本发明属医药技术领域，涉及硫化氢合成酶抑制剂pag在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。经体外实验和体内动物试验显示，硫化氢供体硫氢化钠明显促进子宫内膜间质细胞(esc)生长，而硫化氢合成酶抑制剂pag显著抑制异位灶的生长，pag可用于制备治疗子宫内膜异位症的药物。
背景技术：
现有研究表明子宫内膜异位症(简称内异症，endometriosis，ems)一种复杂的炎症性雌激素依赖生长为特征的常见的慢性疾病，特征是子宫内膜在子宫腔以外的部位生长，影响6-10％的育龄妇女，症状包括慢性盆腔疼痛、痛经和不孕，严重影响女性的生活质量。起源于随经血逆流入腹腔的类固醇激素敏感的内膜细胞或组织，种植于腹膜表面形成子宫内膜异位症的异位病灶(简称异位灶)，进而引起炎症反应。而患有内异症的女性，可能存在着免疫应答及炎症反应的异常，干扰了机体损伤的清除。这些炎症应答常常伴随着血管生成，细胞粘附，纤维化，疤痕形成，神经元的浸润以及解剖学上的变异，从而导致疼痛和不孕。影响6％～15％的育龄女性，给患者带来高昂的医疗费用、极大心理负担。由于其发病机理不明确，目前大多数内异症病人并没有得到满意的治疗。多项研究表明子宫内膜异位症的发生及发展受遗传、生化、环境、免疫功能障碍等多因素影响。深入探究内异症的发病机制，有助于我们对内异症疾病。虽然子宫内膜异位症是一种良性疾病，但同时也表现出恶性肿瘤的特点，如对周围组织的侵袭，转移到远处和治疗后易复发等。深入探究内异症的发病机制，有助于我们对内异症疾病。
目前就子宫内膜异位症的发病机制理论众多，其中经血逆流种植学说被广泛接受，这一理论认为有活力的子宫内膜组织在月经期间通过输卵管进入腹膜腔随后植入腹膜组织或盆腔器官。然而，有76-90％的女性存在经血逆流现象，只有6-10％的妇女患子宫内膜异位症。起源于随经血逆流入腹腔的类固醇激素敏感的内膜细胞或组织，种植于腹膜表面进而引起炎症反应。而患有内异症的女性，可能存在着免疫应答及炎症反应的异常，干扰了机体损伤的清除。这些炎症应答常常伴随着血管生成，细胞粘附，纤维化，疤痕形成，神经元的浸润以及解剖学上的变异，从而导致疼痛和不孕。这说明了异常的炎症反应在内异症形成过程中起到了非常关键的作用。h2s是哺乳动物中重要的细胞生物学相关信号分子，其作为一种气体介质，和no、co气体类似，在细胞信号传导中扮演着重要的角色因此具有非常重要的调节细胞的功能，参与了多种细胞的炎症反应。最近的研究表明，h2s参与调节多种细胞的炎症反应，其促进炎症以及抑制炎症的效应都有被报道。这种可变的双面调节作用可能是剂量依赖导致的。在生理低剂量情况下，主要起到抗炎作用，而当达到病理高剂量时，其主要表现为促炎作用。这在之前已明确的no和co模式相同。cse及cbs的表达变化调节着体内内源性h2s的水平，从而介导细胞炎症反应，动脉粥样硬化、糖尿病等疾病的形成。研究积累的证据表明，子宫内膜细胞或组织随经血逆流，种植于腹膜表面引起炎症反应，进而引发一系列病理生理反应最终形成内异症病灶。新近发现的气体介质，介导多种细胞炎症反应，并与肿瘤转移有关。这意味着硫化氢在内异症发生发展中可能起到重要作用。
基于现有技术的现状，本发明拟通过实验研究评估硫化氢合成酶抑制剂cse抑制剂pag在治疗ems中的潜在价值，提供cse抑制剂pag用于制备治疗子宫内膜异位症(内异症)药物组合物中的用途，为ems的临床治疗提供新方法和新思路。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供硫化氢合成酶抑制剂pag新的制药用途，具体涉及硫化氢合成酶抑制剂pag在制备治疗子宫内膜异位症(内异症)的药物中的应用。
本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗子宫内膜异位症的药物组合物。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
硫化氢合成酶抑制剂pag在制备治疗子宫内膜异位症的药物中的应用。所述硫化氢合成酶抑制剂pag抑制子宫内膜异位症异位灶的生长。
实验结果显示，ems患者异位内膜中硫化氢合成酶cse的表达水平高于正常内膜，提示硫化氢可能参与内异症的疾病进展过程。体外实验和体内动物试验结果显示：硫氢化钠明显促进子宫内膜间质细胞(esc)增殖，而硫化氢合成酶抑制剂pag显著抑制异位灶的生长，pag可用于制备治疗子宫内膜异位症的药物。
具体地，本发明提供如下技术方案：收集正常子宫内膜组织及ems患者异位病灶组织，做成石蜡切片，通过免疫组化法检测cbs及cse表达水平，同时分离正常子宫内膜组织及ems患者异位病灶esc结果通过免疫细胞化学法检测cbs及cse表达水平,如图1-2所示。结果如下：cbs和cse均表达于胞浆，腺上皮细胞表达水平高于基质细胞；在组织水平、细胞水平，较正常子宫内膜相比，内异症异位病灶硫化氢合成酶cbs和cse的表达均增加。
体外试验显示，nahs(300μmol/ml，sigma公司)明显促进esc的增殖(如图3所示)，进一步，构建ems小鼠模型(如图4所示)，腹腔注射aoaa(aoaa30mg/kg/d，sigma公司)和或pag(50mg/kg/d，sigma公司)。结果显示，与对照组比较，硫化氢合成酶cbs抑制剂aoaa组和cse抑制剂pag组及联合应用组内异症病灶的重量及数量均明显减少(图5、图6)；同时予动物模型aoaa和pag组内异症模型，较pag组及aoaa组相比，病灶质量及数量无显著差异。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
cbs抑制剂aoaa和cse抑制剂pag联合在制备治疗子宫内膜异位症药物中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述药物可以单独使用或者以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含治疗有效量的cbs抑制剂aoaa、cse抑制剂pag，以及药学上可接受的载体。
所述药学上可接受的载体包括：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、稀释剂等。药物制剂与给药方式相匹配，例如，本发明的硫化氢合成酶抑制剂pag可以以注射剂的形式使用，注射剂采用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。
所述治疗有效量，是指pag施加量足以达到治疗预期目的量，其根据治疗前所期望的治疗效果实现。治疗有效量的确定是本领域技术人员的常规技术手段，有效量取决于多种因素，例如接受治疗个体的体型和/或个体所患疾病或不希望有的病症的发展程度。有效量也取决于药效化合物是否以单一剂量及用药频率。
本发明提供了硫化氢合成酶抑制剂cse抑制剂pag用于制备治疗ems药物的用途；尤其是经体外实验和动物实验证实，应用硫化氢合成酶抑制剂cbs抑制剂aoaa及cse抑制剂pag均显著抑制esc生长和侵袭及其异位灶大小。进一步，所述的硫化氢合成酶抑制剂cbs抑制剂aoaa及cse抑制剂pag可用于制备治疗子宫内膜异位症(内异症)药物组合物。
附图说明
附图1为cse在正常子宫内膜组织和卵巢子宫内膜异位组织的表达。图1a正常内膜组织阴性对照；图1c正常内膜组织cse的表达；图1e正常内膜组织vimentin的表达；图1b卵巢内异症组织阴性对照；图1d卵巢内异症组织cse的表达；图1f卵巢内异症组织vimentin的表达；其中：红色箭头表示cse在卵巢内异症组织及正常内膜腺上皮细胞的表达；黑色箭头表示cse在卵巢内异症组织及正常内膜基质细胞的表达；放大倍数×400。
附图2为cse在正常子宫内膜和卵巢子宫内膜异位基质细胞的表达。图2a正常子宫内膜基质细胞阴性对照；图2c正常子宫内膜基质细胞cse的表达；图2e正常子宫内膜基质细胞vimentin的表达；图2b异位内膜基质细胞阴性对照；图2d卵巢内异症基质细胞cse的表达；图2f异位内膜基质细胞vimentin的表达；其中：红色箭头表示cse在正常内膜间质细胞的表达；黑箭头表示cse在异位内膜基质细胞的表达；放大倍数×400。
图3为nahs促进子宫内膜间质细胞的增殖。细胞增殖通过cck8法检测在450nm处的od值。子宫内膜基质细胞用不同浓度的nahs(50,100,150,200,300,500,1000um/l)处理24h。图表用themean±sem表示。与对照组相比，*p<0.05,**p<0.01。纵坐标为细胞增殖活力能力：处理组/对照组；con代表对照组；硫氢化钠代表h2s供体。
图4为小鼠内异症模型病灶展示图。图中黑色箭头指示为内异症病灶。
图5为不同处理组内异症动物模型内异症病灶。
图6为不同处理组动物模型内异症病灶重量及数量统计数据。与nacl组相较，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，**表示p＜0.001；与pag相较，#表示p＜0.05。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1分析正常子宫内膜及ems患者异位病灶组织cbs及cse表达水平
收集正常子宫内膜组织及ems患者异位病灶组织，做成石蜡切片，通过免疫组化法检测cbs及cse表达水平。结果显示，正常内膜的基质细胞和腺上皮细胞均未见明显的cbs表达；而在卵巢子宫内膜异位组织中，基质细胞和腺上皮细胞均有cbs的较高表达。正常内膜和卵巢子宫内膜异位组织的基质细胞和腺上皮细胞均有cse的表达；而在卵巢子宫内膜异位组织中，基质细胞和腺上皮细胞cse表达水平较高(图1)。
实施例2分析正常子宫内膜基质细胞及异位内膜基质细胞cbs及cse表达水平
收集对照内膜组织、ems患者异位灶内膜组织，通过iv胶原酶(sigma)消化并原代分离培养esc，然后将细胞悬液种在盛有载玻片的六孔板，待细胞长至约70％，予4％多聚甲醛固定后，lx-triton100、3％过氧化氢处理，封闭、抗体孵育、染色。结果显示，正常内膜的基质细胞及卵巢子宫内膜异位症基质细胞cbs均有表达，卵巢子宫内膜异位症基质细胞cbs的表达较正常内膜基质细胞表达高。正常内膜的基质细胞及卵巢子宫内膜异位症基质细胞cse均有表达，卵巢子宫内膜异位症基质细胞cse的表达较正常内膜基质细胞表达高(图2)。
实施例3分析nahs对esc增殖的促进作用
分离培养esc，然后用nahs刺激24小时，cck8(东仁化学公司)法检测esc的细胞增殖活力(如图3所示)。结果显示，nahs能够在一定范围内促进正常子宫内膜基质细胞的增殖。
实施例4应用硫化氢合成酶抑制剂cbs抑制剂aoaa及cse抑制剂pag显著抑制ems小鼠异位灶生长动物实验
(1)构建ems小鼠模型：健康7周龄雌性c57b/l6小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司)，术前一周用雌激素肌肉注射诱导2次(第一天、第三天)，然后麻醉下开腹取自体双侧子宫，剪成子宫内膜碎片，均分为2份，腹腔注射于2只受体小鼠，术后14天常规处理小鼠，显示ems小鼠模型建立成功(如图4所示)。
(2)ems小鼠建模后4天，实验组分别予以抑制剂cbs抑制剂aoaa、cse抑制剂pag、或两药联合应用(药物浓度：aoaa组：aoaa30mg/kg/d；pag组：pag50mg/kg/d；pag+aoaa组：pag50mg/kg/d,aoaa20mg/kg/d；)，造模成功术后第四天、第六天、第八天、第十天、第十二天分别给药，均为腹腔注射，共计5次；对照组给予溶媒(生理盐水)处理；同样建模后14天常规处理小鼠，取异位灶。结果显示，较对照组相比，硫化氢合成酶cbs抑制剂aoaa组、cse抑制剂pag组及联合应用组内异症病灶的重量及数量均明显减少(图5、图6)；同时予动物模型aoaa和pag组内异症模型，较pag组及aoaa组相比，病灶质量及数量无显著差异。
本发明经体外和体内试验结果证实，硫化氢供体硫氢化钠明显促进子宫内膜间质细胞(esc)生长，而硫化氢合成酶抑制剂pag显著抑制异位灶的生长，因此pag可用于制备治疗子宫内膜异位症的药物。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。