聚酯类支架及其在骨缺损修复中的应用的制作方法

本发明涉及一种支架材料，尤其涉及一种由若干种材料交联而成的支架材料，具有促进干细胞分化的作用，以及制取的方法、在诱导成骨和体内骨修复中的应用。

背景技术：

骨缺损是临床上最常见而又棘手的问题，常由创伤、肿瘤或先天性异常导致(biomaterials22(19)(2001)2581～2593)。近年来具有生物活性的组织工程支架已被广泛应用于骨再生(adv.funct.mater.26(7)(2016)1085-1097；materialsscience&engineeringc，2017，76：249-259)。其中，聚癸二酰甘油酯(poly(sebacoyldiglyceride)，psed)是主链含有羟基的一种可降解生物聚酯材料(biomaterials.2010；31：3129-38)。体外实验发现，psed具有良好的促进细胞增殖的能力(acsappliedmaterials&interfaces，2016，8(32)：20591；biomaterials.2010；31：3129-38)。bi等研究了psed在骨组织工程中可促进细胞外基质矿化，并且其生物活性和生物相容性可与目前广泛用于骨组织工程的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)相媲美，促骨再生方面甚至超过了plga，具有应用于骨再生领域的潜力(actabiomaterialia，2014，10(6)：2814-2823)。此外，也有研究尝试将psed应用于血管再生、神经修复再生领域，其结果也显示了psed具有良好的生物相容性和促干细胞分化能力(macromolecularbioscience，2016，16(9)：1334-1347；acsappliedmaterials&interfaces，2016，8(15)：9590)。但降解速度快、机械性能差的缺点大大减弱了psed成骨能力。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种支架材料，由聚酯类材料制成，增强支架的机械性能，并实现诱导细胞成骨。

本发明的另一个目的在于提供一种支架材料，系多孔结构，有利于间充质干细胞于其中生长。

本发明的再一个目的在于提供一种支架材料用于促进间充质干细胞的增殖。

本发明的又一个目的在于提供一种支架材料用于促进间充质干细胞的成骨分化，上调间充质干细胞成骨相关基因和蛋白的表达。

本发明的又一个目的在于提供一种支架材料用于促进间充质干细胞的细胞外基质矿化。

本发明的又一个目的在于提供一种支架材料在骨修复中的应用。

一种支架材料，其为多孔结构，孔隙率为80％以上，空隙外径为75μm～150μm。

另一种支架材料，其由聚癸二酰甘油酯和聚己内酯(polycaprolactone，pcl)按重量比1～3∶7～9交联而成。

另一种支架材料，其由聚癸二酰甘油酯和聚己内酯按重量比3∶7交联而成，其玻璃态温度为-24.8℃，杨氏模量为77.2kpa±4.4kpa，形变40％时的抗压强度为13.4kpa±0.9kpa。

本发明提供的支架材料，其由psed和pcl经热交联而成，具体方法如：

在器具中铺入粒径75μm～150μm致孔剂，于温度37℃，相对湿度85％放置1.5小时。然后置入真空干燥箱(100℃，1torr)1小时，除去水分，制成盐膜。将psed和pcl混合溶解于四氢呋喃(thf)后滴加在盐膜中，之后使thf挥发除去，将盐膜置入真空干燥箱(150℃，1torr)热交联反应24小时。之后将交联好的盐模取出后将致孔剂去除，冷冻干燥，即得psed/pcl多孔支架材料。

所用的器具如：特氟龙镀层的不锈钢容腔和特氟龙镀层的圆环，支架材料的厚度可以通过钢垫片来实现，比如：1mm的厚度。

在支架材料上接种干细胞，经体外非成骨分化培养基培养，将支架材料移植到体内非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损处，移植后随访观察6月，ct检查缺损部位骨修复效果。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明的支架材料其机械强度得到显著增强，能提高干细胞的增殖能力，能上调人脂肪间充质干细胞成骨相关基因和蛋白的表达，促进人脂肪间充质干细胞的成骨分化，以及人脂肪间充质干细胞的细胞外基质矿化。

对于骨缺损病症，本发明的支架材料作为组织工程支架体外接种人间充质干细胞后，移植在缺损部位，促进新骨的再生并修复缺损骨组织。

附图说明

图1a为本发明支架材料扫描电镜(×100)下一实施例的形貌图；

图1b为本发明支架材料扫描电镜(×200)下另一实施例的形貌图；

图2为生长于各种支架材料的干细胞增殖能力结果图；

图3为生长于各种支架材料的干细胞成骨相关基因表达结果图；

图4为生长于各种支架材料的干细胞进行碱性磷酸酶染色结果图；

图5为生长于各种支架材料的干细胞进行茜素红染色结果。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1支架材料的制取

本实施例利用盐析法制备聚酯类复合支架，其中所使用的pcl可依据已公开的文献制取或从第三方购买，比如：aldrich。本实施例使用的psed均可依据文献biomaterials，2010，31(12)：3129～3138制取。

按质量比3∶7将psed和pcl进行交联，具体方法为：

准备一件模子，其包括特氟龙镀层的不锈钢容腔和特氟龙镀层的圆环。支架材料的厚度可以通过钢垫片来实现，比如：1mm的厚度，在圆环中铺入粒径75μm～150μm致孔剂(如：盐颗粒)，并于温度37℃，相对湿度85％放置1.5小时。然后置入真空干燥箱(100℃，1torr)1小时，除去水分，制成盐膜。将psed和pcl混合溶解于四氢呋喃(thf)后滴加在盐膜中，在通风橱中放置30分钟使thf挥发。将盐膜置入真空干燥箱(150℃，1torr)热交联反应24小时。之后将交联好的盐模取出后放入蒸馏水中溶解去除致孔剂，净化后冷冻干燥，即得psed/pcl多孔支架材料。

实施例2支架材料的形貌观察和性能测试

psed/pcl支架材料喷金后，置于扫描电镜(sem)下观察其形貌(参见图1和图2)，结果显示支架材料为多孔贯通结构，孔隙大小在75μm～150μm。

孔隙率测定：采用乙醇渗透法，将多孔支架材料浸泡在无水乙醇中，浸泡前后记录无水乙醇的体积分别为v1和v2，15分钟后，将支架材料移出乙醇溶液，记录剩余的乙醇体积为v3，根据如下公示计算多孔支架的孔隙率(％)。测试支架材料性状大小为10mm×1mm圆形片材，测试10片支架材料，结果进行统计分析。结果如表1所示。

玻璃态温度测定：差示扫描量热法，氮气保护下，测定-70度至150度范围内，支架材料的热力学行为，通过软件分析获得支架材料玻璃态温度。结果如表1所示。

力学性能测定：10mm×1mm的圆形片材支架材料进行压缩测定，以0.01n的初始压力，2.00mm/min的形变速度，在形变40％时，测定支架材料的抗压强度，通过应力-应变曲线计算支架材料的杨氏模量，取5个点的数据进行统计学分析。结果如表1所示。

表1支架材料理化性能

在扫描电镜下，支架的空隙外径为75μm～150μm。

实施例3支架材料对接种于其上的干细胞生物性能检测

细胞增殖实验：以1×10⁴个每孔的细胞密度将干细胞种植于预铺支架材料的96孔细胞培养板内，分为3组：psed/pcl组、psed组、pcl组和玻璃板组，每组设置3个复孔，并设置4个时间点：0h、24h、48h和72h。将所有孔的细胞接种完成的时间点定为0h，加入cck-8溶液10μl后，置入37℃培养箱避光孵育2h，使用酶标仪测定0h时间点细胞450nm波长处的吸光度值。记录数据后，将培养板放回培养箱内。之后的时间点重复上述操作，记录每个时间点细胞450nm波长处的吸光度值并做统计分析。结果显示生长在psed/pcl支架上的人脂肪间充质干细胞增殖速率明显高于对照组，表明psed/pcl支架能提高人脂肪间充质干细胞的增殖能力(详见图2)。

成骨相关基因表达检测：干细胞在psed/pcl、psed、pcl和玻璃皿上培养14d后，提取细胞trna，反转录为cdna后，通过荧光定量pcr分析检测成骨相关基因的表达水平，如：runt相关转录因子2重组蛋白(runt-relatedtranscriptionfactor2，runx2)、i型胶原α1重组蛋白(recombinantcollagentypeialpha1，col-1α)、骨桥蛋白(osteopontin，opn)、骨钙素(osteocalcin，ocn)和骨涎蛋白(bonesialoprotein，bsp)。结果显示生长在psed/pcl支架上的人脂肪间充质干细胞成骨相关基因runx2、col-1α、opn、ocn和bsp的表达显著提高，表明psed/pcl支架具有上调干细胞成骨标志性基因表达的作用(参见图3)

细胞外基质矿化染色：干细胞在psed-pcl、psed、pcl和玻璃皿上培养14d后进行碱性磷酸酶染色(alp)和茜素红染色(ar)。碱性磷酸酶染色(参见图4)及茜素红染色(参见图5)结果显示，相较于其它组，psed/plc支架上的干细胞的矿化钙结节最丰富，表明psed/plc支架能促进干细胞的细胞外基质矿化，适用于在骨修复中应用。

在支架材料上接种干细胞，经体外非成骨分化培养基培养，将支架材料移植到体内非承重骨(如：眼眶骨和颅盖骨)骨缺损处，移植后随访观察6个月，ct检查缺损部位骨修复效果。

实践中，考虑到干细胞的来源，可以使用间充质干细胞，比如：人脂肪间充质干细胞。