能够以HLA限制性方式结合HLA-A2/TYRD的抗体及其用途的制作方法
技术领域及
背景技术：
在一些实施例中，本发明涉及能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd的抗体及其用途。
cd8+细胞毒性t细胞会识别被肿瘤和病毒感染的细胞，所述cd8+细胞毒性t细胞响应于此而被活化以消除这些细胞。为了被活化，克隆型t细胞受体(tcr)需要接触由膜表面主要组织相容性复合物(mhc)分子呈递的特定肽抗原。经历了恶性转化或病毒感染的细胞在其mhci类分子上呈递衍生自肿瘤相关抗原或病毒蛋白的肽。因此，疾病特异性的mhc–肽复合物是免疫治疗方法的理想靶标。一种此类方法将tcr对mhc–肽复合物的独特的精细特异性但固有的低亲和力转变成对肿瘤或病毒表位具有tcr样特异性的高亲和力可溶性抗体分子。这些被称为tcr样抗体的抗体正在作为一类新型的免疫治疗剂被开发，所述免疫治疗剂可以靶向肿瘤和病毒感染的细胞并介导其特异性杀伤作用。除了其治疗功能外，tcr样抗体还作为癌症和传染病的诊断试剂被开发，并充当研究mhci类抗原呈递的有价值的研究工具。
黑色素瘤是衍生自黑色素细胞或与黑色素细胞相关的痣细胞的侵袭性、频繁转移性的肿瘤。即使当黑色素瘤明显定位在皮肤上时，也有多至30％的患者发生全身转移。黑色素瘤的经典治疗方式包括手术、放疗和化疗。在过去的十年中，免疫疗法和基因疗法已成为治疗黑色素瘤的新的且有希望的方法。
wo03/068201公开了产生针对肿瘤抗原(包括酪氨酸酶)的tcr样抗体的方法。
wo2008/120202公开了针对hla-酪氨酸酶369-377复合物的tcr样抗体。
其他背景技术包括：
wo2016/199141
wo2016/199140
技术实现要素：
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种包含抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域包含n-c排序的cdr序列：
cdr1重链(hc)seqidno:8tsgmgvs
cdr2hcseqidno:9hiywdddkrynpslks
cdr3hcseqidno:10kdygssfyamhy
cdr1轻链(lc)seqidno:5kasqdihnyia
cdr2lcseqidno:6ytstlqp
cdr3lcseqidno:7lqydnlwt
其中所述抗体的重链的可变区如seqidno:4所示，并且所述抗体能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd369–377。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种包含抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域包含n-c排序的cdr序列：
cdr1重链(hc)seqidno:8tsgmgvs
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cdr1轻链(lc)seqidno:5kasqdihnyia
cdr2lcseqidno:6ytstlqp
cdr3lcseqidno:7lqydnlwt
其中所述抗体的重链的可变区如seqidno:4所示，所述抗体的轻链的可变区如seqidno:2所示，并且所述抗体能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd369–377。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是igg。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是嵌合抗体。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是抗体片段。
根据本发明的一些实施例，所述抗体选自由以下组成的组：fab、f(ab')2、fv、scfv、dsfv和单结构域分子。
根据本发明的一些实施例，所述抗体的重链如seqidno:21或27所示。
根据本发明的一些实施例，所述抗体的轻链如seqidno:2、19或25所示。
根据本发明的一些实施例，所述抗体包含治疗部分。
根据本发明的一些实施例，所述治疗部分选自由以下组成的组：细胞毒性部分、毒性部分、细胞因子部分和药物。
根据本发明的一些实施例，所述治疗部分包含细胞。
根据本发明的一些实施例，所述细胞选自由以下组成的组：αβt细胞、γδt细胞、nk、cik、nkt、巨噬细胞和b细胞。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是双特异性抗体。
根据本发明的一些实施例，所述双特异性抗体包含抗cd3或抗cd16。
根据本发明的一些实施例，所述抗cd3包含scfv。
根据本发明的一些实施例，能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd369–377的抗体的轻链包含seqidno:2。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码抗体的核酸序列。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种表达载体，其包含可操作地连接至顺式作用调控元件的多核苷酸。
根据本发明的一些实施例，所述表达载体是病毒载体。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种包含多核苷酸或表达载体的细胞。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种药物组合物，其包含如权利要求所述的抗体、载体或细胞。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种治疗黑色素瘤或胶质母细胞瘤的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的抗体、载体或细胞，从而治疗黑色素瘤或胶质母细胞瘤。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了用于治疗黑色素瘤或胶质母细胞瘤的抗体、载体或细胞。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。虽然与本文中所描述的方法和材料相似或相当的方法和材料可以被用于实践或测试本发明的实施方案，但下文仍描述示例性方法和/或材料。在起冲突的情况下，以包括定义的专利说明书为准。另外，所述材料、方法以及实施例仅是说明性的，而非必然旨在进行限制。
附图说明
本发明的一些实施例仅通过举例的方式并参考附图而在本文中描述。现在具体参考附图，应强调，所示的细节是通过举例的方式，并且是为了说明性地讨论本发明的实施例的目的。在这方面，使用附图进行的描述使可以如何实践本发明的实施例对于本领域技术人员变得显而易见。
在附图中：
图1显示了人源化d11(hd11-5)tcrl抗体重链和轻链的核苷酸和氨基酸序列(包含seqidno1-4和24-27)。
图2显示了通过spr测定的d11和hd11-5tcrl抗体对hla-a2/tyrd369-377复合物的表观结合亲和力测定。
图3显示了生物素化的d11和hd11-5tcrl抗体对hla-a2+/tyr抗原阳性或阴性细胞的结合特异性。
图4显示了生物素化的d11和hd11-5tcrl抗体对hla-a2+原代正常细胞的结合。
图5a至图5b显示了cd3-chd11-5双特异性(bs)tcrl(seqdno:16-21)对hla-a2+/tyr+和hla-a2+/tyr-细胞系的杀伤作用。
图6显示了cd3-chd11-5bstcrl对hla-a2+正常原代细胞和正常视网膜色素上皮细胞系(arpe-19)的杀伤作用。
图7显示了已建立的人黑色素瘤异种移植物模型mel526中cd3-d11和cd3-chd11-5bstcrl的抗肿瘤活性。
具体实施方式
在一些实施例中，本发明涉及能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd的抗体及其用途。在详细地解释本发明的至少一个实施例之前，应理解本发明并不一定限于其在以下描述中所阐述的或通过实施例所列举的细节方面的应用。本发明能够具有其他实施例或能够以各种方式实践或执行。
t细胞受体(tcr)样(tcrl)抗体具有对肿瘤表位的tcr样特异性。不同于对hla-肽抗原复合物表现出低亲和力的tcr，tcrl的特征在于即使在其可溶形式下也具有亲和力。tcrl正作为一类新的治疗剂被开发，其用于靶向肿瘤细胞并介导其特异性杀伤作用。
本发明人先前已经通过费力的筛选和实验鉴定了对tyrd-hla-a2具有空前的精细特异性的tcrl(wo2016/199141)。所述抗体被称为d11。
本发明人现已经成功地将d11人源化并产生了具有抗cd3臂的双特异性构型。经过繁琐的人源化过程，其包括在轻链可变区(y49h)中进行关键的框架修饰，获得了被称为hd11-5的完整人源化抗体。人源化形式保留了d11的所有功能特征，包括表观结合亲和力和结合特异性(图2至图4)。如体外和体内所测定的，包含抗cd3臂的抗体的双特异性构型(称为cd3-chd11-5)显示出对黑色素瘤细胞杀伤的有效活性(参见图5至图7)。
总而言之，目前的发现将hd11-5定位为治疗癌症的有力工具。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种包含抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域包含n-c排序的cdr序列：
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cdr2hcseqidno:9hiywdddkrynpslks
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cdr1轻链(lc)seqidno:5kasqdihnyia
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其中所述抗体的重链的可变区如seqidno:4所示，并且所述抗体能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd369–377。
或者，提供了一种包含抗原结合结构域的抗体，所述抗原结合结构域包含n-c排序的cdr序列：
cdr1重链(hc)seqidno:8tsgmgvs
cdr2hcseqidno:9hiywdddkrynpslks
cdr3hcseqidno:10kdygssfyamhy
cdr1轻链(lc)seqidno:5kasqdihnyia
cdr2lcseqidno:6ytstlqp
cdr3lcseqidno:7lqydnlwt
其中所述抗体的重链的可变区如seqidno:4所示，所述抗体的轻链的可变区如seqidno:2所示，并且所述抗体能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd369–377。
如本文所用，“结合(binding)”或“结合(bind)”是指抗体-抗原的结合模式，通常是在临床相关的tcrl的情况下，并且在这种情况下在低于5nm(例如：3.5-4.9nm)的kd范围内，通过表面等离子体共振测定(spr)确定。
通过表面等离振子体共振(spr)确定抗体对其抗原的亲和力，使用捕获或固定的单克隆抗体(mab)格式以最大程度地减少亲合力的影响。为了进行亲和力评估，抗原以其可溶形式使用，即如下所述的单链(sc)hla-a2/tyrd369–377复合物。
如本文所用，术语“kd”是指抗原结合结构域与其相应抗原之间的平衡解离常数。
本发明中所用的术语“抗体”包括完整的分子，例如igg及其片段，其包括人源化重链的可变区，即seqidno:4。
根据一个具体的实施例，抗体片段包括但不限于单链、fab、fab’和f(ab')2片段、fv、dsfv、scfv、双抗体、微型抗体、纳米抗体、fab表达文库或能够以hla限制性方式结合抗原表位的单结构域分子，诸如vh和vl。
如本文所用，“可变区”和“cdr”可以指通过本领域已知的任何方法(包括方法的组合)定义的可变区和cdr。根据一个具体的实施例，根据kabat等(以上)确定cdr。
根据一个具体的实施例，抗体是人源化抗体。
根据一个具体的实施例，抗体是嵌合抗体。
如本文所用，“嵌合抗体”是指其中至少一条链是非人(例如：鼠)动物的并且恒定区[例如：恒定，区例如cl(κ或λ)]是人的抗体。因此，例如：抗体可以是完整抗体或其片段，其中两条链均包含非人可变区和人恒定区。根据另一个实例，一条链被人源化，而另一条链包含非人可变区和人恒定区。嵌合抗体的双特异性构型在下文描述。
非人(例如：鼠)抗体的人源化形式是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的免疫球蛋白、免疫球蛋白链的嵌合分子。人源化抗体包括其中来自受者的互补决定区(cdr)的残基在这种情况下被来自诸如小鼠的非人物种(供体抗体)的cdr的具有所需特异性、亲和力和效力(细胞杀伤)的残基替换的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，所述人免疫球蛋白的fv框架残基被对应的非人残基替换。人源化抗体还可以包含既不存在于受者抗体中也不存在于输入cdr或框架序列中的残基。人源化抗体包含与非人免疫球蛋白的那些对应的所有cdr区和人免疫球蛋白共有序列的所有或基本上所有fr区。人源化抗体最佳地还包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区[jones等，《自然(nature)》，321:522-525(1986)；riechmann等，《自然(nature)》，332:323-329(1988)；和presta，《结构生物学的最新观点(curr.op.struct.biol.)》，2:593-596(1992)]。
根据一个具体的实施例，所述抗体包含如seqidno:2或25所示的轻链的可变区，因此是人源化抗体。
根据一个具体的实施例，所述抗体包含如seqidno:19所示的轻链的可变区。
在一些实施例中，免疫球蛋白同种型选自igg1、igg2、igg3和igg4，更具体地，igg1或igg4。根据一个具体的实施例，同种型是igg1。
根据一个具体的实施例，抗体包含治疗部分。
根据一个具体的实施例，抗体是双特异性抗体。因此，本文还考虑了hd11-5抗体的双特异性构型，其为人源化形式(具有分别如seqidno:2和seqidno:4所示的轻链和重链的可变区)或嵌合形式(例如：具有如seqidno:19所示的轻链和如seqidno:21所示的重链的可变结构域)。双特异性抗体(bsab)是由两种不同的单克隆抗体的片段构成的人工蛋白质，因此在这种情况下其结合两种不同类型的抗原hla-a2/tyrd369-377和不同于所述tyrd369-377的另一个表位。根据一个具体的实施例，将bsab工程改造为通过cd3与细胞毒性细胞(诸如t细胞)结合，并同时通过tyrdhla-a2-限制性肽与靶黑色素瘤细胞结合。下文描述了其他示例性构型。
如本文所用，短语“mhc(或hla)限制性肽”是指hla分子上呈递的肽，在这种情况下是hla-a2分子上呈递的tyrd369-377(在此缩写为“tyrd”seqidno:15)。
根据一个具体的实施例，抗cd3的scfv如seqidno:16、17所示，多核苷酸或多肽)。
根据本发明的一个方面，还提供了一种分离的多核苷酸，其包含编码如本文所述的抗体的核酸序列。
根据一个具体的实施例，编码能够以hla-a2限制性方式结合tyrd369-377的人源化抗体的核酸序列如seqidno:1、3、24、26所示)。
根据一个具体的实施例，编码能够以hla限制性方式结合tyrd369-377嵌合抗体的核酸序列如seqidno:3、20或26和18所示。
根据一个具体的实施例，编码抗cd3scfv的核酸序列如seqidno:17所示。
还提供了一种表达载体，其包含可操作地连接至顺式作用调控元件的多核苷酸。
本发明的一些实施例的核酸构建体(本文也称为“表达载体”)包括使所述载体适于在原核生物、真核生物或优选两者中复制和整合的额外序列(例如：穿梭载体)。另外，典型的克隆载体还可以含有转录和翻译起始序列、转录和翻译终止子和聚腺苷酸化信号。举例来说，此类构建体通常将包含5'ltr、trna结合位点、包装信号、第二链dna合成的起点以及3'ltr或其一部分。
本发明的一些实施例的核酸构建体通常包含用于从其所放置的宿主细胞分泌或呈递抗体的信号序列。优选地，为此目的的信号序列是哺乳动物信号序列。
真核启动子通常含有两种类型的识别序列：tata盒和上游启动子元件。tata盒位于转录起始位点上游25至30个碱基对处，被认为与指导rna聚合酶开始rna合成有关。其他上游启动子元件决定转录起始的速率。
优选地，本发明的一些实施例的核酸构建体所利用的启动子在转化的特定细胞群中具有活性。细胞类型特异性和/或组织特异性启动子的实例包括诸如白蛋白的肝特异性启动子[pinkert等，(1987)《基因与发育(genesdev.)》1:268-277]、淋巴特异性启动子[calame等，(1988)《免疫学进展(adv.immunol.)》43:235-275]；尤其是t细胞受体[winoto等，(1989)emboj.8:729-733]和免疫球蛋白的启动子；[banerji等，(1983)《细胞(cell)》33729-740]，神经元特异性启动子，诸如神经丝启动子[byrne等，(1989)《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)》usa86:5473-5477]、胰腺特异性启动子[edlunch等，(1985)《科学(science)》230:912-916]或乳腺特异性启动子，诸如乳清启动子(美国专利号4,873,316和欧洲申请公布号264,166)。
增强子元件可以从连接的同源或异源启动子刺激转录至高达1,000倍。当置于转录起始位点下游或上游时，增强子是有活性的。许多衍生自病毒的增强子元件具有广泛的宿主范围，并在多种组织中具有活性。例如：sv40早期基因增强子适用于许多细胞类型。适用于本发明的一些实施例的其他增强子/启动子组合包括衍生自多瘤病毒、人或鼠巨细胞病毒(cmv)、来自各种逆转录病毒诸如鼠白血病病毒、鼠或劳斯肉瘤病毒和hiv的长期重复的那些增强子/启动子组合。参见，增强子与真核表达，冷泉港出版社，冷泉港，n.y.1983，其以引用的方式并入本文。
在表达载体的构建中，优选将启动子定位于距异源转录起始位点的距离与在其天然环境中距转录起始位点的距离大致相同的位置。如本领域中已知，然而，这个距离的一些变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。
也可以将聚腺苷酸化序列添加到表达载体中，以增加tcrlmrna翻译的效率。准确有效的聚腺苷酸化需要两个不同的序列元件：位于聚腺苷酸化位点下游的富含gu或u的序列，以及位于上游11至30个核苷酸处的6个核苷酸的高度保守的序列aauaaa。适用于本发明的一些实施例的终止信号和聚腺苷酸化信号包括衍生自sv40的那些。
除了已经描述的元件外，本发明一些实施例的表达载体通常可以含有其他专门的元件，其旨在增加克隆的核酸的表达水平或促进鉴定携带重组dna的细胞。例如：许多动物病毒含有的dna序列会在允许的细胞类型中促进病毒基因组的染色体外复制。只要携带在质粒上或具有宿主细胞基因组的基因提供适当的因子，携带这些病毒复制子的质粒就可以进行游离型(episomally)复制。
载体可以包括或可以不包括真核复制子。如果存在真核复制子，则载体可使用适当的可选择标记物在真核细胞中扩增。如果载体不包含真核复制子，则不能进行游离型扩增。相反，重组dna整合到工程改造的细胞的基因组中，其中启动子指导所需核酸的表达。
通过有效增加转染宿主细胞中基因的剂量，可以实现哺乳动物细胞中重组多肽表达的改善。增加基因拷贝数最普遍地是通过使用缺乏一种酶(诸如二氢叶酸还原酶(dhfr)或谷氨酰胺合成酶(gs))的细胞系以及含有编码这些酶的基因的表达载体和诸如抑制dhfr的甲氨蝶呤(mtx)和抑制gs的蛋氨酸亚氨基代砜(msx)的剂进行基因扩增来实现的。因此，在一个示例性实施例中，可以分别获得含有在强启动子控制下的重组基因和编码dhfr或gs、dhfr+或gs.sup+转染子的基因的表达载体，然后通过使转染子在逐渐增加浓度的mtx或msx0中生长来实现基因扩增。
在ep2861741、us20120178126和us20080145895中描述了用于表达的示例性系统，所述文献中的每一个以引用的方式整体并入本文。
还提供了包含如本文所述的多核苷酸/表达载体的细胞。
适合用于克隆或表达编码抗体的载体的宿主细胞包括本文所描述的原核或真核细胞。例如：抗体可以在细菌中产生，在不需要糖基化和fc效应功能时尤其如此。还参见charlton，《分子生物学方法》，第248卷(b.k.c.lo编，胡马纳出版社，托托瓦，n.j.，2003)，第245至254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(e.coli)中的表达。在表达之后，抗体可以从细菌细胞糊状物分离于可溶性部分中并且可以进一步纯化。
除了原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物为适合用于编码抗体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化路径已经“人源化”，从而使得产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见gerngross，《自然生物技术(nat.biotech.)》22:1409-1414(2004)，和li等，《自然生物技术(nat.biotech.)》24:210-215(2006)。
适合用于表达糖基化抗体的宿主细胞也来源于多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴别众多可以连同昆虫细胞一起使用的杆状病毒株，尤其是用于转染草地黏虫(spodopterafrugiperda)细胞。
也可以利用植物细胞培养物作为宿主。参见，例如：美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的plantibodies.tm.技术)。
也可以使用脊椎动物细胞作为宿主。例如：适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例是由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；人胚胎肾细胞系(293或293细胞，如例如graham等，《普通病毒学杂志(j.genvirol.)》36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠睾丸支持细胞(tm4细胞，如例如mather，《生殖生物学(biol.reprod.)》23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；buffalo大鼠肝细胞(brl3a)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hepg2)；小鼠乳腺肿瘤(mmt060562)；tri细胞，如例如mather等，《纽约科学院年鉴(annalsn.y.acad.sci.)》383:44-68(1982)中所述；mrc5细胞；以及fs4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr.sup.-cho细胞(urlaub等，《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.)》usa77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，诸如y0、ns0和sp2/0。对于适于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的评述，参见例如yazaki和wu，《分子生物学方法(methodsinmolecularbiology)》，第248卷(b.k.c.lo编，《胡马纳出版社(humanapress)》，托托瓦，n.j.)，第255-268页(2003)。
抗体的高特异性使其特别适用于诊断(尤其是体内诊断，其中抗体的人源化特性至关重要)和治疗应用。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种以hla限制性方式检测呈递tyrd369-377的细胞的方法。所述方法包括使细胞与对hla-a2限制性tyrd肽抗原具有特异性的本发明抗体接触。所述接触在允许免疫复合物形成的条件下进行，其中免疫复合物的存在或其水平指示细胞呈递感兴趣的hla限制性肽抗原。
如本文所用，术语“检测”是指检测、感知、发现、暴露、可视化或鉴定细胞的动作。精确的检测方法取决于抗体所连接的可检测部分(本文中也称为可鉴定部分)，如下文进一步所述。
上述检测方法可以用于以hla限制性方式呈递tyrd369-377为特征的癌症(例如：黑色素瘤和胶质母细胞瘤)的诊断。
如本文所用，术语“诊断”是指分类疾病、确定疾病的严重程度(等级或阶段)、监测进展、预测疾病的结果和/或恢复的前景。
受试者可以是接受例行健康检查的健康受试者(例如：人)。或者，受试者可能具有患病风险。又或者，所述方法可以用于监测治疗功效。
tcrl可以包括例如连接到可鉴定部分。或者或另外地，tcrl(或包含其的复合物)可以诸如通过使用第二抗体间接鉴定。
如上所述，本发明的方法在足以形成免疫复合物(例如：本发明的抗体与复合至hla的肽之间的复合物，通常在不裂解细胞时)的条件下进行；此类条件(例如：适当的浓度、缓冲液、温度、反应时间)以及优化此类条件的方法是本领域技术人员已知的，并且本文公开了实例。
本发明的抗体特别适用于治疗癌症。
如本文所用的术语“癌症”被定义为其特征在于异常细胞的快速且非受控生长的疾病。癌细胞可以局部地扩散或通过血流和淋巴系统扩散至身体的其他部分。
根据本发明的一些实施例，所述病理是实体瘤。
根据一个具体的实施例，所述病理是黑色素瘤。
根据一个具体的实施例，所述病理是胶质母细胞瘤。
根据本发明的一些实施例，本发明的抗体具有抗肿瘤效应。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”是指可通过肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量降低、转移瘤的数量降低、预期寿命增加或与癌性病状相关联的各种生理症状改善表现出来的生物效应。“抗肿瘤效应”还可以通过本发明的药物最初预防肿瘤发生的能力表现出来。
根据一个具体的实施例，当抗体用于酪氨酸酶(tyrd)阳性癌症时。
术语“tyrd369-377阳性癌症”是指包含以hla限制性方式呈递tyrd的细胞的癌症。根据一个具体的实施例，tyrd369-377阳性癌症是黑色素瘤或胶质母细胞瘤。
如本文所用，“黑色素瘤”是指从称为黑色素细胞的含色素细胞发展而来的癌症。黑色素瘤通常发生在皮肤中，但可能很少发生在口腔、肠或眼睛中。
本发明的实施例涉及以下类型的黑色素瘤：
恶性雀斑样痣
恶性雀斑样痣性黑色素瘤
浅表扩散性黑色素瘤
肢端雀斑样痣性黑色素瘤
粘膜恶性黑色素瘤
结节性黑色素瘤
息肉样黑色素瘤
促纤维增生性黑色素瘤
小痣样细胞黑色素瘤
斯皮茨痣样黑色素瘤
葡萄膜黑色素瘤
黑色素瘤的癌症阶段可在tnm获得。同样重要的是“clark分级”和“breslow深度”，它们是指肿瘤浸润的微观深度。
黑色素瘤阶段，本文中涵盖每个阶段。
阶段0：原位黑色素瘤(clarki级)，存活率99.9％
阶段i/ii：侵袭性黑色素瘤，存活率89至95％
t1a：小于1.0mm的原发肿瘤厚度，无溃疡，并且有丝分裂<1/mm2
t1b：小于1.0mm的原发肿瘤厚度，有溃疡或有丝分裂≥1/mm2
t2a：1.01–2.0mm的原发肿瘤厚度，无溃疡
阶段ii：高危黑色素瘤，存活率45至79％
t2b：1.01–2.0mm的原发肿瘤厚度，有溃疡
t3a：2.01–4.0mm的原发肿瘤厚度，无溃疡
t3b：2.01–4.0mm的原发肿瘤厚度，有溃疡
t4a：大于4.0mm的原发肿瘤厚度，无溃疡
t4b：大于4.0mm的原发肿瘤厚度，有溃疡
阶段iii：区域转移，存活率24至70％
n1：单阳性淋巴结
n2：2至3个阳性淋巴结或局部皮肤/中途转移
n3：四个阳性淋巴结或一个淋巴结及局部皮肤/中途转移
阶段iv：远处转移，存活率7至19％
m1a：远处皮肤转移，ldh正常
m1b：肺转移，ldh正常
m1c：其他远处转移或ldh升高的任何远处转移
根据ajcc，在适当治疗的情况下从最初的黑色素瘤诊断开始具有五年存活期。
如本文所用，“胶质母细胞瘤”或“多形性胶质母细胞瘤(gbm)”是指始于脑内的最具攻击性的癌症。
根据一个具体的实施例，胶质母细胞瘤可以如下分类：
典型：“典型”亚型中有97％的肿瘤带有表皮生长因子受体(egfr)基因的额外拷贝，并且大多数的表达高于表皮生长因子受体(egfr)的正常表达，而经常在胶质母细胞瘤中发生突变的基因tp53(p53)在所述亚型中很少发生突变。
腹膜前亚型经常在tp53(p53)和pdgfra(编码a型血小板衍生生长因子受体的基因)和idh1(编码异柠檬酸脱氢酶-1的基因)中具有较高的变化率。
间充质亚型的特征是与其他类型相比，nf1(编码神经纤维瘤蛋白1的基因)的突变率较高或有其他改变，egfr基因的改变较少，并且egfr的表达较少。
神经亚型的特征是神经元标记物诸如nefl、gabra1、syt1和slc12a5的表达。
描述了胶质母细胞瘤中的许多其他遗传改变，并且它们中的大多数聚集在两个途径中，即rb和pi3k/akt。胶质母细胞瘤分别在68至78％和88％的这些途径中具有改变。
另一个重要的变化是mgmt(一种“自杀”dna修复酶)的甲基化。甲基化被描述为损害dna转录，从而损害mgmt酶的表达。由于mgmt酶因其自杀修复机制而只能修复一个dna烷基化，反向能力较低，并且mgmt基因启动子的甲基化极大地影响了dna修复能力。[35][36]实际上，mgmt甲基化与对dna破坏性化学治疗剂(诸如替莫唑胺)的治疗反应改善有关。
在任一种情况下，根据一些实施例，癌症的特征在于酪氨酸酶mrna或蛋白质的表达(例如：使用本领域熟知的方法，诸如通过rt-pcr或免疫组织化学所确定的)。
前述分类与诊断和治疗均相关。
确定本发明的免疫复合物的存在或水平取决于抗体所连接的可检测部分。
可以用于本发明的可检测部分的实例包括但不限于放射性同位素、磷光化学物质、化学发光化学物质、荧光化学物质、酶、荧光多肽和表位标签。可检测部分可以是结合对的成员，其可通过与结合对的另一成员的相互作用和直接可视化的标记来鉴定。在一个实例中，结合对的成员是通过对应的标记抗体鉴定的抗原。在一个实例中，标记是产生比色反应的荧光蛋白或酶。
可检测部分的其他实例包括可通过正电子发射断层扫描(pet)和磁共振成像(mri)检测的那些，所有这些都是本领域技术人员所熟知的。
当可检测部分是多肽时，免疫标记(即与可检测部分缀合的抗体)可以通过重组方式产生，或者可以通过例如使用固相肽合成技术按定义的顺序逐步添加一个或多个氨基酸残基来化学合成。可以使用重组dna技术(其中编码tcrl的多核苷酸以翻译方式融合到可检测部分)连接到本发明抗体的多肽可检测部分的实例包括荧光多肽、磷光多肽、酶和表位标签。
或者，可检测部分与本发明抗体的化学连接可以使用任何合适的化学键直接或间接地实现，例如通过肽键(当可检测部分是多肽时)，或通过共价键合到中间接头元件，诸如接头肽或其他化学部分，诸如有机聚合物。此类嵌合肽可以通过在肽的羧基(c)或氨基(n)末端键合或通过键合至内部化学基团(诸如直链、支链或环状侧链、内部碳原子或氮原子等)来连接。通过使用肽合成和/或肽的共价键合的熟知方法，本领域普通技术人员可以容易地鉴定和制备此类修饰的肽。抗体的荧光标记的描述在美国专利号3,940,475、4,289,747和4,376,110中详细提供。
因此，本文描述的缀合物可以通过将抗体与脂质、碳水化合物、蛋白质、毒素、药物或其他原子和分子连接的已知方法制备。在一些实施例中，使用合适的键联或键通过位点特异性缀合形成缀合物。位点特异性缀合更可能保留抗体的结合活性。所述物质可以通过硫醚键的形成而缀合或连接在还原的抗原结合构建体的铰链区。在一些实施例中，可以采用酪氨酸缀合。用于形成缀合物的其他键联或键可以包括但不限于共价键、非共价键、二硫键、腙键、酯键、酰胺键和氨基键、亚氨基键、缩氨基硫脲键、缩氨基脲键、肟键和碳-碳键。在一些实施例中，抗体中不需要包括半胱氨酸或其他连接方面(《生物结合技术(bioconjugatetechniques)》(第三版)作者：gregt.hermanson，isbn:978-0-12-382239-0)。
在wo2017/027325或u.s.9,078,931中描述了缀合部分的示例性方法，其中每个特此以引用的方式整体并入。
如上所述，本发明的抗体也可以用于治疗。
在完整抗体中，由于fc结构域活化抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，所以治疗活性是分子固有的。adcc是一种细胞介导的免疫防御机制，通过所述机制免疫系统的效应细胞主动裂解靶细胞，所述靶细胞的膜表面抗原已被特异性抗体结合。它是作为体液免疫应答的一部分，抗体可以通过其限制和遏制感染的机制中的一种。典型的adcc由自然杀伤(nk)细胞介导；巨噬细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也可以介导adcc。例如：嗜酸性粒细胞可以通过ige介导的adcc杀死某些被称为蠕虫的寄生虫。由于adcc依赖于先前的抗体反应，因此它是适应性免疫应答的一部分。
或者或另外地并且如所提及的，抗体可以是双特异性抗体，其中治疗性部分是例如t细胞接合剂，诸如抗cd3抗体或抗cd16a，或者治疗性部分可以是抗免疫检查点分子(例如抗pd-1、抗pd-l1、抗ctla4)。根据一个具体的实施方案，治疗部分是抗cd3。
或者或另外地，抗体可以连接至异源治疗部分(缀合方法如上文所述)。治疗部分可以是例如细胞毒性部分、毒性部分、细胞因子部分、药物。实例包括但不限于braf抑制剂，诸如维罗非尼(vemurafenib)和达拉非尼(dabrafenib)，以及放射性同位素或毒素，例如嘌呤硫素、绿脓杆菌外毒素a、甲氨蝶呤。
抗体可以呈可溶或不可溶形式。
不溶形式可以是其中包含人源化抗体可变区的分子由细胞表达的那些形式(即，在本文中也称为治疗部分)。
此类细胞的实例包括免疫细胞、t细胞、b细胞、树突状细胞、cik、nkt、nk细胞(自体的、同种异体的、异种的)。
根据一个具体的实施方案，抗体(或其可变区)形成car或人工t细胞受体。
如本文所用的术语“嵌合抗原受体(car)”可以指例如人工t细胞受体、t小体(t-bodies)、单链免疫受体、嵌合t细胞受体或嵌合免疫受体，并且涵盖将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞上的工程改造受体。可以使用car赋予t细胞单克隆抗体特异性，从而允许产生大量特异性t细胞，例如用于过继细胞疗法。在具体的实施方案中，例如：car指导细胞对肿瘤相关抗原的特异性。在一些实施例中，car包含细胞内活化结构域(允许t细胞在靶向部分与靶细胞(诸如靶肿瘤细胞)结合后活化)、跨膜结构域和长度可变并且包含与疾病或病症相关的例如肿瘤-抗原结合区的细胞外结构域。在特定方面，car包含衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scfv)的融合物，其融合至cd3-ζ、跨膜结构域和内结构域。其他car设计的特异性可以源自受体(例如：肽)的配体或源自模式识别受体，诸如dectin。在某些情况下，可以改变抗原识别结构域的间隔以减少活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，car包含用于其他共刺激信号传导的结构域，诸如cd3-ζ、fcr、cd27、cd28、cd137、dap10/12和/或ox40、icos、tlr等。在一些情况下，分子可以与car共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因(例如：用于正电子发射断层扫描)、添加前药后有条件地消融t细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
在某些实施方案中，本发明的一些实施例的αβt细胞、γδt细胞、nk、巨噬细胞或b细胞或细胞群体进行工程改造以稳定表达由表达盒编码的一种或多种结构上不同的抗体。所述抗体可以选自由以下组成的组：嵌合抗原受体(car)、完整抗体或其抗原结合片段，单链可变片段(scfv)、重链或轻链单结构域抗体(sdab)、fab、f(ab)2或其任何组合，其结合：(i)细胞表面肿瘤抗原或(ii)衍生自在细胞表面上表达为与mhc的复合物(肽-mhc复合物)的肿瘤抗原的肽。
因此，在感兴趣的细胞中转导编码这种分子的多核苷酸(例如：seqidno.1、3或编码seqidno:2、4的任何多核苷酸)。
根据本发明的一些实施例，所述细胞是t细胞、自然杀伤细胞、对靶细胞发挥效应子杀伤功能的细胞、对效应t细胞起抑制作用的细胞、具有效应子杀伤功能的工程改造的细胞或具有抑制功能的工程改造的细胞。
根据本发明的一些实施例，所述细胞是t细胞或αβt细胞或γδt细胞。
根据本发明的一些实施例，所述细胞是自然杀伤(nk)细胞。
根据本发明的一些实施例，自然杀伤细胞用于靶向癌症。
根据本发明的一些实施例，所述t细胞是细胞毒性t细胞(效应t细胞)。
根据本发明的一些实施例，细胞毒性t细胞(效应t细胞)用于靶向癌症抗原，在这种情况下是tyrd。
根据本发明的一些实施例，所述t细胞包含treg(t调节细胞)。
根据本发明的一些实施例，所述t细胞包含cd3t细胞。
根据本发明的一些实施例，所述t细胞包含cd4t细胞。
根据本发明的一些实施例，所述t细胞包含cd8t细胞。
根据本发明的一些实施例，所述抗体是单链fv(scfv)分子。
本发明的car分子的细胞质结构域(也称为“细胞内信号传导结构域”)负责活化已放置car的免疫细胞的至少一种正常效应功能。
术语“效应功能”是指细胞的专门功能。t细胞的效应功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指蛋白质的转导效应功能信号并且指导细胞执行专门功能的部分。虽然通常可以采用整个细胞内信号传导结构域，但是在许多情况下，不需要使用整条链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度下，可以使用此截短部分代替完整的链，只要所述截短部分转导效应功能信号即可。因此，术语细胞内信号传导结构域旨在包括细胞内信号传导结构域的足以转导效应功能信号的任何截短部分。
用于本发明的car分子中的细胞内信号传导结构域的实例包括t细胞受体(tcr)和共受体的配合作用来启动抗原受体结合之后的信号转导的细胞质序列、以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。
已知，通过tcr单独生成的信号不足以用于t细胞的完全活化，并且还需要次级信号或共刺激信号。因此，t细胞活化可以由两个不同类别的细胞质信号传导序列介导：通过tcr启动抗原依赖性初级活化的那些序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原依赖性方式作用来提供次级信号或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节tcr复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以包含信号传导基序，所述信号传导基序被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)。
在本发明中具有特定用途的包含itam的初级细胞质信号传导序列的实例包括来源于tcrζ、fcrγ、fcrβ、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd5、cd22、cd79a、cd79b以及cd66d的那些序列。特别优选的是，本发明的car中的细胞质信号传导分子包含来源于cd3ζ的细胞质信号传导序列。
在一个优选的实施方案中，car的细胞质结构域可以被设计来包括cd3-ζ信号传导结构域本身或与可用于本发明的car的环境中的任何其他所需的细胞质结构域组合。例如：car的细胞质结构域可以包括cd3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指car的包含共刺激分子的细胞内结构域的部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体以外的对于淋巴细胞对抗原的高效反应所需要的细胞表面分子。此类分子的实例包括cd27、cd28、4-1bb(cd137)、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3以及与cd83特异性地结合的配体等。因此，虽然本发明主要以4-1bb作为共刺激信号传导元件进行例示，但是其他共刺激元件也在本发明的范围内。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含共刺激信号区域和ζ链部分。共刺激信号传导区域是指car分子的一部分，其包含共刺激分子的细胞内结构域。共刺激分子是除了抗原受体或其配体以外的对于淋巴细胞对抗原的高效反应所需要的细胞表面分子。
如本文所用的术语“共刺激配体”包括特异性结合t细胞上的同源共刺激分子、从而提供一种信号的抗原呈递细胞[例如：aapc(人工抗原呈递细胞)、树突状细胞、b细胞等]上的分子，所述信号除了由例如tcr/cd3复合物与载有肽的mhc分子结合提供的初级信号外，还介导t细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。共刺激配体可以包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、结合toll配体受体的激动剂或抗体和与b7-h3特异性结合的配体。共刺激配体尤其还包括与存在于t细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，诸如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3和与cd83特异性结合的配体。
“共刺激分子”是指t细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，从而介导t细胞的共刺激应答，诸如但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于mhc1类分子、btla和toll配体受体。
如本文所用，“共刺激信号”是指一种信号，其与初级信号诸如tcr/cd3连接组合导致t细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
术语“刺激”是指刺激分子(例如：tcr/cd3复合物)与其同源配体结合而引起的初级应答，从而诱导信号转导事件，诸如但不限于，通过tcr/cd3复合物进行的信号转导。刺激可以介导某些分子表达的改变，诸如tgf-β的下调和/或细胞骨架结构的重组等。
本文使用的术语“刺激性分子”意指t细胞上与抗原呈递细胞上存在的同源刺激性配体特异性结合的分子。
如本文所用，“刺激性配体”意指一种配体，其在存在于抗原呈递细胞(例如：aapc、树突状细胞、b细胞等)上时可以与t细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激性分子”)特异性结合，从而介导t细胞的初级应答，包括但不限于活化、免疫应答的启动、增殖等。刺激性配体在本领域中是熟知的，并且尤其包括装载有肽的mhci类分子、抗cd3抗体、超激动剂抗cd28抗体和超激动剂抗cd2抗体。
相对于细胞质结构域，本发明的一些实施例的car分子可以被设计成自身包含cd28和/或4-1bb信号传导结构域，或者与可用于本发明的一些实施例的car分子的环境中的任何其他所需的细胞质结构域组合。在一个实施方案中，car的细胞质结构域可以被设计成还包含cd3-ζ的信号传导结构域。例如：car的细胞质结构域可以包括但不限于cd3-ζ、4-1bb和cd28信号传导模块及其组合。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含选自由以下组成的组中的至少一种，例如至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、例如至少六种的多肽：cd3ζ(cd247，cd3z)、cd28、41bb、icos、ox40和cd137。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含cd3ζ-链[cd247分子，也称为“cd3-zeta”和“cd3z”；genbank登录号np_000725.1和np_932170.1]，其为来自内源tcr的主要信号发送器。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含car胞质尾部的各种共刺激蛋白受体，以向t细胞(第二代car)提供额外的信号。实例包括但不限于cd28[例如：genbank登录号np_001230006.1、np_001230007.1、np_006130.1]、4-1bb[肿瘤坏死因子受体超级族成员9(tnfrsf9)，也被称为“cd137”，例如genbank登录号np_001552.2]和icos[诱导性t细胞共刺激物，例如genbank登录号np_036224.1]。临床前研究表明，第二代car设计改善了t细胞的抗肿瘤活性。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含多个信号传导结构域，诸如cd3z-cd28-41bb或cd3z-cd28-ox40，以进一步增强效力。术语“ox40”是指肿瘤坏死因子受体超家族成员4(tnfrsf4)，例如genbank登录号np_003318.1(“第三代”car)。
根据本发明的一些实施例，细胞内结构域包含cd28-cd3z、cd3z、cd28-cd137-cd3z。术语“cd137”是指肿瘤坏死因子受体超家族成员9(tnfrsf9)，例如genbank登录号np_001552.2。
根据本发明的一些实施例，当car分子被设计用于自然杀伤细胞时，则信号传导结构域可以是cd28和/或cd3ζ。跨膜结构域可以来源于天然来源或合成来源。在来源是天然来源的情况下，所述结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在本发明中具有特定用途的跨膜区域可以来源于(即，至少包括以下各项的跨膜区域)t细胞受体的α链、β链或ζ链、cd28、cd3ε、cd45、cd4、cd5、cd8、cd9、cd16、cd22、cd33、cd37、cd64、cd80、cd86、cd134、cd137、cd154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在所述情况下，所述跨膜结构域将包含主要是疏水性的残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。优选地，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体存在于合成的跨膜结构域的每个端部处。任选地，优选地长度在2与10个氨基酸之间的短寡肽或多肽可以在car的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间形成键。甘氨酸-丝氨酸二联体提供特别合适的接头。
根据本发明的一些实施例，本发明的一些实施例的car分子中包含的跨膜结构域是与car中的结构域之一天然缔合的跨膜结构域。根据本发明的一些实施例，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免这些结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。
根据一些实施例，在car分子的细胞外结构域与跨膜结构域之间，或在car分子的细胞质结构域与跨膜结构域之间，可以并入间隔区结构域。如本文所用，术语“间隔区结构域”通常意指作用来将跨膜结构域连接到多肽链中的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔区结构域可以包含多至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸并且最优选地25至50个氨基酸。
以上任何配置均可以用于治疗。
根据本发明的一些实施例的一个方面，提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者施用如本文所述的抗体，从而治疗受试者的癌症。
还提供了如本文定义的抗体在制备用于治疗病理(例如：癌症)的药物中的用途。
术语“治疗”是指抑制、预防或阻止病理(疾病、病症或病状)的发展和/或引起病理的减少、缓解或消退。本领域技术人员将理解，各种方法和测定可以用于评估病理的发展，并且类似地，各种方法和测定可以用于评估病理的减少、缓解或消退。
如本文所用，术语“受试者”包括患有病理的哺乳动物，优选为任何年龄的人。
本发明一些实施例的抗体可以将其本身或与合适的载剂或赋形剂混合的药物组合物施用于生物体。
如本文所用，“药物组合物”是指本文所述的一种或多种活性成分与其他化学组分诸如生理上合适的载剂和赋形剂的制剂。药物组合物的目的是促进化合物向生物体的施用。
在本文中，术语“活性成分”是指负责生物学作用的抗体。
在下文中，可以互换使用的短语“生理上可接受的载剂”和“药学上可接受的载剂”是指不会对生物体造成明显刺激并且不会消除所施用化合物的生物学活性和特性的载剂或稀释剂。这些短语中包括佐剂。
本文中的术语“赋形剂”是指添加到药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。赋形剂的实例包括但不限于碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和施用技术可以在宾夕法尼亚州伊斯顿的mack出版公司的“雷明顿药学”中找到，其最新版本以引用的方式并入本文。
合适的施用途径可以例如包括口服、直肠、经粘膜、尤其是经鼻、肠或肠胃外递送，包括肌肉内、皮下和髓内注射以及鞘内、直接心室内、心内(例如进入右或左心室腔、进入共同的冠状动脉)、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射。
根据一个具体的实施方案，施用包括静脉内施用。
用于将药物递送到中枢神经系统(cns)的常规方法包括：神经外科策略(例如：脑内注射或脑室内输注)；对所述药剂进行分子操作(例如：产生一种包含对内皮细胞表面分子具有亲和力的转运肽以及本身无法穿越bbb的药剂的嵌合融合蛋白)以尝试开发一种bbb的内源性运输途径；被设计来增加药剂的脂质溶解性的药理策略(例如：水溶性药剂与脂质或胆固醇载剂的缀合)；以及通过高渗破坏(由于将甘露醇溶液注入颈动脉或使用生物活性剂(诸如血管紧张素肽)而导致)短暂破坏bbb的完整性。然而，这些策略中的每一个都有局限性，诸如与侵入性外科手术相关的固有风险、由内源性运输系统固有的局限性引起的大小局限、与包含可能在cns之外具有活性的载体基序的嵌合分子的全身性施用相关的潜在不良生物副作用，以及在bbb被破坏的大脑区域内脑部受损的可能风险，这使其成为次佳的递送方法。
或者，可以局部而不是全身方式施用药物组合物，例如：通过将药物组合物直接注射至患者的组织区域内。
术语“组织”是指由被设计来执行一种或多种功能的细胞组成的生物体的一部分。实例包括但不限于脑组织、视网膜、皮肤组织、肝组织、胰腺组织、骨骼、软骨、结缔组织、血液组织、肌肉组织、心脏组织、脑组织、血管组织、肾组织、肺组织、性腺组织、造血组织。
本发明的一些实施例的药物组合物可以通过本领域熟知的方法来制备，例如通过常规的混合、溶解、粒化、糖衣片制造(dragee-making)、研细、乳化、胶囊化、包埋或冻干过程。
因此根据本发明的一些实施例使用的药物组合物可以常规方式使用包含赋形剂和助剂的一种或多种生理上可接受的载剂来配制，所述载剂有助于将活性成分加工成可以药学上使用的制剂。适当的制剂取决于所选择的施用途径。
对于注射，可以将药物组合物的活性成分在水溶液中，优选在生理相容缓冲液(诸如汉克斯溶液、林格氏溶液或生理缓冲盐水)中配制。对于经粘膜施用，适合于待渗透的屏障的渗透剂用于制剂中。这些渗透剂通常是本领域已知的。
对于口服施用，可以通过将活性化合物与本领域中熟知的药学上可接受的载剂组合来容易地配制药物组合物。此类载剂使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、混悬液等，以便患者口服摄入。用于口服使用的药理制剂可以通过以下制备：使用固体赋形剂，任选地研磨所得混合物，并且在添加合适的助剂(如果需要的话)之后，加工颗粒混合物以获得片剂或糖锭剂核心。合适的赋形剂具体地是填充剂，诸如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制剂，例如像玉米淀粉、小麦淀粉、小麦淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠；和/或生理上可接受的聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮(pvp)。如果需要，可以添加崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或海藻酸或其盐，诸如海藻酸钠。
糖锭剂核心提供有合适的包衣。为此，可以使用浓缩糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆胶、聚乙二醇、二氧化钛、漆溶液以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或糖锭剂包衣中添加染料或色素以用于鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物组合物包括由明胶制成的推入配合型胶囊(push-fitcapsule)以及由明胶和增塑剂(诸如甘油或山梨糖醇)制成的软密封型胶囊。所述推入配合型胶囊可以含有与填料(诸如乳糖)、粘合剂(诸如淀粉)、润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)以及任选地稳定剂混合的活性成分。在软胶囊中，活性成分可以溶解或悬浮在合适的液体中，诸如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。用于口服施用的所有制剂的剂量都应为适用于所选的施用途径。
对于颊施用，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于鼻腔吸入的施用，根据本发明的一些实施例使用的活性成分使用适合的推进剂(例如：二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳)从加压包装或喷雾器以气溶胶喷雾剂呈现形式方便地递送。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可以通过提供阀以递送计量的量来确定。用于分配器中的由例如明胶制成的胶囊和药筒可以经过配制而含有化合物和合适的粉末基质(诸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文所述的药物组合物可以被配制用于例如通过推注或连续输注进行肠胃外施用。用于注射的制剂可以任选地与添加的防腐剂制成单位剂量形式，例如在安瓿中或在多剂量容器中。所述组合物可以是油性或水性媒介物中的混悬剂、溶液剂或乳剂，且可以含有诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。
用于肠胃外施用的药物组合物包括呈水溶性形式的活性制剂的水溶液。此外，活性成分的混悬液可以制备为适当的油性或水基注射混悬液。合适的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪油(诸如芝麻油)或合成脂肪酸酯(诸如油酸乙酯、甘油三酯)或脂质体。水性注射混悬液可以含有增加混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。任选地，混悬液也可以含有合适的稳定剂或增加活性成分的溶解度以允许制备高浓度溶液的试剂。
或者，活性成分可以呈使用前用合适的媒介物(例如无菌无热原的水基溶液)复原的粉末形式。
本发明的一些实施例的药物组合物也可以使用例如常规的栓剂基质(诸如可可脂或其他甘油酯)配制成直肠组合物(诸如栓剂或保留灌肠剂)。
适用于本发明的一些实施例的环境的药物组合物包括含有有效实现其预期目的的量的活性成分的组合物。更确切地说，治疗有效量意指有效预防、减轻或改善正在治疗的受试者的疾病症状(例如：癌症)或者延长存活期的活性成分(tcrl-抗体)的量。
确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其鉴于本文提供的详细公开内容。
对于本发明方法中使用的任何制剂，治疗有效量或剂量最初可以由体外和细胞培养物测定来估计。例如：可以在动物模型中配制剂量以达到所需的浓度或效价。这一信息可以用于更准确地确定人中的有用剂量。
本文所述的活性成分的毒性和治疗功效可以通过体外、细胞培养或实验动物中的标准药学方法来确定。从这些体外和细胞培养物测定和动物研究中获得的数据可以用于配制用于人类的剂量范围。所述剂量可以根据所采用的剂型和利用的施用途径而改变。可以由个体医师鉴于患者的病状来选择确切制剂、施用途径以及剂量。(参见，例如：fingl等，1975，于：“治疗学的药理学基础”，第1章，第1页中)。
可以单独调节剂量和间隔以提供tcrl或含有tcrl的实体，诸如细胞(tcrl组织)，有效成分的水平足以诱导或抑制生物学效应(最小有效浓度，mec)。mec将因各制剂而不同，但是可以从体外数据进行估算。实现mec所必需的剂量将取决于个体特征和施用途径。检测测定可以用于测定血浆浓度。
取决于待治疗的病状的严重性和反应性，给药可以为单次或多次施用，其中治疗过程持续若干天至若干周，或者直至实现治愈或实现疾病状态的减少。
组合物的施用量当然将取决于正在治疗的受试者、病痛的严重程度、施用方式以及处方医师的判断等。
如果需要，本发明的一些实施例的组合物可以在需要时存在于包装或分配器装置中，诸如fda批准的试剂盒(诊断或治疗)，所述包装或分配器装置可以包括容纳含有活性成分的一个或多个单位剂型。所述包装可以例如包含金属或塑料箔，诸如泡罩包装。包装或分配器装置可以随附有施用说明书。包装或分配器中还可以装有规定药物制剂的制造、使用或销售的呈由政府机构指定的形式的与容器相关的通知，所述通知体现由所述机构批准所述组合物的形式用于人类或兽医学施用。例如：所述通知可以是由美国食品与药品管理局(theu.s.foodanddrugadministration)批准用于处方药物的标签或已批准的产品插页。如上文进一步详述的，还可以制备包含在相容的药物载剂中配制的本发明的制剂的组合物，其被置于适当的容器中并且贴上关于治疗所指示的病状的标签。
如本文所用，术语“约”是指±10％。
术语“包含(comprises或comprising)”、“包括”、“具有”及其变化形式意指“包括但不限于”。
术语“由...组成”意指“包括并限于”。
术语“基本上由...组成”意指组合物、方法或结构可以包括另外的成分、步骤和/或部件，但仅是如果另外的成分、步骤和/或部件未实质性改变所要求的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征。
因此，除非上下文另外明确指出，否则如在本文中使用，单数形式“一个(种)”和“所述”包括多个指示物。例如：术语“化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请中，本发明的各种实施方案可以范围格式呈现。应理解，呈范围格式的描述仅为了方便和简洁起见，并且不应解释为对本发明的范围进行不可改变的限制。因此，对范围的描述应被认为已经确切地公开所有可能的子范围以及所述范围内的单独数值。例如：诸如从1到6的范围的描述应视为已明确公开了子范围，诸如从1到3、从1到4、从1到5、从2到4、从2到6、从3到6等，以及所述范围内的单个数字，例如1、2、3、4、5和6。此在任何宽度范围的条件下均适用。
每当在本文中指示数值范围时，意味着包括所指示范围内的任何引用的数值(分数或整数)。短语第一指示数字与第二指示数字“之间的范围/范围(ranging/rangesbetween)”以及“从”第一指示数字“到”第二指示数字的“范围/范围(ranging/ranges)”在本文中可互换使用并且意指包括第一指示数字和第二指示数字以及它们之间的所有分数和整数。
如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，其包括但不限于已知的方式、手段、技术和程序或者化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者从已知的方式、手段、技术和程序很容易地开发的方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“治疗”包括消除、基本上抑制、减慢或逆转病状的进展、基本上改善病状的临床或美学症状或基本上防止病状的临床或美学症状的出现。
当提到特定的序列表时，应理解为所述参考还包括基本上对应于其互补序列的序列，包括由于例如由测序错误、克隆错误或其他导致碱基替换、碱基删除或碱基添加的改变引起的微小序列变化，前提条件是此类变化的频率小于50个核苷酸中的1个、或者小于100个核苷酸中的1个、或者小于200个核苷酸中的1个、或者小于500个核苷酸中的1个、或者小于1000个核苷酸中的1个、或者小于5,000个核苷酸中的1个、或者小于10,000个核苷酸中的1个。
应理解，在本申请中公开的任何序列标识号(seqidno)可指dna序列或rna序列，这取决于其中提到seqidno的内容，即使所述seqidno仅以dna序列格式或rna序列格式表达。
应了解，为清楚起见而在单独实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征也可以组合的形式在单个实施方案中提供。相反地，为简便起见，为了简洁而在单个实施方案的上下文中描述的本发明的不同特征也可以单独地或以任何合适的子组合提供或者在适当情况下提供于本发明的任何其他描述的实施方案中。在不同实施方案的上下文中描述的某些特征不认为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案在没有那些要素的情况下是无效的。
上文描述和下文权利要求部分要求保护的本发明的各个实施方案和方面中的每一个将在以下实施例中找到实验支持。
实施例：
现在参考以下实施例其连同以上描述以非限制性方式说明本发明的一些实施例。
通常，本文所用的命名法和本发明中所用的实验室方法包括分子、生化、微生物学和重组dna技术。此类技术在文献中有详尽的解释。参见例如："分子克隆：实验室手册"sambrook等，(1989)；"分子生物学中的当前的操作流程"第i-iii卷ausubel，r.m.,编(1994)；ausubel等，"分子生物学中的当前的操作流程"，johnwileyandsons，baltimore，maryland(1989)；perbal，"分子克隆的一实践指南"，johnwiley&sons，newyork(1988)；watson等，"重组脱氧核糖核酸",科学美国图书，纽约；birren等(编)"基因组分析：实验室手册系列"，第1-4卷，冷泉港实验室出版社，纽约(1998)；如美国专利号4,666,828；4,683,202；4,801,531；5,192,659和5,272,057中所示的方法；"细胞生物学：实验室手册"，第i-iii卷cellis，j.e.,编(1994)；"动物细胞培养-基础技术手册"freshney，wiley-liss，n.y.(1994)，第三版；"免疫学中的现有方案"第i-iii卷coliganj.e.,编(1994)；stites等(编)，"基础与临床免疫学"(第8版)，appleton&lange，norwalk，ct(1994)；mishell和shiigi(编)，"细胞免疫学中的多个选择方法"，w.h.freeman公司，纽约(1980)；可用的免疫测定在专利和科学文献中广泛地描述，参见例如美国专利号3,791,932；3,839,153；3,850,752；3,850,578；3,853,987；3,867,517；3,879,262；3,901,654；3,935,074；3,984,533；3,996,345；4,034,074；4,098,876；4,879,219；5,011,771和5,281,521；"寡核苷酸合成"gait，m.j.,编(1984)；“核酸杂交"hames，b.d.,和higginss.j.,编(1985)；"转录与转译"hames，b.d.,和higginss.j.,编(1984)；"动物细胞培养"freshney，r.i.,编(1986)；"固定化细胞及酶"irl出版社，(1986)；"分子克隆的一实践指南"perbal，b.，(1984)和"酶学方法"第1-317卷，学术出版社；"聚合酶链式反应(pcr)操作流程：方法及应用指南"，学术出版社，圣地亚哥，，ca(1990)；marshak等，"蛋白质纯化及表征策略-实验室课程手册"cshl出版社(1996)；所有这些文献均以引用的方式并入，如同在本文中完全阐述一样。本文档中提供了其他的一般参考。据信其中的过程在本领域中是熟知的，并且为读者的方便提供。其中包含的所有信息均以引用的方式并入本文。
实施例1：
使用cdr接枝的d11tcrl抗体人源化：
d11(seqidno:11-14，具有seqidno:5-10中所示的cdr，根据kabat确定)，是一种针对hla-a2/tyrd369-377(seqidno:15)肽-hla复合物的鼠单克隆抗体，其使用在人类ig框架区上的互补决定区(cdr)接枝进行人源化。基于相对于功能性人类种系基因的序列和结构相似性，选择用于重链和轻链的人类框架。在这方面，通过将小鼠标准cdr结构与具有相同标准结构的人类候选物进行比较来评估结构相似性。
使用计算机辅助的cdr接枝方法(abysis数据库，uclbusinessplc.)和分子工程技术将d11人源化以提供hd11-5。使用本领域公认的技术进行分子工程改造程序。为此，准确确定鼠抗体可变区dna序列(通过rt-pcr扩增)及其重链和轻链蛋白质翻译的同源模建是起点。
为了保持d11结合的有利特性，单一的框架变化是必要的。在这方面，在重链可变区中没有框架变化或回复突变，并且在轻链可变区中仅进行了一个框架修饰(hd11-5中的y49h)。y49h回复突变对于恢复人源化抗体与hla-a2/tyrd369-377复合物的完全结合至关重要。人源化d11抗体(hd11-5)的氨基酸和核苷酸序列示于图1(seqidno:24-27)中。
在通过cdr接枝将所有选择的抗体人源化之后，分析所得的轻链和重链可变区氨基酸序列，以确定它们与鼠供体和人受体轻链和重链可变区的同源性。
实施例2：
将hd11-5tcrl抗体克隆到人igg1表达载体中，然后在expi293系统中表达和纯化。
将hd11-5的人源化重链和轻链可变区的合成dna片段克隆到pci表达载体中，所述载体包含higg1恒定重链和轻链区，如图1所示。然后通过将衍生的重链和轻链构建体共转染到expi293细胞(thermofishera14635)中来表达hd11-5抗体。包括信号序列以介导分泌(轻链为seqidno:36、37，重链为seqidno:38、39)。
简而言之，将人源化可变区基因定向克隆到选定的人免疫球蛋白表达载体中。ig基因特异性pcr中使用的所有引物均包含限制性位点，其允许直接克隆到含有人igg1重链和轻链恒定区的表达载体中。纯化用agei和xhoi(用于重链)和xmai和draiii(用于轻链)消化的合成基因，然后连接到表达载体中。用200ut4-dna连接酶(newenglandbiolabs)、7.5μl消化和纯化的基因特异性pcr产物和25ng线性化载体dna进行总体积为10μl的连接反应。将电感受态大肠杆菌dh10b细菌(lifetechnologies)通过电穿孔(biorad)进行转化，将1μl连接产物铺在氨苄青霉素板上(100μg/ml)。将vh区的agei-xhoi片段克隆到pci-huigg1表达载体的相同位点中，而将合成的xmai-draiiivk插入片段克隆到相应的pci-hu-kappa表达载体的xmai-draiii位点中。
用qiaprepspin柱(qiagen)纯化质粒dna。使expi293细胞在补充有2％fbs的dmem培养基中培养。
对于瞬时转染，expi293细胞生长至250万个细胞/ml。将等量的igh和对应的igl链载体dna(各为15μg)添加到与1.5mlopti-mem培养基(thermofisher31985062)中的80μlexpifectamine293试剂混合的1.5ml的opti-mem培养基中。将混合物在室温下孵育30min，并均匀分布到10-cm组织培养板(corning)上。转染后三天收获上清液，用补充有10％fbs的20ml新鲜dmem替换，并在转染后第6天再次收获。通过在800×g下离心10min清除培养上清液中的细胞碎片。使用蛋白a亲和层析(gehealthcare)纯化重组人源化抗体hd11-5或用作上清液。
实施例3：
d11tcrl抗体在expi293系统中的克隆和表达：
将小鼠亲本d11(igg1同种型)重链和轻链(seqidno:11-14)分别克隆到lifetechnologies,geneart的pcdna3.4表达载体中。框内包括前导序列(seqidno:34、35)以介导分泌。
为了进行瞬时转染，在锥形瓶(thermoscientific，目录号4115-1000)、轨道式震荡器(125rpm)、37℃培养箱、8％的co2中，将expi293细胞在expi293表达培养基(gibco，目录号a14351-01)中生长至250万个细胞/ml。将等量的igh和对应的igl链载体dna(各为375μg)添加到37.5mlopti-mem培养基(gibco，目录号31985-047)中。将2.0mlexpifectamine293试剂(gibco，目录号100014994)添加到opti-mem培养基中，最终体积为37.5ml。将两种溶液混合并在室温下孵育30min。将25ml混合物加到每1升锥形瓶(总共3个烧瓶)中的212.5ml细胞培养物中。转染后16至18小时，添加expifectamine293转染增强剂1(gibco，目录号100013863)和增强剂2(gibco，目录号a14350-01)(每瓶分别为1.25ml和12.5ml)。转染后六天，在700×g下离心5min收获细胞，收集上清液，过滤并在4℃下保存。使用蛋白amabselecthitrapextra柱(gehealthcare)纯化重组小鼠抗体，并在适当条件下保存。
实施例4：
通过spr确定hd11-5tcrl抗体结合的亲和力：
单链hla-肽复合物的生产：
单链hla-a2(schla-a2)/tyrd369–377肽复合物是通过在异丙基β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导下体外重折叠大肠杆菌中产生的包涵体而产生的，如denkberg等，(2000)eur.j.immunol.30,3522–3532中所详述。简而言之，工程改造了一种含有β2-微球蛋白和通过柔性接头彼此连接的hla-a2基因的细胞外结构域的schla。在tyrd369–377(seqidno:15)肽存在下进行体外重折叠。分离正确折叠的hla-肽复合物，并通过阴离子交换q-sepharose色谱法(gehealthcarelifesciences)纯化。
为了确定与亲本d11tcrl抗体相比hd11-5的表观亲和力，进行了表面等离振子体共振(spr)结合分析，其中iggtcrl抗体被固定在芯片表面上的抗小鼠或抗人抗体捕获。将纯化的单链重组hla-a2/tyrd369–377肽复合物用作分析物。简而言之，用50μl0.04mn-乙基-n'-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)和0.01m磺基-n-羟基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs)的混合物在30μl/min的流速下活化6个proteonglm传感器芯片通道(biorad实验室)。将抗小鼠或抗人多克隆抗体(jacksonimmunoresearch)在ph4.5的10mm乙酸钠缓冲液中稀释至25μg/ml的最终浓度，并在注射150μlph8.5的1m乙醇胺-hcl后注射150μl所述溶液。将iggtcrl抗体以30μl/min的流速以垂直取向注射。使用五种不同浓度(250nm、125nm、62.5nm、31.2nm和16nm)以proteon的水平取向注射纯化的单链重组hla-a2/tyrd369-377肽复合物。同时在第六个通道中注射运行缓冲液(pbst)以进行双重参考，以校正实验过程中从芯片传感器表面丢失捕获的抗体的情况。使用集成的proteonmanager(bio-radlaboratories,hercules,usa)软件收集、处理和分析所有结合传感图。使用描述1:1化学计量的朗格缪尔模型或朗格缪尔和传质限制模型拟合结合曲线。如图2所示，hd11-5和d11tcrl抗体显示出对hla-a2/tyrd369-377肽复合物相似的分别为3.9nm和4.6nm的亲和力。
实施例5：
hd11-5tcrl抗体的选择性和特异性：
通过在一组hla-a2+细胞系和原代细胞上的流式细胞术证明了hd11-5与hla-a2/tyrd369-377复合物结合的选择性和特异性。在补充有10％fbs的完全dmem(均由gibco提供)中培养wm266.4细胞系(crl-1676，atcc)。在补充有10％fbs的完全emem(均由gibco提供)中培养c33a细胞系(htb-31，atcc)。将501a、mel526、skmel5(htb-70，atcc)、mewo(htb-65，atcc)和1938(黑色素瘤)、saos2(htb-85，atcc的骨肉瘤)、panc1(crl-1469，atcc的胰腺癌)，j82(htb-1，atcc)、jvm2(crl-3002，atcc的套细胞淋巴瘤)和sw620(ccl-227，atcc的结直肠腺癌)细胞系在补充有10％fbs的完全rpmi(均由gibco提供)中培养。将malme3m(htb-64，atcc的黑色素瘤)和y79(htb-18，atcc的成视网膜细胞瘤)细胞系在补充有20％fbs的完全rpmi(均由gibco提供)中培养。将细胞系保持在7.5％co2的湿润气氛中，温度为37℃。
正常的原代角质形成细胞、肝细胞、心肌细胞、成骨细胞、星形胶质细胞、支气管上皮细胞、结肠平滑肌细胞、尿路上皮细胞和肾上皮细胞从sciencell获得。视网膜上皮细胞(arpe-19)从atcc(crl-2302)获得。按照制造商的说明书培养细胞，并在7.5％co2的湿润气氛中保持在37℃下。
简而言之，将tyr+(501a、skmel5、wm266.4、526)和tyr-(1938、panc1、c33a、saos2、sw620、jvm2)细胞系与10μg/ml生物素化的hd11-5和d11tcrl抗体在4℃下孵育1h，然后与pe标记的链霉亲和素缀合物在4℃下孵育45分钟。使用bb7.2抗体(10μg/ml)监测使用二级pe标记的抗小鼠igg的hla-a2的表达。
如图3所示，生物素化的hd11-5和d11tcrl抗体特异性染色了hla-a2+/tyr阳性细胞。在多个hla-a2+/tyr阴性细胞系上未检测到反应性。bb7.2抗体染色证实了所述组中细胞系的hla-a2+状态。
还对包括星形胶质细胞、肝细胞、肾细胞、心肌细胞、结肠肌、支气管上皮细胞、成骨细胞、支气管、角质形成细胞和正常视网膜色素上皮细胞系arpe19在内的一组正常原代细胞测试了生物素化的hd11-5和d11tcrl抗体的反应性(图4)。没有观察到与这些hla-a2+细胞的结合。bb7.2抗体染色证实了所述组中细胞的hla-a2+状态。
实施例6：
嵌合双特异性tcrlcd3-chd11-5在细胞毒性测定中的产生和功能表征：
将d11的人源化重链和人恒定区1(vh-ch1)的可变区和鼠轻链(vl)和人恒定κ链(cl)的可变区(seqidno20和seqidno18)与抗cd3scfv片段(seqidno:16)组装成双特异性构建体，所述构建体可以将效应t细胞重新靶向到hla-a2+/tyr369-377+靶细胞。简而言之，将抗cd3scfv通过连接子(seqidno:32、33)与嵌合轻链(小鼠-vl人-clκ)的n末端融合，并将6xhis-tag添加到hd11-5的vh-ch1(seqidno:20、21)结构域的c末端。框内包括前导序列(seqidno:34、35)。将两种构建体均克隆到pcdna3.4载体中以在哺乳动物细胞中表达，以产生被称为cd3-chd11-5bs的双特异性抗体。
如实施例3所述，通过将两种构建体共转染到expi293f人细胞中来表达cd3-chd11-5bstcrl。培养6天后，将细胞在700xg下离心5分钟，收集、过滤并透析含有cd3-chd11-5bstcrl抗体的上清液。cd3-chd11-5bstcrl重组蛋白通过金属亲和力(talon)和尺寸排阻色谱法(superdex20010/300glge)纯化。
使用
具体地，将靶细胞和效应细胞洗涤，计数并重悬在无酚红的crpmi培养基(1％fbs)中。将靶细胞的细胞密度调整为2.5x105个细胞/ml，效应细胞的细胞密度为2.5x106个细胞/ml。在96孔v形板中培养40μl(1x104个细胞)靶细胞。在最高测试浓度下制备cd3-chd11-5bstcrl测试试剂的5x原液，然后在无酚红的培养基中在单独的板中以1:10系列稀释以获得其他测试浓度。然后将cd3-chd11-5和cd3-d11bstcrl以每孔20μl的量添加到测定板中的靶细胞中，以给出最终指示的滴定量。然后将含有与bstcrl混合的靶细胞的测定板在37℃/5％co2下孵育20分钟。孵育后，将40μl效应细胞(1x105个细胞)添加到每个孔中，从而使效应物与靶标(e:t)的比率为10:1。对照孔仅设置效应细胞以计算效应子的自发释放，只设置靶细胞以计算靶标的自发释放，最后用含80μg/ml洋地黄皂苷的靶细胞计算出最大释放。每种条件一式三份进行测定，最终体积为100μl。将所述板在37℃/5％co2下孵育24小时。孵育期后，将板在700xg下离心5分钟，并将50μl从每个孔转移到96孔平底maxisorb板(nunc)中的相应孔中。按照制造商的说明书，使用
如图5a至图5b和图6所示，在存在人pbmc的情况下，cd3-chd11-5bstcrl在体外证明了针对黑色素瘤wm266.4细胞的细胞毒性。panc-1、hla-a2+/tyr-细胞系用作阴性对照，并且显示没有细胞毒性。还针对一组hla-a2+/tyr+黑色素瘤细胞系检测到了细胞毒性(图5a)。未检测到针对一组hla-a2+/tyr-细胞系(图5b)和正常人原代细胞(图6)的细胞毒性，cd-chd11-5bstcrl确认了其选择性。
实施例7：
cd3-chd11-5bstcrl和cd3-d11bstcrl在建立的黑色素瘤异种移植物小鼠模型中的抗肿瘤活性：
在补充有10％胎牛血清(gibco,walthamma,usa)的rpmi1640生长培养基(gibco,walthamma,usa)中培养mel526黑色素瘤细胞系。如wo2016/199141中所述，从健康供体制备人外周血单核细胞(pbmc)，并且将cd3阳性细胞体外扩增并用作效应细胞，所述文献特此以引用的方式整体并入。
在第0天，在6至8周大的雌性nod/scid小鼠(envigo,israel)的单个胁腹中皮下接种(s.c.)在最终体积为0.1ml的50％
图7显示，在所述模型中，cd3-chd11-5和cd3-d11bstcrl均在29天内诱导了肿瘤消退。
尽管已结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但明显的是，许多替代方案、修改以及变型对于本领域的技术人员将是显而易见的。因此，旨在涵盖落入所附权利要求的精神和宽泛范围内的所有此类替代方案、修改和变型。
本说明书中所提及的所有公布、专利以及专利申请在本文中以引用的方式整体并入本说明书中，达到如同每一个单独的公布、专利或专利申请被专门地并且单独地指示以引用的方式并入本文的相同的程度。另外，本申请中对任何参考的引用或标明不应被解释为承认此类参考可用作本发明的现有技术。就使用段落标题方面而言，它们不应认为是必要地进行限制。
序列表
<110>阿迪塞特生物公司
雅克布维茨,阿雅
佛德,奥利特
萨特帕耶夫,道略特卡迪尔
彼尔高棉,米拉
丹克贝尔,加利特
瑞特,约拉姆
贝尔,伊兰
仙尼克,卡莲
特布尔,艾尔巴茨,耶尔
雪帕贝,塞里,耶尔
埃雷尔西格尔,列乌特
奥伦,雷蒙特
阿利雪克费斯,德罗尔希姆尔
<120>能够以hla限制性方式结合hla-a2/tyrd的抗体及其用途
<130>70151
<160>39
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>321
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>v_region
<222>(1)..(322)
<223>可变轻链
<400>1
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcacc60
atcacttgcaaggcgagtcaggacattcacaactatatagcttggtatcagcagaaacca120
gggaaagcccctaagctcctgatccactatacatccactttgcaaccaggggtcccatca180
aggttcagtggaagtggatctgggacagattttactttcaccatcagcagcctgcagcct240
gaagatattgcaacatattactgtctacagtatgataatctctggacgttcggtcaaggc300
accaaggtggaaatcaaacgg321
<210>2
<211>107
<212>prt
<213>artificialsequence
<220>
<221>domain
<222>(1)..(108)
<223>可变轻链
<400>2
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcyslysalaserglnaspilehisasntyr
202530
ilealatrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
histyrthrserthrleuglnproglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro
65707580
gluaspilealathrtyrtyrcysleuglntyraspasnleutrpthr
859095
pheglyglnglythrlysvalgluilelysarg
100105
<210>3
<211>366
<212>dna
<213>artificialsequence
<220>
<221>v_region
<222>(1)..(367)
<223>可变重链
<400>3
cagatcaccttgaaggagtctggtcctacgctggtgaaacccacacagaccctcacgctg60
acctgcaccttctctgggttctcactcagcactagtggaatgggtgtgtcctggatccgt120
cagcccccaggaaaggccctggagtggcttgcacacatttattgggatgatgataagcgc180
tacaacccatctctgaagagcaggctcaccatcaccaaggacacctccaaaaaccaggtg240
gtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacatattactgtgcacgaaag300
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tcgagt366
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<223>用于在pcdna3.4中表达的小鼠igh信号序列-前导序列
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valhisser
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20
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valhisser
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