本发明属于肩袖腱骨愈合
技术领域：
：，具体涉及间充质干细胞联合富血小板血浆在制备用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物中的应用。
背景技术：
：：肩关节是人体活动范围最大的关节，同时也是最不稳定的关节，肩袖(rotatorcuff)在维持盂肱关节稳定性和参与其运动方面起重要作用，它既具有一般肌键的特点，又具有独特的性质。肩袖与典型肌键的形态不同，是由来自冈上肌、冈下肌、肩胛下肌和小圆肌的肌腱共同构成的腱-骨结构复合体(balesc，andersonk.arthroscopicdouble-rowrepairoffullthicknessrotatorcufftearsusingasuturebridgetechnique.opertechsports.med,2007,15(3):144-149.)。肩袖损伤是引起肩关节疼痛、功能障碍的最常见疾病之一,占肩关节疾患的30％(kivanca,freddiehf,meganrw,etal.augmentationoftendon-to-bonehealing[j].jbonejointsurgam.2014，96(6):513-519.)。据统计美国每年约有450万肩袖损伤患者，其中25万肩袖患者损伤需接受外科手术(castricinir,longoug,debenedettom,etal.plateletrichplasmaaugmentationforarthroscopicrotatorcuffrepair[j].amjsportmed.2011，39(2):258-265.)。尽管随着肩关节镜技术及相关器械的发展，肩袖损伤微创手术修复已取得显著疗效，但术后仍可能出现肩袖撕裂。有报道显示，肩袖损伤术后3～5年仍有30％～50％再撕裂率(balesc，andersonk.arthroscopicdouble-rowrepairoffullthicknessrotatorcufftearsusingasuturebridgetechnique[j].opertechsportsmed.2007，15(3):144-149.)。肩袖修复手术的成功与否很大程度上取决于骨道和肌腱之间腱-骨界面的生物愈合，而早期腱-骨界面的连接是最薄弱的环节(gulottalv,kovacevicd,yingl,etal.augmentationoftendon-to-bonehealingwithamagnesium-basedboneadhesive[j].amjsportsmed.2008，36(7):1290-1297.)。牢固的腱-骨界面愈合是韧带重建、肩袖修复术后发挥其生理功能的先决条件，但腱-骨界面愈合困难，如何促进腱-骨界面愈合逐渐成为了近年来国内外学者关注的热点。目前，促进键-骨愈合的实验研究越来越多，如kohno等(kohnot，ishibashiy，tsudae，etal.immunohistochemicaldemonstrationofgrowthfactorsatthetendon-boneinterfaceinanteriorcruciateligamentreconstructionusingarabbitmodel[j].jorthopsci，2007,12(1)67-73.)在对兔acl重建后腱-骨界面fgf-2、vegf、bmp-2和bmp-7表达情况的研究中发现，fgf-2、vegf主要促进术后早期腱-骨界面的纤维整合，而bmp-2和bmp-7则可明显促进腱-骨的骨整合。huangfu等(huangfux，zhaoj.tendon-bonehealingenhancementusinginjectabletricalciumphosphateinadoganteriorcruciateligamentreconstructionmodel[j].arthroscopy，2007,23(5)：455-462.)报告硫酸钙填充骨隧道可明显促进比格犬acl重建后的腱-骨愈合。但以上实验研究多集中于对前交叉韧带重建术后的腱骨愈合问题，对于肩袖修复术后的腱骨愈合方面的研究相对较少。肩袖修复时将肌腱固定于骨表面，而非骨隧道内，组织愈合条件较差，其腱骨愈合过程有别于交叉韧带重建术后的腱骨愈合。近年来国外研究报道富血小板血浆(plateletrichplasma，prp)可促进骨隧道中骨-肌腱结合部的愈合(alsousouj,alia,willettk,etal.theroleofplatelet-richplasmaintissueregeneration[j].platelets.2013；24(3):173-82.；zhaiw,wangn,qiz,etal.platelet-richplasmareversestheinhibitionoftenocytesandosteoblastsintendon-bonehealing[j].orthopedics.2012,35(4):520-525.)。富血小板血浆(prp)是血浆中血小板浓缩物，富含多种与创伤愈合、骨再生相关的生长因子，如血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子(tgf)、胰岛素样因子(igf)、表皮生长因子(egf)和血管内皮生长因子(vegf)。通过离心将血小板浓缩和分离出来，具有高效诱导活性，又不引起免疫排斥反应，具有促进组织愈合和组织再生的功能(krügerjp,hondkes,endresm,etal.humanplateletrichplasmastimulatesmigrationandchondrogenicdifferentiationofhumansubchondralprogenitorcells[j].jorthopres.2012；30(6):845-852.；mazzoccaad,mccarthymb,chowaniecdm,etal.thepositiveeffectsofdifferentplateletrichplasmamethodsonhumanmuscle,bone,andtendoncells[j].amjsportsmed.2012,40(8):1742-1749.)。同时，bmsc移植促进腱骨愈合的研究已在国内外广泛开展。nourissat等(nourissatg,diopa,maureln,etal.mesenchymalstemcelltherapyregeneratesthenativebone-tendonjunctionaftersurgicalrepairinadegenerativeratmodel[j].plosone,2010,18(8):1224-1228.)研究发现，在大鼠模型中腱骨界面植入自体外周血bmsc可以促进跟腱腱-骨结合部的填充与愈合。chong等(chong,a.k.,j.chang,andj.c.go.mesenchymalstemcellsandtendonhealing[j].frontbiosci.2009；14:4598-4605.)发现采用bmsc移植可以有效改善肌腱愈合的组织学和生物力学特性。karaoglud等(karaoglu,s.,c.celik,andp.korkusuz.theeffectsofbonemarroworperiosteumontendon-to-bonetunnelhealinginarabbitmodel[j].kneesurgsportstraumatolarthrosc.2009；17(2):170-178.)研究发现把骨髓血注入腱骨界面可以增强肌腱与骨隧道的愈合；术后6周，骨长入和软骨岛形成更为明显，术后12周可以观察到明确的纤维软骨带，重建韧带的生物力学特性良好。上述研究分别验证了各种促进腱骨愈合方法的有效性，但同时也暴露了各种方法存在的局限性，如bmsc移植后过快凋亡、prp释放的生长因子早期过快的降解等。技术实现要素：本申请提供了间充质干细胞联合富血小板血浆在制备用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物中的应用，将间充质干细胞(bmscs)与富血小板血浆(prp)联合制备用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物，其间充质干细胞的抗凋亡能力增强，富血小板血浆释放的生长因子的降解速度变慢，而且间充质干细胞和富血小板血浆能够相互促进各自利于腱骨愈合的生长因子的表达。间充质干细胞联合富血小板血浆在制备用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物中的应用，该应用包括：将富血小板血浆与间充质干细胞悬液混合，待间充质干细胞融入富血小板血浆后，利用激动剂使富血小板血浆聚集，形成用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的复合物。上述复合物能够直接作为用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物，用于肩袖损伤腱骨界面，也可以作为所述药物的主要成分发挥作用。具体地，所述应用包括：(1)用注射器a吸取体积比为4:1:1的富血小板血浆、间充质干细胞悬液和空气，并将间充质干细胞与富血小板血浆混匀，使间充质干细胞融入富血小板血浆中；作为优选，所述的间充质干细胞悬液的浓度为106-108个/ml。间充质干细胞融入富血小板血浆后，注射器内容物的体积会增大，预先吸入空气可以为体积增大的内容物预留空间。(2)用注射器b吸取激动剂溶液；作为优选，所述的激动剂溶液中的激动剂为凝血酶。作为优选，所述的凝血酶的酶活力为2000～3500u/ml。作为进一步优选，所述的激动剂与富血小板血浆的体积比为(0.5-2):4。(3)取t形管，所述的t形管具有a’管口、b’管口和c管口，其中a管口和b管口处于同一直线上；将注射器a连接到a’管口上、将注射器b连接到b’管口上，并将各注射器的内容物匀速地注入t形管中，使间充质干细胞和富血小板血浆聚合成胶状的复合物，所述的复合物从c管口释出。本发明还提供了一种间充质干细胞-富血小板血浆复合物。本发明还提供了一种所述的间充质干细胞-富血小板血浆复合物的制备方法，该制备方法包括：将富血小板血浆与间充质干细胞悬液混合，待间充质干细胞融入富血小板血浆后，利用激动剂使富血小板血浆聚集，形成所述的间充质干细胞-富血小板血浆复合物。本发明还提供了一种用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物，所述的药物包括本发明所述的间充质干细胞-富血小板血浆复合物。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明将间充质干细胞与富血小板血浆联合使用，制备用于促进肩袖损伤腱骨复合体愈合的药物，该药物中间充质干细胞的抗凋亡能力增强，富血小板血浆释放的生长因子的降解速度变慢，而且间充质干细胞和富血小板血浆能够相互促进各自利于腱骨愈合的生长因子的表达，从而有效提高肩袖损伤腱骨界面的愈合速度，提高肩袖损伤腱骨界面的愈合能力。附图说明图1为骨髓bmscs细胞原代培养72小时的显微观察图；图2为骨髓bmscs细胞原代培养8天的显微观察图；图3a为单独培养的bmscs和在transwell系统中与prp共培养的bmscs细胞中vegf、bmp-2和bmp-7的rna表达量比较；其中，bmscs表示单独培养的bmscs，bmscs-transwell表示与prp共培养的bmscs；图3b为单独培养的prp和在transwell系统中与bmscs共培养的prp中vegf、pdgf、egf和fgf-2的rna表达量比较；其中，prp表示单独培养的prp，prp-transwell表示与bmscs共培养的prp；图4a各实验组在术后四周和八周时vegf的rna表达量比较；图4b各实验组在术后四周和八周时pdgf的rna表达量比较；图4c为各实验组在术后四周和八周时egf的rna表达量比较；图4d为各实验组在术后四周和八周时fgf-2的rna表达量比较；图4e为各实验组在术后四周和八周时bmp-2的rna表达量比较；图4f为各实验组在术后四周和八周时bmp-7的rna表达量比较；图5为各处理组的最大载荷测定情况。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。实施例11、prp对mscs基因表达、分化以及抗凋亡能力的影响(1)实验动物健康成年新西兰白兔27只，雌雄不限，体质量(3.0±0.5)kg，兔普通饲料喂养，24h循环光照，自由摄食、饮水，所有动物均无手术区创伤、感染及畸形，也无其他全身疾病，所有操作程序均遵守动物实验准则。实验动物由本校动物实验中心提供。(2)自体外周血bmscs的获取①动物处理：第一组3只实验动物按粒细胞集落刺激因子(g-csf)10ug/(kg·d)剂量连续5d背部皮下注射，每日分两次注射；②细胞提取、分离：细胞因子动员后第6天实验动物用肝素润洗过的注射器分别抽出约5ml血液，10％的pbs液1:1稀释。另取一含percoll分离液的离心管，将稀释好的血液1:1加在浓度为1.073g/lpercol分离液上，2000r/min速度离心20min后，用1.5ml的离心管收集灰白色云雾状层单个核细胞层，加入等量不含血清的低糖dmem培养液，以1500r/min，10min洗涤三次；③原代培养：将分离出的细胞悬液细胞计数后以2×104/ml细胞密度接种25cm2一次性塑料培养瓶中，每瓶加入含10％fbs、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的dmem/f-12培养基约5ml，置于37℃、5％co2恒温饱和湿度的培养箱内，8h后观察其贴壁情况，接种后48～72h(如图1)首次半量换液，弃去未贴壁细胞及死细胞，以后每隔2～4d换液1次，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长情况(如图2)；并做细胞活力检测(台盼蓝染色法)；④传代培养：原代细胞培养至10～12d，倒置显微镜观察显示细胞呈集落生长，贴壁细胞呈长梭形单层生长，铺满培养瓶底约贴壁细胞融合80％以上时，倾去培养液，先加10％pbs润洗两次，再加入0.25％胰蛋白酶溶液，37℃消化1～3min，镜下见细胞间出现间隙、细胞回缩成圆形之后立即用含有10％fbs的完全培养基终止消化，制成单细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清，加入含10％fbs的完全培养成细胞悬液，按照1:2的比例隔日更换培养液进行传代培养，倒置相差显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况；收集细胞。(3)prp的制备参照改进的landesberg方法制备prp：自兔耳背中央动脉采集5ml全血，采用二次离心法制备prp。先将装有5ml全血的a离心管放入恒温离心机内，以转速1400r/min离心10min，离心后吸取上部血浆及界面下2mm的红细胞转移至b离心管中，b离心管再次以转速1400r/min离心15min，去掉上部的血浆层，剩余约l.2ml摇匀即为prp。全部过程均在无菌条件下进行，离心机内的温度恒定22℃，并保持环境温度于20℃。(4)prp和bmscs之间相互作用的研究①基因表达取三块六孔板，采用dmem培养基对上述制备的bmscs和prp进行培养，其中，第一块六孔板培养bmscs，第二块六孔板培养prp，第三块六孔板中采用transwell系统共培养bmscs和prp；在5％co2、37℃下培养24小时后，分别收样，transwell系统共培养中的bmscs和prp也单独收样；将各样品抽提rna，反转录成cdna，分别测定各样品中vegf、fgf-2、bmp-2、bmp-7、egf、pdgf和tgf等因子的rna表达情况。如图3a和3b所示，与单独培养的bmscs相比，在transwell系统中与prp共培养的bmscs中vegf、bmp-2、bmp-7的表达量更高，其中bmp-2的表达量是单独培养的bmscs的2.8倍。而与单独培养的prp相比，在transwell系统中与bmscs共培养的prp中vegf、pdgf、egf、fgf-2的表达量更高，其中bmp-2的表达量是单独培养的bmscs的3.6倍。这表明bmscs和prp能够相互促进各自利于腱骨修复的生长因子的表达，从而促进腱骨愈合。2、制备bmscs-prp复合物将2mlprp、0.5mlbmscs(1×107/ml)悬液及0.5ml空气一起吸入5ml的注射器a中；再取一支1ml的注射器b，吸入0.5ml牛凝血酶溶液(牛凝血酶酶活力为2800u/ml)；取一根具有a’管口、b’管口和c管口的t形管(a管口和b管口处于同一直线上)，待注射器a中的间充质干细胞融入富血小板血浆中后，将注射器a连接到a’管口上、将注射器b连接到b’管口上，并将各注射器的内容物匀速地注入t形管中，使间充质干细胞和富血小板血浆聚合成胶状的bmscs-prp复合物，bmscs-prp复合物从c管口释出，留待实验备用。2、兔肩袖急性断裂术后腱-骨修复动物模型的建立及分组(1)动物分组所有动物随机分为四组：a组为对照组、b组为bmscs-prp复合物组、c组为bmsc组、d组为prp组，每组包含动物6只。(2)兔肩袖损伤模型的建立以速眠新ⅱ注射液0.2ml/kg对实验动物进行肌肉注射以施行全身麻醉，麻醉成功后将其置于俯卧位。术区备皮、清洁，常规消毒，铺无菌单。在肩关节做长约2cm的纵行皮肤切口。钝性分离三角肌，显露冈上肌肌腱在大结节上的止点。于大结节止点处，锐性切断冈上肌肌腱，并切除0.5cm×0.5cm的肌腱组织造成全层肩袖损伤模型。用直径约为0.5mm的克氏针沿几乎垂直于冈上肌键离断方向在原止点下方骨性组织内打孔,然后进行腱-骨缝合,重建冈上肌腱附着点。检查组织无活动性出血及确定肌键断离断及缝合无误后,庆大霉素盐水冲洗关节腔和皮下。(3)bmscs-prp复合物注入腱-骨界面内待兔建模完成后，取此前收集的bmscs-prp复合物，用连接器把空针相连，将bmscs-prp复合物注入腱骨界面内。(4)术后处理动物模型术后给予石膏固定，常规予以青霉素20万u肌肉注射，2次/d，共3d。在石膏固定期间，人工辅助饮食，l周后拆除石膏，人工喂养，自主饮食。(5)损伤部位中腱骨愈合相关生长因子的表达术后第四周、第八周安乐死兔子，收取各实验组一侧肩关节损伤部位组织样本，留取一部分(要求每组取得损伤部位应该保持一致)，使用组织破碎仪打碎组织，然后使用trizol提取其中的rna，反转后使用rt-pcr技术检测损伤部位中腱骨愈合相关生长因子的表达情况。如图4a至图4f所示，在术后四周和术后八周，b组损伤部位中各生长因子的表达量均高于其他实验组。这可能是因为bmscs与prp结成复合物后，prp的凝聚和络合作用延长了bmscs的生命周期，bmscs在释放各生长因子的同时与prp配合，促使bmscs-prp复合物具有较高的生长因子表达量。同时，bmscs-prp复合物组在术后八周仍有较高的生长因子表达量，这表明与prp联用后，bmscs的抗凋亡能力得到提高。(6)生物力学测定收取各实验组另一侧肩关节损伤部位组织样本，标本保留肱骨头及远端和冈上肌腱及近端各约3.0cm，切除除重建冈上肌腱止点重建腱-骨结构以外所有软组织，-80℃保存。实验前把标本解冻，首先用游标卡尺测出兔冈上肌腱止点横向宽度，再用测量仪测出肌腱止点处中部厚度，计算出各取材标本兔冈上肌腱横截面积。把各个标本用桶形卡具加横行钢钉固定兔肱骨骨性部分，牙膏粉包埋。放置标本并调整兔冈上肌腱与肱骨生理力学成角角度，调节复合体和卡具的位置，使拉力力线分别经过肱骨与兔冈上肌腱长轴轴线，应用mts858生物材料测试机做拉伸试验。拉力达到2.0n时用电子游标卡尺测量兔冈上肌腱的长度。先行预处理，拉伸速度0.5mm/s，拉长0.5mm，共3次，然后行拉断试验，拉伸速度为500mm/min，试验机绘出载荷-位移曲线，并进行最大载荷计算。如图5所示，处理组b术后四周的样品的最大载荷接为33.4n，术后八周样品的最大载荷达到42.7n，均远远高于其他处理组。表明在prp的辅助下，bmscs的成骨分化能力更强，损伤部位的腱骨愈合更加良好。当前第1页12当前第1页12