本发明涉及生物材料技术领域，特别涉及一种兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶制备方法。
背景技术：
每年因烧、烫伤和糖尿病足等引发大量的皮肤组织缺损病患，如不及时救治会导致皮肤组织坏死继而引发严重的全身急性反应，因此临床上通常采用各种皮肤修复材料对缺损处进行修复处理。现今的文献和大量专利表明，水凝胶因为包含亲水性聚合物链的三维网络，具有可调控的物理、化学和生物性能，结构与天然细胞外基质相似，因而被广泛用于皮肤组织缺损修复。水凝胶根据其组成成分可分为合成高分子水凝胶和天然高分子水凝胶等。其中合成高分子主要有聚丙烯酸、聚氨酯、聚乙烯吡咯烷酮等，天然高分子主要有胶原、明胶、壳聚糖、丝素蛋白、海藻酸盐等。特别地，皮肤组织中的主要成分为i型胶原，从材料仿生的角度出发，采用i型胶原水凝胶对患者皮肤组织缺损进行修复成为广大科技工作者竞相研究的重点。如陈新等制备了基于胶原和两种多糖衍生物——氧化葡聚糖和氧化纤维素的胶原水凝胶用以作为组织工程的基质材料(张霞.氧化多糖改性胶原水凝胶[d].复旦大学,硕士论文,2014)。胡杨等发明了一种基于胶原和多巴胺相互作用的胶原水凝胶(胡杨,朱士臣,熊善柏等.一种胶原基贻贝仿生黏附性水凝胶及其制备方法[p].中国专利,2018,专利号zl201610050568.3)。但是，近年来，在创伤修复中，由于清创不彻底、交叉感染等原因，伤口会受到微生物的侵袭，如果微生物的数量超过一定的限度，伤口就会形成临床感染，增加伤口的疼痛，并使创面形成大量脓包，影响伤口愈合。普通的胶原水凝胶材料尽管组织诱导作用优良，但是往往不具备抑菌功能，因此研究并生产兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶用于组织创伤修复具有十分重要的理论和现实意义。
现有专利公开了若干具有抑菌作用的胶原材料，如周久才等公开了一种具有抑菌功效的胶原-dna-ag复合物及其制备方法，将胶原、dna和可溶性银盐agno3溶液混合得到了一种抑菌型的医学临床生物敷料(周久才,刘占龙,金桂菊,等.具有抑菌功效的胶原-dna-ag复合物及其制备方法[p].中国专利,2003,公开号1406489a)；但卫华等公开了一种具有抗菌/抑菌功效的胶原集合体复合型医用纤维，将酸溶性胶原集合体、双醛酸甲基纤维素钠和甲壳素有机混合，经搅拌、脱泡、纺丝等工艺流程制备了胶原集合体复合型医用纤维(但卫华,刘新华,但年华,等.具有抗菌/抑菌功效的胶原集合体复合型医用纤维[p].中国专利,2015,公开号104711702b)；王喆等公开了一种胶原蛋白-茶多酚抗菌膜，将胶原溶于蒸馏水中并在20-60℃下热处理5-30min后于茶多酚混合进行真空脱气、流延成膜即可(王喆,叶忱,王怀雨.一种胶原蛋白-茶多酚抗菌膜及其制备方法[p].中国专利,2016,申请号201610131170.2)；但卫华等公开了一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法，采用过量的氧化壳寡糖交联胶原，再引入银离子，并在氨基的作用下稳定纳米银颗粒，从而制备具有优良使用性能、生物相容性和双重抗菌效果的胶原材料(但年华,陈一宁,但卫华,等.一种氧化壳寡糖交联胶原并原位生成纳米银制备抗菌型胶原的方法[p].中国专利,2016,申请号201610529368.6)；
王玉路等公开了一种抗菌性胶原的制备方法，采用改性三氯生在25～50℃下对胶原进行改性，透析并冷冻干燥得到抗菌性胶原材料(王玉路,靳丽强.一种抗菌性胶原的制备方法[p].中国专利,2016,申请号201610935790.1)；魏坤等公开了一种载银介孔硅/胶原/缩醛化聚乙烯醇抗菌敷料的制备方法(魏坤,许为康.一种载银介孔硅/胶原/缩醛化聚乙烯醇抗菌敷料的制备方法[p].中国专利,2014,申请号201410460969.7)；
王雪梅等公开了一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法，采用静电纺丝技术对含有agno3或金、银纳米簇等荧光纳米材料的细菌纤维素和胶原蛋白混合溶液进行纺丝，并采用紫外光光照还原含有agno3或金、银纳米簇等的纳米纤维支架，将相关复合纳米纤维支架用于细胞培养制备组织工程材料(王雪梅,刘晓丽,来兰梅.一种抗菌修复型静电纺丝胶原蛋白-细菌纤维素复合纳米纤维支架的制备方法及其应用[p].中国专利,2014,201410038926.x)；胡里安-科尔内留·阿卢佩伊等公开了一种自消毒、抗菌的胶原蛋白制剂，将自由氯己定的盐、奥克太啶的盐、苯扎氯铵等阳离子抗菌剂加入胶原蛋白溶液中即可得到自消毒、抗菌的胶原蛋白制剂(胡里安-科尔内留·阿卢佩伊,马里于斯-托马斯·戈尔卡,彼得·路得,等.自消毒、抗菌的胶原蛋白制剂及其用途和制备方法[p].中国专利,2006,200680012963.7)。
通过现有文献和公开的专利方法可知，目前的抗菌或抑菌胶原材料主要以引入ag+通过鱼细菌体内含有巯基活性基团的酶类结合使其失去活性，从而使细菌生长繁殖受到抑制，但作为重金属离子，它亦可以使蛋白质失去生物活性。抑或采用引入茶多酚等自身具有抗菌作用的多酚类物质使得终产物具有抑菌性能，但是多酚的加入会在一定程度上影响终产物的生物相容性，且已被广大科技工作者所证实。或者引入苯扎氯铵等具有抗菌作用的成分，但是同样会导致胶原的生物诱导作用减弱，同时也有其它的引入抗菌成分的方法，如采用改性三氯生等改性胶原，但是反应条件不温和，亦会影响终产物的生物诱导作用。因此，开发和制备一种兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶，具有十分重要的理论价值和现实意义。特别值得指出的是，在构成蛋白质的二十多个氨基酸中，精氨酸因为含有胍基(在中性、酸性或碱性条件下均带正电荷)，其质子化结构形式可使胍基在体内与具有负电性的基团如磷酸根、羧酸基和氧负离子自由基等产生特异性的相互作用以促使生物反应的进行，同时也可与带负电的细菌作用从而抑制细菌生长。因此可以利用该特点，将精氨酸引入胶原水凝胶，在温和的作用条件下，制备兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶。
本发明的专业名词如下：
2-吗啉乙磺酸半钠盐缓冲液简写为：mes缓冲液；
1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐简写为：edc·hcl；
n-羟基琥珀酰亚胺简写为：nhs。
技术实现要素：
本发明针对现有技术的缺陷，提供了一种兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶制备方法。该水凝胶材料应是一种既具有很好的生物诱导作用又具有良好的抑菌作用的促进创面愈合和修复的生物材料。
为了实现以上发明目的，本发明采取的技术方案如下：
一种兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶制备方法，其制备步骤如下：
步骤1，未改性胶原水凝胶的制备：在4～10℃下将胶原溶解于0.5m乙酸中，得到5mg/ml～20mg/ml的胶原溶液，随后在4℃下采用naoh溶液缓慢调节胶原溶液ph值至6.5～8.5，接着将胶原溶液置于37～42℃的恒温箱中孵化1～4h，即得到未改性胶原水凝胶；所述胶原为酸溶性的猪皮、牛皮、羊皮、鱼皮、驴皮等动物皮胶原中的一种或几种的混合物；
步骤2，将精氨酸引入未改性胶原水凝胶：首先称取干重10～20g的未改性胶原水凝胶在0～10℃的条件下浸没于体积为1l、浓度为25～50mmol/l的mes缓冲液中，其ph＝5.0；然后称取edc·hcl及nhs，其用量按摩尔比n(edc)：n(nhs)：n(胶原水凝胶中的-cooh)＝5:3:2的比例加入上述mes缓冲液中；随后，将精氨酸按照edc·hcl物摩尔质量的1/4～1/2加入到mes缓冲溶液中，在4℃的条件下搅拌12h～48h后，加入干重1～10wt％的盐酸羟胺终止反应，并采用naoh溶液调节ph至9.0；
步骤3胶原水凝胶的后处理：将上述制备的胶原水凝胶在6000～8000道尔顿截留分子量的透析袋中透析12-36h，进一步除去未反应的化学小分子试剂，并冷冻干燥、钴-60射线灭菌装袋即得到兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶材料，钴-60射线灭菌强度为15～30kgy；
作为优选，所述步骤1中的胶原为人类进化远端、免疫原性更低的鱼皮胶原；
作为优选，胶原溶解温度优选4℃，胶原溶液浓度优选10mg/ml，胶原溶液ph值优选7.5，恒温箱温度优选40℃，孵化时间为3h。
作为优选，所述步骤2中的未改性胶原水凝胶质量为15g，水凝胶浸没温度为4℃，mes缓冲液浓度为35mmol/l，精氨酸与edc·hcl物摩尔质量比例为1/3，搅拌时间为24h，盐酸羟胺用量为未改性胶原水凝胶干重的5wt％。
作为优选，所述步骤3中的透析袋截留分子量为8000道尔顿，透析时间为36h，钴-60射线灭菌强度为25kgy。
上述兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶的关键性能应符合以下要求：
外观：白色或浅黄色水凝胶状物；
重金属含量：≤8μg/g(m/m)；
弹性模量：50～500pa；
溶胀率：100％～500％；
细胞毒性：0级；
无菌试验：无菌；
致敏反应：无迟发性超敏反应。
与现有技术相比本发明的优点在于：
(1)与现有报道的采用重金属ag或ag+进行抑菌不同，本发明避免了重金属对胶原自身的失活与变性作用，通过引入人体必需的精氨酸，进行胍基化反应，在保持抑菌功效的同时，保留了胶原良好的生物诱导作用；
(2)与现有报道的采用多酚或者苯扎氯铵或改性三氯生对胶原进行改性进而制备抑菌的胶原材料不同，本发明避免了多酚对胶原水凝胶生物相容性的影响，采用的偶联剂亦是学术上业已认可的生物相容性良好的交联剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)且反应条件温和，温度在4～10℃，在胶原自身变性温度以下，有效保证了胶原的生物诱导作用不被破坏。
附图说明
图1为本发明实施例1兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶的弹性模量线形图；
图2为本发明实施例2兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶的溶胀率线形图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下参照附图并举实施例，对本发明做进一步详细说明。
实施例1
(1)未改性胶原水凝胶的制备：在4℃下将猪皮胶原溶解于0.5m乙酸中，得到5mg/ml的胶原溶液，随后在4℃下采用naoh溶液缓慢调节胶原溶液ph值至6.5，接着将胶原溶液置于37℃的恒温箱中孵化1h，即得到未改性胶原水凝胶；
(2)将精氨酸引入未改性胶原水凝胶：首先称取10g上述未改性胶原水凝胶在0℃的条件下浸没于体积为1l、浓度为25mmol/l的2-吗啉乙磺酸半钠盐(mes)缓冲液中(ph＝5.0)；然后称取一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，其用量按摩尔比n(edc)：n(nhs)：n(胶原水凝胶中的-cooh)＝5:3:2的比例加入上述mes缓冲液中；随后，将一定质量的精氨酸按照edc·hcl物质量(摩尔)的1/3加入到mes缓冲溶液中，在4℃的条件下搅拌12h后，加入未改性胶原水凝胶干重的1wt％的盐酸羟胺终止反应，并采用naoh溶液调节ph至9.0即可；
(3)胶原水凝胶的后处理：将上述制备的胶原水凝胶在6000道尔顿截留分子量的透析袋中透析12h，进一步除去未反应的化学小分子试剂，并冷冻干燥、钴-60射线灭菌，钴-60射线灭菌强度为15kgy，装袋即得到兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶材料，实施例1所制备的一组兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶的弹性模量如图1所示。
实施例2
(1)未改性胶原水凝胶的制备：在6℃下将牛皮胶原溶解于0.5m乙酸中，得到10mg/ml的胶原溶液，随后在4℃下采用naoh溶液缓慢调节胶原溶液ph值至7.5，接着将胶原溶液置于40℃的恒温箱中孵化3h，即得到未改性胶原水凝胶；
(2)将精氨酸引入未改性胶原水凝胶：首先称取15g上述未改性胶原水凝胶在4℃的条件下浸没于体积为1l、浓度为35mmol/l的2-吗啉乙磺酸半钠盐(mes)缓冲液中(ph＝5.0)；然后称取一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，其用量按摩尔比n(edc)：n(nhs)：n(胶原水凝胶中的-cooh)＝5:3:2的比例加入上述mes缓冲液中；随后，将一定质量的精氨酸按照edc·hcl物质量(摩尔)的1/4加入到mes缓冲溶液中，在4℃的条件下搅拌36h后，加入未改性胶原水凝胶干重的5wt％的盐酸羟胺终止反应，并采用naoh溶液调节ph至9.0即可；
(3)胶原水凝胶的后处理：将上述制备的胶原水凝胶在8000道尔顿截留分子量的透析袋中透析36h，进一步除去未反应的化学小分子试剂，并冷冻干燥、钴-60射线灭菌，钴-60射线灭菌强度为20kgy，装袋即得到兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶材料，实施例2所制备的一组兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶的溶胀率如图2所示。
实施例3
(1)未改性胶原水凝胶的制备：在4℃下将鱼皮胶原溶解于0.5m乙酸中，得到20mg/ml的胶原溶液，随后在4℃下采用naoh溶液缓慢调节胶原溶液ph值至8.5，接着将胶原溶液置于42℃的恒温箱中孵化4h，即得到未改性胶原水凝胶；
(2)将精氨酸引入未改性胶原水凝胶：首先称取20g上述未改性胶原水凝胶在4℃的条件下浸没于体积为1l、浓度为40mmol/l的2-吗啉乙磺酸半钠盐(mes)缓冲液中(ph＝5.0)；然后称取一定质量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc·hcl)及n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，其用量按摩尔比n(edc)：n(nhs)：n(胶原水凝胶中的-cooh)＝5:3:2的比例加入上述mes缓冲液中；随后，将一定质量的精氨酸按照edc·hcl物质量(摩尔)的1/2加入到mes缓冲溶液中，在4℃的条件下搅拌48h后，加入未改性胶原水凝胶干重的10wt％的盐酸羟胺终止反应，并采用naoh溶液调节ph至9.0即可；
(3)胶原水凝胶的后处理：将上述制备的胶原水凝胶在7000道尔顿截留分子量的透析袋中透析24h，进一步除去未反应的化学小分子试剂，并冷冻干燥、钴-60射线灭菌，钴-60射线灭菌强度为30kgy，装袋即得到兼具抑菌与生物诱导作用的胶原水凝胶材料。
本领域的普通技术人员将会意识到，在本发明各方法实施例中，所述各步骤的序号并不能用于限定各步骤的先后顺序，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，对各步骤的先后变化也在本发明的保护范围之内。这里所述的实施例是为了帮助读者理解本发明的实施方法，应被理解为本发明的保护范围并不局限于这样的特别陈述和实施例。本领域的普通技术人员可以根据本发明公开的这些技术启示做出各种不脱离本发明实质的其它各种具体变形和组合，这些变形和组合仍然在本发明的保护范围内。