本发明涉及一种新型细菌毒力因子抑制剂的应用，具体涉及化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮在制备抗菌药物中的应用，属于天然药物化学与医药应用技术领域。
背景技术：
目前，随着抗生素的广泛应用，致病菌的耐药性逐渐成为人类面临的重大课题，多重耐药菌的不断出现也使人们面临着类似抗生素缺乏年代的困扰。因此，寻找抑制细菌毒力因子的新型药物已成为急需解决的问题。多重耐药菌中，大多数为条件致病菌，其中革兰阴性杆菌占较大比例，如大肠杆菌、志贺菌、沙门菌、铜绿假单胞菌等。同时由于革兰阴性致病菌存在广泛的宿主范围，目前已对人类、食源性动物和农作物等造成了很大的健康和生存威胁，带来巨大的经济损失。
革兰阴性致病菌在致病过程中，存在多种致病因子，促进其对宿主细胞的粘附或侵袭，从而引起进一步的感染。其中，iii型分泌系统(t3ss)是许多革兰阴性致病菌分泌毒性蛋白进入宿主细胞的蛋白复合体，在致病菌的致病性方面起到非常重要的作用。t3ss在革兰阴性致病菌中存在广泛性和结构的保守型，同时在宿主正常菌群中不存在，因此成为一个新颖的抗菌靶点。
药用植物为现代药物发现提供了丰富的“源泉”。然而植物提取物在抗感染方面的研究仍然有待深入，例如，很多研究报道传统中药对细菌和其他感染有保护和治疗作用，但是对其中的活性分子及其作用机制知之甚少。主要原因之一是传统的抗菌、抗感染活性筛选模型是基于抑菌或杀菌作用，这些植物提取物虽然抗感染，但对病原细菌不一定有抑制作用，提示传统中药的抗感染活性成分可能是通过靶向病原细菌毒力因子识别宿主，或抑制病原细菌毒力蛋白的表达和功能，使细菌定殖宿主的能力大大减弱。缅甸多为热带区域，生物多样性丰富，药用植物资源丰富，但缅甸气候炎热潮湿，为热带多发病区，饮食卫生条件较差，胃肠道病也较普遍，因此本发明即在此背景下创制，即从缅甸药用植物中寻找革兰阴性致病菌的新型抗菌剂。
诃子terminaliacitrina(gaertn)roxb为使君子科诃子属植物诃子的干燥成熟果实，具有治久泻、久痢的作用，文献报道诃子属植物主要含有单宁类、多酚类、呋喃木质素糖苷类、香豆素类及其三萜酸类成分(exclij2016,15,589-598；journalofnaturalproducts2016,79,1298；fitoterapia2016,113,74)。作为一种药用植物，诃子(terminaliacitrina(gaertn)roxb)在缅甸被广泛用于治疗胃肠道不适以及痢疾等病症，但对其作用的药效物质基础没有任何报道。本发明首次从缅甸产诃子terminaliacitrina(gaertn)roxb的成熟果实中分离鉴定了化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮，该化合物在很多植物中都被分离得到，如3种诃子属植物terminaliabellerica,terminaliachebula和terminaliahorrid(phytochemistry2010,71,1132–1148)；lagerstroemiaspeciosa(j.agric.foodchem.2008,56,11668–11674)；mallotusfuretianus(naturalproductresearch,2017，https://doi.org/10.1080/14786419.2017.1350664)；walnutkernels(foodchemistry,2009,113(1):160-165)等，报道的该化合物的活性主要涉及抗氧化作用。但本发明化合物对沙门菌t3ss的毒性蛋白sipa、b、c和d分泌有抑制活性，并能显著降低沙门菌对宿主细胞的侵袭，因此对发现广谱高效且具有自主知识产权的新型抗菌剂具有重要意义。
技术实现要素：
本发明首次从缅甸产诃子terminaliacitrina(gaertn)roxb的成熟果实中分离鉴定了3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮，该化合物对沙门菌t3ss的毒性蛋白sipa、b、c和d分泌具有较好的抑制作用，但对沙门菌自身的生长没有抑制作用，且能够抑制沙门菌对hela细胞的侵袭。因此，本发明旨在提供化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮在抗菌药物中的应用，尤其是制备抗革兰阴性致病菌药物中的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮在制备抗菌药物中的应用，所述化合物结构式如下所示：
根据本发明优选的，本发明所述的应用，其中化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮是从诃子的成熟果实中分离出来的，所述分离方法如下：
(1)称取诃子1.0kg，粉碎后室温用体积比4:1的乙酸乙酯和甲醇混合溶剂浸泡提取三次，合并浸提液、40℃减压浓缩至干，得粗提物；
(2)将粗提物溶于水，用石油醚多次萃取脱脂；水相再经乙酸乙酯多次萃取，有机相40℃减压浓缩至干得ea提取物22.0g；
(3)ea提取物首先经180g反相c18硅胶柱层析分离，分别用水，30％，50％，70％，100％甲醇依次洗脱，每个组分洗脱2l，200ml/份接收，tlc检测，用ch2cl2:meoh＝4:1体积比展开，碘蒸气和浓硫酸显色，合并30％洗脱组分；继续用凝胶sephadexlh-20柱层析分离，甲醇洗脱，5ml/管,合并76-92管得到255mg；继续用30g、200-300目正相硅胶柱层析分离,ch2cl2-meoh以不同梯度50:1,30:1,15:1,meoh洗脱得化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮80mg。
根据本发明优选的，所述的抗菌药物包括化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮以及药学上可接受的辅料。
根据本发明优选的，本发明的化合物可与现有技术中其他常规抗菌药物联合用于制备抗菌药物。
根据本发明优选的，本发明的化合物可作为革兰阴性致病菌的iii型分泌系统抑制剂用于制备抗革兰阴性致病菌的药物。
有益效果
化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对沙门菌t3ss毒性蛋白sipa、b、c和d的分泌具有较好的抑制作用，且具有明显的浓度梯度依赖性；对沙门菌自身的生长没有抑制作用，并能通过抑制毒性蛋白的转运抑制沙门菌对hela细胞的侵袭，可以作为一种新型的抑菌剂。鉴于iii型分泌系统在革兰阴性致病菌中广泛存在且具有高度保守性，因此该化合物可作为制备抗革兰阴性致病菌的药物。
附图说明
图1是化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮抑制沙门菌iii型分泌系统毒性蛋白sipa、b、c和d的分泌的图。
图2是化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮抑制沙门菌培养上清中sipc的含量的图。
图3是化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对鼠伤寒沙门菌的生长曲线的影响的图。
图4是化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对鼠伤寒沙门菌侵袭hela细胞的影响的图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。所述百分比数没有特别说明的均为质量百分比，所使用原料没有特别说明的均为市售。
实施例1.化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮的分离
化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮是从诃子的成熟果实中分离出来的，所述分离方法如下：
(1)称取诃子1.0kg，粉碎后室温用体积比4:1的乙酸乙酯和甲醇混合溶剂浸泡提取三次，合并浸提液、40℃减压浓缩至干，得粗提物；
(2)将粗提物溶于水，用石油醚多次萃取脱脂；水相再经乙酸乙酯多次萃取，有机相40℃减压浓缩至干得ea提取物22.0g；
(3)ea提取物首先经180g反相c18硅胶柱层析分离，分别用水，30％，50％，70％，100％甲醇依次洗脱，每个组分洗脱2l，200ml/份接收，tlc检测，用ch2cl2:meoh＝4:1体积比展开，碘蒸气和浓硫酸显色，合并30％洗脱组分；继续用凝胶sephadexlh-20柱层析分离，甲醇洗脱，5ml/管,合并76-92管得到255mg；继续用30g、200-300目正相硅胶柱层析分离,ch2cl2-meoh以不同梯度如50:1,30:1,15:1,meoh洗脱得化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮80mg。
实施例2.化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮的结构鉴定
esi-ms测得化合物的准分子离子峰为m/z277.03[m+h]+。1h和13cnmr显示，化合物物结构共含有13个碳原子(见表1)，包括3个sp2杂化烯碳(δh/δc7.39/108.9d,6.78/113.2d,8.46/119.9d，10个sp2杂化的季碳(δc112.8s,119.3s,133.6s,134.1s,141.8s,144.8s,147.6s,147.2s,142.7s,164.6s)。一组相互耦合的质子信号δh6.78(d,9.04),和8.46(d,9.04)表明化合物中存在一个1,2,3,4-四取代的苯环结构，根据hmbc相关(h-1[8.46(d,9.04)]与c-10a,c-1a,c-4a,c-3,h-2[δh6.78(d,9.04)]与c-4,c-1a,c-4,c-3的远程相关，确定了部分片段的结构。根据单峰质子h-7[(δh7.39(s)]与c-6a,c-10a,c-8,c-9,c-6的远程相关关系，确定了化合物的结构为3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮。
表1化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮在氘代甲醇中核磁共振波谱数据
实施例3.化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮体外对沙门菌iii型分泌系统毒性蛋白分泌sipa、b、c和d的抑制作用
(参见文献hudsondl,et.al.antimicrobialagentschemotherapy,2007,51:2631-2635和lijf,etal.antimicrobialagentsandchemotherapy2013,57(5):2191–2198)
测试原理：iii型分泌系统是革兰阴性菌致病过程中非常重要的一种毒力因子，其借助于iii型分泌系统分泌毒性蛋白促进对宿主细胞的侵袭和在宿主细胞内的繁殖与扩散。因此阻断毒性蛋白的分泌可以抑制革兰阴性致病菌对宿主细胞的入侵。本实验以鼠伤寒沙门菌uk-1(χ8956)为研究对象，通过温度诱导的方法，促使鼠伤寒沙门菌通过iii型分泌系统分泌毒性蛋白至培养的菌液中，利用sds-page和westernblotting进行检测，评价化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对毒性蛋白分泌的抑制作用。
测试材料：
(1)鼠伤寒沙门氏菌uk-1(χ8956)：由美国亚利桑那州立大学roycurtissⅲ教授惠赠提供。
(2)丙烯酰胺-双丙烯酰胺(40％)，aps，temed，考马斯亮蓝r250，硝酸纤维素pvdf膜均为市售品。
(3)sipc鼠单克隆抗体：tgcbiomics公司产品。
(4)样品处理：样品临用前溶于dmso配成适当浓度。
(5)阳性对照药：csnb(文献lijf,etal.antimicrobialagentsandchemotherapy2013,57(5):2191–2198报道)。
测试方法：
新鲜的沙门菌菌液，按1:100转接至lb(0.2％l-ara)中，25℃，220rpm振荡培养过夜。然后过夜培养物，按1:10转接至1ml新鲜lb(0.2％l-ara)培养基中，加入1μl适当浓度的药物，37℃，220rpm振荡培养4h。取各培养物，稀释10倍，测定od600值。其余培养物12000g，4℃离心5min。轻轻吸取上清800μl，然后加入88μl100％tca至终浓度10％，轻轻振荡几次，冰上放置30min。12000g，4℃离心5min，倒掉上清，每管加入400μl-20℃保存的丙酮，轻轻振荡几次，冰上10min，12000g，4℃离心5min。完全挥干丙酮后，根据od600值，加入适当体积1倍上样缓冲液溶解蛋白，95℃加热5min，促进蛋白变性。取适量制备好的蛋白样品，进行10％sds-page，然后用0.1％(w/v)考马斯亮蓝r250染色、脱色，利用凝胶成像系统成像观察(见图1)。
测试结果：
由图1结果可以看出，与阳性对照化合物csnb(100μm)相比较，化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对鼠沙门菌ⅲ型分泌系统毒性蛋白sipa、b、c和sipd均具有不同程度的抑制作用，且具有浓度梯度依赖性，在100μm浓度下，其抑制作用与阳性对照相当。进一步通过westernblotting(图2)进行检测，发现加入化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮后，培养上清中的sipc明显降低，表明可能抑制sipc的转运过程。
实施例4.化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对鼠伤寒沙门菌生长的影响
测试方法:取鼠伤寒沙门菌25℃过夜培养物，按1:10转接至1mllb(0.2％l-ara)中，同时各加入化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮，然后置于37℃震荡培养。每个样品设立三个重复。每隔1h，测定1次od600，然后绘制沙门菌生长曲线(图3)。
测试结果：
结果表明，化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮在200μm浓度下对沙门菌的生长几乎没有影响。
实施例5.化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对鼠伤寒沙门菌侵袭hela细胞的影响
1.将hela细胞消化后接种于小盘培养皿中，每盘2×105个细胞，置于细胞培养箱中过夜(37℃，5％co2)。
2.同时将沙门菌接种于lb培养基(0.2％l-ara)中，于摇床25℃/220rpm振荡过夜。次日测定菌浓od600值。
3.次日将hela细胞换1mldmem培养基(无fbs)，培养适应30min后，moi为1000，加入相应的菌液，同时加入药物(终浓度100μm)与等体积的dmso，37℃培养15/30/45/60min。
4.待培养时间到达后，将菌液吸入ep(1.5ml)管中，再各加入pbs(500μl)清洗胞外的细菌，再加入ep管中，然后离心，12000×g，5min收集上清。
5.将细胞置于冰上，加入细胞裂解液(210μl，临用前加入pmsf，终浓度1mm)冰上放置5min，刮下细胞收集于ep管中，并超声破碎(超1s停1s，超4s，25％)，破碎完的细胞液加入4×loadingbuffer(70μl)溶解。
6.对上述得到的细胞培养液样品与细胞裂解液样品分别95℃煮沸5min，然后westernblotting检测，以gapdh为内参。
结果表明：随着侵袭时间的增长，hela细胞内毒力因子sipc水平，相比于对照组dmso，在不同培养时间，相同的侵染指数下表现出明显的抑制作用，在培养基中毒性蛋白sipc水平相比于对照组dmso，没有明显变化，因此可以判断出化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮可以抑制sipc的分泌从而导致沙门菌侵袭能力降低。(见图4)
综上所述，化合物3,4,8,9,10-五羟基二苯骈[b,d]吡喃-6-酮对沙门菌t3ss毒性蛋白的分泌具有较好的抑制作用，且具有浓度梯度依赖性；对沙门菌自身的生长没有抑制作用，且能够抑制沙门菌对hela细胞的侵袭，可以作为一种新型的抑菌剂。