本发明涉及生物
技术领域：
中抗病毒感染的真核细胞膜包覆仿生纳米粒及其制备方法。
背景技术：
：婴幼儿腹泻是造成全球五岁以下儿童死亡的第二大原因，仅次于呼吸道感染，其中轮状病毒(rotavirus，rv)感染是引起婴幼儿重症腹泻和脱水的首要原因。目前对于rv感染所致腹泻尚无特效药，现阶段临床主要采取对症治疗手段，主要通过及时补液、补水以及使用微生态制剂(如益生菌)、广谱抗病毒药物、免疫调节剂、消化道黏膜保护剂等来降低或减轻患者的腹泻、呕吐等症状。疫苗接种成为有效且唯一的预防控制rv感染所致腹泻的手段。我国使用的是由兰州生物制品研究所研制并于2001年上市的口服轮状病毒单价疫苗罗特威，另外还有葛兰素史克公司生产的rotarix和默克公司研发的rotateq。这些疫苗均为口服减毒活疫苗，在人体内仍有因发生逆行突变而恢复毒力的可能，存在一定风险性，而且在2013年世界卫生组织的立场文件中也确认轮状病毒疫苗存在肠套叠风险。rv病毒是一种双链核糖核酸病毒，属于呼肠孤病毒科，且rv毒株多样化，根据重要的结构蛋白vp6种类，将rv病毒分a-g7个组。其中a、b、c均可以感染人类，但目前应用于临床的rv疫苗均为针对a组开发的。vp7是rv另一种重要蛋白，依vp7可区分病毒g血清型，至今已经鉴定有14个血清型。因为不同流行株的血清型不同，而疫苗毒株单一，所以常常出现接种疫苗后婴幼儿仍被rv感染的情况。因此，预防和治疗rv感染的有效药物或递送系统成为临床急需，对其进行研究开发有着重要意义。另外在rv的感染机制研究中，rv在体内主要感染小肠上皮细胞，体外也仅能感染肠上皮细胞和肾上皮细胞，但细胞膜表面可能存在多种rv受体，研究发现唾液酸、神经调节脂、热休克蛋白、多种整合素等都在rv感染过程中发挥了重要作用，但相互作用复杂，难以找到合适的受体阻断药物来有效控制rv感染。现代药物传递系统可选择性地将药物递送至病灶部位而发挥疗效，目前采用的大多为合成载体，虽可根据使用目的进行各种结构修饰，但不具备人体内源性物质的复杂性和一些功能性，且有时会被机体视为外源性毒物排出体外而无法发挥作用。近年来，细胞膜仿生纳米粒(cellmembrane-camouflagednanoparticles)引起了研究者们极大关注，它将合成的纳米粒与天然生物材料结合在一起，将二者的优势互补，形成了一种新型仿生药物递送系统。细胞膜仿生纳米粒主要通过采用天然细胞膜作为外壳来包载合成的纳米粒内核而实现。通过这一策略，细胞膜的结构与功能得以保留；而合成的纳米粒作为核心，不但起支撑作用，还可以载药或进行结构修饰。近年国内外关于细胞膜仿生纳米粒的文献报道中，采用的细胞膜有红细胞膜、白细胞膜、肿瘤细胞膜、细菌细胞膜等。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何抗轮状病毒感染。为了解决以上技术问题，本发明提供了抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒。本发明所提供的抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒，所述细胞膜仿生纳米粒由外壳和所述外壳包覆的内核组成，所述外壳为真核细胞膜，所述内核为介孔二氧化硅纳米粒，所述真核细胞膜为caco-2细胞膜或mdck细胞膜。上述细胞膜仿生纳米粒中，caco-2细胞为人结肠癌上皮细胞，mdck细胞为犬肾远曲小管上皮细胞(madin-darbycaninekidney)。上述细胞膜仿生纳米粒中，所述细胞膜仿生纳米粒的粒径(直径)可为80-120nm(如90-96nm或93-95nm)；其多分散系数可为≤0.3(如≤0.25或≤0.2)。上述细胞膜仿生纳米粒中，所述细胞膜仿生纳米粒的zeta电位可为0至-20mv(如0至-12mv或-10mv至-11mv)。本发明还提供了制备上述抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒的方法。本发明所提供的制备上述抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒的方法，包括用真核细胞制备真核细胞膜小体，用所述真核细胞膜小体包覆介孔二氧化硅纳米粒，得到细胞膜仿生纳米粒；所述真核细胞为caco-2细胞或mdck细胞。上述方法中，所述制备真核细胞膜小体可包括：1)用细胞裂解液在4℃裂解所述真核细胞2.5小时，然后进行匀浆破碎细胞，再离心收集沉淀，得到所述真核细胞膜；2)将所述真核细胞膜进行功率为50w和频率为20-25khz的超声波处理1分钟，用脂质体挤出器采用孔径为100-400nm、200-400nm或200nm的滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，得到所述真核细胞膜小体。上述方法中，所述超声波处理可在冰浴中进行。上述方法中，所述离心收集沉淀可包括：先以500g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液1；对所述上清液1采用10000g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液2；对所述上清液2进行100000g离心1h，收集沉淀，所述沉淀为所述真核细胞膜。上述方法中，所述细胞裂解液的溶质可为tris,mgcl2和edta-free的蛋白酶抑制剂,溶剂为水，tris和mgcl2在所述细胞裂解液中的浓度均为10mm，所述细胞裂解液的ph可为7.4。上述方法中，用所述真核细胞膜小体包覆介孔二氧化硅纳米粒可包括将所述真核细胞膜小体与介孔二氧化硅纳米粒进行功率为80w和频率为20-25khz的超声波处理2分钟，用脂质体挤出器采用孔径为100-400nm、200-400nm或200nm的滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，得到细胞膜仿生纳米粒。上述方法中，所述用真核细胞膜小体包覆介孔二氧化硅纳米粒中，所述超声波处理可在20-25℃水浴中进行。上述方法中，所述真核细胞膜小体的直径可为80-140nm，如100-120nm或107-110nm；其多分散系数可为≤0.3(如≤0.25或≤0.2)。上述方法中，所述真核细胞膜小体的zeta电位可为-10mv至-25mv，如-15mv至-22mv或-18mv至-20mv。上述方法中，所述介孔二氧化硅纳米粒的直径可为70-110nm，如80-100nm或80-83nm；其多分散系数可为≤0.2，如≤0.1。上述方法中，所述介孔二氧化硅纳米粒的zeta电位可为-20mv至-35mv，如-26mv至-28mv或-27mv。上述细胞膜仿生纳米粒在制备抗轮状病毒感染产品(药物或疫苗)中的应用也属于本发明的保护范围。上文中，所述抗轮状病毒感染可为抗轮状病毒感染动物。所述动物可为哺乳动物。所述哺乳动物可为真兽下纲动物。所述真兽下纲动物可为灵长目动物。所述灵长目动物可为人或猴。上文中，所述抗轮状病毒感染可为抗轮状病毒感染细胞。所述细胞可为哺乳动物细胞。所述哺乳动物可为真兽下纲动物。所述真兽下纲动物可为灵长目动物。所述灵长目动物可为人或猴。本发明采用caco-2细胞(人结肠癌上皮细胞)和mdck细胞(犬肾远曲小管上皮细胞)两种细胞的细胞膜作为仿生纳米粒的外壳，包覆具有物理稳定性高、比表面积和孔隙率大、吸附力强、载药性能优良、生物相容性较好等特点的无机介孔二氧化硅纳米粒(msn)内核。本发明构建的caco-2细胞膜或mdck细胞膜包覆的msn仿生纳米粒，用于rv感染，能有效降低rv对正常小肠细胞的侵染。该发明有望为rv感染的治疗做出有益探索，提供一种可能的新途径，为研究出低毒、高效、具有良好应用前景的抗婴幼儿rv感染给药系统提供良好的理论基础和实践指导，为相关给药系统和技术进入临床提供可借鉴的经验。附图说明图1为msn(a)、mc-cms(b)和mc-cm-msn(c)的透射电镜(tem)图谱。图1中，箭头示细胞膜，a中的bar为200nm，b和c中的bar为100nm。图2为cc-cm-msn的透射电镜(tem)图谱。图2中，bar为50nm。图3为各处理组的细胞存活率。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒的制备及其抗病毒感染效果本实施例提供了两种抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒，分别为caco-2细胞膜仿生纳米粒和mdck细胞膜仿生纳米粒。caco-2细胞膜仿生纳米粒和mdck细胞膜仿生纳米粒均由外壳和所述外壳包覆的内核组成，内核均为介孔二氧化硅纳米粒，caco-2细胞膜仿生纳米粒的外壳为caco-2细胞膜，mdck细胞膜仿生纳米粒的外壳为mdck细胞膜。caco-2细胞膜仿生纳米粒的制备方法包括用caco-2细胞制备caco-2细胞膜小体，用caco-2细胞膜小体包覆介孔二氧化硅纳米粒，得到caco-2细胞膜仿生纳米粒。mdck细胞膜仿生纳米粒的制备方法包括用mdck细胞制备mdck细胞膜小体，用mdck细胞膜小体包覆介孔二氧化硅纳米粒，得到mdck细胞膜仿生纳米粒。具体的制备方法如下：1.caco-2细胞膜仿生纳米粒的制备1.1caco-2细胞膜小体的制备1.1.1caco-2细胞培养caco-2细胞使用含有10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％非必须氨基酸，1％谷氨酸钠，1％青霉素-链霉素双抗的mem培养基，放置于37℃、5％co2的培养箱中培养。隔天更换培养基，用含edta的0.25％胰酶作为消化液，按照1：3比例传代。1.1.2caco-2细胞膜的提取将含有10％胎牛血清，1％谷氨酰胺，1％非必须氨基酸，1％谷氨酸钠和1％青霉素-链霉素双抗的mem培养基置于175cm2培养瓶中，在37℃，5％co2的培养箱中培养caco-2细胞，待细胞融合度达到90％，加入1ml含edta的0.25％胰酶，消化约5min，加入5ml新鲜培养基轻轻吹打，并将细胞悬液转移至离心管中，850rpm离心3min，弃去上层培养基，加入pbs(0.01m，ph为7.2-7.4)，吹打混匀，850rpm离心3min，弃去上清液，并重复两次洗涤步骤。最后弃去上清液，加入10ml预先配制好的冷细胞裂解液(ph为7.4，其中溶质为10mmtris,10mmmgcl2和每10ml细胞裂解液加入1片edta-free的蛋白酶抑制剂,溶剂为水),置于4℃裂解2.5小时后，转移至dounce匀浆器中进行匀浆破碎细胞，将破碎后的细胞悬液转移至离心管中，进行如下分步差速离心：先以500g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液1；对上清液1采用10000g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液2；对上清液2进行100000g离心1h，收集沉淀，该沉淀即为caco-2细胞膜。冻干后得到caco-2细胞膜冻干粉，称重定量，备用。1.1.3caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)的制备取1.1.2的caco-2细胞膜冻干粉2mg，分散在pbs(0.01m，ph为7.2-7.4)溶液中，稀释至6ml；用超声细胞破碎仪进行功率为50w和频率为20-25khz的冰浴超声1min后；用脂质体挤出器，采用200nm孔径的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，获得caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)，备用。1.2介孔二氧化硅纳米粒(msn)的制备称取0.437g十六烷基三甲基溴化铵(ctab)和0.472g苄泽58(brij58)(作为模板剂)，置250ml烧杯中，加入120ml室温的ph7.0的pb溶液(称取kh2po43.43g及naoh0.58g，置于500ml水中，混匀，4℃下放置，备用)，60℃下磁力搅拌加热，使完全溶解。待反应体系温度稳定后，60℃强力搅拌下，逐滴加入2.14ml正硅酸四乙酯(teos)，继续反应至8h。反应结束后，冷却，将样品转移至离心管中，15000rpm离心15min，弃上清液。加入等体积蒸馏水清洗2次，15000rpm离心15min；无水乙醇清洗2次，15000rpm离心15min，弃上清液。取沉淀，以60ml酸性乙醇(取2ml盐酸至150ml无水乙醇中，混匀即得)分散，78℃加热回流，每次8h，共3次，除去模板剂。无水乙醇洗涤3次，除盐酸，即得介孔二氧化硅纳米粒(msn)。分散于乙醇中，4℃冰箱中长期保存。使用时取上述分散于乙醇中的msn，置离心管中，15000rpm离心15min，弃去上清乙醇，加入蒸馏水洗涤2次，以适宜浓度分散于水中，测粒径和zeta电位。bet氮气吸附脱附实验显示该介孔二氧化硅纳米粒(msn)的bet比表面积(betsurfacearea)是565.50±4.21m2/g，孔隙体积(porevolume)是0.73cm3/g，bjh脱附孔径(bjhdesorptiondiameter)是2.13nm。该msn粒径(直径)为81.88±1.25nm，粒径的多分散系数(pdi)为0.068±0.036，zeta电位为-27.10±0.97mv。说明该方法制备的介孔二氧化硅纳米粒(msn)粒径较小，在100nm以下，粒度分布较为均一；粒子表面荷负电。1.3caco-2细胞膜仿生纳米粒(简称cc-cm-msn)的制备取1.1.3的caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)2mg(冻干粉干重)，加入1.2制备的msn1mg,涡旋混合1min，用超声细胞破碎仪进行功率为80w和频率为20-25khz、20-25℃水浴超声2min，用脂质体挤出器，采用200nm孔径的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，获得caco-2细胞膜仿生纳米粒(简称cc-cm-msn)。2.mdck细胞膜仿生纳米粒的制备2.1mdck细胞膜小体的制备2.1.1mdck细胞培养mdck细胞使用含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基，放置于37℃、5％co2的培养箱中培养。用含edta的0.25％胰酶作为消化液，按照1：5～1:10比例传代。2.1.2mdck细胞膜的提取将含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基置于175cm2培养瓶中，在37℃，5％co2的培养箱中培养mdck细胞，待细胞融合度达到90％，加入1ml含edta的0.25％胰酶，消化约5min，加入5ml新鲜培养基轻轻吹打，并将细胞悬液转移至离心管中，850rpm离心3min，弃去上层培养基，加入pbs(0.01m，ph为7.2-7.4)，吹打混匀，850rpm离心3min，弃去上清液，并重复两次洗涤步骤。最后弃去上清液，加入10ml预先配制好的冷细胞裂解液(ph＝7.4，其中溶质为10mmtris,10mmmgcl2和每10ml加入1片edta-free的蛋白酶抑制剂，溶剂为水)，置于4℃裂解2.5小时后，转移至dounce匀浆器中进行匀浆破碎细胞，将破碎后的细胞悬液转移至离心管中，进行如下分步差速离心：先以500g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液1；对上清液1采用10000g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液2；对上清液2进行100000g离心1h，收集沉淀，该沉淀即为mdck细胞膜。冻干后得到mdck细胞膜冻干粉，称重定量，备用。2.1.3mdck细胞膜小体(简称mc-cms)的制备取2.1.2的mdck细胞膜冻干粉2mg，分散在pbs(0.01m，ph为7.2-7.4)溶液中，稀释至6ml；用超声细胞破碎仪进行功率为50w和频率为20-25khz的冰浴超声1min后；用脂质体挤出器，采用200nm孔径的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，获得mdck细胞膜小体(简称mc-cms)，备用。2.2mdck细胞膜仿生纳米粒(简称mc-cm-msn)的制备取2.1.3的mdck细胞膜小体(简称mc-cms)2mg(冻干粉干重)，加入1.2的msn1mg,涡旋混合1min，用超声细胞破碎仪进行功率为80w和频率为20-25khz、20-25℃水浴超声2min，用脂质体挤出器，采用200nm孔径的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下挤出，获得mdck细胞膜仿生纳米粒(简称mc-cm-msn)。3、细胞膜仿生纳米粒、细胞膜小体和介孔二氧化硅纳米粒的表征3.1粒径分布和zeta电位取1.3的caco-2细胞膜仿生纳米粒(简称cc-cm-msn)、2.2的mdck细胞膜仿生纳米粒(简称mc-cm-msn)、1.1.3的caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)、2.1.3的mdck细胞膜小体(简称mc-cms)和1.2的介孔二氧化硅纳米粒(msn)，以适宜浓度分散于水中，用nano-zs90型激光粒度及zeta电位分析仪分别测定其粒径及其多分散系数(pdi)，和zeta电位。取上述各样品，滴在透射电镜铜网上，放入通风橱中待液体挥干，滴加一滴2％磷钨酸溶液染色2min，用滤纸吸去多余液体，干燥后用透射电子显微镜观察各样品形态。结果表明caco-2细胞膜仿生纳米粒(简称cc-cm-msn)和mdck细胞膜仿生纳米粒(简称mc-cm-msn)的粒径(直径)分别为94.60±1.26nm和95.37±1.45nm，粒径的多分散系数(pdi)分别为0.122±0.042、0.131±0.033。而msn粒径(直径)为81.88±1.25nm，粒径的多分散系数(pdi)为0.068±0.036。caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)和mdck细胞膜小体(简称mc-cms)的粒径(直径)分别为108.8±1.26nm和110.1±1.41nm(图1和图2)，粒径的多分散系数分别为0.198±0.031、0.187±0.056。cc-cm-msn和mc-cm-msn中的msn内核外面存在一层膜晕，而且厚度与细胞膜厚度一致，进一步证明，细胞膜已经成功包覆在msn纳米粒内核上，细胞膜仿生纳米粒构建成功。caco-2细胞膜仿生纳米粒(简称cc-cm-msn)和mdck细胞膜仿生纳米粒的zeta电位分别为-10.03mv±1.64mv、-11.32mv±1.33mv，caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)和mdck细胞膜小体(简称mc-cms)的zeta电位分别为-18.58mv±0.45mv、-20.01mv±0.32mv，介孔二氧化硅纳米粒(msn)的zeta电位为-27.10±0.97mv。4、细胞膜仿生纳米粒的体外细胞毒性评价4.1mtt溶液配制将mtt粉末用1×pbs(0.01m，ph为7.2-7.4)溶解并配制成5mg/ml的溶液，过滤灭菌后分装到ep管中，于-20℃避光条件下保存。每次使用时用培养基稀释，保证每孔100μg，通常是连续两管之间10倍稀释，每孔加入200μl。4.2细胞接种按照每孔4000个细胞的密度将mdck细胞接种到96孔板中，于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h使细胞贴壁。4.3加药孵育弃去培养液。设置空白组(无细胞，空白培养基，不加药)、对照组(有细胞，空白培养基，不加药)、msn组(有细胞，msn培养基)、cc-cm-msn组(有细胞，cc-cm-msn培养基)、mc-cm-msn组(有细胞，mc-cm-msn培养基)，于37℃、5％co2的培养箱中孵育24h。空白培养基为含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基。msn培养基是向空白培养基中加入1.2项下所述的msn，并使最终得到的msn含量分别为500、300、200、100、50、20、10μg/ml的培养基，cc-cm-msn培养基是向空白培养基中加入1.3项下所述的cc-cm-msn，并使最终得到的cc-cm-msn含量分别为200、100、50、20μg/ml的培养基，mc-cm-msn培养基是向空白培养基中加入2.2项下所述的mc-cm-msn，并使最终得到的mc-cm-msn含量分别为200、100、50、20μg/ml的培养基。4.4加入mtt加药孵育24h后，弃去培养液，加入无血清培养基稀释后的mtt溶液，每孔200μl，继续孵育4h。弃去上清液，然后每孔加入150μldmso，空气浴振荡器上振摇使完全溶解。4.5od值测定用酶标仪于490nm处测定隔孔吸光度数值。4.6数据处理细胞存活率＝(od实验组-od空白组)/(od对照组-od空白组)*100％。结果如图3所示，低浓度(浓度小于50μg/ml)时，cc-cm-msn和mc-cm-msn对细胞的毒性小于msn。表明在10-50μg/ml的浓度范围内，细胞膜(cms)的包覆降低了单纯介孔二氧化硅纳米粒(msn)的毒性。5.细胞膜仿生纳米粒的体外抗轮状病毒作用评价5.1病毒培养5.1.1ma104细胞培养ma104细胞(罗猴胎肾细胞)使用含10％血清、1％青霉素-链霉素双抗的mem培养基，于37℃、5％co2的培养箱中培养。5.1.2轮状病毒增殖与病毒液提取取已长成致密单层的ma104细胞，弃掉其中的培养液，用不含血清的mem培养基洗3次，吸净残余维持液，加入0.5ml轮状病毒液(人轮状病毒wa株来自兰州生物制品研究所)，37℃吸附90min，每30min摇晃一次。除去未吸附的病毒液，加入10ml含有0.5μg/ml胰酶的维持液，放回培养箱中，当75％的细胞出现病变(cpe达+++)时，将细胞于-20℃～37℃交替冻融3次，4℃下3000rpm离心10min，取上清液即为轮状病毒液，于-80℃下保存。5.2两种细胞膜仿生纳米粒的体外抗轮状病毒作用评价实验设三次重复，每次重复将ma104细胞均匀地铺在96孔板中，吸去培养基，每孔加入50μl100tcid50的轮状病毒液，放入培养箱中吸附2h，分为病毒对照组和5个样品组(每个样品组又分为6个剂量组)，每个剂量组4个复孔，具体分别为：病毒对照组、msn组(10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组)、cc-cm-msn组(10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组)、mc-cm-msn组(10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组)、mc-cms组(10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组)、cc-cms组(10μg/ml组、20μg/ml组、50μg/ml组、100μg/ml组、200μg/ml组、300μg/ml组)。同时对上述各组分别进行如下处理：病毒对照组每孔加入100μl不含血清的mem培养基，msn组每孔加入100μl含msn培养基(不同剂量组仅加入的msn量不同)、cc-cm-msn组每孔加入100μl含cc-cm-msn培养基(不同剂量组仅加入的cc-cm-msn量不同)、mc-cm-msn组每孔加入100μl含mc-cm-msn培养基(不同剂量组仅加入的mc-cm-msn量不同)、mc-cms组每孔加入100μl含mc-cms培养基(不同剂量组仅加入的mc-cms量不同)、cc-cms组每孔加入100μl含cc-cms培养基(不同剂量组仅加入的cc-cms量不同)。同时设正常细胞对照组：将ma104细胞均匀地铺在96孔板中，吸去培养基，每孔加入50μl不含病毒的维持液，放入培养箱中吸附2h，每孔加入100μl不含血清的mem培养基。其中，含msn培养基是在上述不含血清的mem培养基中加入1.2项下所述的msn得到的培养基，含msn培养基不同剂量组中的msn含量分别为10、20、50、100、200、300μg/ml。含cc-cm-msn培养基是在上述不含血清的mem培养基中加入1.3项下所述的cc-cm-msn得到的培养基，含cc-cm-msn培养基不同剂量组中的cc-cm-msn含量分别为10、20、50、100、200、300μg/ml。含mc-cm-msn培养基是在上述不含血清的mem培养基中加入2.2项下所述的mc-cm-msn得到的培养基，含mc-cm-msn培养基不同剂量组中的mc-cm-msn含量分别为10、20、50、100、200、300μg/ml。含mc-cms培养基是在上述不含血清的mem培养基中加入2.1.3项下所述的mc-cms得到的培养基，含mc-cms培养基不同剂量组中的mc-cms含量分别为10、20、50、100、200、300μg/ml。含cc-cms培养基是在上述不含血清的mem培养基中加入1.1.3项下所述的cc-cms得到的培养基，含cc-cms培养基不同剂量组中的cc-cms含量分别为10、20、50、100、200、300μg/ml。将上述各组放回培养箱中培养3天，每天在倒置显微镜下观察细胞变化，记录细胞病变效应(cpe)程度。待病毒对照组cpe均达80％以上，且细胞对照组正常时，用mtt对活细胞染色，读取a570值，按下列公式计算各样品组对病毒的抑制率：病毒抑制率(％)＝(样品处理组a570-病毒对照组a570)/(正常细胞对照组a570-病毒对照组a570)×100％，并计算出各样品组半数有效浓度ic50。结果见表1：表1.不同剂量细胞膜仿生纳米粒对rv病毒的抑制率(％)由结果可知，细胞膜仿生纳米粒给药处理(cc-cm-msn组和mc-cm-msn组)对rv病毒感染的治疗作用(对病毒增殖的抑制作用)良好，抑制率均随剂量增加而增加，呈现量效关系，cc-cm-msn组和mc-cm-msn组半数有效浓度分别为52.8μg/ml和66.5μg/ml；其中caco-2细胞膜仿生纳米粒处理(cc-cm-msn组)略优于mdck细胞膜仿生纳米粒处理(mc-cm-msn组)。单独的介孔二氧化硅纳米粒处理(msn组)对于rv病毒感染的细胞基本无治疗作用(与病毒对照组相比无显著差异)；单独的caco-2细胞膜小体cms处理(cc-cms组)和mdck细胞膜小体cms处理(mc-cms组)对于rv病毒增殖有一定抑制作用，但明显弱于cc-cm-msn组和mc-cm-msn组。需要说明的是，近年国内外关于细胞膜仿生纳米粒的文献报道中，采用的细胞膜有红细胞膜、白细胞膜、肿瘤细胞膜、细菌细胞膜等，尚未见到使用caco-2细胞膜或mdck细胞膜的报道；将caco-2细胞膜或mdck细胞膜仿生纳米粒用于抗rv病毒感染方面更是未见任何报道。而且，天然的caco-2细胞或mdck细胞在经过细胞破碎、细胞膜提取以及与纳米粒内核共挤压形成仿生纳米粒的复杂过程中，细胞膜表面结构和功能是否能够得以保持，是否能够如期望的那样有效发挥吸附rv病毒的作用，并非可以预测；需要由专业人员经过大量创造性劳动，获得仿生纳米粒体系并进行抗病毒相关的活性测试后才可证实。此外，虽已有其它种类的细胞膜仿生纳米粒相关报道，但不同种类细胞的细胞膜提取工艺和具体参数并不相同，caco-2细胞与其它已有研究的细胞(如肿瘤细胞、红细胞、细菌细胞等)相比，其培养周期更长，而提取细胞膜一次至少需要收集几千万至上亿个细胞才可进行，因此细胞膜提取之前的细胞传代和收集所需时间远超过其它种类细胞，因此染菌或细胞出现异常的风险也高于其它种类细胞，无法简单借鉴其它细胞膜提取的经验。再者，caco-2或mdck细胞膜提取之后，与msn纳米粒共挤压之后，照着文献中仿生纳米粒的制备条件，并不能形成稳定的仿生纳米粒，上述实施例1中的制备抗轮状病毒感染的细胞膜仿生纳米粒的制备方法是发明人经过大量的工艺条件摸索获得的适宜的条件，这些实验包括：1细胞膜提取条件考察采用mdck细胞进行细胞膜提取条件的考察。1.1细胞裂解时间对细胞膜提取的影响为考察细胞裂解时间的影响，设计两个实验组：第一组裂解时间为1h，第二组裂解时间为2.5h。具体方法如下：将含有10％胎牛血清，1％青霉素-链霉素双抗的dmem培养基置于175cm2培养瓶中，在37℃，5％co2培养箱中培养mdck细胞，待细胞融合度达到90％，加入1ml含edta的0.25％胰酶，消化约5min，加入5ml新鲜培养基轻轻吹打，并将细胞悬液转移至离心管中，850rpm离心3min，弃去上层培养基，加入pbs，吹打混匀，850rpm离心3min，弃去上清液，并重复两次洗涤步骤。最后弃去上清液，加入10ml预先配制好的冷细胞裂解液(ph＝7.4，其中溶质为10mmtris,10mmmgcl2和每10ml中加入1片edta-free的蛋白酶抑制剂，溶剂为水)，置于4℃裂解1小时或2.5小时后，转移至dounce匀浆器中进行匀浆破碎细胞，将破碎后的细胞悬液转移至离心管中，进行如下分步差速离心：先以500g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液1；对上清液1采用10000g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液2；对上清液2进行100000g离心1h，收集沉淀。结果表明，裂解1小时，没有收集到细胞膜沉淀，裂解2.5小时收集到了细胞膜沉淀。1.2离心方法对细胞膜提取效率的影响为考察不同离心方法对细胞膜提取效率的影响，设计两个实验组。第一组离心方法为：先以500g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液1；对上清液1采用10000g离心5min收集上清液，将该上清液命名为上清液2；对上清液2进行100000g离心1h，收集沉淀。第二组离心方法为:先以2000g离心12min收集上清液，将该上清液命名为上清液1′，对上清液1′采用100000g离心1h，收集沉淀。具体的测试方法如下：除将1.1的裂解时间替换为2.5小时，将离心替换为上述第一组离心或第二组离心外，其它操作均与1.1相同。结果表明，第二组离心没有收集到细胞膜沉淀，第一组离心收集到了细胞膜沉淀。2、细胞膜小体(简称cms)制备条件优化筛选取实施例1中的1.1.2的caco-2细胞膜冻干粉2mg，分散在pbs溶液中，稀释至6ml，测粒径，将该颗粒命名为cms(分散后)；用超声细胞破碎仪进行功率为50w和频率为20-25khz的冰浴超声1min后，再次测粒径，将该颗粒命名为cms(超声后)；用脂质体挤出器，分别采用孔径为800nm、400nm、200nm、100nm的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下反复挤出10次，将获得的颗粒分别命名为800nm滤膜、400nm滤膜、200nm滤膜和100nm滤膜。用nano-zs90型激光粒度及zeta电位分析仪分别测定上述颗粒的粒径及多分散系数(pdi)。结果如表2所示。说明超声对细胞膜小体的形成十分必要；通过对不同孔径滤膜的筛选结果知，经200nm孔径滤膜挤出后的细胞膜小体，粒径大小合适，且pdi值最小(分散均一性最好)。因此，确定选用200nm孔径聚酯膜进行细胞膜小体的制备。表2.各颗粒的粒径及多分散系数颗粒粒径(nm)pdicms(分散后)13061.0cms(超声后)381.50.528800nm滤膜119.90.255400nm滤膜117.00.231200nm滤膜108.80.198100nm滤膜107.80.2783、细胞膜仿生纳米粒(cm-msn)的制备条件优化筛选取实施例1中1.1.3的caco-2细胞膜小体(简称cc-cms)2mg(冻干粉干重)，加入实施例1中1.2项下的msn1mg，涡旋混合1min，用超声细胞破碎仪进行功率为80w和频率为20-25khz、20-25℃水浴超声2min，用脂质体挤出器，分别采用400nm、200nm和100nm孔径的whatman聚碳酸酯nuclepore径迹蚀刻膜作为滤膜，在0.3mpa的挤出压力下反复挤出10次，用nano-zs90型激光粒度及zeta电位分析仪分别测定所得的细胞膜仿生纳米粒(简称cm-msn)的粒径及多分散系数(pdi)。结果如表3所示，表明选用200nm孔径的滤膜进行纳米粒的挤出包覆，所获得的cm-msn粒径与期望值接近，且pdi值更低，说明粒度分布更为均一。表3.不同孔径滤膜过滤后cm-msn的粒径结果滤膜孔径大小(nm)粒径(nm)pdi40088.860.21620094.600.12210090.880.210当前第1页12