δ-香树脂酮或以δ-香树脂酮为主要成分的提取物在制备保护肝损伤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种中药提取物，具体是δ-香树脂酮(δ-amyrone)或以δ-amyrone为主要成分的提取物在制备保护肝损伤的药物中的应用，以δ-amyrone为主要成分的提取物是以景天属植物为原料制备。

背景技术：

我国是肝病发生率较高的国家，现在各种环境因素和不良生活习惯使得各种肝脏疾病如肝炎、肝硬化、脂肪肝、肝癌等的发病率不断上升，如何有效的预防与治疗肝病已成为医药学界面临的挑战之一。很多肝脏疾病都有一种共同的病理状态，就是肝损伤。化学毒物、肝毒性药物、病毒感染、酒精等各种有害因素都有可能引起肝功能的异常，进而造成肝损伤。目前认为主要是通过氧化应激和炎症反应等机制引起的。持续或严重的肝损伤往往是导致肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌的重要始动因素。因此，防治肝损伤是临床治疗肝病的主要环节之一，是抑制各种肝病发生发展的基础。目前，临床上治疗这类疾病的西药主要分成两类：一是抗病毒药，如拉米夫定、干扰素等；二是保肝降酶药，如双环醇、联苯双酯等。然而，这些西药作用靶点相对单一明确，且重在纠正靶器官的病理改变，因此在病因明确、发病机理清楚的疾病治疗上占优势，但是肝损伤具有多因素、多环节的发病机制，单靶点、单环节作用的西药远期治疗效果并不是很理想，容易产生停药后反弹率高，长期服用易产生耐药性等问题，从而临床应用受到了制约。而中药作用的特色就是中药有效部位通常是由多个有效成分组成，多个成分同时作用与疾病相关的多个靶点，经过多途径发挥治疗效果，这非常符合肝损伤病因多样性和机制复杂性的特点，在治疗肝损伤方面有一定的优势。中药在保肝护肝方面有着悠久的历史。在古代文献典籍中早有肝郁、黄疸、胁痛等发病症状与肝损伤相类似的记载与论述。随着现代医学的发展，对中医药防治肝损伤的认识已经由降低转氨酶等浅层面逐渐深入到细胞分子水平。常用的保肝护肝中药有单味药、亦有复方药，主要是通过保肝降酶、保肝免疫等环节发挥预防治疗作用。近年来，有文献报道一些保肝中药在长期或者高剂量应用时也存在毒性反应，临床的应用受到制约。

垂盆草为景天科景天属植物垂盆草Sedum sarmentosum Bunge的干燥全草，是《中国药典》收载的常用中药之一，并且植株的幼嫩部分可作蔬菜食用，具有较高的安全性，毒副作用较小的特点。据报道，垂盆草极性较大溶剂的提取物，如水提取物、醇提取物等具有保肝活性，其化学成分主要是黄酮、氰苷、倍半萜类。但是有关垂盆草低极性溶剂，如二氯甲烷提取物是否具有保肝活性未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供δ-amyrone(δ-香树脂酮)或以δ-amyrone为主要成分的提取物在制备保护肝损伤的药物中的应用；本发明的目的之二在于提供一种保护肝损伤的垂盆草二氯甲烷提取物的制备方法；本发明的目的之三在于提供δ-amyrone的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1、δ-amyrone或以δ-amyrone为主要成分的提取物在制备保护肝损伤的药物中的应用。

优选的，所述以δ-amyrone为主要成分的提取物δ-amyrone的质量分数大于50％。

更优选的，所述以δ-amyrone为主要成分的提取物为垂盆草二氯甲烷提取物。

更优选的，所述垂盆草二氯甲烷提取物按如下方法制备：垂盆草干燥全草洗净，用体积分数为95％的乙醇提取，浓缩成浸膏，浸膏经过硅胶柱，先用石油醚洗脱至无色，再用二氯甲烷洗脱至无色，收集二氯甲烷洗脱液，回收二氯甲烷有机溶液，浓缩后的浸膏经冷冻干燥即得垂盆草二氯甲烷提取物。

优选的，提取过程中乙醇加入体积相当于药材重量的6倍。

2、一种保护肝损伤的垂盆草二氯甲烷提取物的制备方法，具体步骤如下：垂盆草干燥全草洗净，用体积分数为95％的乙醇提取，浓缩成浸膏，浸膏经过硅胶柱，先用石油醚洗脱至无色，再用二氯甲烷洗脱至无色，收集二氯甲烷洗脱液，回收二氯甲烷有机溶液，浓缩后的浸膏经冷冻干燥，获得即得保护肝损伤的垂盆草二氯甲烷提取物。

优选的，提取过程中乙醇加入体积相当于药材重量的6倍。

优选的，所得保护肝损伤的垂盆草二氯甲烷提取物中δ-amyrone的质量分数大于50％。

3、δ-amyrone的制备方法，将垂盆草干燥全草洗净，用体积分数为95％的乙醇提取，浓缩成浸膏，浸膏经过硅胶柱，先用石油醚洗脱至无色，再用二氯甲烷洗脱至无色，收集二氯甲烷洗脱液，洗脱液有沉淀析出，过滤弃去滤液，沉淀即为有效成分。优选的，提取过程中乙醇加入体积相当于药材重量的6倍。

本发明优点在于：

1.本发明以垂盆草全草为主要原料制备的低极性二氯甲烷提取物，经药理实验证明该提取物对肝损伤具有较好的保护作用，毒副作用较小，可用于保肝类药物的制备；

2.发现了该提取物中主要成分δ-amyrone具有保肝活性，经本发明δ-amyrone的制备方法，可以有效去除杂质成分，短时间获得大量的有效成分，该制备方法简单易行，成本低，效率高。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1显示了垂盆草二氯甲烷提取物对ANIT诱导大鼠肝损伤模型中大鼠肝功能血清生化指标的影响(a：ALT；b：AST；c：ALP；d：GGT/γ-GT；e：DBiL；f：TBiL；g：ALB；h： TP；图中Control为空白组，Model为模型组，BDA为阳性药联苯双酯组，Low为二氯甲烷提取物低剂量组100mg/kg，Medium为二氯甲烷提取物中剂量组200mg/kg，High为二氯甲烷提取物高剂量组400mg/kg。与空白组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05, ##p<0.01)。

图2显示了垂盆草二氯甲烷提取物治疗后大鼠肝组织病理切片的变化：图中Control为空白组，Model为模型组，BDA为阳性药联苯双酯组，Low为二氯甲烷提取物低剂量组100 mg/kg，Medium为二氯甲烷提取物中剂量组200mg/kg，High为二氯甲烷提取物高剂量组400 mg/kg。

图3显示了垂盆草二氯甲烷提取物治疗后对大鼠血清中炎症因子的影响(a：肿瘤坏死因子-α(TNF-α),b：干扰素-γ(IFN-γ)；c：白介素-4(IL-4)；图中Control为空白组，Model 为模型组，BDA为阳性药联苯双酯组，Low为二氯甲烷提取物低剂量组100mg/kg，Medium 为二氯甲烷提取物中剂量组200mg/kg，High为二氯甲烷提取物高剂量组400mg/kg。与空白组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05,##p<0.01)。

图4显示了垂盆草二氯甲烷提取物治疗后对大鼠肝组织中氧化应激指标的影响(a：活性氧ROS,b：超氧化物歧化酶SOD；c：谷胱甘肽过氧化酶GSH-PX；图中Control为空白组， Model为模型组，BDA为阳性药联苯双酯组，Low为二氯甲烷提取物低剂量组100mg/kg， Medium为二氯甲烷提取物中剂量组200mg/kg，High为二氯甲烷提取物高剂量组400mg/kg。与空白组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05,##p<0.01。

图5显示了垂盆草二氯甲烷提取物中主要化合物δ-amyrone对D-GalN诱导的QSG7701 正常肝细胞的保护作用：(a：化合物δ-amyrone结构；b：存活率；c：ALT；d：AST；图中 Control为空白组，Model为模型组，BDA为阳性药联苯双酯组15μM，Low为δ-amyrone低剂量组5μM，Medium为δ-amyrone中剂量组10μM，High为δ-amyrone高剂量组20μM。与空白组比较：*p<0.05,**p<0.01；与模型组比较：#p<0.05,##p<0.01)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明提供的具体实施方式进行详细描述。

实施例1、垂盆草二氯甲烷提取物的制备

垂盆草干燥全草洗净，用体积分数为95％的乙醇浸泡一天后采用渗滤提取3次，3次提取的药液合并，提取过程中乙醇加入体积相当于药材重量的6倍，减压浓缩成浸膏，浸膏经过硅胶柱，先用石油醚洗脱至无色，再用二氯甲烷洗脱至无色，收集二氯甲烷洗脱液，减压回收二氯甲烷有机溶液，浓缩后的浸膏经冷冻干燥即得垂盆草二氯甲烷提取物。

实施例2、化合物δ-amyrone的制备

垂盆草干燥全草洗净，用体积分数为95％的乙醇浸泡一天后采用渗滤提取3次，3次提取的药液合并，提取过程中乙醇加入体积相当于药材重量的6倍，减压浓缩成浸膏，浸膏经过硅胶柱，先用石油醚洗脱至无色，再用二氯甲烷洗脱至无色，收集二氯甲烷洗脱液，洗脱液有沉淀析出，过滤弃去滤液，沉淀即为有效成分。

δ-Amyrone：白色粉末；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ39.3(C-1),34.1(C-2),218.1(C-3), 47.2(C-4),54.8(C-5),19.8(C-6),26.5(C-7),40.9(C-8),50.0(C-9),36.9(C-10),22.2(C-11),26.5 (C-12),134.0(C-13),44.7(C-14),25.0(C-15),36.5(C-16),34.5(C-17),133.6(C-18),39.6(C-19), 33.3(C-20),35.4(C-21),38.7(C-22),21.0(C-23),26.9(C-24),16.2(C-25),17.6(C-26),21.2 (C-27),24.0(C-28),23.7(C-29),32.3(C-30)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.17(3H,s),1.09(3H, s),1.02(3H,s),1.01(3H,s),0.94(6H,s),0.88(3H,s),0.70(3H,s),2.24(d,13.8Hz,1H,H-19), 2.69(m,1H,H-2),2.46-2.48(overlap,2H,H-2,H-12).通过以上光谱数据鉴定该化合物为δ-amyrone。

采用HPLC测定垂盆草二氯甲烷提取物中δ-amyrone的含量；以δ-amyrone为标准品，测得δ-amyrone含量大于50％。

实施例3、垂盆草二氯甲烷提取物的保肝药效研究

1.动物分组、造模、给药方法

取SD大鼠60只，实验室适应性喂养3天后，按体重分为6组：空白组，模型组 ANIT(70mg/kg),阳性药联苯双酯组(150mg/kg)，低剂量给药组100mg/kg，中剂量给药组200mg/kg,高剂量给药组400mg/kg，适应性喂养3天后，于第4天开始给药(注：第一次给药前禁食不禁水24h)，各组动物每日灌胃2次(12h一次)，连续灌胃5天或者一周，在末次给药1h后，除空白组外，每组大鼠腹腔注射ANIT(70mg/kg)制备大鼠肝损伤模型，造模给药12h后，大鼠进行眼眶取血，分离血清，进行血清生化指标的测定和血清炎性因子的检测，在眼眶取血后处死大鼠，取大鼠肝组织，进行肝组织病理学检查和肝组织氧化应激指标的检测。

2.血清生化指标的测定

一部分大鼠血液置于EDTA-Na2抗凝管混匀，离心(3000r/min、10min)，分离血清，全自动生化分析仪测定血清中ALT,AST,ALP,GGT/γ-GT,DBiL,TBiL,ALB,TP的值。

实验结果见图1，与空白组相比，模型组ALT,AST,ALP,GGT/γ-GT,DBiL,TBiL明显升高,ALB和TP明显降低，差别有统计学意义(P<0.01)，说明ANIT诱导大鼠肝损伤模型造模成功。与模型组比较，垂盆草二氯甲烷提取物中剂量(200mg/kg)、高剂量(400mg/kg) 给药后可以降低肝损伤大鼠的ALT,AST,ALP,GGT/γ-GT,DBiL,TBiL水平，也可以增加ALB 和TP含量，且有一定量效关系。结果表明垂盆草二氯甲烷提取物对ANIT诱导大鼠肝损伤有明显的保护作用。

3.肝组织病理切片检查

一部分大鼠肝组织置体积分数10％福尔马林溶液中固定，经脱水，透明浸蜡，包埋，切片，摊片，苏木精和伊红染色后观察肝组织病理变化。

实验结果见图2，肝组织病理切片结果表明，空白组的肝小叶结构清晰，肝细胞排列整齐，无肿胀、萎缩等改变，亦未见有明显的变性、坏死及炎症等病理改变；模型组的肝细胞损伤明显，肝索排列紊乱，肝细胞变性坏死明显，提示造模成功；垂盆草二氯甲烷提取物给药组肝细胞变性、坏死、炎症反应等病理改变有不同程度的改善，其中高剂量组肝细胞变性、坏死、炎症反应明显减轻，肝细胞排列规则。

4.血清炎性因子的检测

一部分大鼠血液置于EDTA-Na2抗凝管混匀，离心(3000r/min、10min)，分离血清，采用ELISA法检测血清中TNF-α,IFN-γ和IL-4的值。

实验结果见图3，模型组与空白组比较，大鼠血清中TNF-α和IFN-γ含量显著升高，IL-4 水平显著降低，提示模型成功。与模型组比较，垂盆草二氯甲烷提取物给药组可以降低大鼠血清中促炎因子TNF-α和IFN-γ含量，提高抗炎因子IL-4水平。结果表明垂盆草二氯甲烷提取物可以减轻ANIT诱导大鼠肝损伤引起的炎症反应。

5.肝组织氧化应激指标的检测

一部分大鼠肝组织置于冷生理盐水清洗后置于EP管，投入液氮冷冻后存于-80℃，测定时取出样品,于冰上操作剪碎肝组织，按重量体积比加以生理盐水制成10％的肝细胞匀浆， 3000r/min，4℃低温离心5min，取上清液，测定SOD，ROS，GSH-Px的值。

实验结果见图4，模型组与空白组比较，大鼠肝组织匀浆中SOD和GSH-Px活性显著降低，ROS含量显著升高，提示模型成功。与模型组比较，垂盆草二氯甲烷提取物给药组可以提高肝组织匀浆中抗氧酶SOD和GSH-Px活性，降低ROS含量。结果表明垂盆草二氯甲烷提取物可以减轻ANIT诱导大鼠肝损伤引起的氧化应激反应。

实施例4、化合物δ-amyrone对D-GalN诱导的QSG7701正常肝细胞的保护作用

正常人肝细胞株QSG7701置于96孔板中，3×10⁴细胞/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱内24小时后，吸弃上清，更换培养液并用不同剂量δ-amyrone(5,10,20μM)和阳性药联苯双酯(15μM)样品预处理12小时，然后加入已经配好的D-GalN(35mM)孵育24小时，收集细胞培养上清液测定ALT、AST产量，同步测定肝细胞的存活率。

1.肝细胞存活率的测定

D-GalN(35mM)孵育肝细胞24小时后，加入MTT(100μL，0.5mg/mL)在培养箱内培养4小时后，弃去孔中所有液体，各孔加入100μL DMSO，震荡10分钟用酶标仪测定570 nm波长下的吸光度。以空白组吸光度值作为参考，细胞生存率为100％，其它各组吸光度值与空白组吸光度值作比较得其生存率。

2.ALT、AST含量的测定

D-GalN(35mM)孵育肝细胞24小时后，经离心10分钟后收集上清，直接测定上清液中ALT、AST含量，结果以U/L表示。

实验结果见图5，模型组与空白组比较，D-GalN诱导的人正常肝细胞QSG7701的存活率明显下降，并且ALT、AST含量显著增加，提示模型成功。与模型组比较，δ-amyrone中剂量(10μM)、高剂量(20μM)组可以明显提高D-GalN诱导QSG7701细胞的存活率，以及降低肝细胞损伤导致的ALT、AST水平。结果表明δ-amyrone对D-GalN诱导QSG7701肝细胞具有保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。