本发明涉及一种脂质体制备方法，以及含有该脂质体的注射剂及其制备方法。
背景技术：
脂质体是一种类似生物膜结构的双分子层微小囊泡，是一种含磷脂组分的脂质微粒。作为药物载体，具有靶向性、延效性、提高药物稳定性、可生物降解且无免疫原性和毒性等特点。
鉴于以上在临床使用方面的诸多问题，如何保护这类药物的内酯环结构，尽可能地降低或避免其被破坏成为此类药物制剂开发的热点问题。利用脂质体的特殊双分子层结构及其特性，将药物包封于脂质体的内水相中，可对其内酯环进行有效的保护。采用硫酸铵梯度法制备盐酸伊立替康脂质体，获得了较高的包封率，解决了被动载药法对于水溶性药物包封率较低的问题，同时将药物包封于具有较低ph环境的脂质体内水相中可保证其内酯形式不发生改变，从而保持其抗癌活性。
将聚乙二醇(peg)－衍生化磷脂接入脂质体膜，可以通过防止脂质体与生物体内环境的相互作用而实现长循环效应，并增强脂质体到实体瘤的外渗作用，这一现象称为epr效应(enhancedpermeabilityandretentioneffect)。研究发现传统的卵磷脂、胆固醇制备的脂质体在体内多被网状内皮系统(reticuloendothelialsystem，res)吞噬，在血液循环中驻留时间较短。而经peg修饰后的脂质体表面亲水性增加，降低了其与吞噬细胞的亲和性，从而能够逃避网状内皮系统的识别而减少其对脂质体的捕获，最终延长脂质体的体内循环，因此长循环脂质体具有越来越高的临床及商业应用价值。
盐酸伊立替康的现有市售制剂为盐酸伊立替康注射液及其冻干粉针制剂、盐酸伊立替康脂质体注射液，其中盐酸伊立替康脂质体注射液因其药物稳定性、改变药物在体内的分布行为、携载药物被动或主动靶向到病变部位、提高药物疗效、降低副作用等优点，被广泛用于抗肿瘤患者。
现有技术cn102271659a、cn105982857a、cn102935066a、cn1994279a、cn103830182a中公开了盐酸伊立替康脂质体注射剂的制备方法，但均未对脂质体制备方法中的预过滤及除菌过滤系统中的过滤时药液、滤芯、管道的温度以及滤芯干燥控制其水分含量等实验条件对样品、辅料含量是否损失进行说明。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种脂质体制备方法中的过滤步骤(温度、滤芯水分含量)可降低过滤时药物含量损失(提高样品的过滤通量)和辅料含量损失、提高载药量和包封率。该方法简单可控、利于工业扩大生产。
本发明的技术方案如下：
本发明提供一种制备脂质体的方法，其特征在于，在制得含有药物活性成分的脂质体溶液后过滤除菌，其中，所述过滤除菌步骤在溶液温度为35-55℃范围内进行，优选40-50℃，更优选45℃。
优选的，所述过滤是使用选自孔径为0.45μm、0.22μm或0.20μm的滤芯过滤。
上述方案中，所述脂质体含有中性磷脂和胆固醇。
上述方案中，所述的中性磷脂为氢化大豆磷脂。
优选的，所述胆固醇与中性磷脂的重量比为1:3～5，药物活性成分与中性磷脂的比例为1:2～5。
本发明优选的方法中脂质体的制备包括如下步骤：
a、空白脂质体的制备；
b、脂质体膜内外水相离子梯度的产生；
c、载药；
d、切向流超滤法去除外水相游离药物；
e、将步骤d所得脂质体溶液过滤除菌。
本发明所述空白脂质体的制备方法为：将中性磷脂、胆固醇溶于有机溶剂中，充分溶解后与硫酸铵溶液混合，减压除去有机溶剂后得到空白脂质体粗品，之后高压均质或挤出；所述有机溶剂优选乙醇或乙醇与叔丁醇的混合溶剂。
本发明所述高压均质或挤出后加入聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dspe)或聚乙二醇-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(peg-dppe)。
本发明所述脂质体膜内外水相离子梯度的产生方法为：置换空白脂质体外水相，使脂质体内水相与外水相产生离子梯度；优选ph5.0-7.0的磷酸盐缓冲液作为脂质体的置换介质；所述磷酸盐缓冲液优选一种或多种li+、k+、na+、fe2+、ca2+、mg2+、ba2+、mn2+、nh4+或h+离子盐。
本发明所述载药方法为：配制药物活性成分溶液，加入到具有离子梯度的空白脂质体中，加热搅拌、孵育，即得含药脂质体。
本发明所述药物活性成分为抗肿瘤药物，优选水溶性抗肿瘤药物，例如伊立替康、阿霉素，优选伊立替康或其可药用盐，更优选盐酸伊立替康三水合物。
优选的，所述脂质体含有以下重量比的成分：
上述方案中，所述的过滤除菌步骤使用滤芯过滤，且过滤时单支滤芯的含水量控制在小于等于10g。
在优选地实施方案中，所述的脂质体可制备成注射液或冻干制剂的形式；所述的注射液或冻干制剂中还可含有稳定剂、渗透压调节剂或抗氧剂中的一种或多种；所述稳定剂可选自一种或多种乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠盐或乙二胺四乙酸二钙盐，稳定剂的加入比例为0％-0.5％/v％且下限不为0％；所述渗透压调节剂可选自一种或多种葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、氯化钠、甘油、组氨酸及其盐酸化物、甘氨酸及其盐酸化物、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酸、精氨酸或缬氨酸，渗透压调节剂加入比例为0％-0.5％/v％且下限不为0％；所述抗氧剂可选自水溶性抗氧剂或油溶性抗氧剂，所述水溶性抗氧剂优选抗坏血酸、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、l-半胱氨酸或其混合物，所述油溶性抗氧剂优选α-生育酚、α-生育酚琥珀酸酯、α-醋酸生育酚或其混合物，抗氧剂的加入比例为0％-0.5％/v％且下限不为0％。
本发明所述的“滤芯”是指材质为pes(聚醚砜)或pvdf(聚偏氟乙烯)或pes(聚醚砜)与pvdf(聚偏氟乙烯)复合材质的滤芯。
本发明所述“滤芯的含水量”是指干燥后单支滤芯吸附的水量(以重量计，单位g)。
本发明所述的“气泡点”是指当滤材被液体(润湿液)浸润后，在滤材的两侧加上气体压差，由于毛细管效应，气体要将毛细管中的液体赶走而冒出气泡，气体的压差必须增大到某一值δp，这个压差之就称为气泡点。孔径越小，气泡点越高。因此可以用气泡点来检测过滤器的性能。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明制备方法具有以下优点：
本发明除菌过滤时控制药液在特定温度范围内，可以有效控制药物和辅料的含量损失、提高包封率。
具体实施方式
以下结合实施例用于进一步描述本发明，但这些实施例并非限制本发明的范围。
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
使用分析天平称量滤芯干燥前后的重量，分析天平型号为sartoriusbt125d；
含量测定的hplc设备型号为agilenttechnologies1200series。
实施例1、盐酸伊立替康脂质体注射剂的制备
处方
表1、不同盐酸伊立替康脂质体处方比较
制备方法：
将处方量的氢化大豆卵磷脂(hspc)、胆固醇(chol)溶于适量无水乙醇得脂质溶液，与100ml硫酸铵溶液混合，减压除掉乙醇得到空白脂质体粗品；采用高压均质机1000bar均质5次循环，再通过挤出设备挤出脂质体控制其粒径(挤出器铺2张0.1μm挤出膜，挤出5次)；加入配制好的dspe-peg2000水溶液，搅拌孵育20分钟，采用切向流超滤装置透析空白脂质体，中间不间断的补充磷酸缓冲盐，即得空白脂质体。
用注射用水配制盐酸伊立替康水溶液，按照表1中不同盐酸伊立替康与hspc的重量比加入到上述具有离子梯度的空白脂质体分散液中，60℃加热搅拌，孵育20分钟即得载药脂质体；采用切向流超滤装置除去未包封的药物，同时将样品浓缩至约50ml。调整药物浓度，定容，0.22μm滤芯过滤除菌，充氮气灌封于小瓶中，即得盐酸伊立替康脂质体注射液。
实施例2、除菌过滤条件考察
(1)药物样品含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ultimatexb-c18，250×4.6mm，5μm)；
流动相：以0.05mol/l磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水800ml、三乙胺10ml，滴加磷酸调节ph为4.0，再加水至1000ml，即得)-甲醇-乙腈(45:55:5，体积比)为流动相；
检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃；
进样量：20μl；
记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中盐酸伊立替康三水合物的含量。
(2)依地酸钙钠含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合多孔硅胶为填充剂，如agilentzorbaxeclipsexdb(5μm，4.6×150mm)；
流动相：0.006m四丁基氢氧化铵溶液(用磷酸调ph至6.5)-乙腈＝77:23(体积比)；
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：40℃；
进样量：50μl；
记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中依地酸钙钠的含量。
(3)胆固醇含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(phenomenexgeminic18，150×4.6mm，5μm)；
流动相：甲醇；
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；
进样量：20μl；
以标准曲线法计算供试品中胆固醇的含量。
(4)氢化磷脂酰胆碱含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以硅胶为填充剂(watersxbridgehilic，150×4.6mm,5μm)，
流动相：[正己烷-异丙醇-(甲醇-醋酸-三乙胺＝500:10:4，体积比)＝100:100:75，体积比]:[甲醇-醋酸-三乙胺＝500:10:4，体积比]＝60:40，体积比；
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；
进样量：20μl；
以标准曲线法计算氢化磷脂酰胆碱含量。
(5)培化磷脂酰乙醇胺含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ods-a，150×4.6mm，5μm)；
流动相：甲醇-冰醋酸-三乙胺(500:10:4，体积比)；
检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；
进样量：20μl；
以标准曲线法计算培化磷脂酰乙醇胺含量。
(6)包封率的测定方法：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ultimatexb-c18，250×4.6mm，5μm)；
流动相：以0.05mol/l磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水800ml，加三乙胺10ml，滴加磷酸调节ph为4.0，再加水至1000ml)-甲醇-乙腈(55:45:5)；
检测波长254nm；流速1.0ml/min，柱温30℃；
进样量：20μl；
使用实施例1中胆固醇:磷脂:dspe-peg2000为1:4:0.4的处方，在制得脂质体溶液定容后，比较其过滤除菌前后的参数变化。吸取1ml过滤前后的样品溶液至10ml量瓶中，加入水稀释至刻度，摇匀，置超滤器(millipore)超滤，弃去初滤液，取续滤液为供试品，分别吸取供试品溶液、对照品溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，以外标法计算制剂游离药物含量，记为w，另按含量测定项下方法计算本品的药物总含量，记为w0，包封率计算公式如下：
实验结果：
表2、过滤温度对产品质量研究实验结果
实验结论：
由表2可知，45℃过滤前后样品的氢化大豆磷脂酰胆碱、培化磷脂酰乙醇胺、胆固醇变化不大，45℃过滤对辅料含量影响不大，含量降低约4.5％，对包封率影响不大；60℃过滤，经0.45μm过滤后含量无损失，但是经0.22μm过滤后含量、各辅料量均降低约30％，包封率也降低约10％；可见，选择合适的过滤温度对脂质体成品的性质影响极大。
实施例3、滤芯干燥处理、水分残留量对药物含量的影响
滤芯在使用前需灭菌，灭菌后浸泡在水中30min以检查气泡点是否合格，然后放入热的电热烘箱中干燥。将干燥之后的过滤器，按标记安装到相应的位置，打开压缩口气换热及其过滤器进口相关阀门，对每一个滤芯吹扫70min，结束后取出过滤器称重，分别计算各滤芯前后的重量差异。
含量测定条件：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(ultimatexb-c18，250×4.6mm，5μm)；
流动相：以0.05mol/l磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾6.8g，加水800ml、三乙胺10ml，滴加磷酸调节ph为4.0，再加水至1000ml，即得)-甲醇-乙腈(45:55:5，体积比)为流动相；
检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温30℃；
进样量：20μl；
记录色谱图，以外标法计算供试品溶液中盐酸伊立替康三水合物(api)的含量。
实验结果：
表3、不同批次灭菌前与灭菌干燥后测试结果
表4、经预过滤、除菌过滤之后的api含量(滤芯灭菌后未经过干燥处理)
表5、经预过滤、除菌过滤之后的api的含量(滤芯经过干燥处理后，fl-10)
表6、经预过滤、除菌过滤之后的api含量(滤芯经过干燥处理后，fl-14，且水分残留量30.5g>10g)
实验结论：
滤芯在灭菌、检查后，如不进行干燥或干燥不足，将导致过滤除菌后产生大量的药物损失，而控制滤芯水分含量小于等于10g，则对药物含量无影响。