其片段通过接头序列来连接于tcr细胞外结构域。在一些情况下，接头区域包含(g4s)n，其中n＝1至4。在一些情况下，接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
在一些实施方案中，经分离tfp分子进一步包含编码共刺激性结构域的序列。在其他实施方案中，经分离tfp分子进一步包含编码细胞内信号传导结构域的序列。在其他实施方案中，经分离tfp分子进一步包含前导序列。
本文也提供包含编码任何先前所述tfp分子的核酸分子的载体。在一些实施方案中，载体选自由以下组成的组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体。在一些实施方案中，载体进一步包含启动子。在一些实施方案中，载体是在体外转录的载体。在一些实施方案中，载体中的核酸序列进一步包含poly(a)尾部。在一些实施方案中，载体中的核酸序列进一步包含3’utr。
本文也提供包含任何所述载体的细胞。在一些实施方案中，细胞是人t细胞。在一些实施方案中，细胞是cd8+或cd4+t细胞。在其他实施方案中，细胞进一步包含编码抑制性分子的核酸，所述抑制性分子包含含有抑制性分子的至少一部分的第一多肽与含有来自细胞内信号传导结构域的正性信号的第二多肽缔合。在一些情况下，抑制性分子包含含有pd-1的至少一部分的第一多肽和含有共刺激性结构域和初级信号传导结构域的第二多肽。
在另一方面，本文提供经分离tfp分子，其包含抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域蛋白质或其片段、tcr细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述tfp分子能够功能性地与内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽相互作用。
在另一方面，本文提供经分离tfp分子，其包含抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域蛋白质或其片段、tcr细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述tfp分子能够功能性地整合至内源性tcr复合物中。
在另一方面，本文提供包含至少两种tfp分子、或tfp分子和pd-1融合蛋白的人cd8+或cd4+t细胞(例如细胞群体)，所述tfp分子包含肿瘤相关抗原多肽或其片段、tcr细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述tfp分子能够功能性地与在所述人cd8+或cd4+t细胞中、所述人cd8+或cd4+t细胞的表面处和/或表面上的内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽相互作用。在一个实施方案中，一种或多种tfp分子和pd-1融合蛋白存在于同一细胞中。在另一实施方案中，一种或多种tfp分子和pd-1融合蛋白存在于同一细胞群体中。
在另一方面，本文提供蛋白质复合物，其包含i)tfp分子，其包含抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域多肽或其片段、tcr细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域；和ii)至少一种内源性tcr复合物。
在一些实施方案中，tcr包含选自由以下组成的组的蛋白质的细胞外结构域或其部分：t细胞受体的α或β链、cd3δ、cd3ε或cd3γ。在一些实施方案中，抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域多肽或其片段通过接头序列来连接于tcr细胞外结构域。在一些情况下，接头区域包含(g4s)n，其中n＝1至4。在一些情况下，接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
在另一方面，本文提供一种人cd8+或cd4+t细胞群体，其中所述群体的所述t细胞个别地或总体地包含至少两种tfp分子，所述tfp分子包含抗肿瘤抗原结合结构域、cd16结构域或nkg2d结构域多肽或其片段、tcr细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中所述tfp分子能够功能性地与在所述人cd8+或cd4+t细胞中、所述人cd8+或cd4+t细胞的表面处和/或表面上的内源性tcr复合物和/或至少一种内源性tcr多肽相互作用。
在另一方面，本文提供一种人cd8+或cd4+t细胞群体，其中所述群体的所述t细胞个别地或总体地包含至少两种由本文提供的经分离核酸分子编码的tfp分子。
在另一方面，本文提供制备细胞的方法，其包括用任何所述载体或载体的组合转导t细胞。在一个实施方案中，用包含本文所述的tfp和pd-1融合蛋白的单一载体转导t细胞。在另一实施方案中，用超过一种载体转导t细胞，所述载体包括至少一种表达本文提供的tfp的载体和至少一种表达如本文提供的pd-1融合蛋白的载体。
在另一方面，本文提供产生经rna工程改造的细胞的群体的方法，其包括将在体外转录的rna或合成rna引入细胞中，其中所述rna包含编码任何所述tfp分子和/或pd-1融合蛋白的核酸。
在另一方面，本文提供在哺乳动物中提供抗肿瘤免疫性的方法，其包括向所述哺乳动物施用有效量的表达任何所述tfp分子和pd-1融合蛋白/转换受体的细胞。在一些实施方案中，细胞是自体t细胞。在一些实施方案中，细胞是同种异体t细胞。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
在一些实施方案中，哺乳动物患有增生性病症。增生性病症可为癌症，诸如血液癌症或实体肿瘤。在一个实施方案中，肿瘤细胞或肿瘤微环境中的细胞表达pd-l1或pd-l2。在一个实施方案中，哺乳动物对至少一种抗癌治疗剂具有抗性。
因此，在另一方面，本文公开的包含pd-1融合蛋白和tfp的经工程改造t细胞适用于治疗增生性疾病诸如癌症或恶性肿瘤或癌前期疾患，其中癌细胞表达pd-1的配体，即pd-l1或pd-l2。非限制性实例包括癌症，诸如肺癌(dong等,natmed.8(8)(2002),793-800)、卵巢癌(dong等,natmed.8(8)(2002),793-800)、黑素瘤(dong等,natmed.8(8)(2002),793-800)、结肠癌(dong等,natmed.8(8)(2002),793-800)、胃癌(chen等,worldjgastroenterol.9(6)(2003),1370-1373)、肾细胞癌(thompson等,104(10)(2005),2084-91)、食道癌(ohigashi等,11(8)(2005),2947-2953)、神经胶质瘤(wintterle等,cancerres.63(21)(2003),7462-7467)、尿道上皮癌(nakanishi等,cancerimmunolimmunother.56(8)(2007),1173-1182)、视网膜母细胞瘤(usui等,investophthalmolvissci.47(10)(2006),4607-4613)、乳腺癌(ghebeh等,neoplasia8(3)(2006),190-198)、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkinlymphoma)(xerri等,humpathol.39(7)(2008),1050-1058)、胰腺癌(geng等,jcancerresclinoncol.134(9)(2008),1021-1027)、霍奇金氏淋巴瘤(yamamoto等,blood111(6)(2008),3220-3224)、骨髓瘤(liu等,blood110(1)(2007),296-304)、肝细胞癌(gao等,clincancerres.15(3)(2009),971-979)、白血病(kozako等,leukemia23(2)(2009),375-382)、宫颈癌(karim等,clincancerres.15(20)(2009),6341-6347)、胆管癌(ye等,jsurgoncol.100(6)(2009),500-504)、口腔癌(malaspina等,cancerimmunolimmunother.60(7)(2011),965-974)、头颈部癌(badoual等,cancerres.73(1)(2013),128-138)和间皮瘤(mansfield等,jthoraconcol.9(7)(2014),1036-1040)。
在一些实施方案中，表达任何所述tfp分子的细胞与改善一种或多种与施用表达tfp分子的细胞相关的副作用的药剂组合施用。在一些实施方案中，表达任何所述tfp分子的细胞与治疗与pd-1相关的疾病的药剂组合施用。
本文也提供用作药剂的任何所述经分离核酸分子、任何所述经分离多肽分子、任何所述经分离tfp、任何所述蛋白质复合物、任何所述载体或任何所述细胞。
定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与由本发明所属领域中的普通技术人员通常理解相同的含义。
术语“一个(种)(a/an)”是指冠词的一个或超过一个(即至少一个)语法对象。举例来说，“一个(种)要素”意指一个(种)要素或超过一个(种)要素。
如本文所用，视情况而定并且由或可由本领域技术人员所知，“约”可意指加上或减去小于1％或1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％或大于30％。
如本文在说明书中所用，“受试者”或“个体”可包括但不限于哺乳动物诸如人或非人哺乳动物，例如驯化动物、农业动物或野生动物，以及鸟类和水生动物。“患者”是罹患疾病、病症或疾患或处于显现疾病、病症或疾患的风险下或另外需要本文提供的组合物和方法的受试者。
如本文所用，“治疗”是指在治疗或改善疾病或疾患方面的任何成功迹象。治疗可包括例如减轻、延迟或缓和疾病或疾患的一种或多种症状的严重性，或它可包括降低由患者经受疾病、缺陷、病症或不利状况等的症状所处的频率。如本文所用，“治疗或预防”有时在本文中用于指代导致某一水平的对疾病或疾患的治疗或改善的方法，并且涵盖一定范围的涉及那个结局的结果，包括但不局限于完全预防疾患。
如本文所用，“预防”是指防止患者的疾病或疾患例如肿瘤形成。举例来说，如果处于显现肿瘤或其他形式的癌症的风险下的个体用本发明方法治疗并且后来未显现所述肿瘤或其他形式的癌症，那么疾病在那个个体中已至少历经一段时期得以预防。
如本文所用，“治疗有效量”是组合物或其活性组分的足以对被施用所述组合物的个体提供有益作用或另外减少有害非有益事件的量。就“治疗有效剂量”来说，其在本文中意指产生一种或多种施用所述剂量所要达成的所需或合乎需要(例如有益)作用的剂量，所述施用历经给定时期发生一次或多次。精确剂量将取决于治疗目的，并且将可由本领域技术人员使用已知技术确定(参见例如lieberman,pharmaceuticaldosageforms(第1-3卷,1992)；lloyd,theart,scienceandtechnologyofpharmaceuticalcompounding(1999)；以及pickar,dosagecalculations(1999))。
如本文所用，术语“融合蛋白”涉及由来自不同来源的多肽部分制得的蛋白质。因此，它也可被理解为嵌合蛋白。在本文所述的pd-1融合蛋白的情形下，术语“融合蛋白”可与术语“转换受体”互换使用。通常，融合蛋白是通过使两个或更多个最初编码单独蛋白质的基因(或优选是cdna)接合来产生的蛋白质。这个融合基因(或融合cdna)的翻译产生优选具有源于各原始蛋白质的功能性质的单一多肽。重组融合蛋白通过用于生物学研究或治疗学中的重组dna技术来人工产生。本文在以下描述用以产生本发明的融合蛋白的其他细节。
在本发明的情形下，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。所述术语也适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。因此，在本发明的情形下，术语“多肽”涉及包含以下或由以下组成的分子：由肽(酰胺)键连接的氨基酸单体的链。肽键是当一个氨基酸的羧基与另一氨基酸的氨基反应时形成的共价化学键。在本文中，“多肽”不局限于具有限定长度的分子。因此，在本文中，术语“多肽”涉及包含氨基酸链的肽、寡肽、蛋白质或多肽，在所述氨基酸链中，氨基酸残基由共价肽键连接。然而，在本文中，术语“多肽”也涵盖所述蛋白质/多肽的肽模拟物，其中氨基酸和/或肽键已由功能性类似物替换。术语多肽也涉及并且不排除对多肽的修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。所述修饰在本领域中经充分描述。
如本文所用，“t细胞受体(tcr)融合蛋白”或“tfp”包括源于构成tcr的各种多肽的重组多肽，其通常能够i)结合靶标细胞上的表面抗原，以及ii)通常在共定位于t细胞中或t细胞的表面上时与完整tcr复合物的其他多肽组分相互作用。
如本文所用，术语“pd-1”是指程序化细胞死亡蛋白1，也称为cd279(分化簇279)，是一种在t细胞和祖b细胞上表达的抑制性细胞表面受体。它涉及于在免疫性和耐受性期间对t细胞功能的调控中。在配体结合后，pd-1以抗原特异性方式抑制t细胞效应物功能。它与其他因子联合充当可能的细胞死亡诱导剂。在人中，pd-1由pdcd1基因编码。已知pd-1会结合两种配体，即pd-l1和pd-l2。pd-1和它的配体在通过阻止t细胞的活化来使免疫系统下调方面起重要作用，所述阻止转而会降低自体免疫性和促进自身耐受性。pd-1的抑制作用通过促进淋巴结中抗原特异性t细胞的凋亡(程序化细胞死亡)，同时降低调控性t细胞(抑制t细胞)的凋亡的双重机理来实现。
人和鼠氨基酸和核酸序列可见于公共数据库诸如genbank、uniprot和swiss-prot中。举例来说，人pd-1序列对应于uniprot登录号q02242，并且具有序列：mqipqapwpvvwavlqlgwrpgwfldspdrpwnpptfspallvvtegdnatftcsfsntsesfvlnwyrmspsnqtdklaafpedrsqpgqdcrfrvtqlpngrdfhmsvvrarrndsgtylcgaislapkaqikeslraelrvterraevptahpspsprpagqfqtlvvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl(seqidno:14)。
如本文所用的术语“pd-1融合蛋白”或“pd-1”转换受体是指通过结合pd-l1或pd-l2来接收抑制性信号，并且通过融合蛋白的共刺激性结构域来将所述信号转变(即“转换”)成活化性信号的所述pd-1融合蛋白。
术语“抗肿瘤作用”是指可通过各种方式来显现的生物作用，所述方式包括但不限于例如肿瘤体积降低、肿瘤细胞的数目降低、转移的数目降低、预期寿命增加、肿瘤细胞增殖降低、肿瘤细胞存活降低、或与癌性疾患相关的各种生理症状的改善。“抗肿瘤作用”也可通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体起初预防肿瘤发生的能力来显现。
术语“自体”是指任何物质源于它稍后将被再引入其中的同一个体。在一个实施方案中，本文公开的tfpt细胞和pd-1转换体细胞对于t细胞的接受者来说是自体的。
术语“同种异体(allogenic/allogeneic)”是指任何物质源于与向其中引入所述物质的个体属于同一物种的不同动物或与所述个体不同的患者。当在一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体。在一些方面，来自同一物种的个体的同种异体物质可在遗传上足够不相似以发生抗原性相互作用。在一个实施方案中，本文公开的tfpt细胞和pd-1转换体细胞对于t细胞的接受者来说是同种异体的。
术语“异种异体(xenogenic/xenogeneic)”是指移植物源于不同物种的动物。
术语“癌症”是指特征在于异常细胞快速和不受控制生长的疾病。癌细胞可局部扩散，或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部分。各种癌症的实例在本文中加以描述，并且包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、黑素瘤、肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、子宫癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer)、胃癌(gastriccancer)、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、胆管癌、鳞状细胞肺癌、间皮瘤、肾上腺皮质癌、食道癌、头颈部癌、肝癌、鼻咽癌、神经上皮癌、腺样囊性癌、胸腺瘤、慢性淋巴细胞性白血病、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、乳头状肾细胞癌、套膜细胞淋巴瘤、淋巴母细胞性白血病、急性骨髓性白血病等。
术语“保守性序列修饰”是指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。所述保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术诸如定点诱变和pcr介导的诱变来将修饰引入本发明的抗体或抗体片段中。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的tfp内的一个或多个氨基酸残基可用来自同一侧链家族的其他氨基酸残基置换，并且可使用本文所述的功能性测定测试改变的tfp。
术语“刺激”是指由以下方式诱导的初级应答：刺激性结构域或刺激性分子(例如tcr/cd3复合物)与它的同源配体结合，由此介导信号转导事件，诸如但不限于通过tcr/cd3复合物进行的信号转导。刺激可介导某些分子的表达改变和/或细胞骨架结构的重新组织等。
术语“刺激性分子”或“刺激性结构域”是指由t细胞表达的提供初级细胞质信号传导序列的分子或其部分，所述序列以对于t细胞信号传导路径的至少某一方面具有刺激性的方式调控tcr复合物的初级活化。在一个方面，初级信号由例如tcr/cd3复合物与装载有肽的mhc分子的结合引发，并且此导致介导t细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激性方式起作用的初级细胞质信号传导序列(也被称为“初级信号传导结构域”)可含有称为免疫受体酪氨酸基活化基序或“itam”的信号传导基序。特别适用于本发明中的含itam初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源于tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b、cd278(也称为“icos”)和cd66d的那些。
术语“抗原递呈细胞”或“apc”是指在它的表面上显示与主要组织相容性复合物(mhc)复合的外来抗原的免疫系统细胞，诸如辅助细胞(例如b细胞、树突细胞等)。t细胞可使用它们的t细胞受体(tcr)识别这些复合物。apc对抗原进行加工，并且将它们递呈给t细胞。
“细胞内信号传导结构域”，如所述术语在本文中所使用，是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生促进含有tfp的细胞例如tfp表达性t细胞的免疫效应物功能的信号。例如在tfp表达性t细胞的情况下，免疫效应物功能的实例包括细胞溶解活性和t辅助细胞活性，包括分泌细胞因子。在一实施方案中，细胞内信号传导结构域可包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包括源于导致初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些。在一实施方案中，细胞内信号传导结构域可包含共刺激性细胞内结构域。示例性共刺激性细胞内信号传导结构域包括源于导致共刺激性信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。
初级细胞内信号传导结构域可包含itam(“免疫受体酪氨酸基活化基序”)。含itam初级细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源于cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b以及cd66ddap10和dap12的那些。
术语“共刺激性分子”是指t细胞上与共刺激性配体特异性结合，由此介导由t细胞达成的共刺激性应答诸如但不限于增殖的同源结合配偶体。共刺激性分子是除抗原受体或它们的配体以外的为高效免疫应答所需的细胞表面分子。共刺激性分子包括但不限于1类mhc分子、btla和toll配体受体以及dap10、dap12、cd30、light、ox40、gitr、cd2、cd27、cd7、cd28、cds、icam-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1，也称为cd11a/cd18)、nkg2c、icos、baffr、hvem、nkg2c、slamf7、nkp80、cd160、b7-h3、4-1bb(cd137)和与cd83特异性结合的配体。共刺激性细胞内信号传导结构域可为共刺激性分子的细胞内部分。共刺激性分子可表示在以下蛋白质家族中：tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白质、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)和活化性nk细胞受体。细胞内信号传导结构域可包含它所源于的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域或其功能性片段。术语“4-1bb”是指tnfr超家族的具有以genbank登录号aaa62478.2提供的氨基酸序列或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基的成员；并且“4-1bb共刺激性结构域”被确定为genbank登录号aaa62478.2的氨基酸残基214-255或来自非人物种例如小鼠、啮齿动物、猴、猿等的等效残基。
术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cdna或mrna)中的特定核苷酸序列用以在生物过程中充当用于合成具有确定核苷酸序列(例如rrna、trna和mrna)或确定氨基酸序列以及由其所致的生物性质的其他聚合物和大分子的模板的固有性质。因此，如果对应于某一基因的mrna的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，那么那个基因、cdna或rna编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mrna序列同一，并且通常提供在序列表中)与非编码链(用作用于基因或cdna的转录的模板)两者均可称为编码那个基因或cdna的蛋白质或其他产物。
除非另外规定，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括是彼此的简并形式并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列也可在编码所述蛋白质的核苷酸序列可在某一形式中含有一个或多个内含子的程度上包括内含子。
术语“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述的化合物、制剂、物质或组合物的有效实现特定生物或治疗结果的量。
术语“内源性”是指任何物质来自生物体、细胞、组织或系统或在其内部产生。
术语“外源性”是指任何物质从生物体、细胞、组织或系统引入或在其外部产生。
术语“表达”是指特定核苷酸序列的由启动子驱动的转录和/或翻译。
术语“转移载体”是指包含经分离核酸，并且可用于将所述经分离核酸递送至细胞的内部中的物质组合物。众多载体在本领域中是已知的，包括但不限于线性多核苷酸、与离子性或两亲性化合物缔合的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“转移载体”包括自主复制性质粒或病毒。所述术语也应解释为进一步包括有助于将核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物，诸如像聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒转移载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含表达控制序列操作性地连接于待表达的核苷酸序列。表达载体包含足以用于表达的顺式作用性元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞或在体外表达系统中供给。表达载体包括本领域中已知的所有那些，包括并有重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸质粒或含于脂质体中的质粒)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒之中在能够感染非分裂细胞方面是独特的；它们可将大量遗传信息递送至宿主细胞的dna中，因此它们是基因递送载体的一种最高效方法。hiv、siv和fiv是慢病毒的所有实例。
术语“慢病毒载体”是指源于慢病毒基因组的至少一部分的载体，尤其包括自失活慢病毒载体，如milone等,mol.ther.17(8):1453-1464(2009)中所提供。可在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自oxfordbiomedica的lentivectortm基因递送技术、来自lentigen的lentimaxtm载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可用的，并且将为本领域技术人员所知。
术语“同源性”或“同一性”是指两个聚合分子之间，例如两个核酸分子诸如两个dna分子或两个rna分子之间，或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的某一亚单位位置均由相同单体亚单位占据时；例如如果两个dna分子各自之中的某一位置由腺嘌呤占据，那么它们在那个位置处是同源的或同一的。两个序列之间的同源性是匹配或同源性位置的数目的直接函数；例如如果两个序列中的半数位置(例如长度是10个亚单位的聚合物中的5个位置)是同源的，那么两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如10个中的9个)是匹配的或同源的，那么两个序列是90％同源的。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(诸如fv、fab、fab’、f(ab’)2或抗体的其他抗原结合子序列)。在很大程度上，人源化抗体及其抗体片段是人免疫球蛋白(接受者抗体或抗体片段)，其中来自接受者的互补决定区(cdr)的残基被来自非人物种(供者抗体)诸如小鼠、大鼠或兔的cdr的具有所需特异性、亲和力和能力的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应非人残基置换。此外，人源化抗体/抗体片段可包含既不见于接受者抗体中也不见于输入cdr或框架序列中的残基。这些修饰可进一步改进和优化抗体或抗体片段性能。一般来说，人源化抗体或其抗体片段将包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或重大部分的fr区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体或抗体片段也可包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的至少一部分恒定区。对于其他细节，参见jones等,nature,321:522-525,1986；reichmann等,nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
“人”或“完全人”是指免疫球蛋白诸如抗体或抗体片段，其中整个分子具有人来源或由与抗体或免疫球蛋白的人形式同一的氨基酸序列组成。
术语“经分离”意指从天然状态改变或移除。举例来说，天然存在于活体动物中的核酸或肽不是“经分离的”，但部分地或完全地与它的天然状态的共存物质分离的相同核酸或肽是“经分离的”。经分离核酸或蛋白质可以大致上纯化形式存在，或可存在于非天然环境诸如像宿主细胞中。
在本发明的情形下，使用代表通常存在的核酸碱基的以下缩写。“a”是指腺苷，“c”是指胞嘧啶，“g”是指鸟苷，“t”是指胸苷，并且“u”是指尿苷。
术语“可操作地连接”或“转录控制”是指调控序列与异源性核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。举例来说，当第一核酸序列与第二核酸序列以功能关系放置时，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列可操作地连接。举例来说，如果启动子影响编码序列的转录或表达，那么所述启动子可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接的dna序列可彼此邻接，并且例如当有必要使两个蛋白质编码区接合时，处于同一阅读框中。
术语“胃肠外”施用免疫原性组合物包括例如皮下(s.c.)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射、肿瘤内或输注技术。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)及其聚合物。除非明确限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，其与参照核酸具有类似结合性质，并且以与天然存在的核苷酸类似的方式进行代谢。除非另外指示，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、snp和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；以及rossolini等,mol.cell.probes8:91-98(1994))。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指包含由肽键共价连接的氨基酸残基的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且关于可构成蛋白质的序列或肽的序列的氨基酸的最大数目不设限制。多肽包括包含两个或更多个由肽键彼此接合的氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，所述术语是指也通常在本领域中被称为例如肽、寡肽和寡聚物的短链与通常在本领域中被称为其中存在许多类型的蛋白质的较长链两者。“多肽”包括例如生物活性片段、大致上同源性多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰多肽、衍生物、类似物、融合蛋白以及其他多肽。多肽包括天然肽、重组肽或其组合。
术语“启动子”是指由细胞的转录机构或引入的合成机构识别，为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的dna序列。
术语“启动子/调控序列”是指为表达可操作地连接于启动子/调控序列的基因产物所需的核酸序列。在一些情况下，这个序列可为核心启动子序列，并且在其他情况下，这个序列也可包括增强子序列和为基因产物的表达所需的其他调控元件。启动子/调控序列可例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
术语“组成型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致所述基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在所述细胞中产生的核苷酸序列。
术语“诱导型”启动子是指当与编码或指定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，导致所述基因产物实质上仅当对应于启动子的诱导剂存在于细胞中时在所述细胞中产生的核苷酸序列。
术语“组织特异性”启动子是指当与编码基因或由基因指定的多核苷酸可操作地连接时，导致基因产物实质上仅当细胞是具有对应于启动子的组织类型的细胞时才在所述细胞中产生的核苷酸序列。
如在scfv的情形下使用的术语“接头”和“柔性多肽接头”是指由氨基酸诸如甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的肽接头，其单独或组合用于将可变重链区和可变轻链区连接在一起。在一个实施方案中，柔性多肽接头是gly/ser接头，并且包含氨基酸序列(gly-gly-gly-ser)n，其中n是等于或大于1的正整数。举例来说，n＝1，n＝2，n＝3，n＝4，n＝5，n＝6，n＝7，n＝8，n＝9以及n＝10。在一个实施方案中，柔性多肽接头包括但不限于(gly4ser)4或(gly4ser)3。在另一实施方案中，接头包括(gly2ser)、(glyser)或(gly3ser)的多个重复。在本发明的范围内也包括wo2012/138475(以引用的方式并入本文)中所述的接头。在一些情况下，接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
如本文所用，5’帽(也被称为rna帽、rna7-甲基鸟苷帽或rnam7g帽)是一种在转录开始之后不久已被添加至真核信使rna的“前端”或5’末端中的经修饰鸟嘌呤核苷酸。5’帽由连接于第一转录核苷酸的末端基团组成。它的存在对由核糖体进行的识别以及保护免遭rna酶至关重要。帽添加与转录联结，并且以共转录方式发生，以致各自影响另一者。在转录开始之后不久，所合成的mrna的5’末端由与rna聚合酶缔合的帽合成复合物结合。这个酶复合物催化为mrna加帽所需的化学反应。合成以多步生物化学反应形式进行。加帽部分可被修饰以调节mrna的功能性诸如它的稳定性或翻译效率。
如本文所用，“在体外转录的rna”是指已在体外合成的rna，优选是mrna。通常，在体外转录的rna由体外转录载体产生。体外转录载体包含用于产生在体外转录的rna的模板。
如本文所用，“poly(a)”是通过多腺苷酸化来连接于mrna的一系列腺苷。在用于短暂表达的构建体的优选实施方案中，polya在50与5000之间，优选大于64，更优选大于100，最优选大于300或400。poly(a)序列可以化学方式或以酶促方式修饰以调节mrna功能性诸如定位、稳定性或翻译效率。
如本文所用，“多腺苷酸化”是指多腺苷酰基部分或它的经修饰变体共价连接于信使rna分子。在真核生物体中，大多数信使rna(mrna)分子在3’末端加以多腺苷酸化。3’poly(a)尾部是通过酶多腺苷酸聚合酶的作用来添加至前mrna中的腺嘌呤核苷酸长序列(经常数百个腺嘌呤核苷酸)。在高等真核生物中，poly(a)尾部添加于含有特定序列即多腺苷酸化信号的转录物上。poly(a)尾部和结合于它的蛋白质有助于保护mrna免遭由核酸外切酶达成的降解。多腺苷酸化对于转录终止、mrna从核输出、以及翻译也是重要的。多腺苷酸化紧接在dna转录成rna之后发生在核中，但另外也可稍后发生在细胞质中。在已终止转录之后，mrna链通过与rna聚合酶缔合的核酸内切酶复合物的作用来裂解。裂解位点的特征通常在于在裂解位点附近存在碱基序列aauaaa。在已裂解mrna之后，腺苷残基在裂解位点处被添加至游离3’末端。
如本文所用，“短暂”是指非整合转基因持续数小时、数天或数周的时期进行表达，其中表达时期短于如果在宿主细胞中整合至基因组中或含于稳定质粒复制子内的基因表达时期。
术语“信号转导路径”是指在信号从细胞的一个部分传递至细胞的另一部分中起作用的多种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接受信号以及跨越细胞的膜传递信号的分子和分子的复合物。
术语“受试者”意图包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物、人)。
术语“大致上纯化”细胞是指基本上不含其他细胞类型的细胞。大致上纯化细胞也指已与它在它的天然存在状态下通常与其相伴的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，大致上纯化细胞的群体是指同质细胞群体。在其他情况下，这个术语仅仅指代已与它们在它们的天然状态下天然地与其相伴的细胞分离的细胞。在一些方面，在体外培养细胞。在其他方面，不在体外培养细胞。
如本文所用的术语“治疗性”意指治疗。治疗作用通过减轻、抑制、缓解或根除疾病状态来获得。
如本文所用的术语“防治”意指预防或保护性治疗疾病或疾病状态。
在本发明的情形下，“pd-1配体”、“pd-l1”和“pd-l2”是指pd-1对其具有结合亲和力的蛋白质。在一些实施方案中，pd-1蛋白或其结合片段(诸如pd-1蛋白的细胞外结构域)的特征在于相较于天然pd-1蛋白，能够以相同(即相等)、增强或降低(即减弱)的亲和力结合人pd-1的天然配体，即人pd-l1(也称为cd274，uniprot登录号q9nzq7)和/或人pd-l2(也称为cd273，uniprot登录号q9bq51)。
在某些方面，本发明的pd-1配体源于各种癌，包括但不限于肺癌、卵巢癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食道癌、神经胶质瘤、尿道上皮癌、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈部癌或间皮瘤。
术语“转染”或“转化”或“转导”是指外源性核酸被转移至或引入宿主细胞中所采用的过程。“经转染”或“经转化”或“经转导”细胞是已用外源性核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代主题细胞和它的子代。
术语“特异性结合”是指抗体、抗体片段或特定配体识别和结合存在于样品中的同源结合配偶体(例如pd-1配体)，但必定地以及大致上不识别或结合所述样品中的其他分子。
范围：在整篇本公开中，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应了解，以范围形式进行的描述仅为方便和简洁起见，并且不应解释为刚性限制本发明的范围。因此，对范围的描述应被视为已明确公开所有可能的子范围以及在那个范围内的个别数值。举例来说，对诸如1至6的范围的描述应视为已明确公开子范围诸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及在那个范围内的个别数值例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。作为另一实例，诸如95-99％同一性的范围包括某物具有95％、96％、97％、98％或99％同一性，并且包括子范围诸如96-99％、96-98％、96-97％、97-99％、97-98％以及98-99％同一性。无论范围的宽度如何，这都适用。
描述
本文提供用于使用t细胞受体(tcr)融合蛋白来治疗疾病诸如癌症的物质组合物和使用方法。如本文所用，“t细胞受体(tcr)融合蛋白”或“tfp”包括源于构成tcr的各种多肽的重组多肽，其通常能够i)结合靶标细胞上的表面抗原例如肿瘤相关抗原，以及ii)通常在共定位于t细胞中或t细胞的表面上时与完整tcr复合物的其他多肽组分相互作用。如本文所提供，相较于嵌合抗原受体，tfp提供实质性益处。术语“嵌合抗原受体”，或替代地，“car”是指包含呈scfv形式的细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源于如下定义的刺激性分子的功能性信号传导结构域的细胞质信号传导结构域(在本文中也称为“细胞内信号传导结构域”)的重组多肽。通常，car的主要细胞内信号传导结构域源于通常发现与tcr复合物缔合的cd3ζ链。cd3ζ信号传导结构域可与一个或多个源于至少一种共刺激性分子诸如4-1bb(即cd137)、cd27和/或cd28的功能性信号传导结构域融合。
t细胞受体(tcr)融合蛋白(tfp)
本发明涵盖编码tfp和pd-1融合蛋白的重组dna构建体，其中在一个方面，所述tfp包含特异性结合一种或多种肿瘤相关抗原(“taa”)例如人taa的抗体片段，其中所述抗体片段的序列与编码tcr亚单位或其部分的核酸序列邻接，并且与编码tcr亚单位或其部分的核酸序列处于同一阅读框中。本文提供的tfp能够与一个或多个内源性tcr亚单位(或替代地，一个或多个外源性tcr亚单位、或内源性tcr亚单位和外源性tcr亚单位的组合)缔合以形成功能性tcr复合物。在另一方面，tfp包含特异性结合igg1或igg4抗体的tc区的cd16片段。
在一个方面，本发明的tfp包含另外被称为抗原结合结构域的靶标特异性结合元件。对部分的选择取决于限定靶标细胞的表面的靶标抗原的类型和数目。举例来说，可选择抗原结合结构域以识别充当靶标细胞上与特定疾病状态相关的细胞表面标志物的靶标抗原。因此，可充当本发明的tfp中的抗原结合结构域的靶标抗原的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生生物感染；自体免疫疾病；以及癌性疾病(例如恶性疾病)相关的那些。
在一个方面，可通过将抗原结合结构域工程改造成特异性结合所需抗原的tfp的方式来使tfp介导的t细胞应答针对目标抗原。
在一个实施方案中，本发明的tfp构建体进一步包含dnax表达盒。
抗原结合结构域可为结合抗原的任何结构域，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体诸如重链可变结构域(vh)、轻链可变结构域(vl)和骆驼科动物源性纳米体的可变结构域(vhh)，以及本领域中已知的用以充当抗原结合结构域的替代性骨架，诸如重组纤维连接蛋白结构域、抗运载蛋白(anticalin)、darpin等。同样，特异性识别和结合靶标抗原的天然或合成配体可用作tfp的抗原结合结构域。在一些情况下，有益的是抗原结合结构域源于tfp将最终在其中使用的同一物种。举例来说，对于在人中使用，可为有益的是tfp的抗原结合结构域包含用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人或人源化残基。
因此，在一个方面，抗原结合结构域包含人源化或人抗体或抗体片段、或鼠抗体或抗体片段。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的轻链互补决定区1(lccdr1)、轻链互补决定区2(lccdr2)和轻链互补决定区3(lccdr3)中的一者或多者(例如全部三者)，和/或本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的重链互补决定区1(hccdr1)、重链互补决定区2(hccdr2)和重链互补决定区3(hccdr3)中的一者或多者(例如全部三者)，例如人源化或人抗taa结合结构域包含一个或多个例如全部三个lccdr和一个或多个例如全部三个hccdr。在一个实施方案中，人源化或人抗taa结合结构域包含本文所述的人源化或人抗taa结合结构域的重链互补决定区1(hccdr1)、重链互补决定区2(hccdr2)和重链互补决定区3(hccdr3)中的一者或多者(例如全部三者)，例如人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域具有两个可变重链区，各自包含本文所述的hccdr1、hccdr2和hccdr3。在一个实施方案中，人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域包含本文所述的人源化或人轻链可变区和/或本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域包含本文所述的人源化重链可变区，例如至少两个本文所述的人源化或人重链可变区。在一个实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域是包含具有本文提供的氨基酸序列的轻链和重链的scfv。在一实施方案中，抗肿瘤相关抗原结合结构域(例如scfv或vhhnb)包含：轻链可变区，其包含本文提供的轻链可变区的氨基酸序列的具有至少1个、2个或3个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；和/或重链可变区，其包含本文提供的重链可变区的氨基酸序列的具有至少1个、2个或3个修饰(例如取代)但不超过30、20或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，或与本文提供的氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。在一个实施方案中，人源化或人抗肿瘤相关抗原结合结构域是scfv，并且包含本文所述的氨基酸序列的轻链可变区通过接头例如本文所述的接头来连接于包含本文所述的氨基酸序列的重链可变区。在一个实施方案中，人源化抗肿瘤相关抗原结合结构域包括(gly4-ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5或6，优选是3或4。scfv的轻链可变区和重链可变区可例如呈任何以下定向：轻链可变区-接头-重链可变区或重链可变区-接头-轻链可变区。在一些情况下，接头序列包括长接头(ll)序列。在一些情况下，长接头序列包含(g4s)n，其中n＝2至4。在一些情况下，接头序列包括短接头(sl)序列。在一些情况下，短接头序列包含(g4s)n，其中n＝1至3。
细胞外结构域
细胞外结构域可源于天然来源或重组来源。当来源是天然的时，结构域可源于任何蛋白质，但特别是膜结合或跨膜蛋白质。在一个方面，细胞外结构域能够与跨膜结构域缔合。特别适用于本发明中的细胞外结构域可包括至少以下各物的细胞外区域：例如t细胞受体的α、β或ζ链、或cd3ε、cd3γ或cd3δ，或在替代性实施方案中，cd28、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。
跨膜结构域
一般来说，tfp序列含有由单一基因组序列编码的细胞外结构域和跨膜结构域。在替代性实施方案中，tfp可被设计来包含对于tfp的细胞外结构域是异源性的跨膜结构域。跨膜结构域可包括一个或多个邻近于跨膜区域的额外氨基酸，例如一个或多个与跨膜区域所源于的蛋白质的细胞外区域相关的氨基酸(例如细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多达15个氨基酸)，和/或一个或多个与跨膜蛋白质所源于的蛋白质的细胞内区域相关的额外氨基酸(例如细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或多达15个氨基酸)。在一个方面，跨膜结构域是与tfp的所使用的一个其他结构域缔合的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域可通过氨基酸取代来选择或修饰以避免所述结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域的结合，例如以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小。在一个方面，跨膜结构域能够与tfpt细胞表面上的另一tfp同二聚化。在一不同方面，可修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列以便使与存在于同一tfp中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用最小。
跨膜结构域可源于天然来源或重组来源。当来源是天然的时，结构域可源于任何膜结合或跨膜蛋白质。在一个方面，每当tfp已结合于靶标时，跨膜结构域能够向细胞内结构域传导信号。特别适用于本发明中的跨膜结构域可包括至少以下各物的跨膜区域：例如t细胞受体的α、β或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。
在一些情况下，跨膜结构域可通过铰链例如来自人蛋白质的铰链来连接于tfp的细胞外区域，例如tfp的抗原结合结构域。举例来说，在一个实施方案中，铰链可为人免疫球蛋白(ig)铰链例如igg4铰链，或cd8a铰链。
接头
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽接头可形成tfp的跨膜结构域与细胞质区域之间的连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。举例来说，在一个方面，接头包含氨基酸序列ggggsggggsggggsle(seqidno:1)。在一些实施方案中，接头由对应于aaaievmypppylggggsggggsggggsle(seqidno:3)的核苷酸序列编码。
细胞质结构域
如果tfp含有cd3γ、δ或ε多肽，那么tfp的细胞质结构域可包括细胞内信号传导结构域；tcrα和tcrβ亚单位通常缺乏信号传导结构域。细胞内信号传导结构域通常负责使其中已引入tfp的免疫细胞的至少一种正常效应物功能活化。术语“效应物功能”是指细胞的专门化功能。t细胞的效应物功能例如可为细胞溶解活性或辅助活性，包括分泌细胞因子。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应物功能信号以及引导细胞执行专门化功能的部分。尽管通常可采用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，所述截短部分可替代完整链使用，只要它转导效应物功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域意图包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应物功能信号的任何截短部分。
用于本发明的tfp中的细胞内信号传导结构域的实例包括在抗原受体啮合之后协力起引发信号转导的作用的t细胞受体(tcr)和共受体的细胞质序列，以及这些序列的具有相同功能性能力的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何重组序列。
已知通过单独tcr产生的信号不足以使原初t细胞完全活化，并且需要二级和/或共刺激性信号。因此，原初t细胞活化可被称为由以下两个不同类别的细胞质信号传导序列介导：通过tcr来引发抗原依赖性初级活化的细胞质信号传导序列(初级细胞内信号传导结构域)和以抗原非依赖性方式起提供二级或共刺激性信号的作用的细胞质信号传导序列(二级细胞质结构域，例如共刺激性结构域)。
初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控tcr复合物的初级活化。以刺激性方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可含有称为免疫受体酪氨酸基活化基序(itam)的信号传导基序。
特别适用于本发明中的含itam初级细胞内信号传导结构域的实例包括cd3ζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b和cd66d的那些。在一个实施方案中，本发明的tfp包含细胞内信号传导结构域，例如cd3-ε的初级信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含经修饰itam结构域，例如相较于天然itam结构域具有改变的(例如增加的或降低的)活性的突变itam结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含含经修饰itam初级细胞内信号传导结构域，例如含优化和/或截短itam初级细胞内信号传导结构域。在一实施方案中，初级信号传导结构域包含一个、两个、三个、四个或更多个itam基序。
tfp的细胞内信号传导结构域可包含单独cd3ζ信号传导结构域，或它可与在本发明的tfp的情形下适用的任何其他所需细胞内信号传导结构域组合。举例来说，tfp的细胞内信号传导结构域可包含cd3ε链部分和共刺激性信号传导结构域。共刺激性信号传导结构域是指tfp的包含共刺激性分子的细胞内结构域的部分。共刺激性分子是除抗原受体或它的配体以外的为淋巴细胞对抗原的高效应答所需的细胞表面分子。所述分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、dap10、dap12、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体等。举例来说，已证明cd27共刺激会在体外增强人tfpt细胞的扩增、效应物功能和存活，并且在体内加强人t细胞持久性和抗肿瘤活性(song等blood.2012；119(3):696-706)。
本发明的tfp的细胞质部分内的细胞内信号传导序列可以随机或指定顺序彼此连接。任选地，例如长度在2与10个氨基酸之间(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)的短寡肽或多肽接头可形成细胞内信号传导序列之间的连接。
在一个实施方案中，甘氨酸-丝氨酸双联体可用作适合接头。在一个实施方案中，单一氨基酸例如丙氨酸、甘氨酸可用作适合接头。
在一个方面，本文所述的tfp表达性细胞可进一步包含第二tfp，例如包括针对细胞表面靶标(例如cd123)的抗原结合结构域的第二tfp。可与本文公开的pd-1tfp组合的包含抗原结合结构域的tfp例如描述于共同待决的国际(pct)申请号pct.us2016/033146中，所述申请以引用的方式并入本文。
在另一方面，本文所述的tfp表达性细胞或第二tfp表达性细胞可进一步表达另一药剂，例如使tfp表达性细胞的活性增强的药剂。举例来说，在一个实施方案中，药剂可为抑制抑制性分子的药剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如pd-1可使tfp表达性细胞发动免疫效应物应答的能力降低。抑制性分子的实例包括pd-1、pd-l1、ctla-4(也是ctla4或cd152)、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的药剂包含第一多肽例如抑制性分子与对细胞提供正性信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。在一个实施方案中，药剂包含第一多肽，例如抑制性分子诸如pd-1、pd-l1、ctla-4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、pd-10、2b4和tgfrβ或任何这些抑制性分子的片段(例如任何这些抑制性分子的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，以及第二多肽，其是本文所述的细胞内信号传导结构域(例如包含共刺激性结构域(例如4-1bb、cd27或cd28，例如如本文所述)和/或初级信号传导结构域(例如本文所述的cd3ζ信号传导结构域))。在一个实施方案中，药剂包含pd-1或其片段(例如pd-1的细胞外结构域的至少一部分)的第一多肽，以及本文所述的细胞内信号传导结构域(例如本文所述的cd28信号传导结构域和/或本文所述的cd3ζ信号传导结构域)的第二多肽。pd-1是cd28受体家族的抑制性成员，所述家族也包括cd28、ctla-4、icos和btla。pd-1在活化的b细胞、t细胞和骨髓细胞上表达(agata等1996int.immunol8:765-75)。已显示pd-1的两个配体pd-l1和pd-l2在结合pd-1后会使t细胞活化下调(freeman等2000jexpmed192:1027-34；latchman等2001natimmunol2:261-8；carter等2002eurjimmunol32:634-43)。pd-l1在人癌症的情况下是丰富的(dong等2003jmolmed81:281-7；blank等2005cancerimmunol.immunother54:307-314；konishi等2004clincancerres10:5094)。免疫抑制可通过抑制pd-1与pd-l1的局部相互作用来逆转。
在一个实施方案中，药剂包含抑制性分子的细胞外结构域(ecd)，例如程序化死亡1蛋白(pd-1)可融合于跨膜结构域以及任选融合于细胞内信号传导结构域诸如41bb和cd3ζ(在本文中也称为pd-1转换体)。在一个实施方案中，pd-1转换体在与本文所述的抗taatfp组合使用时使t细胞的持久性改进。在一个实施方案中，tfp是taatfp，其包含taa的细胞外结构域。
在另一方面，本文公开一种tfp表达性t细胞群体，所述t细胞例如是tfpt细胞。在一些实施方案中，tfp表达性t细胞的群体包含表达不同tfp的细胞的混合物。举例来说，在一个实施方案中，tfpt细胞群体可包括表达pd-1融合蛋白和具有对肿瘤细胞相关抗原具有特异性的scfv的tfp的细胞。作为另一实例，tfp表达性细胞群体可包括表达包含例如如本文所述的pd-1多肽或其片段的融合蛋白的第一细胞，以及表达包括针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域的tfp的第二细胞。
在另一方面，本发明提供一种细胞群体，其中所述群体中的至少一种细胞表达具有本文所述的pd-1配体结合结构域的融合蛋白，至少一种细胞表达抗taatfp，并且第三细胞表达另一药剂，例如使tfp表达性细胞的活性增强的药剂。举例来说，在一个实施方案中，药剂可为抑制抑制性分子的药剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如可使tfp表达性细胞发动免疫效应物应答的能力降低。抑制性分子的实例包括pd-1、pd-l1、ctla-4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。在一个实施方案中，抑制抑制性分子的药剂包含第一多肽例如抑制性分子与对细胞提供正性信号的第二多肽例如本文所述的细胞内信号传导结构域缔合。
在另一实施方案中，tfp构建体的一个或多个结构域(例如细胞外、跨膜和细胞内信号传导结构域)或t细胞基因组(例如一个或多个内源性基因诸如编码pd1的基因)使用基因编辑技术来工程改造、修饰或缺失，所述技术诸如成簇规律间隔短回文重复序列(
本文公开用于产生在体外转录的编码tfp的rna的方法。本发明也包括一种可直接转染至细胞中的编码tfp的rna构建体。一种用于产生供在转染中使用的mrna的方法可涉及对采用特别设计的引物获得的模板的体外转录(ivt)，继之以添加polya，以产生含有3’和5’非翻译序列(“utr”)、5’帽和/或内部核糖体进入位点(ires)、待表达的核酸以及长度通常是50-2000个碱基的polya尾部的构建体。如此产生的rna可高效转染不同种类的细胞。在一个方面，模板包括用于获得tfp的序列。
在一个方面，pd-1融合蛋白和/或抗taatfp由信使rna(mrna)编码。在一个方面，将编码pd-1融合蛋白和/或抗taatfp的mrna引入t细胞中以产生tfpt细胞。在一个实施方案中，在体外转录的rnatfp可以短暂转染的形式引入细胞中。rna通过使用聚合酶链式反应(pcr)产生的模板进行体外转录来产生。使用适当引物和rna聚合酶，来自任何来源的目标dna都可通过pcr直接转变成模板以达成体外mrna合成。dna的来源可为例如基因组dna、质粒dna、噬菌体dna、cdna、合成dna序列或任何其他适当来源的dna。为体外转录所需的模板是本发明的tfp。在一个实施方案中，待用于pcr的dna含有开放阅读框。dna可来自生物体的基因组的天然存在的dna序列。在一个实施方案中，核酸可包括5’和/或3’非翻译区(utr)的一些或全部。核酸可包括外显子和内含子。在一个实施方案中，待用于pcr的dna是人核酸序列。在另一实施方案中，待用于pcr的dna是包括5’和3’utr的人核酸序列。或者，dna可为通常不在天然存在的生物体中表达的人工dna序列。一示例性人工dna序列是含有各基因的连接在一起以形成编码融合蛋白的开放阅读框的各部分的dna序列。连接在一起的各dna部分可来自单一生物体或来自超过一个生物体。
pcr用于产生模板以进行用于转染的mrna的体外转录。用于进行pcr的方法在本领域中是熟知的。用于pcr中的引物被设计来具有与dna的待用作pcr的模板的区域大致上互补的区域。如本文所用的“大致上互补”是指核苷酸序列中大部分或全部引物序列碱基是互补的，或一个或多个碱基是非互补的或不匹配的。大致上互补序列能够在用于pcr的退火条件下与预定dna靶标退火或杂交。引物可被设计来大致上互补于dna模板的任何部分。举例来说，引物可被设计来扩增核酸的通常在细胞中转录的包括5’和3’utr的部分(开放阅读框)。引物也可被设计来扩增核酸的编码特定目标结构域的部分。在一个实施方案中，引物被设计来扩增人cdna的包括5’和3’utr的全部或部分的编码区。适用于pcr的引物可通过本领域中熟知的合成方法来产生。“正向引物”是含有大致上互补于dna模板上在待扩增的dna序列的上游的核苷酸的核苷酸区域的引物。“上游”在本文中用于指代关于编码链在待扩增的dna序列的5位。“反向引物”是含有在待扩增的dna序列的下游大致上互补于双链dna模板的核苷酸区域的引物。“下游”在本文中用于指代关于编码链在待扩增的dna序列的3’位。
适用于pcr的任何dna聚合酶都可用于本文公开的方法中。试剂和聚合酶可从许多来源商购获得。
也可使用能够促进稳定性和/或翻译效率的化学结构。rna优选具有5’和3’utr。在一个实施方案中，5’utr的长度在1与3,000个核苷酸之间。待添加至编码区中的5’和3’utr序列的长度可通过不同方法来改变，包括但不限于设计退火于utr的不同区域的pcr引物。使用这个方法，本领域普通技术人员可修改为在转录rna转染之后实现最优翻译效率所需的5’和3’utr长度。
5’和3’utr可为目标核酸的天然存在的内源性5’和3’utr。或者，不是目标核酸内源性的utr序列可通过将utr序列并入正向引物和反向引物中或通过对模板的任何其他修饰来添加。不是目标核酸内源性的utr序列的使用可适用于改进rna的稳定性和/或翻译效率。举例来说，已知在3’utr序列中富含au的元件可使mrna的稳定性降低。因此，可基于utr的在本领域中是熟知的性质来选择或设计3’utr以使转录rna的稳定性增加。
在一个实施方案中，5’utr可含有内源性核酸的kozak序列。或者，当不是目标核酸内源性的5’utr通过如上所述的pcr来添加时，共有kozak序列可通过添加5’utr序列来重新设计。kozak序列可使一些rna转录物的翻译效率增加，但似乎不为所有rna能够达成高效翻译所需。对于许多mrna，对kozak序列的需要在本领域中是已知的。在其他实施方案中，5’utr可为其rna基因组在细胞中是稳定的rna病毒的5’utr。在其他实施方案中，各种核苷酸类似物可在3’或5’utr中用于阻碍核酸外切酶对mrna的降解。
为使得能够在不需要基因克隆的情况下从dna模板合成rna，转录的启动子应在待转录序列的上游连接于dna模板。当将充当rna聚合酶的启动子的序列添加至正向引物的5’末端时，rna聚合酶启动子变得在待转录的开放阅读框的上游并入pcr产物中。在一个优选实施方案中，启动子是如在本文中其他地方所述的t7聚合酶启动子。其他适用启动子包括但不限于t3和sp6rna聚合酶启动子。t7、t3和sp6启动子的共有核苷酸序列在本领域中是已知的。
在一个实施方案中，mrna具有决定mrna在细胞中的核糖体结合、翻译起始和稳定性的在5’末端上的帽与3’poly(a)尾部两者。在环状dna模板例如质粒dna上，rna聚合酶产生不适于在真核细胞中表达的长多联产物。在3’utr的末端加以线性化的质粒dna的转录产生正常大小mrna，其在真核转染中不是有效的，即使在转录之后它被多腺苷酸化。
在线性dna模板上，噬菌体t7rna聚合酶可使转录物的3’末端延伸超过模板的末个碱基(schenborn和mierendorf,nucacidsres.,13:6223-36(1985)；nacheva和berzal-herranz,eur.j.biochem.,270:1485-65(2003))。
将polya/t链段整合至dna模板中的常规方法是分子克隆。然而，整合至质粒dna中的polya/t序列可导致质粒不稳定性，此是为何从细菌细胞获得的质粒dna模板经常受到缺失和其他畸变高度污染的原因。这使得克隆程序不仅繁重和耗时，而且经常不可靠。那是为何允许在不进行克隆下构建具有polya/t3’链段的dna模板的方法高度合乎需要的原因。
转录dna模板的polya/t节段可通过使用含有polyt尾部诸如100t尾部(大小可为50-5000t)的反向引物来在pcr期间，或通过包括但不限于dna连接或体外重组的任何其他方法来在pcr之后产生。poly(a)尾部也对rna提供稳定性，并且降低它们的降解。通常，poly(a)尾部的长度与转录rna的稳定性正性相关。在一个实施方案中，poly(a)尾部在100与5000个腺苷之间。
rna的poly(a)尾部可在体外转录之后使用poly(a)聚合酶诸如大肠杆菌(e.coli)polya聚合酶(e-pap)加以进一步延伸。在一个实施方案中，使poly(a)尾部的长度从100个核苷酸增加至在300与400个核苷酸之间导致rna的翻译效率增加至约两倍。另外，使不同化学基团连接于3’末端可使mrna稳定性增加。所述连接可含有经修饰/人工核苷酸、适体和其他化合物。举例来说，atp类似物可使用poly(a)聚合酶来并入poly(a)尾部中。atp类似物可进一步增加rna的稳定性。
5’帽也对rna分子提供稳定性。在一优选实施方案中，通过本文公开的方法产生的rna包括5’帽。使用本领域中已知以及本文所述的技术提供5’帽(cougot,等,trendsinbiochem.sci.,29:436-444(2001)；stepinski,等,rna,7:1468-95(2001)；elango,等,biochim.biophys.res.commun.,330:958-966(2005))。
通过本文公开的方法产生的rna也可含有内部核糖体进入位点(ires)序列。ires序列可为引发帽非依赖性核糖体结合于mrna以及有助于翻译起始的任何病毒、染色体或人工设计序列。可包括适于细胞电穿孔的任何溶质，其可含有有助于细胞可渗透性和活力的因子，诸如糖、肽、脂质、蛋白质、抗氧化剂和表面活性剂。
rna可使用许多不同方法中的任一者来引入靶标细胞中，所述方法例如可商购获得的方法，其包括但不限于电穿孔(amaxanucleofector-ii(amaxabiosystems,cologne,germany))、ecm830(btx)(harvardinstruments,boston,mass.)或genepulserii(biorad,denver,colo.)、multiporator(eppendort,hamburggermany)，使用脂质体转染进行的阳离子脂质体介导的转染、聚合物囊封、肽介导的转染或基因枪粒子递送系统诸如“基因枪”(参见例如nishikawa,等humgenether.,12(8):861-70(2001))。
编码tfp或pd-1融合蛋白的核酸构建体
本发明也提供编码一种或多种本文所述的tfp构建体和/或pd-1融合蛋白的核酸分子。在一个方面，核酸分子以信使rna转录物形式提供。在一个方面，核酸分子以dna构建体形式提供。
编码所需分子的核酸序列可使用本领域中已知的重组方法获得，诸如像使用标准技术，通过筛选由表达基因的细胞获得的文库，通过从已知包括基因的载体获得所述基因，或通过直接从含有基因的细胞和组织分离。或者，目标基因可合成产生，而非克隆。
本发明也提供其中插入本发明的dna的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是适于实现长期基因转移的工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合以及它在子细胞中的繁殖。慢病毒载体具有超过源于致癌性逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体的附加优势，因为它们可转导非增殖细胞诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的附加优势。
在另一实施方案中，包含编码本发明的所需tfp或转换体的核酸的载体是腺病毒载体(a5/35)。在另一实施方案中，编码tfp的核酸的表达可使用转座子诸如睡美人转座子、crisper、cas9和锌指核酸酶(参见june等2009naturereviewsimmunol.9.10:704-716，其以引用的方式并入本文)来实现。
本发明的表达构建体也可用于使用标准基因递送方案进行核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法在本领域中是已知的(参见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，其以引用的方式整体并入本文)。在另一实施方案中，本发明提供一种基因疗法载体。
核酸可被克隆至许多类型的载体中。举例来说，核酸可被克隆至包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。受到特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体形式对细胞提供。病毒载体技术在本领域中是熟知的，并且例如描述于sambrook等,2012,molecularcloning:alaboratorymanual,第1-4卷,coldspringharborpress,ny以及其他病毒学和分子生物学手册中。适用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。一般来说，适合载体含有在至少一种生物体中具有功能性的复制起点、启动子序列、适宜限制核酸内切酶位点以及一种或多种可选择标记(例如wo01/96584；wo01/29058；以及美国专利号6,326,193)。
已开发许多基于病毒的系统用于将基因转移至哺乳动物细胞中。举例来说，逆转录病毒提供适宜用于基因递送系统的平台。所选基因可使用本领域中已知的技术来插入载体中，并且包装在逆转录病毒粒子中。可接着分离重组病毒，并且在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方案中，使用慢病毒载体。
额外启动子元件例如增强子会调控转录起始的频率。通常，这些元件位于起始位点的上游30-110bp的区域中，但已显示许多启动子也含有在起始位点的下游的功能性元件。启动子元件之间的间隙经常是灵活的，以致当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保持。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降之前，启动子元件之间的间隙可增加至相隔50bp。视启动子而定，似乎个别元件可合作地或独立地起使转录活化的作用。
能够在哺乳动物t细胞中表达tfp转基因的启动子的一实例是ef1a启动子。天然ef1a启动子驱动延伸因子-1复合物的α亚单位的表达，所述α亚单位负责将氨基酰基trna酶促递送至核糖体中。ef1a启动子已广泛用于哺乳动物表达质粒中，并且已显示有效驱动从克隆至慢病毒载体中的转基因进行tfp表达(参见例如milone等,mol.ther.17(8):1453-1464(2009))。启动子的另一实例是立即早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与其操作性地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强力组成型启动子序列。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)、人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔病毒(epstein-barrvirus)立即早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子以及人基因启动子诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、延伸因子-1a启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本发明不应限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被涵盖为本发明的一部分。使用诱导型启动子会提供能够在需要它所操作性地连接的多核苷酸序列的表达时开启所述表达，或在不需要表达时关闭表达的分子开关。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质素启动子、孕酮启动子和四环素调控启动子。
为评估tfp多肽或其部分的表达，待引入细胞中的表达载体也可含有可选择标记基因或报道体基因或两者以有助于从设法通过病毒载体来转染或感染的细胞群体鉴定和选择表达性细胞。在其他方面，可选择标记可携带在单独dna片块上，并且用于共转染程序中。可选择标记与报道体基因两者均可用适当调控序列侧接以使得能够在宿主细胞中进行表达。适用可选择标记包括例如抗生素抗性基因诸如neo等。
报道体基因用于鉴定潜在经转染细胞以及评估调控序列的功能性。一般来说，报道体基因是不存在于接受生物体或组织中或不由接受生物体或组织表达，并且编码其表达通过某一可易于检测性质例如酶活性来显现的多肽的基因。在dna已引入接受细胞中之后，在某一适合时间测定报道体基因的表达。适合报道体基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、分泌碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如ui-tei等,2000febsletters479:79-82)。适合表达系统是熟知的，并且可使用已知技术制备或商购获得。一般来说，具有显示报道体基因的最高表达水平的最小5’侧接区域的构建体被鉴定为启动子。所述启动子区域可连接于报道体基因，并且用于评估各试剂的调节启动子驱动的转录的能力。
向细胞中引入和表达基因的方法在本领域中是已知的。在表达载体的情形下，载体可易于通过本领域中的任何方法来引入宿主细胞例如哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞中。举例来说，表达载体可通过物理、化学或生物手段来转移至宿主细胞中。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的(参见例如sambrook等,2012,molecularcloning:alaboratorymanual,第1-4卷,coldspringharborpress,ny)。一种用于将多核苷酸引入宿主细胞中的方法是磷酸钙转染。
用于将目标多核苷酸引入宿主细胞中的生物方法包括使用dna和rna载体。病毒载体，并且尤其是逆转录病毒载体，已变为用于将基因插入哺乳动物例如人细胞中的最广泛使用方法。其他病毒载体可源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒i、腺病毒和腺相关病毒等(参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞中的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠粒和基于脂质的系统，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。在体外以及在体内用作递送载体的一示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。其他现有技术核酸靶向递送方法是可用的，诸如用靶向纳米粒子或其他适合亚微米大小递送系统递送多核苷酸。
在其中利用非病毒递送系统的情况下，一示例性递送载体是脂质体。脂质制剂的使用被预期用于将核酸引入宿主细胞中(体外、离体或体内)。在另一方面，核酸可与脂质缔合。与脂质缔合的核酸可囊封在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体与寡核苷酸两者缔合的连接分子来连接于脂质体，圈闭在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，以混悬液形式含于脂质中，用胶束容纳或与胶束复合，或以其他方式与脂质缔合。脂质、脂质/dna或脂质/表达载体相关组合物不限于处于溶液中的任何特定结构。举例来说，它们可以双层结构、胶束、或“崩塌”结构形式存在。它们也可简单地散布在溶液中，有可能形成在大小或形状方面不均一的聚集物。脂质是可为天然存在或合成脂质的脂肪物质。举例来说，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪小滴以及含有长链脂族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇、胺、氨基醇和醛的化合物类别。
适于使用的脂质可从商业来源获得。举例来说，二肉豆蔻基磷脂酰胆碱(“dmpc”)可从sigma,st.louis,mo.获得；磷酸二鲸蜡酯(“dcp”)可从k&klaboratories(plainview,n.y.)获得；胆固醇(“choi”)可从calbiochem-behring获得；二肉豆蔻基磷脂酰甘油(“dmpg”)和其他脂质可从avantipolarlipids,inc.(birmingham,ala.)获得。脂质于氯仿或氯仿/甲醇中的储备溶液可储存在约-20℃下。氯仿用作唯一溶剂，因为它比甲醇更易于蒸发。“脂质体”是通用术语，其涵盖通过产生封闭脂质双层或聚集物来形成的多种单层和多层脂质载体。脂质体可被表征为具有囊泡结构，所述囊泡结构具有磷脂双层膜和内部水性介质。多层脂质体具有由水性介质分隔的多个脂质层。它们在磷脂混悬于过量水溶液中时自发形成。脂质组分经受自身重排，随后形成闭合结构，并且将水和溶解溶质圈闭在脂质双层之间(ghosh等,1991glycobiology5:505-10)。然而，也涵盖在溶液中具有与正常囊泡结构不同的结构的组合物。举例来说，脂质可采用胶束结构或仅以脂质分子的非均一聚集物形式存在。也涵盖转脂胺-核酸复合物。
无论用于将外源性核酸引入宿主细胞中或另外使细胞暴露于本发明的抑制剂的方法如何，为确认在宿主细胞中存在重组dna序列，可进行多种测定。所述测定包括例如为本领域技术人员所熟知的“分子生物学”测定，诸如southern和northern印迹、rt-pcr和pcr；“生物化学”测定，诸如检测特定肽的存在或不存在，例如通过免疫手段(elisa和western印迹)或通过本文所述的用以鉴定属于本发明的范围内的试剂的测定。
本发明进一步提供一种包含编码tfp的核酸分子的载体。在一个方面，tfp载体可直接转导至细胞例如t细胞中。在一个方面，载体是克隆载体或表达载体，例如包括但不限于一种或多种质粒(例如表达质粒、克隆载体、小环、小型载体、双微染色体)、逆转录病毒和慢病毒载体构建体的载体。在一个方面，载体能够在哺乳动物t细胞中表达tfp构建体。在一个方面，哺乳动物t细胞是人t细胞。
t细胞的来源
在扩增和遗传修饰之前，从受试者获得t细胞来源。术语“受试者”意图包括其中可引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。t细胞可从许多来源获得，包括外周血液单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些方面，可使用许多本领域中可用的t细胞系。在本发明的某些方面，t细胞可从使用为熟练技术人员所知的许多技术诸如
在一个方面，通过使红血细胞溶解以及使单核细胞消减，例如通过percolltm梯度离心或通过逆流离心淘析，从外周血液淋巴细胞分离t细胞。特定子群体的t细胞诸如cd3+、cd28+、cd4+、cd8+、cd45ra+和cd45ro+t细胞可通过正性或负性选择技术来进一步分离。举例来说，在一个方面，t细胞通过与cd3抗体/cd28抗体(例如3x28)缀合珠粒一起孵育一段足以对所需t细胞进行正性选择的时期来分离，所述珠粒诸如
通过负性选择来富集t细胞群体可用针对为负性选择细胞所特有的表面标志物的抗体的组合完成。一种方法是通过使用针对存在于负性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物的负性磁性免疫粘附或流式细胞计量术进行细胞分选和/或选择。举例来说，为通过负性选择来富集cd4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对cd14、cd20、cd11b、cd16、hla-dr和cd8的抗体。在某些方面，可合乎需要的是富集或正性选择通常表达cd4+、cd25+、cd62lhi、gitr+和foxp3+的调控性t细胞。或者，在某些方面，t调控性细胞通过c25抗体缀合珠粒或其他类似选择方法来消减。
在一个实施方案中，可选择表达ifn-γ、tnf-α、il-17a、il-2、il-3、il-4、gm-csf、il-10、il-13、il-12、粒酶b和穿孔素或其他适当分子例如其他细胞因子中的一者或多者的t细胞群体。用于筛选细胞表达的方法可例如通过pct公布号：wo2013/126712中所述的方法来确定。
对于通过正性或负性选择来分离所需细胞群体，可改变细胞和表面(例如粒子诸如珠粒)的浓度。在某些方面，可合乎需要的是显著降低珠粒和细胞混合在一起所处的体积(例如增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠粒的最大接触。举例来说，在一个方面，使用20亿个细胞/毫升的浓度。在一个方面，使用10亿个细胞/毫升的浓度。在另一方面，使用大于10000万个细胞/毫升。在另一方面，使用1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000万个细胞/毫升的细胞浓度。在另一个方面，使用7500、8000、8500、9000、9500或10000万个细胞/毫升的细胞浓度。在其他方面，可使用12500或15000万个细胞/毫升的浓度。使用高浓度可导致细胞产率、细胞活化和细胞扩增增加。此外，使用高细胞浓度允许更高效捕集可微弱表达目标靶标抗原的细胞诸如cd28阴性t细胞，或来自其中有许多肿瘤细胞存在的样品(例如白血病性血液、肿瘤组织等)的细胞。所述细胞群体可具有治疗价值，并且将需要获得。举例来说，使用高浓度的细胞允许更高效选择通常具有较微弱cd28表达的cd8+t细胞。
在一相关方面，可合乎需要的是使用较低浓度的细胞。通过显著稀释t细胞和表面(例如粒子诸如珠粒)的混合物，粒子与细胞之间的相互作用得以最小化。这会选择表达待结合于粒子的高量所需抗原的细胞。举例来说，cd4+t细胞表达较高水平的cd28，并且在稀释浓度的情况下比cd8+t细胞更高效被捕集。在一个方面，所用细胞浓度是5x106/ml。在其他方面，所用浓度可为约1x105/ml至1x106/ml，以及介于之间的任何整数值。在其他方面，细胞可在2-10℃下或在室温下在旋转器上在不同速度下孵育不同时长。
用于刺激的t细胞也可在洗涤步骤之后加以冷冻。在不希望受理论束缚下，冷冻和后续解冻步骤通过移除细胞群体中的粒细胞以及在一定程度上移除单核细胞而提供更均一产物。在移除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可将细胞混悬于冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数在本领域中是已知的，并且将在这个情形下适用，但一种方法涉及使用含有20％二甲亚砜(dmso)和8％人血清白蛋白的pbs，或含有10％右旋糖酐40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％dmso、或31.25％plasma-
在本发明的情形下也涵盖在可能需要如本文所述的经扩增细胞所处的时间之前在某一时期从受试者收集血液样品或单独采集产物。因此，待扩增的细胞来源可在所需任何时间点收集，并且分离和冷冻所需细胞诸如t细胞以稍后在针对将受益于t细胞疗法的许多疾病或疾患诸如本文所述的那些的t细胞疗法中使用。在一个方面，血液样品或单独采集物取自大体上健康受试者。在某些方面，血液样品或单独采集物取自处于显现疾病的风险下，但尚未显现疾病的大体上健康受试者，并且分离和冷冻目标细胞以供稍后使用。在某些方面，可扩增、冷冻t细胞，并且在稍后时间使用。在某些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后不久但在任何治疗之前从患者收集样品。在另一方面，在许多相关治疗模态之前从来自受试者的血液样品或单独采集物分离细胞，所述治疗模态包括但不限于用诸如以下的药剂治疗：那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂诸如环孢灵(cyclosporine)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和他克莫司(tacrolimus)、抗体或其他免疫净化剂诸如阿来珠单抗(alemtuzumab)、抗cd3抗体、环磷酰胺(cyclophosphamide)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素(cyclosporin)、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇、罗米地辛(romidepsin)和照射。
在本发明的另一方面，t细胞在使受试者保留有功能性t细胞的治疗之后直接从患者获得。就此而言，已观察到在某些癌症治疗特别是用损害免疫系统的药物治疗之后，在治疗之后不久在患者将通常从治疗恢复所处的时期期间，所得t细胞的就它们离体扩增的能力来说的品质可为最优的或改进的。同样，在使用本文所述的方法进行离体操作之后，这些细胞就达成增强的移入和体内扩增来说可处于优选状态。因此，在本发明的情形内涵盖在这个恢复期期间收集血细胞，包括t细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在某些方面，动员(例如用gm-csf动员)和调节方案可用于在受试者中创建有利于特定细胞类型的再群体化、再循环、再生和/或扩增所处的条件，尤其是在疗法之后确定时间窗口期间。说明性细胞类型包括t细胞、b细胞、树突细胞和免疫系统的其他细胞。
t细胞的活化和扩增
t细胞可通常使用如例如于美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和7,572,631中所述的方法来活化和扩增。
通常，本发明的t细胞可通过与具有与其连接的刺激cd3/tcr复合物相关信号的试剂和刺激t细胞的表面上的共刺激性分子的配体的表面接触来扩增。特定来说，t细胞群体可如本文所述加以刺激，诸如通过与固定在表面上的抗cd3抗体或其抗原结合片段或抗cd2抗体接触，或通过与和钙离子载体联合的蛋白质激酶c活化剂(例如苔藓抑素(bryostatin))接触。对于共刺激t细胞的表面上的辅助分子，使用结合所述辅助分子的配体。举例来说，可使t细胞群体与抗cd3抗体和抗cd28抗体在适于刺激t细胞的增殖的条件下接触。为刺激cd4+t细胞或cd8+t细胞的增殖，使用抗cd3抗体和抗cd28抗体。抗cd28抗体的实例包括9.3、b-t3、xr-cd28(diaclone,besancon,france)，其可如本领域中通常已知的其他方法加以使用(berg等,transplantproc.30(8):3975-3977,1998；haanen等,j.exp.med.190(9):13191328,1999；garland等,j.immunol.meth.227(1-2):53-63,1999)。
已暴露了不同刺激时间的t细胞可展现不同特征。举例来说，典型血液或单独采集外周血液单核细胞产物具有大于细胞毒性或抑制t细胞群体(tc，cd8+)的辅助t细胞群体(th，cd4+)。通过刺激cd3和cd28受体来离体扩增t细胞会产生以下t细胞群体：其在约第8-9天之前主要由th细胞组成，而在约第8-9天之后，所述t细胞群体包含日益更大tc细胞群体。因此，视治疗目的而定，用主要包含th细胞的t细胞群体对受试者输注可为有利的。类似地，如果已分离抗原特异性tc细胞子组，那么可有益的是在更大程度上扩增这个子组。
此外，除cd4和cd8标志物之外，其他表型标志物在细胞扩增过程期间也显著地但在很大程度上可重现地变化。因此，所述可重现性使得能够调适活化t细胞产物以达成特定目的。
一旦构建抗taatfp和/或pd-1融合蛋白，各种测定即可用于评估分子的活性，诸如但不限于在抗原刺激之后使t细胞扩增的能力，在不存在再刺激下维持t细胞扩增的能力，以及在适当体外和动物模型中的抗癌活性。用以评估抗taatfp和/或pd-1融合蛋白的作用的测定在以下进一步详细描述。
对原代t细胞中tfp表达的western印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。极其简要来说，使表达tfp的t细胞(cd4+t细胞和cd8+t细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，随后进行溶解和在还原性条件下进行sds-page。使用针对tcr链的抗体，通过western印迹来检测tfp。相同t细胞子组用于在非还原性条件下进行sds-page分析以容许评估共价二聚体形成。
在抗原刺激之后tfp+t细胞的体外扩增可通过流式细胞计量术来测量。举例来说，cd4+t细胞和cd8+t细胞的混合物用αcd3/αcd28和apc刺激，随后用在待分析的启动子的控制下表达gfp的慢病毒载体转导。示例性启动子包括cmvie基因、ef-1α、泛素c、或磷酸甘油激酶(pgk)启动子。在培养的第6天，通过流式细胞计量术来评估cd4+和/或cd8+t细胞子组中的gfp荧光(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。或者，cd4+t细胞和cd8+t细胞的混合物在第0天用αcd3/αcd28涂布的磁性珠粒刺激，并且在第1天使用利用2a核糖体跳跃序列的表达tfp以及egfp的双顺反子慢病毒载体来用tfp转导。在洗涤之后，将培养物用pd-1+k562细胞(k562-pd-1)、野生型k562细胞(k562野生型)或表达hcd32和4-1bbl的k562细胞在抗cd3抗体和抗cd28抗体存在下(k562-bbl-3/28)再刺激。每隔一天在100iu/ml下将外源性il-2添加至培养物中。使用基于珠粒的计数，通过流式细胞计量术来对gfp+t细胞计数(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。
也可测量在不存在再刺激下的持续tfp+t细胞扩增(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。简要来说，在第0天用αcd3/αcd28涂布的磁性珠粒刺激，以及在第1天用指示的tfp转导之后，在培养的第8天使用coultermultisizertmiii粒子计数器测量平均t细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量tfp-t活性。举例来说，在使用人taa特异性tfp+t细胞和/或pd-1融合蛋白+t细胞(例如pd1cd28+t细胞)来治疗免疫缺陷小鼠的癌症的情况下的异种移植物模型(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。极其简要来说，在建立癌症之后，使小鼠关于治疗组加以随机化。不同数目的经工程改造t细胞在1:1比率下共注射至携带癌症的nod/scid/γ-/-小鼠中。评估在t细胞注射之后在各种时间来自小鼠的脾dna中各载体的拷贝数。在每周间隔下评估动物的癌症。测量用αtaa-ζtfp+t细胞或模拟转导的t细胞注射的小鼠中的外周血液taa+和/或pd-1+癌细胞计数。使用对数秩检验比较各组的存活曲线。此外，也可分析在t细胞注射之后4周nod/scid/γ-/-小鼠中的绝对外周血液cd4+和cd8+t细胞计数。小鼠用癌细胞注射，并且3周后用通过编码连接于egfp的tfp的双顺反子慢病毒载体加以工程改造来表达tfp的t细胞注射。通过在注射之前与模拟转导的细胞混合来使t细胞标准化成45-50％输入gfp+t细胞，并且通过流式细胞计量术加以确认。在1周间隔下评估动物的癌症。使用对数秩检验比较tfp+t细胞组的存活曲线。
可评估剂量依赖性tfp治疗响应(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。举例来说，在第21天用tfpt细胞、相等数目的模拟转导t细胞或不用t细胞注射的小鼠中，在建立癌症之后35-70天获得外周血液。对来自各组的小鼠随机放血以测定外周血液taa+和/或pd-1+癌细胞计数，接着在第35和49天杀死小鼠。其余动物在第57和70天加以评估。
先前已例如在milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009)处描述对细胞增殖和细胞因子产生的评估。简要来说，在微量滴定板中通过以下方式来对tfp介导的增殖进行评估：使经洗涤t细胞与表达pd-1或cd32和cd137(kt32-bbl)的细胞混合以达成最终t细胞:表达pd-1的细胞比率2:1。表达pd-1的细胞在使用之前用γ射线加以照射。抗cd3(克隆okt3)单克隆抗体和抗cd28(克隆9.3)单克隆抗体与kt32-bbl细胞一起添加至培养物中以充当刺激t细胞增殖的阳性对照，因为这些信号支持长期cd8+t细胞离体扩增。如由制造商所述，使用countbrighttm荧光珠粒(invitrogen)和流式细胞计量术来对培养物中的t细胞计数。使用用egfp-2a连接的tfp表达性慢病毒载体工程改造的t细胞，通过gfp表达来鉴定tfp+t细胞。对于不表达gfp的tfp+t细胞，tfp+t细胞用生物素化重组pd-1蛋白和二级亲和素-pe缀合物检测。t细胞上的cd4+和cd8+表达也同时用特定单克隆抗体(bdbiosciences)检测。根据制造商说明书，使用人th1/th2细胞因子细胞测量珠粒阵列试剂盒(bdbiosciences)对在再刺激之后24小时收集的上清液进行细胞因子测量。使用
细胞毒性可通过标准51cr释放测定来评估(参见例如milone等,moleculartherapy17(8):1453-1464(2009))。简要来说，靶标细胞在37℃下在频繁搅拌下用51cr(以nacro4形式，newenglandnuclear)装载2小时，于完全rpmi培养基中洗涤两次，并且涂铺至微量滴定板中。使效应t细胞与靶标细胞在不同效应细胞:靶标细胞比率(e:t)下在孔中于完全rpmi中混合。也制备仅含有培养基(自发性释放，sr)或1％
细胞毒性也可通过乳糖脱氢酶(ldh)测定来测量。ldh比色测定试剂盒可从例如thermoscientifictm或piercetm获得。试剂盒可与不同细胞类型一起用于测量由化合物介导的细胞毒性以及测定细胞介导的细胞毒性。乳酸脱氢酶(ldh)是一种存在于许多不同细胞类型中的胞质酶。质膜损害会将ldh释放至细胞培养基中。培养基中的细胞外ldh可通过偶联酶促反应来定量，其中ldh通过nad+还原成nadh来催化乳酸转化成丙酮酸。黄递酶(diaphorase)接着使用nadh来使四唑嗡盐(int)还原成可在490nm下测量的红色甲臜产物。甲臜形成水平与释放至培养基中的ldh的数量成正比，所述数量指示细胞毒性。使所培养细胞与效应细胞(例如本文公开的经工程改造t细胞)一起孵育以诱导细胞毒性，并且随后使ldh释放。将释放至培养基中的ldh转移至新板中，并且与试剂盒中提供的反应混合物混合。在30分钟室温孵育之后，通过添加终止溶液来终止反应。使用板读取分光光度计来测量在490nm和680nm下的吸光度以测定ldh活性。
细胞毒性也可通过facs和rtca来测量，如以下实施例中所述。
成像技术可用于评估携带肿瘤的动物模型中tfp的特定迁移和增殖。所述测定已例如描述于barrett等,humangenetherapy22:1575-1586(2011)中。简要来说，nod/scid/γc-/-(nsg)小鼠用癌细胞进行静脉内注射，随后在7天后用在用tfp构建体进行电穿孔之后4小时的t细胞注射。t细胞用慢病毒构建体稳定转染以表达萤火虫荧光素酶，并且对小鼠的生物发光进行成像。或者，单次注射tfp+t细胞在癌症异种移植物模型中的治疗功效和特异性可如下加以测量：nsg小鼠用被转导来稳定表达萤火虫荧光素酶的癌细胞注射，随后在7天后单次尾部静脉注射用pd-1tfp电穿孔的t细胞。在注射后在各种时间点对动物成像。举例来说，可产生在第5天(在治疗之前2天)以及第8天(在tfp+pbl后24小时)代表性小鼠中萤火虫荧光素酶阳性癌症的光子密度热图。
其他测定，包括本文实施例章节中所述的那些以及本领域中已知的那些，也可用于评估本发明的pd-1tfp构建体。
组合疗法
本文所述的tfp表达性细胞和/或pd-1融合蛋白表达性细胞(例如pd1cd28表达性细胞)可与其他已知药剂和疗法组合使用。如本文所用的“组合”施用意指在受试者受病症折磨的过程期间向受试者递送两种(或更多种)不同治疗，例如在受试者已被诊断有病症之后以及在病症已被治愈或消除或治疗已由于其他原因而停止之前递送两种或更多种治疗。在一些实施方案中，一种治疗的递送在开始第二治疗的递送时仍然在发生，以致在施用方面存在重叠。这有时在本文中称为“同时”或“并行递送”。在其他实施方案中，一种治疗的递送在开始另一治疗的递送之前结束。在任一情况的一些实施方案中，治疗由于组合施用而更加有效。举例来说，相比于将如果在不存在第一治疗下施用第二治疗所见，第二治疗更加有效，例如以较少第二治疗得见相等作用，或第二治疗在更大程度上减轻症状，或类似情况以第一治疗得见。在一些实施方案中，递送是如此以致症状减轻或与病症相关的其他参数的降低相比于将以在不存在另一治疗下递送一种治疗所观察是更大的。两种治疗的作用可为部分累加的，完全累加的，或大于累加的。递送可为如此以致递送的第一治疗的作用在递送第二治疗时仍然可检测。
在一些实施方案中，至少一种额外治疗剂包括如上所述的pd-1融合蛋白，例如pd1cd28融合蛋白。在一个实施方案中，pd-1融合蛋白与tfp可在同一t细胞群体中表达，因此同时向患者施用。在一些实施方案中，pd-1融合蛋白在第二t细胞群体中表达。包含tfp的t细胞群体和包含pd-1融合蛋白的t细胞群体可同时或依序加以施用。在一些实施方案中，同时施用基于细胞的治疗剂(例如人t细胞治疗剂)的组合。在一些实施方案中，依序施用基于细胞的治疗剂(例如人t细胞治疗剂)和非基于细胞的治疗剂(例如小分子化学治疗剂或抗体治疗剂)的组合。
在一些实施方案中，“至少一种额外治疗剂”包括靶向第二肿瘤相关抗原的第二tfp表达性细胞群体。也提供表达多种结合相同或不同靶标抗原或同一靶标抗原上的相同或不同表位的tfp的t细胞。也提供t细胞群体，其中第一子组的t细胞表达第一tfp，并且第二子组的t细胞表达第二tfp。在一个实施方案中，额外治疗剂是表达il-12的tfp表达性细胞。
本文所述的tfp表达性细胞和至少一种额外治疗剂可于同一组合物中或于单独组合物中同时施用或依序施用。对于依序施用，本文所述的tfp表达性细胞可首先施用，并且额外药剂可其次施用，或施用顺序可加以逆转。
在其他方面，本文所述的tfp表达性细胞可与以下治疗组合用于治疗方案中：手术、化学疗法、放射、免疫抑制剂诸如环孢菌素、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和他克莫司(fk506)或其他免疫净化剂诸如阿来珠单抗、抗cd3抗体或其他抗体疗法、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、罗米地辛(fr901228)、细胞因子和照射。本文所述的tfp表达性细胞也可与诸如描述于izumoto等2008jneurosurg108:963-971中的肽疫苗组合使用。
在一些实施方案中，可向受试者施用减少或改善与施用tfp表达性细胞相关的副作用的药剂。与施用tfp表达性细胞相关的副作用包括但不限于细胞因子释放综合征(crs)和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(hlh)，也被称为巨噬细胞活化综合征(mas)。crs的症状包括高热、恶心、短暂低血压、缺氧等。因此，本文所述的方法可包括向受试者施用本文所述的tfp表达性细胞，以及进一步施用用以管理由用tfp表达性细胞治疗所致的可溶性因子水平升高的药剂。在一个实施方案中，受试者中升高的可溶性因子是ifn-γ、tnfα、il-2和il-6中的一者或多者。因此，被施用来处理这个副作用的药剂可为中和这些可溶性因子中的一者或多者的药剂。所述药剂包括但不限于类固醇、tnfα的抑制剂和il-6的抑制剂。tnfα抑制剂的一实例是依那西普(etanercept)。il-6抑制剂的一实例是托珠单抗(tocilizumab，toc)。
在一些实施方案中，可向受试者施用增强tfp表达性细胞的活性的药剂。举例来说，在一个实施方案中，药剂可为抑制抑制性分子的药剂。在一些实施方案中，抑制性分子例如程序化死亡1蛋白(pd-1)可使tfp表达性细胞发动免疫效应物应答的能力降低。抑制性分子的实例包括但不限于pd-1、pd-l1、ctla-4、tim3、lag3、vista、btla、tigit、lair1、cd160、2b4和tgfrβ。
例如通过在dna、rna或蛋白质水平上进行抑制来抑制抑制性分子可使tfp表达性细胞性能最优化。在各实施方案中，抑制性核酸，例如抑制性核酸，例如dsrna，例如sirna或shrna，可用于抑制tfp表达性细胞中抑制性分子的表达。在一实施方案中，抑制剂是shrna。在一实施方案中，tfp表达性细胞内的抑制性分子被抑制。在这些实施方案中，抑制抑制性分子的表达的dsrna分子连接于编码tfp的组分例如全部组分的核酸。在一个实施方案中，抑制性信号的抑制剂可为例如结合抑制性分子的抗体或抗体片段。举例来说，药剂可为结合pd-1、pd-l1、pd-l2或ctla-4的抗体或抗体片段(例如易普利单抗(ipilimumab)(也被称为mdx-010和mdx-101，并且以yervoytm销售)；bristol-myerssquibb；曲美木单抗(tremelimumab)(可从pfizer获得的igg2单克隆抗体，先前称为替西木单抗(ticilimumab)、cp-675,206))。在一实施方案中，药剂是结合tim3的抗体或抗体片段。在一实施方案中，药剂是结合lag3的抗体或抗体片段。
在一些实施方案中，使tfp表达性细胞的活性增强的药剂可为例如包含第一结构域和第二结构域的融合蛋白，其中所述第一结构域是抑制性分子或其片段，并且所述第二结构域是与正性信号相关的多肽，例如包含如本文所述的细胞内信号传导结构域的多肽。在一些实施方案中，与正性信号相关的多肽可包括cd28、cd27、icos的共刺激性结构域，例如cd28、cd27和/或icos的细胞内信号传导结构域，和/或例如cd3ζ的初级信号传导结构域，例如如本文所述。在一个实施方案中，融合蛋白由表达tfp的同一细胞表达。在另一实施方案中，融合蛋白由例如不表达抗taatfp的t细胞的细胞表达。
药物组合物
本发明的药物组合物可包含如本文所述的tfp表达性细胞例如多种tfp表达性细胞与pd-1融合蛋白(例如pd1cd28转换体)表达性细胞例如多种pd-1融合蛋白表达性细胞以及一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合。所述组合物可包含缓冲剂，诸如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露糖醇；蛋白质；多肽或氨基酸，诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，诸如edta或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。在一个方面，本发明组合物被配制以进行静脉内施用。
本发明的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性的因素决定，但适当剂量可通过临床试验来确定。
在一个实施方案中，药物组合物大致上不含例如不存在可检测水平的例如选自由以下组成的组的污染物：内毒素、支原体、有复制能力的慢病毒(rcl)、p24、vsv-g核酸、hivgag、残余cd3抗体/cd28抗体涂布珠粒、小鼠抗体、汇合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌。在一个实施方案中，细菌是至少一种选自由以下组成的组的细菌：粪产碱菌(alcaligenesfaecalis)、白色念珠菌(candidaalbicans)、大肠杆菌(escherichiacoli)、流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)、脑膜炎奈瑟氏菌(neisseriameningitides)、绿脓假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、链球菌肺炎(streptococcuspneumonia)和a组化脓性链球菌(streptococcuspyogenesgroupa)。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，本发明组合物的待施用的精确量可由医师在考虑在年龄、重量、肿瘤尺寸、感染或转移程度、以及患者(受试者)状况方面的个体差异的情况下确定。可通常陈述的是包含本文所述的t细胞的药物组合物可在以下剂量下施用：每kg体重104至109个细胞，在一些情况下每kg体重105至106个细胞，包括那些范围内的所有整数值。t细胞组合物也可在这些剂量下施用多次。细胞可通过使用免疫疗法中通常已知的输注技术来施用(参见例如rosenberg等,neweng.j.ofmed.319:1676,1988)。
在某些方面，可需要向受试者施用活化的t细胞，接着随后再抽血(或进行单独采集)，根据本发明使由此获得的t细胞活化，并且用这些活化和扩增的t细胞对患者进行再输注。这个过程可每隔几周进行多次。在某些方面，可使来自10cc至400cc的血液抽取物的t细胞活化。在某些方面，使来自20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取物的t细胞活化。
主题组合物的施用可以任何适宜方式进行，包括通过气雾剂吸入、注射、摄取、输液、植入或移植。本文所述的组合物可以经动脉、皮下、真皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射、或腹膜内方式向患者施用。在一个方面，本发明的t细胞组合物通过真皮内或皮下注射来向患者施用。在一个方面，本发明的t细胞组合物通过静脉内注射来施用。t细胞的组合物可直接向肿瘤、淋巴结或感染部位中注射。
在一特定示例性方面，受试者可经受白细胞单采术，其中离体收集、富集或消减白细胞以选择和/或分离目标细胞例如t细胞。这些t细胞分离物可通过本领域中已知的方法来扩增，并且处理以使一种或多种本发明的tfp构建体可被引入，由此产生本发明的tfp表达性t细胞。有需要的受试者可随后经受用高剂量化学疗法继之以外周血液干细胞移植进行的标准治疗。在某些方面，在移植之后或与移植并行，受试者接受本发明的经扩增tfpt细胞的输注。在另一方面，在手术之前或之后施用经扩增细胞。
以上治疗的待向患者施用的剂量将随所治疗的疾患的确切性质和治疗的接受者而变化。可根据本领域接受的规范对用于向人施用的剂量进行缩放。对于成人患者，阿来珠单抗的剂量例如将通常在1至约100mg的范围内，通常每日施用持续1天与30天之间的时期。优选每日剂量是每天1至10mg，但在一些情况下可使用每天多达40mg的较大剂量(描述于美国专利号6,120,766中)。
在一个实施方案中，例如使用体外转录将抗taatfp和/或pd-1融合蛋白引入t细胞中，并且受试者(例如人)接受初始施用本发明的tfpt细胞，以及一次或多次后续施用本发明的tfpt细胞，其中所述一次或多次后续施用在先前施用之后小于15天例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天施用。在一个实施方案中，每周向受试者(例如人)施用本发明的tfpt细胞的超过一次施用，例如每周施用本发明的tfpt细胞的2、3或4次施用。在一个实施方案中，受试者(例如人受试者)接受每周超过一次tfpt细胞施用(例如每周2、3或4次施用)(在本文中也称为一个循环)，继之以一周不施用tfpt细胞，接着向受试者施用tfpt细胞的一次或多次额外施用(例如每周超过一次tfpt细胞施用)。在另一实施方案中，受试者(例如人受试者)接受超过一个循环的tfpt细胞，并且各循环之间的时间小于10、9、8、7、6、5、4或3天。在一个实施方案中，每隔一天施用tfpt细胞，每周进行3次施用。在一个实施方案中，持续至少2、3、4、5、6、7、8周或更多周施用本发明的tfpt细胞。
在一个方面，使用慢病毒病毒载体诸如慢病毒产生pd-1tfpt细胞。以那个方式产生的tfpt细胞将具有稳定tfp表达。
在一个方面，在转导之后，tfpt细胞持续4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天短暂表达tfp载体。tfp的短暂表达可通过递送rnatfp载体来实现。在一个方面，tfprna通过电穿孔来转导至t细胞中。
可在使用短暂表达性tfpt细胞(特别是用携带鼠scfv的tfpt细胞)治疗的患者中出现的潜在问题是在多次治疗之后的过敏性反应。
在不受这个理论束缚下，据信这种过敏应答可能由患者产生体液抗tfp应答即具有抗ige同种型的抗tfp抗体引起。据认为当有10至14天抗原暴露中断时，患者的抗体产生性细胞经受从igg同种型(不导致过敏性反应)向ige同种型的类别转换。
如果患者处于在短暂tfp疗法(诸如通过rna转导产生的那些)的过程期间产生抗tfp抗体应答的高风险下，那么tfpt细胞输注中断不应持续超过10至14天。
实施例
本发明通过参照以下实验实施例来进一步详述。除非另外规定，否则这些实施例仅出于说明的目的提供，并且不意图具有限制性。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教义而变得明显的任何和所有变化形式。在不进一步描述的情况下，据信本领域普通技术人员可使用先前描述和以下说明性实施例制备和利用本发明化合物以及实施要求保护的方法。以下工作实施例明确指出本发明的各个方面，并且不应解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
材料和方法
实施例1：细胞系和细胞培养条件
除非另外指示，否则所有细胞系都购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。适用于本文公开的方法中的细胞系的代表性实例在以下列出。下述肿瘤细胞系在不存在ifnγ暴露下表达低水平的pd-l1。因此，pd-l1也可通过慢病毒来转导至这些细胞系中以产生具有pd-l1的高度稳定表达的形式。可将肿瘤相关抗原或对照抗原转导至这些细胞系中以测试本文公开的融合蛋白；非限制性实例是间皮素(msln)、bcma、cd19、cd20、cd22、前列腺特异性癌症抗原(psca)和ror-1。可用作本文公开的组合疗法的靶标的任何表面表达肿瘤相关抗原都可进行替代。
在一些实施方案中，可使用人间皮瘤细胞系。非限制性实例是msto-211和ovcar3。如果间皮素在细胞上的天然表达较低，那么也可用人间皮素转导这些细胞系以使间皮素的表面表达增加。萤火虫荧光素酶通过慢病毒来转导至株系中以产生msto-211ffluc和ovcar3ffluc。
nalm6是一种具有cd19的高表达的b细胞白血病前体细胞系(德国dsmz细胞保藏中心，目录号：acc128)。叩头虫红(clickbeetlered，“cbg”)或萤火虫荧光素酶通过慢病毒来转导至nalm6中以产生nalm6-cbg或nalm-6ffluc。
k562是一种慢性骨髓源性白血病细胞系(atcc；目录号：ccl-243)。在一个实施方案中，cd19通过慢病毒来转导至k562中以产生k562-cd19。在适当时，可转导其他靶标。
可使用其他示例性肿瘤细胞系，诸如raji(
在补充以10％热失活fcs、100u/ml青霉素、100mg/ml硫酸链霉素和1％l-谷氨酰胺的rpmi1640培养基(gibco，目录号11875-085)中培养肿瘤细胞和t细胞。
产生融合蛋白：t细胞受体融合蛋白(tfp)
如本文公开的供与pd1cd28转换受体组合使用的tfp的产生例如描述于共同待决的国际非临时申请序列号pct/us2016/033146(2016年5月18日提交)以及共同待决的临时申请序列号62/405,551(2016年10月7日提交)、62/357,185(2016年6月30日提交)、62/370,189(2016年8月2日提交)、62/425,697(2016年11月23日提交)、62/425,407(2016年11月22日提交)、62/425,535(2016年11月22日提交)和62/425,884(2016年11月23日提交)中，所述申请各自以引用的方式并入本文。
实施例2：产生融合蛋白：pd1cd28转换受体
pd1cd28转换受体通过使源于pd-1-cdna(origene)的截短细胞外pd-1(氨基酸1-155)与cd28的跨膜和细胞质结构域(氨基酸141-220)融合来构建。也构建pd1cd28转换受体的突变形式(pd1cd28m)，其中cd28信号传导被消除，如liu等,(2016)cancerres.76(6)中所述以及如共同待决的于2016年6月20日提交的国际非临时申请序列号pct/ep2016/064195中进一步所述，所述文献和申请各自以引用的方式并入本文。
实施例3：慢病毒产生
根据以下程序或其微小变化形式制备编码适当构建体的慢病毒。将5x106个hek-293ft细胞接种至100mm培养皿中，并且使其过夜达到70-90％汇合。于0.5ml无血清的dmem或opti-
实施例4：pbmc分离
从全血或白细胞层制备外周血液单核细胞(pbmc)。将全血收集在10ml肝素真空采血管中，并且立刻处理或在4℃下储存过夜。使约10ml抗凝全血与无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲液在50ml锥形离心管中混合以获得20ml的总体积(pbs，ph7.4，无ca2+/mg2+)。接着将20ml这个血液/pbs混合物温和叠加于15mlficoll-pa
白细胞层例如购自researchbloodcomponents(boston,ma)。
实施例5：t细胞活化
从全血或白细胞层制备的pbmc用抗人cd28和cd3抗体缀合的磁性珠粒刺激24小时，随后进行病毒转导。新鲜分离的pbmc于无huil-2的car-t培养基(aimv-albumax(bsa)(lifetechnologies)，具有5％ab血清和1.25μg/ml两性霉素b(geminibioproducts)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中洗涤一次，随后在1x106个细胞/毫升的最终浓度下再混悬于具有300iu/ml人il-2(来自1000x储备物；invitrogen)的car-t培养基中。如果pbmc先前已加以冷冻，那么使它们解冻并在1x107个细胞/毫升下在10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素存在下在1x106个细胞/毫升的浓度下再混悬于9ml预升温(37℃)dmem培养基(lifetechnologies)中，随后如上所述于car-t培养基中洗涤一次，在1x106个细胞/毫升下再混悬于car-t培养基中，并且添加il-2。
在活化之前，抗人cd28和cd3抗体缀合的磁性珠粒(可从例如invitrogen,lifetechnologies获得)用1ml无菌1xpbs(ph7.4)洗涤三次，使用磁性架来从溶液分离珠粒，随后再混悬于具有300iu/ml人il-2的car-t培养基中，以达到4x107个珠粒/毫升的最终浓度。接着通过将25μl(1x106个珠粒)珠粒转移至1mlpbmc中来使pbmc和珠粒在1:1珠粒与细胞比率下混合。接着将所需数目的等分试样分配至12孔低附着或非处理细胞培养板的单孔中，并且在37℃下在5％co2下孵育24小时，随后进行病毒转导。
实施例6：t细胞转导/转染和扩增
在pbmc的活化之后，在37℃、5％co2下孵育细胞48小时。使慢病毒在冰上解冻，并且将5x106个慢病毒连同每ml培养基2μltransplustm(alstem)(最终稀释度1:500)一起添加至具有1x106个细胞的各孔中。将细胞再孵育24小时，随后重复添加病毒。或者，使慢病毒在冰上解冻，并且在5μg/ml聚凝胺(sigma)存在下在5或50moi下添加相应病毒。在室温下在100g下对细胞进行旋转接种100分钟。接着使细胞在持续存在300iu/ml人il-2下生长6-14天的时期(总孵育时间取决于所需最终tfpt细胞数目)。每2-3天分析细胞浓度，其中在那时添加培养基以维持细胞混悬液处于1x106个细胞/毫升下。
在一些情况下，活化的pbmc用在体外转录的(ivt)mrna电穿孔。在一个实施方案中，在300iu/ml重组人il-2(r&dsystems)存在下用
实施例7：通过细胞染色来检测tfp表达
在慢病毒转导或mrna电穿孔之后，通过流式细胞计量术来确认tfp和pd1cd28转换受体的表达。tfp向t细胞受体中的并入可通过使用适当抗靶标抗体来检测(例如cd19特异性tfp的表达可用抗cd19scfv抗体或抗小鼠fab血清检测)；对pd1cd28转换受体的检测可使用用以检测人pd-1的抗pd-1抗体或pd-l1-fc来检测。将t细胞于3ml染色缓冲液(pbs，4％bsa)中洗涤三次，并且在每孔1x106个细胞下再混悬于pbs中。为排除死细胞，使细胞与li
在一个实施方案中，用抗bcmatfp和pd1cd28转换受体转导t细胞。在另一实施方案中，用抗mslntfp和pd1cd28转换受体转导t细胞。具有针对其他靶标抗原的抗体的tfp可与pd1cd28转换受体成功组合。靶标抗原的非限制性实例包括但不限于。示例性结果将显示对关于cd8(cd8抗体apccy7)、靶标抗原例如bcma(
实施例8：通过流式细胞计量术进行的细胞毒性测定
用荧光染料二乙酸羧基荧光素丁二酰亚胺酯(cfse)标记pd-1配体(即pd-l1和/或pd-l2)和靶标肿瘤抗原(例如bcma、cd19、msln等)阳性或阴性靶标细胞。使这些靶标细胞与未转导、用单独pd1cd28转换受体转导、用对肿瘤相关抗原具有特异性的tfp(例如对cd19具有特异性的tfp)转导、用突变pd1cd28转换受体转导、或用tfp以及联合用pd1cd28转换受体或突变pd1cd28m转换受体转导的效应t细胞混合。在指示的孵育时期之后，通过流式细胞计量术来测定各效应细胞/靶标细胞培养的死体经cfse标记靶标细胞对活体经cfse标记靶标细胞以及阴性对照靶标细胞的百分比。相对于含有单独靶标细胞的孔计算各t细胞阳性靶标细胞培养中的靶标细胞的存活百分比。
效应t细胞的细胞毒性活性通过在共同孵育效应细胞和靶标细胞之后，使用流式细胞计量术比较在无或有效应t细胞的情况下靶标细胞中存活靶标细胞的数目来测量。在细胞具有pd-1转换受体与抗肿瘤抗原tfp组合的情况下进行的实验中，靶标细胞是肿瘤抗原阳性细胞，而用作阴性对照的细胞是肿瘤抗原阴性细胞或pd-l1/pd-l2阴性细胞。
在一个实施方案中，靶标细胞在细胞表面上表达cd19，并且组合疗法包含抗cd19tfp和pd1cd28转换受体。一示例性方法如下。将靶标细胞洗涤一次，并且在1×106个细胞/毫升下再混悬于pbs中。将荧光染料二乙酸羧基荧光素丁二酰亚胺酯(cfse)
将用tfp构建体(例如抗cd19tfp构建体)和pd1cd28融合构建体转导(即共同表达两种构建体)的效应t细胞以及作为阴性对照的非转导t细胞洗涤，并且在2x106个细胞/毫升或1x106个细胞/毫升下混悬于细胞毒性培养基中。将50μl效应t细胞混悬液(等效于100,000或50,000个细胞)添加至经涂铺靶标细胞例如nalm6和nalm6-pdl1细胞中来以100μl的总体积分别达到效应物与靶标比率10:1或5:1。接着混合培养物，短暂离心，并且在37℃和5％co2下孵育8小时。在这个孵育之后立刻，如由制造商所推荐将7aad(7-氨基放线菌素d)(biolegend)添加至所培养细胞中，并且用bdlsrfortessatmx-20(bdbiosciences)进行流式细胞计量术。使用
表达肿瘤抗原(例如cd19)的靶标细胞的存活百分比通过以下方式来计算：用具有效应t细胞和靶标细胞的样品中活靶标细胞(cfse+7-aad-)的数目除以具有单独靶标细胞的样品中活(cfse+7-aad-)细胞的数目。将效应细胞的细胞毒性计算为靶标细胞的杀灭百分比＝100％-细胞的存活百分比。
当相较于非转导或用非肿瘤抗原特异性tfp对照转导的t细胞时，用pd1cd28转换受体和肿瘤抗原特异性tfp构建体(例如抗cd19tfp构建体)转导的t细胞将显示针对肿瘤抗原表达性细胞(例如cd19表达性nalm6细胞和/或nalm6-pdl1细胞)的细胞毒性。
用编码对cd19具有特异性的tfp和pd1cd28转换受体的mrna电穿孔的t细胞将显示针对例如cd19表达性nalm6-pdl1细胞的最高细胞毒性。将观察到对cd19阳性nalm6细胞的较低量杀灭，并且采用对照或本文公开的组合疗法，不可观察到对cd19阴性nalm6细胞(pd-l1阴性细胞)的显著杀灭，对cd19/pd-l1(或pd-l2)表达性细胞的cd19特异性杀灭可例如通过用pd-1-cd3ε或pd-1-cd3γtfp转导的t细胞来观察到。
实施例9：通过实时细胞毒性测定来测定细胞毒性的方法
如实施例1中所证明，用抗肿瘤抗原tfp+pd1cd28转换受体转导的t细胞也可在实时细胞毒性测定(rtca)形式中显示优越细胞毒性。rtca测定实时测量专门化96孔板的各孔中粘附靶标细胞单层的电阻抗，并且将最终读出数据呈现为称为细胞指数的值。细胞指数的变化指示由于由共同孵育的t细胞效应物对靶标细胞的杀灭而使靶标细胞单层破坏。因此，可将效应t细胞的细胞毒性评估为具有靶标细胞与效应t细胞两者的孔的细胞指数相较于具有单独靶标细胞的孔的细胞指数的变化。
在dmem、10％fbs、1％抗生素抗霉菌素(lifetechnologies)中培养粘附靶标细胞。为准备rtca，将50μl例如dmem培养基添加至e板(aceabiosciences,inc，目录号：jl-10-156010-1a)的适当孔中。接着将板放置至rtcamp仪器(aceabiosciences,inc.)中，并且如制造商手册中所述将适当板布局和测定时程输入rtca2.0软件中。每15分钟进行基线测量，持续100次测量。接着将处于100μl体积中的1x104个靶标细胞添加至各测定孔中，并且使细胞沉降15分钟。使板返回至读取器中，并且再继续读取。
次日，将效应t细胞洗涤，并且再混悬于细胞毒性培养基(无酚红rpmi1640(invitrogen)外加5％ab血清(geminibioproducts；100-318))中。接着将板从仪器移除，并且将混悬于细胞毒性培养基(无酚红rpmi1640+5％ab血清)中的效应t细胞在100,000个细胞或50,000个细胞下添加至各孔中以分别达到效应物与靶标比率10:1或5:1。接着将板放回至仪器中。每2分钟进行测量，持续100次测量，接着每15分钟进行测量，持续1,000次测量。
在一些实施方案中，在靶标细胞的表面上表达的肿瘤抗原是例如msln。在rtca测定中，对pd-l1和msln表达性细胞的杀灭可通过用pd1cd28转换受体+抗mslntfp转导的t细胞来观察，如由相对于单独细胞或与用对照car构建体转导的t细胞共同孵育的细胞，在添加效应细胞之后细胞指数的时间依赖性降低所证明。举例来说，在添加用抗mslncd3εtfp转导的t细胞的4小时内，对msln阳性pd-l1表达性靶标细胞的杀灭可为基本上完全的。用采用包含其他cd3和tcr构建体的许多tfp构建体转导的t细胞可观察到少许杀灭或无杀灭。相比于采用用单独tfp或转换受体转导的t细胞，在经抗mslntfp+pd1cd28转换受体转导t细胞的情况下，针对msln/pd-l1表达性靶标细胞的细胞毒性将更大。针对msln阳性pd-l1阴性细胞的细胞毒性将较低，因为在那个情况下所述细胞毒性取决于单独tfp。
抗mslntfp构建体通过将由编码接头：ggggsggggsggggsle(seqidno:1)的dna序列连接于cd3εdna片段的mslnscfvdna片段在xbai和ecori位点处克隆至p526载体(来自sbi)中来工程改造。
用于rtca的靶标细胞是例如msln阳性/pd-l1阳性细胞，并且以下对照细胞群体：msln-/pd-l1+细胞、msln+/pd-l1-细胞和msln-/pd-l1-细胞全都用作阴性对照。在具有10％fbs和1％抗生素抗霉菌素(lifetechnologies)的dmem中培养粘附靶标细胞。
接着测定指示细胞毒性的标准化细胞指数。活化的pbmc未经处理，未经转导，或用空载体转导，用单独抗mslntfp转导，用单独pd1cd28转换受体转导，或用抗mslntfp+pd1cd28转换受体的组合转导。靶标细胞呈pd-l1阳性，其中pd-l1阴性细胞用作阴性对照。
相较于经单一转导细胞或阴性对照，靶标msln阳性细胞由经组合转导t细胞高效杀灭。相比之下，msln阴性细胞不由任何构建体高效杀灭。
实施例10：人tfpt细胞在体内实体肿瘤异种移植物小鼠模型中的治疗
可使用肿瘤抗原表达性人癌细胞系，在携带皮下实体肿瘤或散播性或皮下血液肿瘤的免疫损害小鼠模型中测试用本文公开的组合疗法进行的治疗的功效。响应于用人tfpt细胞和pd-1融合受体进行的治疗的肿瘤收缩可通过用测径规测量肿瘤尺寸，或通过追踪由ffluc表达性肿瘤细胞发出的荧光素酶蛋白(ffluc)信号的强度来评估。
可使原代人实体肿瘤细胞在免疫损害小鼠中生长，而不必在体外培养它们。示例性实体癌细胞包括诸如提供于癌症基因组图谱(thecancergenomeatlas，tcga)和/或broad癌细胞系百科全书(broadcancercelllineencyclopedia，ccle，参见barretina等,nature483:603(2012))中的实体肿瘤细胞系。示例性实体癌细胞包括从肺癌、卵巢癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食道癌、神经胶质瘤、尿道上皮癌、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金氏淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈部癌或间皮瘤分离的原代肿瘤细胞。这些小鼠可用于测试表达经工程改造t细胞受体和pd1cd28转换受体的t细胞在人肿瘤异种移植物模型中的功效。在皮下植入或注射1x105-1x107个原代细胞(于ec基质物质中的经胶原酶处理大块肿瘤混悬液)或肿瘤片段(于ec基质物质中的原代肿瘤片段)之后，使肿瘤生长至200-500mm3，随后启动治疗。
实施例11：由elisa测定的il-2和ifn-γ分泌
与识别携带同源抗原的细胞相关的效应t细胞活化和增殖的另一量度是效应物细胞因子诸如白介素-2(il-2)和干扰素-γ(ifn-γ)的产生。
如产品插页中所述进行针对人il-2(目录号eh2il2，thermos
或者，使用人细胞因子磁性缓冲试剂试剂盒(invitrogen，lhb0001m)以及人il-2磁性珠粒试剂盒(invitrogen，lhc0021m)和人ifn-γ磁性珠粒试剂盒(invitrogen，lhc4031m)进行2路测定。简要来说，将25μl人il-2和ifn-γ抗体珠粒添加至96孔板的各孔中，并且使用以下指导方针加以洗涤：200μl1x洗涤溶液洗涤2次，将板置于与磁性96孔板分离器(invitrogen，a14179)接触，让珠粒沉降1分钟以及将液体倾析。接着，将50μl孵育缓冲液与100μl复原标准物一起一式两份或与50μl样品(来自细胞毒性测定的上清液)和50μl测定稀释剂一起一式三份添加至板的各孔中，以获得150μl的总体积。采用具有3mm轨道半径的轨道式振荡器，使样品在室温下在黑暗中在600rpm下混合2小时。遵循相同洗涤指导方针将板洗涤，并且将100μl人il-2和ifn-γ生物素化检测抗体添加至各孔中。采用具有3mm轨道半径的轨道式振荡器，使样品在室温下在黑暗中在600rpm下混合1小时。遵循相同洗涤指导方针将板洗涤，并且将100μl链霉亲和素-r-藻红素添加至各孔中。采用具有3mm轨道半径的轨道式振荡器，使样品在室温下在黑暗中在600rpm下混合30分钟。使用相同洗涤指导方针将板洗涤3次，并且在将液体倾析之后，将样品再混悬于150μl1x洗涤溶液中。采用具有3mm轨道半径的轨道式振荡器，使样品在600rpm下混合3分钟，并且在4℃下储存过夜。之后，遵循相同洗涤指导方针将板洗涤，并且将样品再混悬于150μl1x洗涤溶液中。
使用magpix系统(luminex)和xponent软件对板进行读取。使用milliplexanalyst软件进行数据分析，所述软件提供标准曲线和细胞因子浓度。
相对于非转导t细胞或对照经单一转导t细胞(即用单独tfp或转换受体转导的t细胞)，当与内源性表达肿瘤抗原的细胞或经肿瘤抗原转导细胞共培养时，用肿瘤抗原特异性tfp和pd1cd28转换受体转导的t细胞可产生更高水平的il-2与ifn-γ两者。相比之下，与肿瘤抗原阴性细胞或非转导细胞共培养可导致少许细胞因子或无细胞因子从经tfp转导t细胞释放。
肿瘤抗原抗体-cd3ε和肿瘤抗原抗体-cd3γ可产生tfp构建体的最高il-2和ifn-γ水平。然而，由用抗肿瘤抗原-cd3εtfp或抗肿瘤抗原-cd3γtfp(例如抗cd19-cd3εtfp或抗cd19-cd3γtfp)和pd1cd28转换受体转导的t细胞达成的细胞因子产生在杀灭pd-l1阴性靶标细胞的能力方面可类似于仅表达tfp的t细胞。
活化的pbmc用50moi慢病毒连续两天转导，并且加以扩增。在转导后第8天，在外加5％ab血清(geminibioproducts；100-318)的细胞毒性培养基(无酚红rpmi1640(invitrogen))中在1:1e:t比率(各细胞类型0.2x106)下建立pbmc与靶标细胞(表达pd-l1和抗肿瘤抗原诸如cd19的k562细胞“k562-19-pd-l1”、或pd-l1阴性k562-19、或cd19阴性k562-pd-l1)的共培养。过度表达不同肿瘤相关抗原例如bcma的pd-l1表达性k562细胞可用作阴性对照。在24小时之后，如上所述通过elisa来分析细胞的ifn-γ和il-2表达。在一个实例中，通过与k562-19-d-l1共培养，表达pd1cd28融合蛋白和cd19tfp构建体的t细胞被活化，如由ifn-γ产生与il-2产生两者所证实，从而进一步证明pd-1表达性细胞能够特异性活化t细胞。
实施例12：体内小鼠功效研究
为评估用抗肿瘤抗原tfp例如抗mslntfp转导的效应t细胞在体内实现抗肿瘤应答的能力，将用1)抗mslntfp+pd1cd28转换受体，2)单独抗mslntfp，3)单独pd1cd28转换受体转导，或4)非转导的效应t细胞继承性地转移至先前已用pd-l1+或pd-l1-人癌细胞系接种的nod/scid/il-2rγ-/-(nsg-jax)小鼠中。
在开始研究之前至少6周龄的雌性nod/scid/il-2rγ-/-(nsg-jax)小鼠从thejacksonlaboratory获得，并且在实验使用之前驯化3天。用于接种的人癌细胞系以对数期培养加以维持，随后收集以及用台盼蓝(trypanblue)计数以测定活细胞计数。在肿瘤激发的当天，将细胞在300g下离心5分钟，并且在0.5-1x106个细胞/100μl下再混悬于预升温无菌pbs中。制备用于继承性转移的非转导、用单独tfp转导、用单独pd1cd28转换体转导、或用tfp与pd1cd28转换受体两者共转导的t细胞。在研究的第0天，每个实验组10个动物用0.5-1x106个癌细胞在静脉内激发。3天后，将5x106个效应t细胞的群体于100μl无菌pbs中在静脉内转移至各动物中。每日记录对动物的详细临床观察直至安乐死。每周对所有动物进行体重测量直至死亡或安乐死。在继承性转移测试物品和对照物品之后35天使所有动物安乐死。在研究期间看起来濒死的任何动物都根据研究指导者的判断在与兽医商议的情况下加以安乐死。
预期结果的概述显示于表1中。相对于非转导t细胞或经单一转导t细胞，继承性转移用抗肿瘤抗原tfp构建体+pd1cd28转换受体的组合转导的t细胞可使携带pd-l1+或pd-l2+肿瘤的小鼠的存活期延长，并且可指示包含经tfp转导t细胞和pd1cd28转换受体的组合疗法能够在这些小鼠模型中介导靶标细胞杀灭，伴有存活期相应增加。总之，这些数据将指示包含pd1cd28转换受体和抗肿瘤抗原tfp的组合疗法代表一种用于工程改造嵌合受体的替代性平台，其在体外与在体内均显示优越抗原特异性杀灭。
表1.由继承性转移经共转导msln+t细胞达成的体内肿瘤生长抑制
实施例13：包含pd-1转换受体和tfp的组合疗法
在一些实施方案中，组合疗法包含额外抗体。在一个实施方案中，pd-1转换受体与包含cd16多肽的tfp和针对靶标细胞的表面上的肿瘤抗原的igg1抗体组合施用。举例来说，用cd16-cd3εtfp+pd1cd28转换受体转导t细胞。接着向受试者施用这些t细胞，并且所述受试者接受igg抗肿瘤抗体例如利妥昔单抗(rituximab)。在一些实施方案中，组合疗法中的tfp是双特异性tfp。所述tfp包含连接于单一tcr亚单位的两种串联表达的scfv多肽，或各自表达在不同亚单位上。举例来说，tfp可包含抗cd19scfv-cd3ε构建体和抗bcmascfv-cd3γ构建体。可使用其他抗原结合对，诸如包含针对cd20、cd22、ror1、msln、bcma、cd19等的抗体的那些。双特异性tfp与如上所述的pd-1转换受体组合施用。
尽管本文已显示和描述本发明的优选实施方案，但将对本领域技术人员明显的是所述实施方案仅通过举例方式来提供。在不脱离本发明下，众多改变、变化和替代现将为本领域技术人员所想到。应了解本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案可用于实施本发明。意图以下权利要求限定本发明的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等效物由所述权利要求涵盖。
附录a：序列概述