负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备逆转器官衰老药物上的用途的制作方法

本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备逆转或防治器官衰老药物上的用途。

背景技术：

外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括dna、rna、蛋白等进入效应细胞，有效调控机体细胞信号转导。研究表明，干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞，发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。

胚胎干细胞(embryonicstemcell,escs)与诱导人多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。escs和ipscs具有多能性(pluripotency)，即escs和ipscs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。因而escs和ipscs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。escs或ipscs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mrna、microrna等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体，也可以起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。

外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，外泌体作为药物的纳米载体得到了广泛的关注与研究。与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有丰富的生理功能，可以提高药物的传递效率，实现药物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。外泌体自身携带的蛋白、基因等物质具有细胞调控能力，可以对特定的疾病起到治疗作用。

目前，多种细胞外泌体构建的纳米药物递送系统已经用于疾病治疗的探索。wood课题组最先利用未成熟的树突状细胞(immaturedendriticcells,idc)来源的外泌体负载sirna治疗阿尔兹海默症。idc分泌的外泌体表面缺乏t细胞激活蛋白(例如mhc-i，mhc-ii，cd86)，具有免疫惰性。他们通过基因转染的方法，在外泌体表面蛋白lamp2b上修饰乙酰胆碱受体识别多肽片段rvg，进而赋予idc外泌体定位脑部神经细胞的能力；随后，利用电转的方法，将bace-1的sirna导入到idc外泌体中，通过小鼠动物模型，验证了这些载药外泌体治疗阿尔兹海默症的潜力。然而，idc细胞提取过程繁琐，细胞数量有限，成本高昂，难以产业化生产。同样，肿瘤细胞来源的外泌体也被用于药物递送系统的构建。虽然肿瘤细胞可以无限扩增，制备大量的外泌体，但是它们潜在的安全性风险限制其在临床的使用。最近，研究人员报道了利用牛奶来源外泌体构建的纳米药物递送系统。与细胞来源的外泌体相比，牛奶来源的外泌体提取简便、成本低，实现可以大规模制备满足临床需求。但是，由于牛奶外泌体中含有大量的非人源的基因与蛋白质等物质，其通过静脉全身注射的安全性仍有待进一步确认，而且该研究的重点主要集中于外泌体的药物载体功能，并没有充分发挥外泌体自身所携带的物质对疾病与损伤的治疗潜力。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体及其制备方法与在制备逆转或防治器官衰老药物上的用途。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：

提供人多能干细胞外泌体，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：

采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人escs或ipscs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。

在本发明的一个实施方式中，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。

旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是：将一定容积的培养基于4℃400g离心10min，去除游离细胞，得到的上清移入另一管中，4℃15000g20min，去除细胞碎片，获得的上清液倒入millipore超滤装置中，用pbs洗脱收集滤膜(100kd)上的浓缩液体，即再次加入pbs，经millipore超滤装置再次超滤，得到的浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100800g离心210分钟，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积pbs，转移至可截留100kd分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；pbs洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到exosomes悬液，分装保存至-80℃。

在本发明的一个实施方式中，无血清培养体系选择市售的型号为e8^tm或mtesr1或mtesr2的培养基。

在本发明的一个实施方式中，收集外泌体后，通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定，结果符合外泌体特征：直径范围50-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构，其膜结构表面含有cd9，cd63等标志物。

本发明第二方面：

提供所述人多能干细胞外泌体作为制备逆转或防治全身器官衰老的药物或保健品的应用。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体逆转或防治组织器官衰老。以衰老动物为实验模型，静脉注射或口服或皮肤涂抹人多能干细胞外泌体的悬液，观察人多能干细胞外泌体对动物多种衰老组织器官的逆转或防治效果。

所述器官衰老相关疾病包括老年性痴呆、心脑血管疾病、糖尿病及其并发症、椎间盘退行性变、肿瘤及心、脑、肝、肾等组织损伤及纤维化疾病。

本发明第三方面：

提供基于所述人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：

a、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

b、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

c、以人多能干细胞外泌体作为添加剂：以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或喷雾等形式进行使用。

在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。

本发明第四方面：

提供负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体，包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体为本发明第一方面所述外泌体。

在本发明的一个实施方式中，所述白藜芦醇的包裹浓度为1-100μg/ml。

本发明第五方面：

提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将一定剂量的白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。

在本发明的一个实施方式中，孵育的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度下孵育一定时间。随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/ml–1×10¹²/ml，优选为1×10¹⁰/ml；孵育温度的范围为4℃–50℃，优选为37℃；孵育时间范围为1h–48h，优选为4h；超滤管的截留分子量范围为10kda–5000kda，优选为100kda；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，冻融的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度的冰箱中进行冷冻。随后解冻，再冷冻，如此循环一定次数。最后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/ml–1×10¹²/ml，优选为1×10¹⁰/ml；冷冻温度范围为-10℃--200℃,，优选为-80℃；循环次数为1–20次，优选为3次；超滤管的截留分子量范围为10kda–5000kda，优选为100kda；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，电转的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液和电转液混合，置于电转仪中，在一定条件下电转一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/ml–1×10¹²/ml，优选为1×10¹⁰/ml；电转液为kcl、k3po4和optiprep^tm细胞梯度离心液的混合溶液，其中kcl的浓度范围为1mm–1m，优选为25mm，k3po4的浓度范围为0.01mm-1m，优选为1.15mm，optiprep^tm细胞梯度离心液的体积分数范围为80％-0.1％，优选为21％；电转参数中电压的范围为10kv–0.1v，优选为400v，电容的范围为0.1–1000f，优选为150f；电转时间范围为0.1s–1min，优选为10s；超滤管的截留分子量范围为10kda–5000kda，优选为100kda；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，超声的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液混合，利用针式超声仪在一定条件下对上述混合溶液超声一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/ml–1×10¹²/ml，优选为1×10¹⁰/ml；超声条件中，电压的范围为1kv–1v，优选为500v，频率的范围为1hz–20khz，优选为2khz，循环次数的范围为1–100次，优选为6次，循环中超声输出时间为1s–60s，优选为5s，间隔时间的范围为1s–300s，优选为5s；超滤管的截留分子量范围为10kda–5000kda，优选为100kda；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，通过常规的超滤、超速离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。

在本发明的一个实施方式中，通过高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography，hplc)对人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的效率进行检测分析，最终获得人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的纳米药物递送体系。

本发明第六方面：

提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为制备逆转或防治组织器官衰老药物或保健品的应用。

在本发明的一个实施方式中，应用负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体逆转或防治组织器官衰老。以衰老动物为实验模型，静脉注射或口服或皮肤涂抹负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的悬液，观察负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体对动物多种衰老组织器官的逆转或防治效果。

所述器官衰老相关疾病包括老年性痴呆、心脑血管疾病、糖尿病及其并发症、椎间盘退行性变、肿瘤及心、脑、肝、肾等组织损伤及纤维化疾病。

本发明第七方面：

提供基于所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：

a、悬浮剂：将所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

b、缓释外泌体的复合物：由所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

c、以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或喷雾等形式进行使用。

在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。

白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物，众多研究结果表明，白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护、保肝、神经系统保护、免疫调节、抗衰老等多种药理作用。也有研究结果确切表明白藜芦醇对于多种皮肤病具有一定的预防或治疗作用。白藜芦醇难溶于水，化学性质不稳定，易被氧化分解，口服后在体内迅速代谢，体内生物利用度低，制约了其广泛应用。脂质体及纳米乳等是白藜芦醇的剂型研究的热点。

外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移，清除衰老细胞等功能，且外泌体可通过粘膜屏障或皮肤屏障或血脑屏障直接进入组织细胞内。

利用干细胞外泌体作为纳米载体既可以实现药物的有效递送，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的功能，起到更好的疾病治疗效果。在众多种类的干细胞中，多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)具有强大的增殖扩增能力，可以实现产业化生产以满足治疗需求。

本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以大大提高其逆转或防治各器官衰老的效果。

附图说明

图1：人多能干细胞分泌的外泌体(esc-exos)粒径分布图。

图2：外泌体标志物鉴定。

图3：res的hplc标准定量曲线。

图4(a)：血清、皮肤、肝脏组织氧化指标检测。

图4(b)：ki-67免疫组化结果。

图4(c)：细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果。

图5：股骨组织学切片he染色。

图6(a)：两组小鼠原代bmsccck8、克隆形成实验及transwell实验。

图6(b)：bmscs成骨诱导分化茜素红和碱性磷酸酶染色。

图7：三组动脉粥样斑块he染色比较。

图8：三组治疗后左心室射血分数比较。

图9：三组心肌组织ⅰ、ⅲ型胶原所占百分比。

图10：三组大鼠fbg变化趋势比较。

图11：三组大鼠2次输注后1周ogtt实验结果。

图12：各组大鼠肝组织病理(he染色，*200)。

图13：各组小鼠肾组织病理he染色。

图14：各组小鼠肾组织病理masson染色。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

人胚胎干细胞(escs)的培养和外泌体的提取与鉴定

在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(esc-qualifiedbdmatrigel,bdsparks,md,usa)，将escs移入该培养皿，加入mtesr1无血清培养基(stemcellvancouver,bc,canada)，在温箱内(37℃，5％co2，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100kd分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入pbs稀释，转移至可截留100kd分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；pbs洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液esc-exos，分装保存至-80℃。

esc-exos的形态通过透射电镜(tem)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μl样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μl对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

esc-exos的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(izonqnano,newzealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将nanopore(np100)安装到加样孔下方，调节stretch至43cm，向加样孔内加入40μlpbs，使电流稳定在100-120na范围内。吸去pbs，加入40μl1：100稀释的cpc100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，pbs洗3次，加入40μl1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图1。

通过westernblot检测esc-exos特异性表面标志物cd9和cd63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过bca蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物cd9和cd63。见图2。

实施例2

人诱导人多能干细胞(ipscs)的培养和外泌体的提取与鉴定

在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(esc-qualifiedbdmatrigel,bdsparks,md,usa)，将ipsc移入该培养皿，加入mtesr1无血清培养基(stemcellvancouver,bc,canada)，在温箱内(37℃，5％co2，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100kd分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入pbs稀释，转移至可截留100kd分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；pbs洗涤3次，最终按后续实验要求以pbs定容至一定体积，得到外泌体悬液ips-exo，分装保存至-80℃。

ips-exo的形态通过透射电镜(tem)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μl样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μl对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

ips-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(izonqnano,newzealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将nanopore(np100)安装到加样孔下方，调节stretch至43cm，向加样孔内加入40μlpbs，使电流稳定在100-120na范围内。吸去pbs，加入40μl1：100稀释的cpc100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，pbs洗3次，加入40μl1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。

通过westernblot检测ips-exo特异性表面标志物cd9和cd63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过bca蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物cd9和cd63。

实施例3

人esc来源外泌体(esc-exos)通过共孵育法包裹白藜芦醇(res)

esc-exos溶液来自实施例1。

res的定量标准曲线测定：准确称取1mg的res粉末溶解于1ml的甲醇中，随后将该溶液用甲醇进行稀释，配置成50μg/ml，20μg/ml，10μg/ml的res的甲醇标准溶液，hplc进样。色谱条件如下：

色谱柱：zorbaxextendc-18，150*4.6μm，5–micro

流动相：甲醇：水＝95:5

流速：1ml/min

柱温：室温

检测波长：305nm

获得相应的实验结果后，将色谱峰的峰面积(pa)作为res浓度(c，μg/ml)的函数作图(如附图3)，得到如下该色谱分离条件下res的定量标准曲线：

pa＝38.42c+71.12，r²＝0.9991

白藜芦醇的包裹：配制1mg/ml的白藜芦醇(res)的生理盐水溶液(ph＝4.0)，随后用1n的氢氧化钠水溶液调节溶液ph至6左右。取esc-exos溶液100μl(浓度1.0*10¹²/ml)，向其中加入1ml的res溶液。37℃孵育1h后，用5ml的生理盐水超滤洗涤溶液两次，留取200μl液体，得到负载res的esc-exos溶液。随后，取50μl该溶液，利用200μl的乙腈进行稀释，12000rad/min下离心，除去蛋白沉淀，上清液在标准曲线的测定条件下，进行hplc检测，res的包裹浓度为5μg/ml。

实施例4：

应用人胚胎干细胞外泌体(esc-exos)逆转小鼠全身各脏器的衰老。

选择5月龄samp8早衰小鼠作为实验动物模型，所有小鼠分为esc-exos治疗组和对照组，esc-exos治疗组治疗方式为采用200ul外泌体悬液(粒子数为2x10⁹particles)灌胃，对照组予以同体积的pbs灌胃治疗，给药频率为2d/次，治疗周期为6个月。治疗结束后对小鼠进行大体拍照观察，处死小鼠，行心脏取血并对小鼠皮肤、股骨、肝脏进行取材，所取组织行病理学检测及衰老相关表型检测以评估各器官衰老情况，其中股骨另行microct检测，评估各组骨小梁情况并对股骨形态计量学指标进行评价，此外治疗结束后对各组小鼠行bmsc提取，对比两组bmsc衰老表型及分化能力。

实验结果显示：对照组小鼠呈现明显的衰老状态，毛发稀疏、杂乱、黯淡，esc-exos治疗组小鼠较对照组毛发浓密、有光泽；血清、皮肤、肝脏氧化指标检测结果显示，esc-exos治疗组sod、gsh-px、cat活性显著高于对照组，且mad含量较对照组小鼠明显减少；ki-67免疫组化结果显示esc-exos治疗后小鼠肝脏、皮肤ki-67阳性细胞数明显多于对照组；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色结果显示esc-exos治疗组小鼠肝脏和皮肤衰老染色阳性细胞数明显少于对照组；股骨组织he染色显示，对照组骨小梁纤细、排列紊乱、吸收明显、数量减少、结构不完整，骨髓腔扩大等骨质疏松状态的表现。esc-exos治疗6个月后，骨质疏松状态明显改善；股骨远端骨组织三维重建图像及形态计量学指标结果显示，esc-exos治疗组股骨远端骨小梁结构完整，而对照组骨小梁数量明显减少；骨组织形态计量学参数表明，对照组骨密度(bmd)明显低于治疗组，骨容积比例(bv/tv)下降，骨小梁数目(tb.n)减少，骨小梁厚度(tb.th)减低，骨小梁表面面积(bsa/bv)增加，而骨皮质厚度(co.th)未发生改变。两组小鼠原代bmsccck8实验、克隆形成实验及transwell实验结果显示，esc-exos治疗组小鼠原代bmscs增殖、克隆形成、迁移能力显著优于对照组。westenblot检测衰老相关指标p16、p21等结果表明esc-exos可以改善bmscs的衰老状态。bmscs成骨诱导分化茜素红和碱性磷酸酶染色显示esc-exos治疗组小鼠bmscs成骨分化能力明显强于对照组，见图4、5、6。

结果表明，esc-exos具有逆转小鼠全身各脏器的衰老的功能。

实施例5

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗动脉粥样硬化。

动物模型建立：1)选择c57bl/6小鼠于8周开始给予高脂饲料(含0.25％胆固醇和15％脂肪)喂养。2)左侧颈总动脉套管(缩窄性硅胶管)术诱发动脉粥样硬化：全部小鼠10周称重，腹腔注射2％戊巴比妥钠(新鲜配制)剂量约为30.40mg/kg，待小鼠适当麻醉后固定四肢和牙齿，小鼠颈部周围碘伏消毒3遍，铺手术洞布。颈部正中切口，分离腺体，从正中往两边拨开，气管两侧是胸锁乳突肌，颈动脉在该肌肉下方，分开即可见鲜红色有搏动的动脉，分离迷走神经和颈动脉。用眼科弯头镊子将游离的左侧颈动脉稍挑起并撑住，套入硅胶管，分别在套管两端和中间打结。通过使用含1％青链霉素的pbs，滴入创面为预防感染。在套管手术后继续进行高脂喂养直至第16周。建模成功后将实验动物随机分为esc-exos、res、esc-exos-res三组，分别予以尾静脉注射进行治疗，每2天注射1次，在第16周时进行心脏取血、颈总动脉取材。观察各组血清总胆固醇、甘油三酯及粥样斑块组织病理学特点。

实验结果显示，esc-exos-res组总胆固醇(2.12±0.33)较esc-exos组(28.34±2.26)、res组(14.94±4.42)明显降低；甘油三酯方面，esc-exos-res组(0.79±0.06)也较esc-exos组(2.50±0.43)、res组(1.14±0.22)明显下降。he染色显示16周时，esc-exos组，颈动脉血管内膜有明显的增厚，大量的平滑肌细胞增生，形成较厚的纤维帽，斑块较实，并伴有大量有核细胞的浸润；res组血管内膜有明显的增厚，大量的平滑肌细胞增生，有核细胞相对较轻，形成较厚的纤维帽，斑块较实，面积较小；esc-exos-res组斑块表面仅有很薄的内皮细胞覆盖，平滑肌细胞减少，见图7。

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对动脉粥样硬化有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例6

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗心肌梗死。

选择sd大鼠，腹腔麻醉后开胸暴露心脏，使用无损伤血管钳轻轻夹住升主动脉约5～8s，心脏膨大心率减慢后立即松开血管钳，10min后大鼠无死亡迹象后行冠脉结扎建立心肌梗死模型。建模成功后将实验动物随机分为esc-exos、res、esc-exos-res三组，分别予以尾静脉注射进行治疗，每2天注射1次，4周后进行b超检查左心室射血分数并对心肌进行取材观察心脏胶原沉积情况。

实验结果显示，esc-exos-res治疗后左心射血分数较其余两组明显增高，esc-exos组左心功能最差。ⅰ、ⅲ型胶原免疫组化结果显示，esc-exos-res组ⅰ、ⅲ型胶原含量较其余两组明显降低。见图8，9。

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对心肌梗死有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例7

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗脑梗。

选择sd大鼠，雄性，1月龄，210-270g，采用线栓法建立大鼠大脑中动脉阻塞模型。术前禁饮食4h，按无菌原则操作，在大鼠腹腔以2.5％氯胺酮20mg/kg进行注射麻醉，约10min后将其固定；俯卧位下取颈正中切口，充分游离右侧颈总、颈内和颈外动脉，仔细分离伴行的迷走神经以及迷走神经节，结扎颈总动脉、颈外动脉后，在颈总动脉分叉约5mm处做一切口，采用明胶处理过的1.8号鱼线经切口插入右颈内动脉，进线深度为17.0-18.0mm，栓线头端到达大脑前动脉和大脑中动脉分叉处结扎颈内动脉，以完全阻断血供，阻断2h后将栓线轻轻拔出约1cm，形成血流再灌注。建模成功后将实验动物随机分为对照组(pbs)、esc-exos、esc-exos-res三组，于造模成功24h后，治疗组大鼠给予尾静脉注射2～5×10⁹个esc-exos或esc-exos-res治疗，对照组予以注射等体积的pbs，连续注射14d，1次/d。不同时间点进行神经功能评分，梗死周围组织脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43的mrna表达，以观察esc-exos及esc-exos-res对脑梗的治疗功能。

实验结果显示，神经功能评分方面第1、3d各组均无明显差异，而在治疗第7、14天，对照组明显高于其余两组，esc-exos-res组评分最低，esc-exos组评分低于对照组，却高于esc-exos-res组，差异具有统计学意义(p＜0.05)；脑源性神经生长因子、生长相关蛋白43的mrna表达方面，esc-exos-res、esc-exos组明显高于对照组，且以esc-exos-res组升高最明显。见表1，2。

表1三组治疗后各时间点神经功能评分比较

表2三组脑梗死周围组织脑源性生长因子、生长相关蛋白43mrna表达的比较(与

esc-exos-res组比较，ap＜0.05)

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对脑梗死有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例8

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗老年性痴呆。

选择sd大鼠实验动物在标准环境适应性饲养1周后，皮下注射d-半乳糖150mg/(kg*d)，连续6周，第7周双侧海马注射4nmol/l的aβ25-35，复制老年痴呆模型。大鼠随机分为对照组(pbs)、esc-exos、esc-exos-res组，于造模成功24h后，治疗组大鼠给予尾静脉注射2～5×10⁹个esc-exos或esc-exos-res治疗，对照组予以注射等体积的pbs，连续注射14d，1次/d。治疗结束后通过定位航行实验、空间探索实验评价治疗效果。

实验结果显示，在定位航行实验中，与对照组相比，esc-exos、esc-exos-res组大鼠逃避潜伏期明显缩短，且以后者明显。空间探索实验中，对照组大鼠在目标象限内游泳的距离比药物治疗两组明显降低，而esc-exos组大鼠目标象限内游泳的距离又较esc-exos-res组显著降低。以上结果表明，esc-exos、esc-exos-res组大鼠空间学习能力较对照组明显提高，且esc-exos-res组效果更好。见表3，4。

表3各组大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期比较(a表示与对照组比较差异具有统计学意义，b表示与esc-exos-res组比较差异具有统计学意义)

表4各组大鼠目标象限游程比较(a表示与对照组比较差异具有统计学意义，b表示

与esc-exos-res组比较差异具有统计学意义)

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对老年性痴呆有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例9

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗糖尿病。

选择sd大鼠,6周龄，100-120g。2型糖尿病模型的建立：所有大鼠高脂喂养4周，第28天时，所有大鼠禁食隔夜禁食，腹腔注射链脲佐霉素(stz)40mg/kg，注射3天后检测空腹血糖变化，一周后行ogtt及ipitt实验，糖尿病模型标准为连续2次fbg(空腹血糖)＞11.1mmol/l。建模成功的大鼠随机分为对照组(pbs)、esc-exos、esc-exos-res组，stz注射后10天及21天给予尾静脉注射2～5×10⁹个esc-exos或esc-exos-res治疗，对照组注射等量pbs。建模成功后第0、7(第一次注射esc-exos或esc-exos-res)、14(第二次注射esc-exos或esc-exos-res)、21天检测大鼠fbg及两次输注后1周ogtt变化情况。

实验结果显示，esc-exos、esc-exos-res治疗后大鼠空腹血糖有下降趋势，差异具有统计学意义(p＜0.05)，且以esc-exos-res组明显；ogtt实验也显示出类似的治疗结果，见图10，11。

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对糖尿病有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例10

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗肝纤维化。

选取6周龄清洁级雄性wistar大鼠，体重200-300g，肝纤维化模型建立：皮下注射四氯化碳3ml/kg，2次/周，首剂加倍。所有大鼠随机分为对照组、esc-exos、esc-exos-res组，分别于第2，3，5周尾静脉注射pbs、esc-exos(2～5×10⁹个esc-exos)、esc-exos-res(2～5×10⁹个esc-exos-res)，注射6周末进行肝功能检测及肝组织病理(he染色)检测。

实验结果显示，对照组血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶和总胆红素水平均显著升高，esc-exos组中虽总胆红素水平改善不明显但能显著改善谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平，esc-exos-res组无论总胆红素水平还是谷丙、谷草转氨酶水平均得到明显改善。肝组织病理结果显示：对照组肝组织呈广泛而严重的干细胞脂肪变性和坏死，门静脉和中央静脉周围炎症细胞浸润，汇管区扩大及大量纤维组织增生；esc-exos组干细胞脂肪变性和坏死较轻，汇管区纤维组织增生减少；esc-exos-res组仅可见少量干细胞变性坏死，炎细胞浸润不明显，汇管区纤维组织增生不明显。见表5，图12。

表5各组大鼠肝功能水平比较

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对肝纤维化有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例11

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗肾纤维化。

选取6～8周c57bl/6雄性小鼠(体重20～25g)，肾纤维化造模方法：4％水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取右侧卧位，局部剃毛，常规消毒铺孔巾，选择左侧背部肋下约0.5cm为切口，游离肾及输尿管，将左侧输尿管用组织钳托起取中段部位，用止血钳夹住，在管两段各用丝线结扎后剪断输尿管，然后连续缝合皮肤。所有小鼠随机分为对照组、esc-exos、esc-exos-res组，于造模14d后各组小鼠尾静脉分别注射pbs、esc-exos及esc-exos-res(2～5×10⁹个esc-exos或esc-exos-res)，隔日注射一次，治疗两周后处死小鼠取肾组织置于多聚甲醛中同定、脱水、制备石蜡切片，行he、masson染色比较肾纤维化情况。

he染色结果显示，对照组小鼠左肾肾小管扩张，小管上皮细胞空泡变，肾间质增宽并伴有单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润；esc-exos组肾小管扩张不明显，单核巨噬细胞及淋巴细胞浸润较对照组减少；esc-exos-res组肾小管结构基本正常，肾间质增宽不明显，仅有少量炎性细胞浸润。masson染色结果显示，对照组肾间质有大量胶原增生，蓝色胶原增生明显，胶原纤维粗大，肾小球不同程度纤维化；esc-exos组蓝色胶原纤维增生较对照组减轻，肾小球纤维化程度低；esc-exos-res组蓝色胶原沉积显著降低，染色呈淡绿色。见图13，14。

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对肾纤维化有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。

实施例13

应用人多能干细胞外泌体(esc-exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(esc-exos-res)治疗椎间盘退行性变。

选择清洁级新西兰大白兔，4月龄作为实验对象，随机分为对照组、esc-exos、esc-exos-res组。动物称重，以3％戊巴比妥钠30mg/kg静脉麻醉，取右侧卧位，以l4-5为中心备皮，碘伏消毒、铺无菌巾。取腹部后外侧切口，经腹膜外入路钝性分离腰肌到达椎体侧方，将横突分离并切除，暴露l2-3、l3-4、l4-5、l5-6椎间盘，21g注射器针头刺入椎间隙5mm，抽吸并停顿15s，可见吸出少量髓核组织。esc-exos、esc-exos-res组分别注入2～5×10⁹个esc-exos和esc-exos-res，对照组注入等体积的pbs。碘伏及生理盐水冲洗，缝合肌肉及皮肤等组织。术后前3d每天肌肉注射青霉素8×10⁵u，1次/d，伤口用碘伏消毒。常规喂食及饮水。每天观察记录动物一般情况。分别于术后2、4、8周使用空气栓塞法将各组兔子各处死2只。按原切口进入腹膜后部，游离脊柱腰段并截取l2上段至l6椎体间脊柱，去除脊柱附着肌肉及横突等附件，仅保留l2～l6椎体及椎间盘。检测不同时间点il-1β、tnf-α含量。

实验结果显示，对照组各时间点il-1β、tnf-α含量均明显高于其余两组，且esc-exos-res组含量最低。见表7，8。

表7椎间盘组织匀浆中il-1β平均浓度(ng/ml)

表8椎间盘组织匀浆中tnf-α平均浓度(ng/ml)

结果表明，esc-exos和esc-exos-res均对椎间盘退行性变有治疗效果，且以esc-exos-res的效果最显著。