本发明属于生物医药
技术领域：
，更具体地，涉及一种口服胰岛素纳米颗粒制剂及其制备方法和应用。
背景技术：
：胰岛素自问世以来一直是胰岛素依赖型糖尿病患者的首选药物。胰岛素主要通过皮下途径给药，且需要长期反复给药，这造成病人极大的痛苦以及低的顺应性，同时还会造成一系列的安全性问题，如过敏反应、皮下脂肪萎缩或增生、耐受性等等。相比于皮下注射带来的一系列问题，口服给药被认为是更适合的给药途径。口服给药可以有效的减少高胰岛素血症，防范与全身胰岛素治疗相关的体质量增加，降低低血糖的风险，同时口服胰岛素通过胃肠道吸收进入门静脉直接参与肝脏对葡萄糖的代谢，能够精确的模拟人体正常生理途径。然而由于胰岛素在胃肠道生理环境下易降解变性，且在小肠处吸收效率很低，造成口服胰岛素的生物利用度极低。装载蛋白的纳米颗粒体系，如脂质体，胶束，聚合物/蛋白复合粒子，无机粒子等，可以有效的提高胰岛素的口服利用度，被广泛应用于口服输送胰岛素。小肠上皮表面覆盖一层黏液层，可以阻挡并快速清除外部颗粒以及有害物质进入小肠。口服载药颗粒到达小肠后，首先要穿过黏液层屏障才能被小肠吸收。克服这一屏障主要通过黏液穿透以及黏液吸附两种策略来实现。研究发现，表面亲水且显电中性或电负性的颗粒与黏液层作用力小，可以有效的穿过黏液层抵达小肠上皮细胞。然而由于其“惰性”的表面性质，颗粒难以被小肠上皮细胞吸收；且由于其缺乏与小肠黏液的相互作用力，导致其小肠内滞留时间下降；这一系列原因造成黏液穿透体系生物利用度偏低。黏液吸附性材料可以通过静电力，氢键，疏水力，共价键合等方式与黏液层相互作用，增加颗粒进入黏液层的效率以及颗粒在小肠处的滞留时间，促进胰岛素在小肠处的吸收。然而，由于黏液吸附性颗粒与黏液具有较强的作用力，颗粒容易被困在黏液层，并被黏液层快速清除，无法到达小肠上皮处，造成胰岛素的生物利用度不高。现今仍旧缺乏一种有效克服小肠黏液层屏障的胰岛素输送体系。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服现有胰岛素输送体系存在的缺陷和不足，通过利用改性的壳聚糖季铵盐以及巯基化透明质酸制备得到了一种具有核壳结构负载有胰岛素的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有黏附和穿透小肠黏液的功能，提高了胰岛素在小肠部位的吸收，具有高的口服生物利用度，可以给i型糖尿病患者提供一种方便，无痛苦，安全高效的给药方式。本发明的第一个目的是提供一种负载胰岛素的纳米颗粒。本发明的第二个目的是提供所述负载胰岛素纳米颗粒的制备方法。本发明的第三个目的是提供所述负载胰岛素纳米颗粒的应用。本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种负载胰岛素的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有核壳结构，核为壳聚糖季铵盐和胰岛素组成的纳米复合核心，壳为涂覆在核心表面的透明质酸或巯基化透明质酸。本发明纳米颗粒中经季铵化改性后的壳聚糖季铵盐在生理条件下具有良好的水溶性，同时具有更好的打开紧密连接的能力；而透明质酸生物相容性好，经巯基改性后的巯基化透明质酸可以与小肠黏液中粘蛋白形成二硫键，增强黏液吸附性。优选地，所述壳聚糖季铵盐的分子量为50kda～200kda(优选为50kda)，季铵化程度为10%～70%（优选为43%）；巯基化透明质酸的分子量为3.4kda～200kda(优选为35kda)，巯基化程度为5%～30%（优选为12.3%）。优选地，所述纳米颗粒的粒径为50～200nm（优选为100nm）。优选地，所述纳米颗粒的pdi为0.1～0.2。优选地，所述纳米颗粒的电位为-5mv～-30mv。优选地，所述纳米颗粒的载药量为25%～60%。本发明负载胰岛素的纳米颗粒具有黏附和穿透小肠黏液的功能，提高了胰岛素在小肠部位的吸收，具有高的口服生物利用度；因此本发明还请求保护上述纳米颗粒在制备口服胰岛素制剂中的应用。一种口服胰岛素药物制剂，包含上述负载胰岛素的纳米颗粒。优选地，所述药物制剂还包含药学上可接受的赋形剂。优选地，所述药物制剂为冻干制剂。优选地，所述药物制剂为胶囊。一种制备负载胰岛素纳米颗粒的方法，包括如下步骤：s1.将壳聚糖季铵盐溶液通过通道1和2，胰岛素溶液通过3和4，到达涡流混合区域中混合，得到胰岛素与壳聚糖季铵盐组成的纳米复合核心；四个通道液体匀速流动，流速为2ml/min～50ml/min（优选为5ml/min～50ml/min，更优选为40ml/min）；s2.将s1所得混合液通过通道1和2，透明质酸或巯基化透明质酸溶液通过通道3和4，到达涡流混合区域中混合，得到表面涂覆透明质酸或巯基化透明质酸纳米颗粒；四个通道液体匀速流动，流速为2ml/min～50ml/min（优选为5ml/min～50ml/min，更优选为40ml/min）；优选地，本发明采用fnc技术在多入口涡流混合器中来制备负载胰岛素纳米颗粒，所述多入口涡流混合器（如图1a，1b所示）包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体；第一部件设置有多个通道（优选为4个，分别为通道1，通道2，通道3，通道4），第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道；第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通；第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通；第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通；具有高通量，可控性强的特点，制得的纳米颗粒分布均匀且粒径较小，批次间差异小；上述技术及装置记载在本发明人前期申请号为pct/us2017/014080的专利中。优选地，所述的胰岛素溶液的ph为7～9（优选8.0）；具体为将胰岛素溶解于ph=2的hcl溶液中，后用naoh溶液将ph值调至7～9（优选8.0）。优选地，所述壳聚糖季铵盐的季铵化程度为10%～70%（优选为43%）；所述巯基化透明质酸的巯基化程度为5%～30%（优选为12.3%）。优选地，所述壳聚糖季铵盐的浓度为0.2～3mg/ml（优选为1mg/ml），胰岛素溶液浓度为0.5～3mg/ml（优选为2mg/ml）。优选地，所述透明质酸或巯基化透明质酸的浓度为0.25～1mg/ml（优选为1mg/ml）。优选地，所述胰岛素与壳聚糖季铵盐的质量比为0.5～2。优选地，所述壳聚糖季铵盐的制备方法为：将壳聚糖溶解于2wt%的醋酸溶液中，加热至80℃，后向溶液内滴加氯化缩水甘油基三甲基铵（gtmac）水溶液，80℃下反应24h，得到最终产物壳聚糖季铵盐（htcc）。优选地，所述巯基化透明质酸的制备方法为：将透明质酸（ha）溶解于双蒸水中，加入离子交换树脂搅拌0.5h，滤去树脂，利用四丁基氢氧化铵将溶液ph值调至7.04，冻干，得到产物ha-tba。将第一步所得产物ha-tba溶解于dmso中，并加入4-二甲氨基吡啶，二硫代二丙酸，二碳酸二叔丁酯，在45℃反应20h。对水透析，除去dmso，后在丙酮中沉淀两次，溶解于双蒸水中，冻干。将冻干产物溶解于双蒸水中，调节ph至8.5，加入二硫苏糖醇，反应3h，将ph值调节至3.5，在冰乙醇中沉淀一次，复溶于双蒸水中，冻干即得到巯基化透明质酸（ha-sh）。本发明通过对黏液穿透性材料-透明质酸进行巯基化改性，得到巯基化透明质酸，并利用fnc技术将巯基化透明质酸涂敷于装载胰岛素纳米颗粒表面，使其能够与小肠黏液层具有较强相互作用，相比于单纯利用透明质酸作为涂覆层，增加颗粒进入小肠黏液层以及在小肠处的滞留时间；同时，进入小肠黏液层后，巯基化透明质酸涂层可以随时间逐渐降解脱落，相比于单纯的胰岛素与壳聚糖季铵盐的纳米复合核心具有更好的黏液穿透性，减少滞留在黏液层的纳米颗粒，增加到达小肠上皮处的颗粒；颗粒穿过黏液层达到小肠上皮这一过程中，外层巯基化透明质酸涂覆层脱落，具有打开小肠上皮紧密连接功能的壳聚糖季铵盐暴露出来，发挥作用，促进胰岛素通过细胞旁路被小肠吸收。本发明中胰岛素纳米制剂，口服后可以有效控制血糖，且相较于皮下注射，血糖变化更加平稳，具有良好的降血糖效果以及高的生物利用度。本发明的口服胰岛素制剂可以有效控制血糖，极大的减轻糖尿病病人不必要的痛苦，安全且方便。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明所述纳米颗粒具有较高包封率和/或载药量且具有黏附和穿透小肠黏液的功能，提高了胰岛素在小肠部位的吸收，具有高的口服生物利用度；所述胰岛素纳米制剂，口服后可以有效控制血糖，且相较于皮下注射，血糖变化更加平稳，具有良好的降血糖效果以及高的生物利用度，可以有效控制血糖，极大的减轻糖尿病病人不必要的痛苦，安全且方便。附图说明图1为示例性地描述了用于制备本发明的纳米粒的多入口涡流混合器；图1a为第一部件、第二部件和第三部件组装后并连接了外部管道的状态；图1b-1为第一部件的仰视图；图1b-2为第二部件的俯视图；图1b-3为第三部件的俯视图；图1c显示了实施例1中用于制备纳米粒的装置，图1c-1显示了注射器、高压泵、塑料管和多入口涡流混合器，图1c-2为连接了塑料管的多入口涡流混合器的放大图。图2所示为多入口涡流混合器的示意图以及本发明制备纳米颗粒的制备示意图。图3所示为实施例3中不同流速得到的纳米复合核心（nc）。htcc浓度为1mg/ml，胰岛素浓度为2mg/ml。图4所示为实施例3中不同胰岛素与htcc比例得到的纳米核心（nc），流速为40ml/min，htcc浓度为1mg/ml。图5所示为实施例3中不同胰岛素/htcc比例下对应的nc的包封率以及载药量。图6所示为实施例3中制得的npha以及npha-sh，流速为40ml/min。图7所示为优选条件下制得的nc，npha和npha-sh的透射电镜图。图8所示为实施例5中模拟胃肠道环境的胰岛素释放曲线。图9所示为实施例5中生理条件下胰岛素释放曲线。图10所示为实施例6中粘蛋白，ha-sh/粘蛋白共混物和ha-sh/粘蛋白孵育后冻干粉的dsc曲线。图11所示为实施例7中nc，npha以及npha-sh在光漂白过程中的荧光图像。图12所示为实施例7中光漂白区域平均荧光强度随时间变化关系。图13所示为实施例8中npha以及npha-sh在e12单细胞层中的分布，其中，htcc用ritc标记，胰岛素用cy5标记。图14所示为实施例8中npha以及npha-sh在e12单细胞层中的分布，其中ha和ha-sh用罗丹明123标记，胰岛素用cy5标记。图15所示为实施例9中经三种颗粒处理后，除去黏液前后小肠的荧光图像。图16所示为实施例9中经三种颗粒处理后，除去黏液前后小肠表面的平均荧光强度。图17所示为后实施例10中加入胰岛素溶液或纳米颗粒细胞跨膜电阻随时间的变化。图18所示为实施例10中不同颗粒运输胰岛素穿过caco2单细胞层的表观渗透系数。图19所示为实施例10中加入npha-sh颗粒前后caco2细胞的紧密连接。图20所示为实施例11中口服胰岛素溶液或载胰岛素颗粒后，胰岛素在小肠部位的吸收情况。图21所示为实施例12中口服载胰岛素颗粒或皮下注射胰岛素溶液后的降血糖曲线图22所示为实施例13中口服npha，npha-sh，胰岛素溶液以及皮下注射胰岛素溶液后的血药浓度随时间变化。图23所示为实施例14中利用不同季铵化程度的htcc得到的nc纳米颗粒。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1壳聚糖季铵盐（htcc）的合成将2g壳聚糖溶解于100ml的2wt%的醋酸溶液中，加热至80oc后向溶液内缓慢滴加5ml氯化缩水甘油基三甲基铵（gtmac）水溶液，80oc下反应24h，所得溶液冷却后在10倍体积的丙酮中沉淀2次，沉淀物复溶于双蒸水中，对水透析3天，冻干，得到最终产物htcc。其中gtmac水溶液质量浓度为20%，htcc季铵化程度为43%。此外，通过调节gtmac的体积为2ml或4ml可以得到季铵化程度分别为为12%和23%的htcc。实施例2巯基化透明质酸（ha-sh）的合成1、将透明质酸（ha）溶解于双蒸水中，浓度为5mg/ml，加入离子交换树脂（树脂与透明质酸质量比为3：1），搅拌0.5h，滤去树脂，利用四丁基氢氧化铵将溶液ph值调至7.04，冻干，得到产物ha-tba。2、将ha-tba（1.5g）溶解于dmso中，浓度为0.5mg/ml，并加入4-二甲氨基吡啶（0.35g），二硫代二丙酸（2.4g），二碳酸二叔丁酯（0.2ml），在45℃反应20h。冷却至室温后，对双蒸水透析，除去dmso，后在10倍体积的丙酮中沉淀两次，溶解于双蒸水中，对水透析3天，冻干。将冻干产物（0.5g）溶解于双蒸水中，调节ph至8.5，加入二硫苏糖醇（0.5g），反应3h，将ph值调节至3.5，在冰乙醇中沉淀一次，复溶于双蒸水中，冻干即得到巯基化透明质酸（ha-sh）。ha-sh的巯基化程度为12.3%。其中，调节二硫代二丙酸的质量为1.5g和5.0g，可以得到巯基化程度分别为8.4%和32.3%的ha-sh。实施例3利用fnc技术制备纳米颗粒fnc技术为一种水相中通过静电相互作用制备载药纳米颗粒的技术（记载在本发明人前期申请号为pct/us2017/014080的专利中），制备过程主要在多入口涡流混合器中进行，具有高通量，可控性强的特点，制得的纳米颗粒分布均匀且粒径较小，批次间差异小。由于整个过程中无有机溶剂的参与，特别适合于蛋白、核酸等生物大分子的制剂化。所述多入口涡流混合器（图1a，图1b）包括位于上部的第一部件、位于中部的第二部件和位于下部的第三部件，所述第一部件、第二部件和第三部件为具有相同直径的圆柱体；第一部件设置有多个通道（优选为4个，分别为通道1，通道2，通道3，通道4），第二部件设置涡流混合区域和多个导流区域，第三部件设置通道；第一部件的通道与第二部件的导流区域流体连通；第二部件的导流区域均与涡流混合区域流体连通；第二部件的涡流混合区域与第三部件的通道流体连通。1、胰岛素与htcc纳米复合核心的制备htcc溶解于水中，浓度为1mg/ml。胰岛素溶解于ph=2的hcl溶液中，后用naoh溶液将ph值调至8.0，胰岛素溶液浓度为0.5～3mg/ml。将htcc溶液和胰岛素溶液分别装入四支注射器中，将四支注射器分别置于高压泵上，各注射器的注射孔分别与塑料管1～4各自的一端密封连接，塑料管的另一端分别通过连接部件与多入口涡流混合器第一部件的四个通道密封连接。多入口涡流混合器的第一部件、第二部件和第三部件通过螺栓密封连接，并且第三部件的通道通过连接部件与塑料管5的一端密封连接，塑料管5的另一端连接收集容器；图1c显示了本实施例的制备纳米粒的装置，图1c-1显示了注射器、高压泵、塑料管和多入口涡流混合器，图1c-2为连接了塑料管的多入口涡流混合器的放大图。开启高压泵，使htcc溶液和胰岛素溶液和胰岛素溶液同时以25ml/min的流速经塑料管1-4进入多入口涡流混合器，并在第二部件的涡流混合区域混合；所述htcc溶液分布于第一以及第二通道，胰岛素溶液分布于第三及第四通道，如图2所示，四个通道流速一致，调节通道流速，2ml/min，5ml/min，10ml/min，20ml/min，30ml/min，40ml/min，50ml/min，使两种溶液通过四个通道到达涡流混合区进行混合，得到胰岛素与htcc的纳米复合核心（nc）。图3所示为不同流速得到的nc。htcc浓度为1mg/ml，胰岛素浓度为2mg/ml。当流速小于20ml/min时，颗粒粒径随流速降低而增大，当流速位于20～50ml/min之间时，颗粒粒径不变。当流速为40ml/min时，得到的颗粒最为均一。选择流速40ml/min这一优选条件。图4所示为不同胰岛素与htcc比例得到的nc，流速为40ml/min，htcc浓度为1mg/ml。当胰岛素/htcc（w/w）大于2时，颗粒电位急剧下降，粒径急剧增大；当胰岛素/htcc（w/w）位于0.5～2之间时，得到的颗粒电位及粒径基本相同。图5所示为不同胰岛素/htcc比例下对应的nc的包封率以及载药量。为了得到较高的载药量，最终选择胰岛素浓度为2mg/ml，htcc浓度为1mg/ml这一优选条件。2、表面涂敷ha（npha）或ha-sh（npha-sh）纳米颗粒的制备透明质酸或巯基化透明质酸溶解于水中，浓度为0.25mg/ml，0.5mg/ml，0.75mg/ml，1mg/ml，第一步制得的nc混悬液分布于第一及第二通道，ha或者ha-sh水溶液分布于第三及第四通道，如图2b所示，四个通道流速一致，调节通道流速5ml/min，10ml/min，20ml/min，30ml/min，40ml/min，50ml/min，使两种液体通过四个通道到达涡流混合区域进行混合，得到表面涂敷ha（npha）或ha-sh（npha-sh）的纳米颗粒。表1为经过筛选后，优选条件下得到的npha和npha-sh。图6所示为制得的npha以及npha-sh，流速为40ml/min。nc经ha或ha-sh表面涂敷后，粒径增大，电荷发生反转。对于两种不同的涂层，二者粒径及电位基本相同。当ha或ha-sh浓度逐渐升高时，粒径逐渐减小，同时电位逐渐增加。最终选择ha及ha-sh浓度为1mg/ml，此时有最小的粒径以及多分散性指数。表1所示为优选条件下制得的npha和npha-sh。表1优选条件下制得的npha和npha-sh纳米颗粒粒径（nm）pdiζ-电位（mv）包封率（%）载药量（%）npha101±30.11±0.03-25.3±2.090.5±0.637.6±0.2npha-sh102±30.11±0.02-26.2±1.091.1±0.438.0±0.1实施例4粒径、电位和形态表征利用马尔文粒径仪测量颗粒的粒径、多分散性指数以及表面电位。利用透射电镜表征颗粒的形态。图7所示为优选条件下制得的nc，npha和npha-sh的透射电镜图。三种颗粒的粒径与马尔文粒径仪得到的粒径相一致。从图中可以清晰的看到npha和npha-sh颗粒的核壳结构。实施例5体外药物释放实验将nc悬浮液稀释1倍待用。取1ml的稀释一倍的nc颗粒悬浮液，1ml的npha悬浮液以及1ml的npha-sh颗粒悬浮液，分别置于1ml的透析管中，封口。将透析管置于20ml10mm的pbs缓冲液中，在37℃，150rpm的摇床中孵育，每隔特定时间取出1ml缓冲液（随后用1ml的空白缓冲液补充，保持体系体积不变），利用bca检测法测量胰岛素浓度。（1）模拟颗粒经过胃肠体系时ph值的变化，胃部ph值为2.5，胃排空时间为2～3h，小肠部ph值为6.8～7.4，为了模拟胃肠体系的ph环境，先将透析管置于ph=2.5的hcl溶液中，每隔1h取样一次。2h后，将缓冲液置换为ph=6.8的10mm的pbs缓冲液，每隔2h取样一次。图8所示为胰岛素的释放曲线。胃ph环境中，2小时后，nc颗粒有50%的胰岛素释放出来，然而对于ha以及ha-sh包覆的颗粒npha及npha-sh仅有33%的胰岛素释放出来，由此说明ha或ha-sh包覆的颗粒在胃部对胰岛素具有更好的保护效果。（2）将透析管置于ph=7.4的10mm的pbs缓冲液中，每隔2h取样一次。图9所示为生理条件下胰岛素释放曲线。在生理条件下，24小时内，高于70%的胰岛素可以被释放出来。实施例6利用差示扫描量热法（dsc）测量ha-sh与粘蛋白（mucin）的相互作用将ha-sh与猪粘蛋白共溶解于10mm的pbs溶液中，37oc下孵育8小时，后冻干。利用dsc测量粘蛋白，ha-sh/粘蛋白共混物和ha-sh/粘蛋白孵育后冻干粉的吸热曲线。其中ha-sh与粘蛋白的重量比为1:1，升温速率为20oc/min。由图10可知，粘蛋白在230oc时熔融，具有明显的吸热峰；ha-sh/粘蛋白共混物在230oc仍能观察到明显的粘蛋白的熔融峰；然而ha-sh/粘蛋白孵育后冻干粉的dsc曲线中，这一吸热峰消失，证明粘蛋白完全与ha-sh结合。实施例7利用光漂白测量载胰岛素纳米颗粒在黏液中的运动将20µl纳米颗粒悬浮液（胰岛素（ins）浓度为0.5mg/ml，胰岛素用ritc标记）与60µl小肠黏液混合均匀，在37oc下孵育0.5h，后置于荧光显微镜盖玻片上，利用激光共聚焦显微镜将某一特定区域暴露在100%的荧光强度（激发波长：552nm）下60s，并每隔10s采集一次图像，并统计曝光区域的平均荧光强度。图11所示nc，npha以及npha-sh在光漂白过程中的荧光图像。图12所示为光漂白区域平均荧光强度随时间变化关系。光漂白区域的荧光强度取决于光漂白过程的荧光损失以及纳米颗粒自由运动产生的荧光恢复。光漂白后，荧光强度损失越小，颗粒运动能力越强。60s后，npha仅有～17%的荧光损失，具有最强的运动能力。npha-sh荧光损失与npha相近，具有相似的运动能力，nc荧光损失最大，～50%，黏液中运动能力最差。实施例8载药纳米颗粒在e12单细胞层中的分布e12单细胞层用来模拟具有黏液层的小肠上皮体系。e12细胞接种于腔式盖玻片内，孵育3天，e12细胞形成单层细胞层。将100µlnpha和npha-sh于e12细胞共培养，孵育2小时后，将颗粒取出，用pbs清洗3次，利用4%的多聚甲醛溶液固定细胞，并用dapi对细胞核进行染色，后置于激光共聚焦显微镜下观察并采集不同深度的荧光图像。其中胰岛素用cy5标记，htcc用ritc标记来测量htcc/ins纳米复合核心的分布；胰岛素用cy5标记，ha以及ha-sh用罗丹明123标记来测量胰岛素以及ha（ha-sh）的分布。图13所示为胰岛素溶液，nc，npha以及npha-sh在e12单细胞层中的分布，其中，htcc用ritc标记，胰岛素用cy5标记。nc颗粒在30µm以及15µm的深度（黏液层）均观察到较强的htcc以及胰岛素的信号，且二者共定位。npha和npha-sh在30µm的深度基本观察不到htcc以及ins的信号，在深度为15µm时，可以观察到微弱的htcc以及胰岛素的信号，且二者共定位。在深度为0µm（细胞层）三种颗粒均能观察到强的htcc与ins的信号，且二者共定位。由此证明htcc以及ins的正电核心在穿过黏液层的过程中保持结合，并未解离，且npha和npha-sh比nc具有更强的黏液穿透能力。在深度为15µm处，npha-sh相比于npha具有更强的信号，说明npha-sh与黏液层具有更强的相互作用。图14所示为实施例8中npha以及npha-sh在e12单细胞层中的分布，其中ha和ha-sh用罗丹明123标记，胰岛素用cy5标记。在深度为30µm处未观察到ins，ha以及ha-sh的信号。深度为15μm时，二者均观察到微弱的胰岛素信号以及均匀分布于整个区域的壳层材料（ha或ha-sh）的信号，且不与胰岛素的信号共定位；深度为0μm时，两种颗粒均观察到强的胰岛素与壳层材料（ha和ha-sh）的信号，大部分ha以及ha-sh并未与胰岛素共定位，证明npha以及npha-sh颗粒可以有效的穿过黏液层到达细胞，且在穿过黏液层过程中，ha以及ha-sh壳层会逐渐脱落下来，当到达细胞层后，带正电的核心会暴露出来。实施例9载药颗粒在小肠黏液处的分布sd大鼠禁食12小时，麻醉后，通过手术，在大鼠空肠处通过两端结扎形成一段5cm的闭合区域，并注入0.5ml的载药颗粒，其中胰岛素用cy5标记，2小时后，将这一闭合区域取出，沿径向剪开，用10mm的pbs清洗3次，后将其黏液层朝上固定，在小动物活体成像仪中观察成像，后利用真空泵将小肠表面黏液层吸走，再次置于小动物活体成像仪中观察成像，并统计除去黏液层前后小肠区域的平均荧光强度。图15所示为经三种颗粒处理后，除去黏液前后小肠的荧光图像。图16所示为统计所得除去黏液前后小肠表面的平均荧光强度。除去黏液前nc处理的小肠具有最强的胰岛素信号，npha-sh次之，npha最弱。除去黏液层后，npha-sh处理的小肠具有最强的胰岛素信号，npha次之，nc最差。除去黏液后剩余的胰岛素即为成功穿透小肠黏液层的胰岛素。证明npha-sh具有良好的黏液吸附性质以及黏液穿透性质。实施例10细胞穿透实验以caco2单层细胞上模拟小肠上皮细胞层，1%的粘蛋白溶液模拟小肠上皮黏液层。cacao2细胞接种于transwell板中，37℃培养2～3周，直至caoco2细胞形成一层单层细胞层且细胞跨膜电阻高于700ω，细胞之间形成紧密连接，。实验前将细胞膜上下的培养基置换为hbss。在细胞层上加入1%的粘蛋白溶液以模拟小肠上皮黏液。（1）细胞层跨膜电阻：将200µl胰岛素溶液，nc，npha和npha-sh颗粒悬浮液与caco2细胞共孵育2个小时，将颗粒取出，继续孵育8个小时。每隔特定时间，测量细胞跨膜电阻。图17所示为加入胰岛素溶液或纳米颗粒后，细胞跨膜电阻随时间的变化。对于胰岛素溶液，细胞跨膜电阻基本不变；对于其他颗粒，加入颗粒后，细胞跨膜电阻均下降；取出颗粒后，细胞跨膜电阻值逐渐恢复，证明实验颗粒可以可逆的打开细胞间的紧密链接。对于无黏液caco2细胞层，nc颗粒使电阻值下降50%左右，具有最好的紧密连接打开效果，npha或npha-sh颗粒使电阻值下降至40%左右。对于有黏液caco2细胞层，npha或npha-sh依旧可以使细胞电阻下降37%左右，而nc仅能使细胞电阻下降30%。正电性的nc颗粒与负电性的粘蛋白相互作用，阻碍了nc颗粒到达细胞层处发挥作用。ha涂敷层具有负电性，防止npha颗粒与粘蛋白相互作用，因此粘蛋白的加入对其打开紧密连接的能力影响很小。对于npha-sh，虽然ha-sh涂覆层的巯基可以与粘蛋白形成二硫键，但由于ha-sh涂敷层可以从颗粒表面逐渐剥离下来，使得npha-sh颗粒可以脱离粘蛋白的阻碍，粘蛋白对颗粒打开紧密连接的能力也基本无影响。（2）表观渗透系数测量：将胰岛素溶液和3不同的颗粒分别与caco2细胞共孵育4h，每隔1h从transwell下腔取出100µl溶液，并补充相同体积的hbss测量荧光强度，通过公式（1）计算得到papp值。式中，papp为表观渗透系数，dq/dt为荧光标记的颗粒从transwell上腔到下腔的流量，co为上腔的初始荧光强度，a为transewell膜面积。图18所示为不同颗粒运输胰岛素穿过caco2单细胞层的表观渗透系数。对于无粘蛋白的caco2细胞层，nc具有最高的表观渗透系数。对于有黏液的caco2细胞层，相比于nc，npha和npha-sh具有较高的表观渗透系数。加入粘蛋白后，nc表观渗透系数急剧下降，而粘蛋白的加入，对npha以及npha-sh的表观渗透系数几乎无影响。与nc相比，npha和npha-sh具有更好的黏液穿透能力，可以更有效的促进小肠对胰岛素的吸收。（3）紧密连接成像：利用闭锁蛋白抗体作为一抗，室温下与caco2细胞共孵育0.5小时，使其与紧密连接上的闭锁蛋白充分结合，后加入af488标记的二抗，室温下孵育1小时，使二抗与一抗充分结合。在荧光显微镜下，观察加入npha-sh颗粒前，与npha-sh颗粒共孵育两小时后，以及取出颗粒后继续孵育10小时后的细胞间的紧密连接。图19所示为加入npha-sh颗粒前后caco2细胞的紧密连接。加入颗粒前（0h）可以观察到连续清晰的环状结构；加入npha-sh，共孵育2h后，环状结构消失，说明紧密连接打开；移除颗粒，继续孵育10h，又可以观察到连续清晰的环状结构，说明紧密连接可以回复。由此说明本发明中颗粒可以可逆的打开紧密连接，促进胰岛素通过细胞旁路被小肠吸收。实施例11口服载胰岛素纳米颗粒在小肠部位的吸收sd大鼠禁食12h，后口服胰岛素溶液，nc，npha以及npha-sh颗粒，其中胰岛素用ritc标记，2小时后，将大鼠麻醉，处死，通过手术，取出小肠的空肠部位，切片，用4%的多聚甲醛固定小肠组织，利用dapi以及af-645对小肠上皮细胞核以及小肠黏液层进行染色，在激光共聚焦显微镜下成像。图20所示为口服胰岛素溶液或载胰岛素颗粒后，胰岛素在小肠部位的吸收情况。口服npha-sh组具有最强的胰岛素吸收，同时黏液层中仍结合有大量胰岛素；口服npha组具有比较强的胰岛素吸收；口服nc黏液层中观察到胰岛素信号，且仅有少部分胰岛素进入小肠上皮细胞，口服吸收较差；口服胰岛素溶液组基本观察不到胰岛素信号。实施例12口服降血糖效果200～250g的sd大鼠通过腹腔注射80mg/kg链脲佐菌素诱导成为i型糖尿病模型鼠。将模型鼠分为6组，每组7只。实验前，所有实验组禁食10～12h，组1灌胃去离子水，组2灌胃胰岛素溶液（75iu/kg），组3灌胃nc颗粒悬浮液（75iu/kg），组4灌胃npha颗粒悬浮液（75iu/kg），组5灌胃npha-sh颗粒悬浮液（75iu/kg），组6皮下注射胰岛素溶液（5iu/kg）。每隔1h，尾尖取血，利用血糖仪测量血糖。图21所示为口服载胰岛素颗粒或皮下注射胰岛素后的降血糖曲线。皮下注射胰岛素实验鼠血糖迅速下降至较低水平，而口服胰岛素纳米颗粒制剂血糖可以平稳的下降。npha-sh具有最强的降血糖效果，npha次之，nc降血糖效果比较差。口服胰岛素溶液作为阴性对照，对血糖基本无影响。实施例13npha以及npha-sh的口服生物利用度将200～250g的i型糖尿病模型鼠分为4组，实验前所有实验组禁食10～12h。组1皮下注射胰岛素溶液（5iu/kg），组2灌胃npha颗粒悬浮液（75iu/kg），组3灌胃npha-sh颗粒悬浮液（75iu/kg），组4灌胃胰岛素溶液（75ui/kg）。每隔特定时间，眼眶取血，利用胰岛素elisa试剂盒测量血液中胰岛素的浓度，得到胰岛素血药浓度与时间的曲线，如图22所示。皮下注射胰岛素组作为100%对照，通过比较口服颗粒组和皮下注射胰岛素组曲线下面积可以得到生物利用度。npha以及npha-sh的口服生物利用度分别为：5.8%和11.3%。口服胰岛素溶液组作为阴性对照，胰岛素浓度接近于零。实施例14壳聚糖季铵化程度对负载胰岛素的纳米颗粒的影响利用三种不同季铵化程度的htcc（12%，23%和43%）分别制备了负载胰岛素的nc纳米颗粒，其他原料及方法与实施例3相同。通过改变壳聚糖的季铵化程度，可以调控nc纳米颗粒的尺寸及表面电荷。如图23所示，随着壳聚糖季铵化程度降低，nc颗粒粒径从75nm增到约263nm，颗粒的表面电位由+27mv减至约+17mv。实施例15透明质酸的巯基化程度负载胰岛素的纳米颗粒的制备利用巯基化程度为8.4%，12.3%，32.3%的巯基化透明质酸来制备负载胰岛素的npha-sh纳米颗粒，其他原料及制备方法与实施例3相同。由于本专利中ha的巯基化改性主要是利用ha的羟基与二硫代二丙酸的羧基发生酯化反应，改性后ha-sh具有与改性前ha相似的带电性，因此不同巯基化程度修饰透明质酸依靠电荷作用涂敷在nc纳米颗粒表面后可推测得到粒径、分散度、包封率及载药量相似的负载胰岛素的纳米颗粒。当前第1页12