细胞支架材料的制备方法、材料及应用与流程

本发明涉及医疗仿生材料领域，且特别涉及一种细胞支架材料的制备方法、材料及应用。

背景技术：

仿生材料是指模仿生物的各种特点或特性而研制开发的材料，不仅要模拟生物对象的结构，更要模拟其功能。组织工程支架材料作为仿生材料，是指能与组织活体细胞结合并能植入生物体的不同组织，并根据具体替代组织具备的功能的材料。

组织工程生物活性组织，需要构建出细胞支架复合物，且支架材料可使种子细胞有效的黏附增殖和生长。组织工程支架材料包括：骨、软骨、血管、神经、皮肤和人工器官，如肝、脾、肾、膀胱等的组织支架材料。

但是，现有技术中的组织工程支架材料主要以猪、牛等来源的纤维蛋白原粗品进行支架材料的制备，存在过敏、异种异体免疫排斥反应。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种细胞支架材料的制备方法，通过其制得的细胞支架材料具有良好的生物相容性，且能促进骨及软骨的形成及生长，有利于新生骨组织的发育。

本发明的另一目的在于提供一种细胞支架材料，其通过上述的制备方法制得，具备生物相容性良好且能促进骨及软骨的形成及生长、有利于新生骨组织的发育等特点。

本发明的再一目的在于提供一种上述细胞支架材料在用于制备骨诱导膜中的应用，促进骨损伤的愈合。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本发明提出一种细胞支架材料的制备方法，其包括：用人体血液制备纤维蛋白原；将纤维蛋白原成膜得膜片，将膜片用含抑肽酶的溶液处理后与骨生长助剂混合。

本发明提出一种细胞支架材料，其根据上述的细胞支架材料的制备方法制得。

本发明提出一种上述细胞支架材料在用于制备骨诱导膜中的应用。

本发明实施例的有益效果是：

本发明提供的细胞支架材料的制备方法，其以人体血液为原料提取纤维蛋白原用于制备支架材料。纤维蛋白原非异种来源，与人体的生物相容性好。

骨生长助剂能促进骨及软骨的形成及生长，有利于新生骨组织的发育，有助于促进骨损伤的愈合。

本发明提供的细胞支架材料，通过上述细胞支架材料的制备方法制得，具备生物相容性良好且能促进骨的形成及生长、有利于新生骨组织的发育等特点。

本发明提出的上述细胞支架材料在用于制备骨诱导膜中的应用，采用该细胞支架材料作为主料或辅料制备骨诱导膜，有利于促进骨损伤的愈合。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明实施例提供的细胞支架材料的实物图；

图2为本发明实施例提供的细胞支架材料的电镜图；

图3为人骨髓间充质干细胞在本发明实施例提供的细胞支架材料上的live/dead活性染色图；

图4为人骨髓间充质干细胞在本发明实施例提供的细胞支架材料上的live/dead活性染色图；

图5为本发明实施例提供的细胞支架材料上碱性磷酸酶染色的成骨染色图；

图6为本发明实施例提供的细胞支架材料上茜素红染色的成骨染色图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面对本发明实施例的细胞支架材料的制备方法、材料及应用进行具体说明。

一种细胞支架材料的制备方法，其包括：

用人体血液制备纤维蛋白原；将纤维蛋白原成膜得膜片，将膜片用含抑肽酶的溶液处理后与骨生长助剂混合。

本发明采用人体血液为原料提取纤维蛋白原用于制备支架材料。该提取于人体血液的纤维蛋白原非异种来源，使制得的材料与人体的生物相容性好。

进一步地，由于支架材料的使用患者先前通常会经历行各类手术，该人体血液较佳地采用使用患者在先手术中的术中废弃血液。该操作至少具备以下优点：

原料为手术中废弃物，将废弃血液变废为宝，原料易得、有利于降低材料制备成本，从而降低患者的治疗费用；原料来源于使用患者自身，自体来源无免疫排斥，生物相容性极佳，可促进细胞的黏附及增殖；同时使用自身血液无需在使用前对人体血液中可能存在的传染病毒等进行检查及筛除，安全性更高。

在本发明较佳的实施例中，纤维蛋白原由以下操作制得：将人体血液离心得血浆，将血浆用沉淀法析出纤维蛋白原粗品，冷冻干燥纤维蛋白原粗品。

将人体血液离心得血浆的操作，该操作去除了血液中含有的血细胞，便于对血浆内的纤维蛋白原进行提取，有利于提高纤维蛋白原的纯度。

在本发明较佳的实施例中，离心操作的转速为2800～3200r/min，时间为14～16min。优选地，离心操作的转速为3000r/min，时间为15min。其离心分离的效果好。

将血浆用沉淀法析出纤维蛋白原粗品的操作将纤维蛋白原从离心得到的血浆中分离，便于进行细胞支架材料的制备。

在本发明较佳的实施例中，该沉淀法为乙醇沉淀法，使纤维蛋白原发生醇沉从而进行分离。

上述的乙醇沉淀法较佳地包括：将血浆与医用无水乙醇以9.5～10.5：1的体积比混合，于-22～-20℃条件下孵育8～10mim。优选地，血浆与医用无水乙醇的体积比为10：1，孵育的温度为-20℃，其能够保持纤维蛋白原的生物活性，且醇沉效果更佳。

孵育完成后较佳地，以大致3000r/min的转速离心大致10min，即得纤维蛋白原粗品。

纤维蛋白原成膜后得到的膜片经含抑肽酶的溶液处理，其能够显著地降低纤维蛋白原粗品的降解速度，同时有利于骨细胞在支架材料上的生长及吸附。

在本发明较佳的实施例中，含抑肽酶的溶液中抑肽酶的浓度为4000～8000ku/ml，较佳地为8000ku/ml，其酶处理效果更佳。

由于该方法制得的细胞支架材料主要应用于骨科，将膜片酶处理后与骨生长助剂混合，骨生长助剂的用量可根据不同的患者的具体病情适当调节选择。能促进骨的形成及生长，有利于新生骨组织的发育，有助于促进骨损伤的愈合。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，骨生长助剂包括：骨膜组织、骨生长因子以及prp。

生长因子包括：mp-2、tgf-β1、igf-1、tgf、bmp、fgf、或g-csf中的任意一种或至少两种的组合。

mp-2是指骨形态发生蛋白-2，tgf-β1是指转化生长因子-β1，igf-1是指类胰岛素一号增长因子，tgf是指转化生长因子，bmp是指骨形态发生蛋白，fgf是指纤维母细胞生长因子，g-csf粒细胞集落刺激因子。将上述生长因子中的任意一种或至少两种的组合，能够促进骨及软骨的形成及生长，利于骨组织的形成和发育。

骨膜组织能够促进血管化的形成。prp是指高浓度血小板血浆，具有迅速止血、止痛、加速伤口愈合的作用。

在本发明较佳的实施例中，膜片由纤维蛋白原通过静电纺丝操作成膜制得。采用静电纺技术进行成膜，制得的膜片具备高孔隙率、高比表面积，材料性能优异。

进一步地，静电纺丝操作包括：将纤维蛋白原与混合溶剂混合得静电纺丝溶液，将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置成膜。

优选地，混合溶剂包括体积比为8.5～9.5：1的hfp和mem，静电纺丝溶液中纤维蛋白原的浓度为90～120mg/ml。mem是指10*mem培养基。

更优选地，混合溶剂包括体积比为9：1的hfp和mem，静电纺丝溶液中纤维蛋白原的浓度为120mg/ml。使成膜得到的膜片均匀平整。

进一步地，静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头后成膜，静电纺丝装置的收集圆轴(直径6cm，长度20cm)的转速为500～700r/min。使收集于收集圆轴的静电纺丝膜片平整一致。

一种细胞支架材料，通过上述细胞支架材料的制备方法制得，具备生物相容性良好且能促进骨的形成及生长、有利于新生骨组织的发育等特点。

一种上述细胞支架材料在用于制备骨诱导膜中的应用，采用该细胞支架材料作为主料或辅料制备骨诱导膜，有利于促进骨损伤的愈合。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3000r/min的转速离心15min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育9min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为600r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、mp-2、tgf-β1、igf-1、bmp、fgf、g-csf以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例2

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3000r/min的转速离心15min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育9min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为600r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、mp-2、tgf-β1、igf-1以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例3

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3000r/min的转速离心15min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育9min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为600r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、tgf、bmp、fgf、g-csf以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例4

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3000r/min的转速离心15min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育9min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为600r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、tgf-β1、igf-1、g-csf以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例5

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以2800r/min的转速离心16min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以9.5：1的体积比混合，于-22℃条件下孵育8min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照8.5：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为90mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为500r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、tgf-β1以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例6

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以2800r/min的转速离心16min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以9.5：1的体积比混合，于-22℃条件下孵育8min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照8.5：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为90mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为500r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、tgf-β1、bmp以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例7

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3200r/min的转速离心14min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10.5：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育10min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9.5：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为700r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、g-csf以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

实施例8

一种细胞支架材料的制备方法，包括：

s1、将人体血液以3200r/min的转速离心14min，得血浆。

s2、将血浆与医用无水乙醇以10.5：1的体积比混合，于-20℃条件下孵育10min，以3000r/min的转速离心10min，得纤维蛋白原粗品。

s3、将纤维蛋白原粗品冷冻干燥，得纤维蛋白原。

s4、将hfp与mem培养基按照9.5：1的体积比混合，得混合溶剂。将纤维蛋白原溶解于混合溶剂，得纤维蛋白原的浓度为120mg/ml的静电纺丝溶液。

s5、将静电纺丝溶液通过静电纺丝装置的22号钝性针头，于转速为700r/min、直径为6cm、长度为20cm的收集圆轴上成膜，得膜片。

s6、将膜片用抑肽酶的浓度为8000ku/ml的含抑肽酶的溶液进行处理，与含骨膜组织、mp-2、fgf以及prp的骨生长助剂混合，得细胞支架材料。

对实施例1～8制得的细胞支架材料进行测试，其与人体骨组织的生物相容性好，能促进骨的形成及生长，有利于新生骨组织的发育，有助于促进骨损伤的愈合。

试验例

根据实施例提供的细胞支架的制备方法制得细胞支架材料，如图1所示，其电镜图如图2所示。从图2可以看出，本发明实施例制得的细胞支架材料具有良好的孔径及孔隙率，其比表面积大，有利于细胞的黏附及生长。

图3及图4为人骨髓间充质干细胞在制得的细胞支架材料上的live/dead活性染色图，其中红色部分表示死细胞，绿色部分表示活细胞，从图中可以看出，细胞在本发明实施例制得的细胞支架材料上的相容性好，可以良好的生长。

图5为制得的细胞支架材料上碱性磷酸酶染色的成骨染色图，图6为细胞支架材料上茜素红染色的成骨染色图，从图中可以看出，本发明实施例制得的细胞支架材料的成骨及成软骨的效果好。

综上所述，本发明的细胞支架材料的制备方法，以人体血液为原料提取纤维蛋白原粗品用于制备支架材料。纤维蛋白原粗品非异种来源，与人体的生物相容性好。骨生长助剂能促进骨的形成及生长，有利于新生骨组织的发育，有助于促进骨损伤的愈合。

本发明的细胞支架材料，通过上述细胞支架材料的制备方法制得，具备生物相容性良好、能促进骨的形成及生长、有利于新生骨组织的发育、有助于促进骨损伤的愈合等优点。

本发明的上述细胞支架材料在用于制备骨诱导膜中的应用，采用该细胞支架材料作为主料或辅料制备骨诱导膜，有利于促进骨损伤的愈合。

以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。