本发明涉及微生物领域、基因工程领域及兽医生物制药领域，具体地说，涉及一种用昆虫细胞-杆状病毒表达系统生产猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的方法。
背景技术：
猫传染性鼻结膜炎是由猫杯状病毒(felinecalicivirus，fcv)引起，临床上以鼻炎、结膜炎、急性口腔溃疡、肺炎和慢性胃炎为特征。目前认为，fcv呈世界性分布，并可能感染所有的猫科动物。猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus，fpv)引起，临床表现以患猫突发高热、呕吐、腹泻、脱水及循环血流中白细胞减少为特征。fpv主要感染猫科与鼬科等多种动物，尤其以6月龄以下幼小动物的发病率和死亡率更高，是猫科动物最重要的传染病。
为了猫免遭传染病的威胁，保持其身心健康，对其接种疫苗是关键。需要接种的核心疫苗包括的抗原有：fpv、fcv、猫传染性鼻气管炎病毒(felineherpesvirus,fhv)、狂犬病病毒(rabies,rabv)。目前，相关的国产疫苗有猫二联疫苗，包括fpv、rabv，但在网上、市场上均找不到关于此疫苗的具体信息，很可能是某科研单位的中试产品。市售疫苗均为进口疫苗，主要为猫三联疫苗，包括fpv、fcv、fhv。这些疫苗均为弱毒疫苗或灭活疫苗，而弱毒疫苗有潜在的安全隐患，灭活疫苗不能有效刺激机体产生细胞免疫等缺点。此外，病毒变异是导致当前疫苗免疫失败的主要原因。因此针对流行毒株制备新型、高效、安全的新型疫苗对猫传染病的防控具有重大意义。
本发明选用国内流行毒株，使用基因工程手段制备病毒样颗粒抗原，进行新型猫二联基因工程疫苗的制备，可同时预防猫传染性鼻结膜炎、猫泛白细胞减少症。由于病毒样颗粒形态和结构与天然病毒粒子相似，因此可有效的诱导机体产生细胞免疫和体液免疫；由于病毒样颗粒不含有核酸，不能自主复制，因此安全性更高。此外，还有易生产、效价高、成本低等优点，同时填补了国内关于猫疫苗研制、商品化的空白。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗及其制备方法。
本发明提供的一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗含有猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。
所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示。
所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。
为了实现本发明目的，本发明利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统来生产猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。
本发明首先提供一种优化的猫杯状病毒vp1基因、一种优化的猫泛白细胞减少症病毒vp2基因，即根据昆虫细胞偏爱密码子进行优化的基因。优化后的猫杯状病毒vp1基因如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示；优化后的猫泛白细胞减少症病毒vp2基因如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。
本发明提供了上述猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联疫苗的制备方法，包括制备猫杯状病毒病毒样颗粒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒、将两种病毒样颗粒进行混合，添加防腐剂和佐剂，且混合前，猫杯状病毒病毒样颗粒含量不低于4mg/ml，猫泛白细胞减少症病毒血凝效价不低于1:214。
所述猫杯状病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示；所述猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒中，猫杯状病毒病毒的基因序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示。
具体地，本发明提供的一种猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：(1)根据昆虫细胞偏爱密码子对猫杯状病毒vp1基因、猫泛白细胞减少症病毒vp2基因进行优化，将优化的基因分别插入到昆虫细胞表达载体中，转化dh10bac感受态，提取重组杆状病毒基因组；(2)将重组杆状病毒基因组转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒，按moi＝0.1-1接种昆虫细胞，4-5天后收获混合物，即分别获得猫杯状病毒抗原、猫泛白细胞减少症病毒抗原；(3)将猫杯状病毒抗原反复冻融1次后收获上清，即获得猫杯状病毒病毒样颗粒；将猫泛白细胞减少症病毒抗原使用裂解液处理细胞后收获上清，即获得猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒。
在一个优选实施方案中，所述的一种猫杯状病毒和猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备方法，其中所述用于处理细胞的裂解液，为nahco3溶液，更优先的是25mm浓度的nahco3溶液。
本发明的另一目的是提供一种猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗，其中包含至少一种猫杯状病毒抗原和至少一种猫泛白细胞减少症病毒抗原。
为了实现本发明目的，本发明将上述制备的两种病毒样颗粒按一定比例混合，并辅以防腐剂和佐剂制备而成。其中，两种病毒样颗粒混合体积比例为1:1-5:1，优选比例为3:1，所述防腐剂为硫柳汞等，优选终浓度为0.005％；所述佐剂为磷酸铝等，优选终浓度为0.4％。
本发明的猫杯猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗为肌肉注射疫苗或皮下注射疫苗。
本发明进一步提供上述制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗在预防猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症中的应用。
本发明以杆状病毒作为表达载体，以sf9细胞作为生物反应器，制备的猫传染性鼻结膜炎和猫泛白细胞减少症二联基因工程疫苗具有滴度高、免疫原性高、安全性好、便于大规模生产等优点，免疫后可诱导机体产生高水平的特异性抗体，对猫传染性鼻结膜炎、猫泛白细胞减少症具有良好的免疫预防效果。
附图说明
图1为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒vp1蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，a为病毒感染孔，b为正常细胞孔。
图2为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒vp1蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原的sds-page、westernblot鉴定结果；其中，a为sds-page鉴定结果，泳道1为重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后沉淀，泳道2为重组杆状病毒感染sf9细胞后收获的抗原，泳道3为重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后上清，泳道4为f81细胞培养的细胞毒，泳道5为蛋白彩虹marker，b为westernblot鉴定结果，泳道1为重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后沉淀，泳道2为重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原冻融一次离心后上清，泳道3为f81细胞培养的细胞毒，泳道4为蛋白暴光marker，泳道5为蛋白彩虹marker。
图3为本发明实施例1中可表达猫杯状病毒vp1蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞收获抗原的电镜观察结果。
图4为本发明实施例1中制备的猫杯状病毒单克隆抗体间接免疫荧光检测结果；其中，a为表达猫杯状病毒vp1蛋白的重组杆状病毒感染的sf9细胞，b为正常sf9细胞，c为猫杯状病毒感染的f81细胞，d为正常f81细胞。
图5为本发明实施例1中制备的猫杯状病毒多克隆抗体间接免疫荧光检测结果；其中，a为表达猫杯状病毒vp1蛋白的重组杆状病毒感染的sf9细胞，b为正常sf9细胞，c为猫杯状病毒感染的f81细胞，d为正常f81细胞。
图6为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白的重组杆状病毒vp1的重组杆状病毒感染sf9细胞后间接免疫荧光检测结果；其中，a为病毒感染孔，b为正常细胞孔。
图7为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞后收获抗原的sds-page、westernblot鉴定结果；其中，a为sds-page鉴定结果，b为westernblot鉴定结果。
图8为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞收获抗原的电镜观察结果。
图9为本发明实施例2中可表达猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白的重组杆状病毒感染sf9细胞收获抗原的血凝检测结果；其中，a为序列优化后制备的抗原，b为序列未优化后制备的抗原。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1猫杯状病毒病毒样颗粒的制备及鉴定
对fcv-jl2毒株提取rna、反转录、pcr进行测序后，获得vp1序列，根据insectnewii细胞偏爱性进行优化，密码子偏爱性指标由0.47调整至0.98，gc含量由42.6％调整至57.6％，并去除不利的顺式作用元件，去除mrna易成颈-环区域等。将优化后序列送公司进行基因合成。对优化后的序列，使用引物扩增vp1基因，分别通过noti-hindiii、smai-xhoi连入pfastbacdual载体中，获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化dh10bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组bacmid。将bacmid转染sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多。对24孔板中已长单层的sf9接种重组杆状病毒，48h后使用针对猫杯状病毒的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的绿色荧光，见图1的a图，表明可成功表达目的蛋白。
对重组杆状病毒以moi＝0.1接毒量接种悬浮培养的sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原冻融一次后，3000rpm30min离心，分离上清和沉淀，进行sds-page检测，以f81细胞培养的细胞毒作为对照。结果可见，收获的vlps有目的蛋白条带(图2a，第1-3泳道)，细胞毒对照泳道显示的粗条带为培养液中的血清成分，非目的蛋白。使用针对猫杯状病毒的单克隆抗体(购自mybiosourc公司)进行westernblot检测，可见vlps样品泳道有特异性目的条带(图2b，第1-2泳道)，且冻融一次后，目的蛋白主要进入上清中。且收获的vlps的目的蛋白明显多于细胞毒对照(图2b，第3泳道)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径38nm左右的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图3)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。
对重组杆状病毒以moi＝0.1接毒量接种悬浮培养的sf9细胞，接毒后4天收获抗原，冻融一次后，3000rpm30min收获上清。经超速离心30000rpm1.5h，获得的沉淀用pbs溶解。再经蔗糖梯度离心(蔗糖密度从上至下依次为：10％、20％、30％、40％)，收获10-20％之间条带的病毒，溶解于pbs中，再经30000rpm1.5h，获得的沉淀用pbs溶解。用bca法测定蛋白浓度后，免疫小鼠，制备单克隆抗体。最后筛选得到一株单克隆细胞株，为13#，浓度为2.5mg/ml，亚型为g2b。使用13#单抗分别对表达fcv-vp1的重组杆状病毒感染的sf9细胞(图4的a、b图)、fcv活毒感染的f81细胞(图4的c、d图)进行间接免疫荧光染色，接种病毒孔均显示为绿色的阳性(图4的a、c图)，细胞对照孔为阴性(图4的b、d图)。
对fcv活毒感染f81细胞收获的病毒液冻融两次后，3000rpm30min收获上清。按1/50比例加入1.3m醋酸锌，4℃沉淀1h，10000rpm30min，用饱和edta悬浮沉淀，再经蔗糖梯度离心(蔗糖密度从上至下依次为：20％、30％、40％)，收获20-30％之间条带的病毒，溶解于pbs中，再经30000rpm1.5h，获得的沉淀用pbs溶解。用bca法测定蛋白浓度后，采用背部多点免疫兔，500ug/次，共免疫四次，制备多克隆抗体,浓度为9.8mg/ml。使用多克隆抗体分别对表达fcv-vp1的重组杆状病毒感染的sf9细胞(图5的a、b图)、fcv活毒感染的f81细胞(图5的c、d图)进行间接免疫荧光染色，接种病毒孔均显示为绿色的阳性(图5a、c)，细胞对照孔为阴性(图5的b、d图)。
使用制备的13#单抗作为捕获抗体，包被elisa板子，包被浓度为1ug/孔，再加入待检抗原(制备的vlps)，再以制备的兔多抗10000倍稀释作为检测抗体，hrp-抗兔抗体20000倍稀释为二抗，用显色液进行显色，终止显色后使用酶标仪读取od值。结果显示(表1)，经序列优化制备的重组杆状病毒表达的vlpsod值高于序列未优化制备的重组杆状病毒表达的vlps、f81细胞培养的细胞阳性毒，表明fcvvp1经序列优化后，显著改变了目的蛋白表达量，且比常规培养的细胞毒表达量高。
表1双抗体夹心elisa结果
实施例2猫泛白细胞减少症病毒病毒样颗粒的制备及鉴定
对fpv毒株提取基因组进行测序后，获得vp2基因序列，根据insectnewii细胞偏爱性进行优化，密码子偏爱性指标由0.37调整至0.87，gc含量由35.1％调整至53.0％。将优化后序列送公司进行基因合成。对优化后的序列，使用引物扩增vp2基因，分别通过noti-hindiii、xhoi-nhei连入pfastbacdual载体中，获得携带有双拷贝外源片段的转移载体。将转移载体转化dh10bac感受态进行重组，获得携带有双拷贝外源片段的重组杆状病毒基因组bacmid。将bacmid转染sf9细胞后，拯救获得重组杆状病毒。将重组杆状病毒感染sf9细胞，可产生明显的细胞病变，如体积增大、细胞脱落、细胞内颗粒增多。对24孔板中已长单层的sf9接种重组杆状病毒，48h后使用针对猫细小病毒的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测，可见有特异性的绿色荧光(图6的a)，表明可成功表达目的蛋白。
对重组杆状病毒以moi＝0.1接毒量接种悬浮sf9细胞，接毒后4天收获抗原，对抗原进行sds-page检测，结果可见有目的蛋白条带(图7的a图)。使用针对猫细小病毒的单克隆抗体针进行westernblot检测，可见有特异性目的条带(图7的b图)。对抗原负染后，进行电镜观察，结果可见有直径20nm左右的病毒样颗粒，形态与天然病毒相似(图8)，表明表达的目的蛋白可成功组装成病毒样颗粒。使用15mmph6.5pbs进行血凝效价的测定，经序列优化后收获的重组病毒表达的fpv抗原效价可达1:218(图9的a图)，而未经序列优化后收获的重组病毒表达的fpv抗原效价仅能达1:212(图9的b图)，结果表明，序列优化后，fpvvp2表达量明显增多，且能组装成有血凝活性的抗原。
实施例3猫免疫试验
将上述重组杆状病毒按moi＝0.1分别接种悬浮sf9细胞，培养4天后收获。将接种了fcv抗原的sf9细胞冻融1次后，3000rpm离心30min，获得上清，即为含有fcv病毒样颗粒的收获液。使用bca法测定蛋白浓度，为4.9mg/ml。将接种了fpv抗原的sf9细胞直接3000rpm离心30min，弃上清，细胞用等体积25mmnahco3悬浮，冰上作用30min，3000rpm离心30min，获得上清，即为含有fpv病毒样颗粒的收获液。使用猪血进行血凝效价的测定，ha为1:216。
将上述制备的fcv病毒样颗粒、fpv病毒样颗粒按3:1体积混合，再按1/5比例加入20％铝胶佐剂(哈药六厂)、0.005％硫柳汞，制成猫二联疫苗。再按上述方法分别制备猫fcv疫苗、猫fpv疫苗。制备的疫苗均于4℃保存。
将8-9周龄幼猫(fcv中和抗体效价不高于1:4、fpvhi效价不高于1:4)分为4组，分别为免疫a组、免疫b组、免疫c组和对照组，3只/组，分别免疫猫二联疫苗、猫fcv疫苗、猫fpv疫苗和pbs，免疫剂量为1.0ml/只，首免后第4周加强免疫一次。免疫后每2周采血，分离血清，测定其fcv中和抗体效价、fpv血凝抑制抗体效价。
结果显示，免疫后2周，免疫a组均可刺激机体产生抗猫杯状病毒中和抗体(表2)和抗猫泛白细胞减少症病毒血凝抑制抗体(表3)，且加强免疫后抗体增加，并可持续至第8周。且免疫组与对照组饮食、精神状态、体温均正常，也无其他不良反应。此外，针对fpv的血凝抑制抗体效价而言，免疫a组与免疫c组的效果无显著差异，血凝抑制抗体效价最高时均可达到1:211。而针对fcv的中和抗体效价而言，免疫a组抗体效价比免疫b组高，免疫效果好，免疫a组的中和抗体效价最高可达1：39.81。说明两种病毒样颗粒混合后免疫，刺激机体产生的效价在原来单独使用的基础上，会进一步的提高。
表2fcv中和抗体效价(1：n)
表3fpv血凝抑制抗体效价(1：2n)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
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