本发明涉及药学领域，具体而言，一种中药组合物及其应用。
背景技术：
空气污染对人体健康的影响已经成为大家普遍关心的社会问题。据中国环境科学研究院专家统计，共有2000多项研究指出，在可吸入颗粒中，对人体健康危害最大的是直径小于或等于2.5微米的颗粒物(fineparticulatematter,pm2.5)。pm2.5有着粒径小，在体内滞留时间长，不易代谢，有毒物质含量高等特点。作为一种可吸入颗粒物，pm2.5可以通过呼吸系统进入人体肺部，沉淀在支气管和肺泡中，其中更细小成分甚至能够穿透肺泡，干扰肺内的气体交换，引发肺部细胞氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡等生物过程，对人体健康造成很大影响。因此，预防或缓解pm造成疾病的形势刻不容缓。
目前市场上宣称防治或缓解可吸入颗粒物造成肺损伤的产品都没有起到令人满意的效果。研究表明市售的一些防霾口罩根本不能起到阻隔pm2.5的作用；室内的空气净化器会吸附一些颗粒，但是其产生的臭氧严重危害人类健康。因此，将传统中医药理论与现代药理学相结合，合理利用中药组合物资源，开发预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤中药组合物具有重要现实意义。
技术实现要素：
针对相关技术中的问题，本发明研究了一种中药组合物，其特征在于，所述中药组合物的原料药包括山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母、白术、白扁豆、荷叶中的两种或以上的组合。
上述中药组合物的原料药由山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母、白术、白扁豆、荷叶中的两种或以上的组合组成。
上述中药组合物的原料药由山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母中的两种或以上的组合组成。
上述中药组合物的原料药由白术、白扁豆、桑叶中的两种或三种的组合组成。
上述中药组合物的原料药由玉竹、白扁豆、荷叶中的两种或三种的组合组成。
上述中药组合物的原料药由玉竹和桑叶组成。
上述中药组合物的原料药由橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹中的两种或以上的组合组成。
在上述中药组合物中，橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物、玉竹提取物的质量比为1-2:1-4:2-6:6-10:30-34。
本发明还提供了一种预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤的药物制剂，其中，所述药物制剂包括上述中药组合物。
在上述药物制剂中，所述药物制剂的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂或它们的组合。
本发明还提供了上述中药组合物在制备预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤的药物制剂中的应用。
本发明提供了一种中药组合物以及包括该中药组合物的药物制剂，该中药组合物能够减少活性氧、丙二醛、白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子积累，增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶含量，从而提高机体抗氧化和抗炎能力，增强机体免疫力，达到抵御可吸入颗粒物损伤机体的作用，该中药组合物可以用于预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1.1示出颗粒物(pm)的粒径大小分布图。
图2.1a示出不同浓度的pm作用不同的时间对a549细胞氧化应激状态的影响图，其中，“*”表示与空白组相比，p<0.05；“**”表示与空白组相比，p<0.01；“***”表示与空白组相比，p<0.001。
图2.1b示出不同浓度的pm作用不同的时间对a549细胞炎症状态的影响图，其中，“*”表示与空白组相比，p<0.05；“**”表示与空白组相比，p<0.01；“***”表示与空白组相比，p<0.001。
图2.2a示出不同浓度的pm作用不同的时间对a549细胞存活率的影响图，其中，“*”表示与空白组相比，p<0.05；“**”表示与空白组相比，p<0.01；“***”表示与空白组相比，p<0.001。
图2.2b示出pm对a549细胞凋亡状态的影响图。
图2.2c示出pm对a549细胞凋亡状态的影响图，其中，“**”表示与对照组相比，p<0.01。
图2.2d示出pm对a549细胞凋亡状态的影响图，其中，“**”表示与对照组相比，p<0.01。
图2.2e示出pm对a549细胞线粒体损伤的影响图，其中，jc-1下面的两列图中，左边一列图(即第一列图)中的浅色部分为绿色，右边一列图(即第二列图)中的浅色部分为红色，其中，“**”表示与对照组相比，p<0.01。
图2.2f示出pm对a549细胞tnf-a表达量的影响图，其中，“*”表示与对照组相比，p<0.05；“**”表示与对照组相比，p<0.01。
图3.1示出105个中药提取物的标准化提取流程。
图4.1a示出105个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激状态的影响图。
图4.1b示出21个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激状态的影响图，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.1c示出6个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.1d示出6个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激状态的影响图，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.1e示出6个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.1f示出6个中药提取物对pm造成的a549细胞氧化应激相关蛋白表达异常的影响图，其中，“#”表示与空白对照组相比，p<0.05；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.2a示出105个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症状态的影响图。
图4.2b示出10个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.2c示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.2d示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.2e示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.2f示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞炎症相关蛋白表达异常的影响图，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
图4.3a示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞凋亡状态的影响图。
图4.3b示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞凋亡状态的影响图，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05，“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.3c示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞线粒体损伤的影响图，其中，jc-1下面的两列图中，左边一列图中的浅色部分为绿色，右边一列图中的浅色部分为红色，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.3d示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞凋亡状态的影响图，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.3e示出3个中药提取物和凋亡抑制剂对pm造成的a549细胞低存活率的影响图，其中，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图4.3f示出3个中药提取物对pm造成的a549细胞凋亡相关蛋白表达异常的影响图，其中，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图5.1示出传统中药配伍理论指导组方设计图。
图6.1示出中药组合物对斑马鱼体内pm排泄速度的影响图。
图7.1示出中药组合物对pm造成的小鼠肺损伤的影响图。
图7.2示出中药组合物对pm造成的小鼠氧化应激状态的影响图，其中，“##”表示与空白对照组相比，p<0.01；“*”表示与模型组相比，p<0.05；“**”表示与模型组相比，p<0.01。
图7.3示出中药组合物对pm造成的小鼠炎症状态的影响图，其中，“###”表示与空白对照组相比，p<0.001；“**”表示与模型组相比，p<0.01；“***”表示与模型组相比，p<0.001。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例中的，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一些实施例，本发明提供了一种药食同源的中药组合物，其原料药包括山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母、白术、白扁豆、荷叶中的任意两种或以上的组合。该中药组合物可以用于制备预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤(例如pm2.5造成的肺损伤)的药物制剂。在一些实施例中，该中药组合物还可以包括不影响其对可吸入颗粒物造成的肺损伤的治疗效果的其他中药组合物组分。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药由山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母、白术、白扁豆、荷叶中的两种或以上的组合组成。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药由山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹、川贝母中的两种或以上的组合组成，其主要通过提高抗氧化活性来预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤，在该中药组合物中，山药提取物、龙眼肉提取物、桑叶提取物、橘红提取物、玉竹提取物、川贝母提取物的质量比为2:16:4:1:32:32。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药可以由白术、白扁豆、桑叶中的两种或三种的组合组成，其主要通过提高抗炎活性来预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤，在该中药组合物中，白术提取物、白扁豆提取物、桑叶提取物的质量比为1:4:2。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药可以由玉竹、白扁豆、荷叶中的两种或三种的组合组成，其主要通过提高抗细胞凋亡活性来预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤，在该中药组合物中，玉竹提取物、白扁豆提取物、荷叶提取物的质量比为4:1:2。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药可以由玉竹和桑叶组成，其主要通过提高巨噬细胞吞噬效果来预防或治疗可吸入颗粒物造成的肺损伤，在该中药组合物中，玉竹提取物和桑叶提取物的质量比为8:1。
根据本发明的一些实施例，中药组合物的原料药可以包括橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹中的一种或多种的组合，优选地，中药组合物的原料药可以由橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹中的一种或多种的组合组成，其中，橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物、玉竹提取物的质量比为1-2:1-4:2-6:6-10:30-34，优选地，橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物、玉竹提取物的质量比为1:2:4:8:32。
根据本发明的一些实施例，本发明还提供了一种预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤的药物制剂，该药物制剂包括上述中药组合物。
根据本发明的一些实施例，本发明还提供了上述中药组合物在制备预防或缓解可吸入颗粒物造成的肺损伤的药物制剂中的应用，该药物制剂的剂型选自片剂、胶囊剂、丸剂、气雾剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、糖浆剂或它们的组合。
根据本发明的一些实施例，本发明还提供一种中药组合物的制备方法，具体步骤如下：将橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹分别用10倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，于50-60℃下减压浓缩，再经冷冻干燥，得这5味中药的提取物；将橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物及玉竹提取物按质量比1:2:4:8:32称取并混匀，得到粉末状中药组合物。
本发明使用的试验材料及其来源如下：
1.中药材：105种中药购自北京三和药业有限公司。
2.试剂：超氧化物歧化酶(sod)试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；聚乙二醇辛基苯基醚triton-x100，购自上海生工生物工程有限公司；小鼠丙二醛(mda)elisa试剂盒、人丙二醛(mda)elisa试剂盒、小鼠活性氧(ros)elisa试剂盒、人活性氧(ros)elisa试剂盒、小鼠谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)elisa检测试剂盒、人谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)elisa检测试剂盒、ripa组织/细胞裂解液、小鼠白细胞介素8(il-8)elisa试剂盒、人白细胞介素8(il-8)elisa试剂盒、小鼠白细胞介素6(il-6)elisa试剂盒、人白细胞介素6(il-6)elisa试剂盒、小鼠白细胞介素1β(il-1β)elisa试剂盒、人白细胞介素1β(il-1β)elisa试剂盒、小鼠肿瘤坏死因子elisa检测试剂盒及人肿瘤坏死因子elisa检测试剂盒，均购自上海酶联生物科技有限公司；四甲基偶氮唑盐(mtt)，购自上海生工生物工程有限公司；一步法tunel细胞凋亡原位检测试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)、annexinv-kfluor488/pi双染细胞凋亡检测试剂盒、caspase抑制剂z-vad-fmk，购自凯基生物；caspase3antibody、caspase8antibody、caspase9antibody，购自天津润泰。
3.细胞系：人非小细胞肺癌细胞系(a549)，购自南京凯基生物科技发展有限公司
4.实验动物：spf级昆明雄性小鼠18～22g，同时购入饲料(国家标准啮齿类动物干燥饲料)。
5.仪器：ar2202cn电子天平，购自上海奥豪斯仪器有限公司；台式冷冻离心机，thermolegendmicrozir；bcd-192kj4度冰箱，购自青岛海尔股份有限公司；dw-86l286立体超低温保存箱，购自青岛海尔特种电器有限公司；酶联免疫检测仪，thermofisherscientific；日本岛津uv-1800紫外分光光度计，购自上海天河环境技术有限公司；ysl-1a多功能小鼠自主活动记录仪，购自济南益延科技发展有限公司；普通温度计，购自陕西医疗器械生产厂；0.22μm滤器，millipore；bioiia生物安全柜，西班牙泰事达(telstar)；stikil-161hico2培养箱，购自施都凯仪器设备(上海)有限公司；ckx41倒置相差显微镜，奥林巴斯；thermonunc96孔板，购自赛默飞世尔科技有限公司；bx53正置荧光显微镜，购自奥林巴斯。
6.颗粒物pm：使用pm高容量自动采样机采集空气中的pm。
7.所用药物及试剂的配制方法：(1)单味中药提取物供试品的制备：用10倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，于50-60℃下减压浓缩，再经冷冻干燥，得中药组合物提取物；将中药组合物提取物100mg溶于1640培养基10ml中(10mg/ml)超声溶解得到药物母液，用0.22μm滤器过滤除菌后使用。现用现配，溶液的配制及使用均应在无菌生物安全柜中操作；(2)中药组合物供试品的配制：小鼠试验中以蒸馏水为溶剂，将粉末状中药组合物配置成0.5g/ml，1g/ml和2g/ml3个浓度；斑马鱼试验中以受精卵培养液为溶剂(受精卵培养液配置方法：氯化钠3.5g、氯化钾0.05g、碳酸氢钠0.025g、氯化钙0.1g，溶于蒸馏水中，并用蒸馏水补至1l)，将粉末状中药组合物配置成5mg/ml；(3)细胞试验pm悬浮液的配置：称取20mgpm颗粒物装于4mlep管中，于高压蒸汽锅中高压灭菌，在超净工作台中加入2ml1640培养基溶解，制成浓度为10mg/ml的pm颗粒物悬浮液母液，用封口膜封好，超声处理1h，现用现配，处理细胞时用1640培养基配置成所需浓度并超声处理10min；(4)动物试验用pm悬浮液的配置：称取0.5gpm溶解于20ml0.9％生理盐水中配成浓度为25mg/ml的pm悬浮液，超声处理1h，使颗粒混散均匀，放置于4℃冰箱备用。
实施例1可吸入颗粒物的表征
使用粒度分析仪分析所用颗粒的粒径大小并获得其粒径分布，通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)原子发射光谱分析样品中的元素及其含量，使用x-射线衍射分析样品中的化合物及其含量，结果见图1.1，表1和2，其中，图1.1示出所使用的颗粒物的粒度分布，尽管本发明中使用的是具有图1.1中的粒度分布的颗粒物，但是本发明针对的是所使用的颗粒物中的可吸入颗粒物(即粒径在10微米以下的颗粒物(即pm10))造成的肺损伤。
表1颗粒物的元素组成与含量
表2颗粒物的化合物组成与含量
实施例2建立pm造成肺泡上皮a549细胞损伤——氧化应激、炎症和凋亡模型
1.建立pm造成a549细胞氧化应激和炎症模型
利用1640培养基将pm母液依次稀释成400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml的pm悬液分别作用a549细胞6h、12h、24h和48h，测定细胞裂解液中超氧化物歧化酶(sod)含量及细胞培养液中白细胞介素6(il-6)含量，并用mtt法测定细胞存活率，以sod含量与细胞存活率的比值为指标，评价不同浓度pm作用不同时间对a549细胞氧化应激状态的影响；以il-6含量与细胞存活率的比值为指标，评价不同浓度pm作用不同时间对a549细胞炎症状态的影响。
结果见图2.1a和2.1b。图2.1a显示200μg/ml与400μg/ml的pm作用48h，a549细胞氧化应激受损最为严重，因400μg/ml的pm使细胞成活率较低，为保障后续试验的持续进行，选定200μg/ml的pm作用48h为造成a549细胞氧化应激模型条件；
图2.1b显示200μg/ml与400μg/ml的pm作用6h，a549细胞分泌白细胞介素6的含量最多，200μg/ml的pm又不至于对细胞的存活率影响太大，选定200μg/ml的pm作用6h为造成a549细胞炎症模型条件。
2.建立pm造成a549细胞凋亡模型
利用1640培养基将pm母液依次稀释成400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml和25μg/ml的pm悬液分别作用a549细胞24h、48h、72h和96h，利用mtt法测定细胞存活率，筛选出对a549细胞存活率具有显著影响的pm浓度与作用时间；采用annexinv-fitc/pi双染色法检测200μg/ml的pm作用24h和48h的a549细胞的凋亡情况；采用tunel免疫染色实验(根据以上两个实验结果，选定造成细胞出现明显凋亡状态的pm浓度及作用时间)验证pm造成a549细胞凋亡的条件；由于大量研究表明细胞凋亡的两条经典途径有线粒体途径和tnf途径，因此采用线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)检测由200μg/mlpm作用24h和48h的a549细胞线粒体损伤情况，采用固相夹心法酶联免疫吸附实验(elisa)检测不同浓度pm作用不同时间a549细胞的肿瘤坏死因子(tnf-α)的表达情况，由此说明pm造成a549细胞凋亡的途径，同时进一步验证pm造成a549细胞凋亡的最佳条件。
结果见图2.2a、2.2b、2.2c、2.2d、2.2e、2.2f。图2.2a显示pm以时间和剂量依赖的方式降低a549细胞存活率，与对照组相比，200μg/ml的pm作用48h时，a549细胞存活率显著降低。图2.2b显示对照组annexinv-fitc/pi均呈阴性，说明细胞膜完整，无磷脂酰丝氨酸外翻，细胞正常；pm作用24h部分细胞出现annexinv-fitc阳性，pi阴性，说明一些细胞的细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻但细胞摸仍保存完整，这是细胞早期凋亡特征；pm作用48h细胞呈现annexinv-fitc阳性，pi阳性，说明细胞膜不完整，细胞处于晚期凋亡。图2.2c显示由200μg/ml的pm作用24h的a549细胞产生凋亡的比率为q1+q2＝5.17％，作用48h的a549细胞产生凋亡的比率为q1+q2＝17.85％，凋亡比率明显升高(annexinv阳性、碘化丙啶阴性(右下方)反映早期凋亡的比率；annexinv阳性，碘化丙啶阳性(右上方)反映晚期凋亡以及坏死的比率)。图2.2d显示由200μg/ml的pm作用48h的a549细胞细胞核浓缩，染色加深，细胞核呈新月形，即开始凋亡。图2.2e显示随着200μg/ml的pm作用时间的增加，线粒体膜电位去极化使得红色荧光逐渐减弱，说明线粒体跨膜电位破坏，细胞开始凋亡，即内源性凋亡途径在pm诱导的a549细胞凋亡中存在。图2.2f显示随pm的浓度及作用时间增加，tnf-α的表达量呈浓度和剂量依赖性上升，表明外源性凋亡途径在pm诱导的a549细胞凋亡中存在，相比空白组，200μg/ml的pm作用48h时tnf-α的表达量具有显著性差异。综上所述，选定200μg/ml的pm作用48h为造成a549细胞凋亡模型的条件。
实施例3建立中药组合物有效成分实体库
按照食品级要求对105味中药进行标准化提取、浓缩、冷冻干燥及二维码标识，利用高效液相(hplc)和薄层色谱(tlc)法对105个提取物建立指纹图谱。中药提取物制备流程见图3.1。
实施例4筛选对pm造成a549细胞损伤具有缓解作用的中药组合物
1.筛选105个中药提取物的最佳给药浓度
将待实验a549细胞分为632组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)及105个中药提取物的0.3125mg/ml、0.625mg/ml、1.25mg/ml、2.5mg/ml、5mg/ml、10mg/ml的6个浓度组，632个中药提取物组用相应浓度的中药提取物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，用mtt法测定细胞存活率，以细胞存活率为指标筛选出105个中药提取物的最佳给药浓度，结果见表3。
表3105个中药提取物的最佳给药浓度
2.筛选对pm造成a549细胞氧化应激具有缓解作用的中药提取物
(1)筛选与验证
将待实验a549细胞分为107组，分别为空白对照组(control)、模型组(model)、105个中药提取物组(给药浓度参考表3)。105个中药提取物组用相应中药提取物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，测定超氧化物歧化酶(sod)含量，并用mtt法测定细胞存活率，以sod含量与细胞存活率的比值为指标，筛选出能显著提高sod含量的中药提取物；对筛选得到的中药提取物的抗氧化应激活性做重复性验证；结合中医药理论，进一步筛选出具有补肺益脾，补气滋阴作用的中药提取物，并通过测定活性氧(ros)，谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)，丙二醛(mda)在中药提取物干预的pm造成氧化应激状态的a549细胞培养基中的含量(给药浓度与药物作用时间同测定ros的筛选实验)深入评价筛选得到的中药提取物的抗氧化应激活性；另外，采用abts试验(原理：abts2,2-连氮-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐]不被氧化前是白色的，可被k2s2o8等试剂氧化，生成蓝绿色的自由基阳离子abts·+。在有供氢能力的抗氧化剂(如酚类物质)存在下，abts·+与之反应，变成没有颜色的abts。抗氧化剂清除abts·+的能力可用414或734nm处吸光度的变化测量)在化学层面验证筛选得到的中药提取物的抗氧化活性。
表4abts试验测定中药提取物的抗氧化活性
注：ec50为自由基清除率为50％时的样品浓度，其值越小表明抗氧化活性越强；teac值越大表明抗氧化活性越强。
结果见图4.1a、4.1b、4.1c、4.1d、4.1e及表4。图4.1a显示大部分中药组合物都具有抗氧化活性，但抗氧化活性大小具有差异性，从中筛选出21个活性较显著的中药提取物；图4.1b显示21味中药提取物的抗氧化活性具有重复性，结合图4.3a，排除具有细胞毒性的中药提取物，得到6个中药提取物；图4.1c、4.1d、4.1e及表4通过测定生物学相关指标及化学方法证明最后筛选得到山药、龙眼肉、桑叶、橘红、玉竹和川贝母这6个中药提取物均具有显著的抗氧化活性。根据一些实施例，山药提取物、龙眼肉提取物、桑叶提取物、橘红提取物、玉竹提取物、川贝母提取物的质量比为2:16:4:1:32:32。
(2)分子机制研究
将待实验a549细胞分为9组，分别为空白对照组(control)、模型组(model)、阳性药组(n-乙酰-l-半胱氨酸(nac))及6个中药提取物组(给药浓度参考表3)，阳性药组及6个中药提取物组用相应药物干预1h后，模型组、阳性药组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，利用蛋白免疫印迹技术，检测筛选得到的6个中药提取物对内源性抗氧化应激通路中总nrf2、胞浆内nrf2、核内nrf2以及血红素氧合酶1(ho-1)蛋白表达水平的影响，进一步探讨对pm造成a549细胞氧化应激具有缓解作用的中药提取物的作用机制。
结果见图4.1f，显示筛选得到的中药提取物能不同程度地提高总nrf2、核内nrf2和血红素氧合酶1(ho-1)的表达水平，不同程度地降低胞浆内nrf2的表达水平，由此推断筛选得到的6个中药提取物可能通过促进nrf2核易位，进而促进血红素氧合酶1(ho-1)的表达而发挥缓解pm造成a549细胞氧化应激的作用。
3.筛选对pm造成a549细胞炎症具有缓解作用的中药提取物
(1)筛选与验证
将待实验a549细胞分为107组，分别为空白对照组(control)、模型组(model)、105个中药提取物组(给药浓度参考表3)，105个中药提取物组用相应中药组合物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用6h，测定白细胞介素6(il-6)含量，并用mtt法测定细胞存活率，以il-6含量与细胞存活率的比值为指标，筛选出能显著提高il-6含量的中药提取物；对筛选得到的中药提取物的抗炎活性做重复性验证；结合中医药理论，进一步筛选出具有补肺益脾，补气滋阴作用的中药提取物，并通过测定白细胞介素8(il-8)，白细胞介素1β(il-1β)，肿瘤坏死因子(tnf-α)在中药提取物干预的pm造成炎症状态的a549细胞培养基中的含量(给药浓度与药物作用时间同测定il-6的筛选实验)深入评价筛选得到的中药提取物的抗炎活性。
结果见图4.2a，4.2b，4.2c，4.2d，4.2e。图4.2a显示部分中药提取物具有抗炎活性，且活性大小具有差异性，从中筛选出10个活性较显著的中药提取物；图4.2b显示10个中药提取物的抗炎活性具有重复性，结合图4.2a，排除具有细胞毒性的中药提取物，得到3味中药提取物；图4.2c，4.2d，4.2e通过测定生物学相关指标证明最后筛选得到白术、白扁豆和桑叶这3味中药提取物均具有显著的抗炎活性。根据一些实施例，白术提取物、白扁豆提取物、桑叶提取物的质量比为1:4:2。
(2)分子机制研究
将待实验a549细胞分为5组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)，3个中药提取物组(给药浓度参考表3)，3个中药提取物组用相应中药组合物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用6h，提取并检测(聚丙烯酰氨凝胶电泳法)胞浆中nf-κb和iκbα、胞核中nf-κb及总蛋白中stat3的含量，进一步探讨对pm造成a549细胞炎症具有缓解作用的中药提取物的作用机制。
结果见图4.2f，显示筛选出来的中药提取物可以明显降低nf-κb在核内的表达，升高nf-κb和iκbα在胞浆中的表达，降低stat3的表达，由此推断筛选得到的3味中药提取物可能是通过升高iκbα在胞浆中的表达，进而抑制nf-κb入核转运而发挥抗炎作用，同时3味中药提取物可能通过降低stat3的表达而抑制炎症加重。
4.筛选对pm造成a549细胞凋亡具有缓解作用的中药提取物
(1)筛选与验证
将待实验a549细胞分为632组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)及105个中药提取物的0.3125mg/ml，0.625mg/ml，1.25mg/ml，2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml的6个浓度组，630个中药提取物组用相应浓度的中药组合物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，用mtt法测定细胞存活率，以细胞存活率为指标筛选出提高细胞存活率效果最佳的中药提取物；采用annexinv-fitc/pi双染色法验证筛选得到的中药提取物的抗凋亡活性；采用线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)检测筛选得到的中药提取物对pm造成a549细胞线粒体损伤的影响，进一步验证其抗凋亡活性；采用tunel免疫染色法验证筛选得到的中药提取物的抗凋亡活性(给药浓度参考表3)。
结果见图4.3a，4.3b，4.3c，4.3d。利用mtt法测定细胞存活率实验显示部分中药提取物具有提高细胞存活率的活性，从中筛选出3个活性较显著的中药提取物；图4.3a显示3个中药提取物使出现annexinv-fitc阳性，pi阳性的细胞均明显降低，说明3个中药提取物均可以缓解pm造成的a549细胞凋亡状态；图4.3b显示3味中药提取物可以明显降低pm造成a549细胞凋亡的发生率；4.3c显示3个中药提取物组的红色荧光/绿色荧光的比率明显高于模型组，说明3个中药提取物可以明显缓解pm造成a549细胞线粒体损伤的发生率；4.3d显示3个中药提取物组的tune阳性数量明显减少，说明3个中药提取物具有抗凋亡活性。综上所述，玉竹、白扁豆和荷叶这3个中药提取物均具有显著的抗细胞凋亡活性。根据一些实施例，玉竹提取物、白扁豆提取物、荷叶提取物的质量比为4:1:2。
(2)分子机制研究
将待实验a549细胞分为6组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)，凋亡抑制剂组(z-vad)，3个中药提取物组(给药浓度参考表3)，凋亡抑制剂组和3个中药提取物组分别用z-vad-fmk(浓度为0.25um，溶剂为细胞培养液)和相应浓度中药提取物干预1h后，模型组、凋亡抑制剂组和3个中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，采用mtt法检测细胞存活率；将待实验a549细胞分为5组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)，3个中药提取物组(给药浓度参考表3)，3个中药提取物组用相应中药提取物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm2.5作用48h，利用westernblot法检测凋亡相关途径的重要蛋白的表达，包括线粒体途径的caspase-9蛋白和tnf途径的caspase-8蛋白，进一步探讨对pm造成a549细胞凋亡具有缓解作用的中药提取物的作用机制。
结果见图4.3e和图4.3f。图4.3e显示凋亡抑制剂组和3个中药提取物组均可以显著逆转pm造成的a549细胞存活率降低的现象，由于z-vad-fmk是广泛的caspase抑制剂，外源性和内源性凋亡途径的下游蛋白均属于caspase家族，推测3个中药提取物可能通过抑制凋亡相关的caspase蛋白表达而发挥作用的；图4.3f显示筛选得到的中药提取物可以抑制caspase-9和caspase-8蛋白活化，进而抑制caspase-3蛋白活化，其中玉竹与荷叶抑制caspase-9蛋白活化的作用优于对caspase-8蛋白活化的抑制作用，白扁豆抑制caspase-9和caspase-8蛋白活化均较显著，由此推断玉竹与荷叶可能主要通过抑制线粒体途径中caspase-9蛋白活化，白扁豆可能是通过抑制线粒体途径中caspase-9蛋白和tnf途径中caspase-8蛋白活化，进而抑制caspase-3的活化而发挥缓解pm造成a549细胞凋亡的作用。
实施例5筛选加速巨噬细胞吞噬pm的中药提取物
将待实验raw巨噬细胞分为632组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)及105个中药提取物的0.3125mg/ml，0.625mg/ml，1.25mg/ml，2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml的6个浓度组，630个中药提取物组用相应浓度的中药提取物干预1h后，模型组和中药提取物组用200μg/ml的pm作用48h，然后每孔加入浓度为0.075mol/ml的中性红溶液孵育3h，用pbs洗2遍，测定吸光度，以吸光度为指标筛选出提高raw巨噬细胞吞噬pm效果最佳的中药提取物。
结果显示提高raw巨噬细胞吞噬pm效果最佳的中药提取物为玉竹、桑叶。根据一些实施例，玉竹提取物和桑叶提取物的质量比为8:1。
实施例6传统中药配伍理论指导组方设计
根据上述体外筛选实验得到的最优中药提取物，我们采用清华大学李梢课题组建立的中药配伍网络herbnetwork进行组方设计，进一步确定上述最优中药提取物相应的中药形成的两两之间的组合在历代中药方剂中是否有过应用，如果应用过，那么就可认为二者的提取物的组合具有足够的组方合理性和安全性。见图5.1(图5.1中的图均选自lis*,zhangb,jiangd,weiyy,zhangnb.herbnetworkconstructionandco-moduleanalysisforuncoveringthecombinationruleoftraditionalchineseherbalformulae.bmcbioinformatics2010；11(s11):s6)，该网络中的节点是中药，节点的颜色表示中药药性，边是中药之间的两两组合，边越粗表示两味中药在历代中药方剂中的组合配伍使用的可能性越高。将上述四个模型中分别筛选出来的中药提取物相应的中药(比如预防氧化应激效果最好的桑叶、橘红；预防炎症效果最好的白术、桑叶、白扁豆；预防细胞凋亡效果最好的玉竹、白扁豆；促巨噬细胞吞噬效果最好的玉竹、桑叶)共同映射到herbnetwork中，得到了橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹这五味中药的组合，结果显示它们在历代中药方剂中两两之间是常常配在一起出现的。另外，根据体外实验的最优给药量确定中药组合物的配伍剂量为橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物及玉竹提取物质量比1:2:4:8:32。
实施例7中药组合物对斑马鱼体内pm排泄速度的影响
中药组合物的制备：将橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹分别用10倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，于50-60℃下减压浓缩，再经冷冻干燥，得这5味中药的提取物；将橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物及玉竹提取物按质量比1:2:4:8:32称取并混匀，得到粉末状中药组合物。
将试验用斑马鱼卵分为两大组：即a组未添加1-苯基-2-硫脲(ptu)和b组添加ptu(溶剂为受精卵培养液，浓度按质量分数计为0.0045％)，其中a组分3小组即空白对照组(未添加pm)、模型组(只添加pm)、中药组合物组(添加pm和中药组合物)，b组分3小组(同a组)，每小组20枚受精卵。受精8h后，按分组情况，各组相应的不加或加入ptu和中药组合物(给药方式为直接将原有受精卵培养液替换为含有ptu或(和)中药组合物的培养液)，受精24h后，按分组情况，各组相应的不加或加入pm，即向卵黄囊显微注射磁性氧化铁纳米球(溶剂为蒸馏水，浓度为5mg/ml)2μl。将注射后48h(即受精后72h)的斑马鱼置于立体显微镜下观察、拍照并保存。
结果见图6.1，显示与a组相比，b组的斑马鱼胚胎相对透明，且胚胎状态无显著差异，表明注射用ptu发挥了抑制黑色素分泌的作用，消除了斑马鱼皮肤黑色素对观察pm排泄过程的干扰；b组中，与空白组相比，模型组斑马鱼胚胎卵黄囊中观察到黑色沉积物，表明磁性氧化铁纳米球被成功注射；b组中，与模型组相比，中药组合物组斑马鱼胚胎卵黄囊中的黑色沉积物较分散，表明中药组合物对斑马鱼体内pm的排泄促进作用。
实施例8中药组合物对pm造成小鼠肺损伤的影响
中药组合物的制备：将橘红、白术、桑叶、白扁豆、玉竹分别用10倍量蒸馏水加热回流提取2次，每次2h，过滤，合并滤液，于50-60℃下减压浓缩，再经冷冻干燥，得这5味中药的提取物；将橘红提取物、白术提取物、桑叶提取物、白扁豆提取物及玉竹提取物按质量比1:2:4:8:32称取并混匀，得到粉末状中药组合物。
小鼠随机分为5组，分别为空白对照组(control)，模型组(model)和中药组合物高(2g/ml)、中(1g/ml)、低(0.5g/ml)剂量组，每组5只。第一周，空白对照组、模型组小鼠每天灌胃0.2ml蒸馏水，中药组合物组小鼠每天灌胃0.2ml对应浓度中药组合物；一周后，空白对照组小鼠每天气管滴注0.4ml0.9％生理盐水同时灌胃0.2ml蒸馏水，模型组小鼠每天气管滴注0.4mlpm2.5悬液(25mg/ml，用0.9％生理盐水配置)同时灌胃0.2ml蒸馏水，中药组合物组小鼠每天气管滴注0.4mlpm2.5悬液同时灌胃0.2ml相应剂量的中药组合物，直至实验结束，整个试验过程持续30天。
1.中药组合物对pm造成小鼠肺损伤的影响
实验结束后将实验小鼠断颈处死解剖取得新鲜肺组织进行观察。
结果见图7.1，显示对照组肺部形态规则完整，无明显病变；模型组肺部组织变黑，出现萎缩；中药组合物组出现部分变黑，肺部状态好于模型组，且中、高浓度组效果好于低浓度组。
2.中药组合物对pm造成小鼠氧化应激状态的影响
对实验结束后小鼠血清和肺均浆进行sod、ros、gsh-px和mda含量测定。
结果见图7.2，显示中药组合物低、中、高剂量组都可降低ros和mda含量，升高sod和gsh-px含量，证明该中药组合物确实可改善小鼠的氧化应激状态，且中、高剂量组与模型组相比，ros和mda含量显著降低，sod和gsh-px含量显著升高，这说明中药组合物对肺损伤有良好的缓解效果。
3.中药组合物对pm造成小鼠炎症状态的影响
对实验结束后小鼠支气管灌洗液、肺均浆及血清进行il-6、il-8、il-1β和tnf-α含量测定。
结果见图7.3，显示中药组合物低、中、高剂量组都可降低il-6、il-8、il-1β和tnf-α的含量，证明该中药组合物确实可改善小鼠的炎症状态，且低、中、高剂量组与模型组相比，以上四个指标均有显著性地下降。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。