本发明涉及无机非金属材料和生物医学材料领域的人工骨修复材料的制备技术领域，具体涉及一种高生物活性支架材料的制备方法。
背景技术：
疾病、创伤、人口老龄化及自然灾害等均可导致人体骨组织损伤，临床上对骨修复材料需求巨大。而作为黄金法则的自体骨移植手术由于其来源受限和对患者二次手术痛苦使其远远无法满足现状。异体骨移植手术也存在生物安全隐患问题，可能对患者留下终生免疫排斥反应和带来未知疾病。因此，人工制备骨修复材料在临床上受到了越来越多的关注。
组织再生修复的过程，是通过将细胞接种到具有一定生物活性的生物可降解多孔支架材料上，在体外进行培养一段时间后，将得到的细胞-支架复合物移植入病人体内组织缺损部位，细胞增殖并分化，成为近似于天然的组织，支架材料可降解，逐渐被新生成的组织替代，从而修复或取代病人自身病变或缺损的组织。因此，组织工程的核心是活细胞和可供细胞进行生命活动的支架材料，以及它们之间的相互总用。
支架材料是组织工程化组织的最基本构架，为细胞提供了获取营养、气体交换、排泄废物和生长代谢的场所，也是形成新的具有形态和功能的组织、器官的物质基础。组织工程对支架材料的要求主要有以下几点：（1）生物安全性好，对人体无毒无致敏性和无致癌性；（2）生物相容性良好，对人体、组织、血液和免疫系统无不良反应；（3）应具有良好的细胞粘附能力，能尽可能模拟适合细胞生长、增生、分化的生理环境；（4）必须可生物降解，降解产物应无毒，能被机体代谢或清除，降解时间应与愈合过程和再生过程相匹配，有适于操作的力学特性，降解后的力学特性改变应与愈合或再生进程匹配；（5）支架要有一定的柔韧性，可与机体有机的紧密结合在一起。
然而，目前骨组织工程支架的研究和应用仍面临着许多问题，如：1、材料体内降解不可控，细胞繁殖效率低，降解产物引起炎性反应，细胞去分化等。尤其是在力学性能方面，单一的使用聚合物或陶瓷材料作为支架材料存在强度弱或脆性大的问题，都无法满足承力骨修复的要求；2、成型难，可塑性差；3、生物相容性差；4、干燥时易碎裂、降解较慢等。
因此，亟需研制出一种能够解决上述问题的支架材料非常有必要。
技术实现要素：
本发明主要解决的技术问题，针对目前材料体内降解不可控，降解产物易引起炎性反应，单一的使用聚合物或陶瓷材料作为支架材料，可塑性差、生物活性低，细胞增殖速率慢，无法满足承力骨修复要求的缺陷，提供了一种高生物活性支架材料的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：
一种高生物活性支架材料的制备方法，其特征在于具体制备步骤为：
（1）将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗，将清洗后的钛片放入烘箱中干燥后转移至装有10～15ml氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温，保温反应，得到钛基钛酸盐纳米线基体；
（2）将0.2～0.3g石墨粉和0.12～0.13g硝酸钠加入到装有10～12ml浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应，撤去冰水浴常温下搅拌反应，向烧杯中加入10～15ml去离子水和20～25ml双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；
（3）继续向上述烧杯中加入20～25ml硫酸溶液和10～15ml双氧水，搅拌反应后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入烘箱中干燥，得到固态氧化石墨烯；
（4）将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散，得到氧化石墨烯悬浊液，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散，得到羧基化氧化石墨烯胶体；
（5）将1～2g三羟甲基氨基甲烷加入上述羧基化氧化石墨烯胶体中，得到混合液，向混合液中继续加入2～3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3～4g1，3-丙二胺，反应得到石墨烯纳米片悬浮液；
（6）将丝素蛋白原液、酪蛋白混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以钛基钛酸盐纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到仿生支架，再将包膜液作为新沉积液，对仿生支架进行电泳沉积，得到高生物活性支架材料。
步骤（1）所述的无水乙醇和丙酮清洗时间为10～15min，控制超声频率为30～35khz，烘箱设定温度为70～80℃，干燥时间为4～5h，氢氧化钠溶液的质量分数为40%，高压反应釜升温后温度为200～240℃，保温反应时间为7～8h。
步骤（2）所述的浓硫酸溶液的质量分数为85%，搅拌反应时间为30～45min，撤去冰水浴后常温下搅拌反应时间为1～2h，双氧水质量分数为10%。
步骤（3）所述的硫酸溶液质量分数为8%，双氧水质量分数为5%，搅拌反应时间为45～50min，烘箱温度为60～70℃，干燥时间为20～24h。
步骤（4）所述的加入蒸馏水超声分散时间为10～15min，得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2～3mg/l，加入氯乙酸后超声分散时间为1～2h，控制超声频率为30～33khz。
步骤（5）所述的超声分散时间为30～35min，反应时间为3～4h。
步骤（6）所述的丝素蛋白原液质量分数为20%，丝素蛋白原液与酪蛋白混合质量比为5:1，沉积过程中控制沉积液的ph为7.00～8.50，沉积电压为1.0～1.3v，沉积时间为5～10min。
本发明的有益效果是：
（1）本发明以钛片为材料制成钛基钛酸盐纳米线基体，将石墨粉、硝酸钠在冰水浴条件下依次加入硫酸溶液、双氧水，搅拌反应后真空抽滤，得到滤饼，经过洗涤干燥后得到固态氧化石墨烯，将固态氧化石墨烯配置成悬浊液，超声分散加入氢氧化钠、氯乙酸后得到羧基化氧化石墨烯胶体，将三羟甲基氨基甲烷掺入羧基化氧化石墨烯胶体中超声分散，继续加入1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1，3-丙二胺，反应得到石墨烯纳米片悬浮液，将丝素蛋白原液与酪蛋白混合配制成包膜液，通过二电极池反应池依次以石墨烯纳米片悬浮液、包膜液作为沉积液，对钛基钛酸盐纳米线基体进行电泳沉积得到高生物活性支架材料，本发明所用钛基钛酸盐纳米线基体化学反应活性高，可将氧化石墨烯沉积修饰在其表面，不仅提高了支架材料的生物相容性和生物活性，还可通过电泳沉积时间对支架材料进行塑形调控，所用包膜液为丝素蛋白原液和酪蛋白，它们都具有高生物相容性，丝素蛋白可在人体中缓慢降解，酪蛋白在酸性环境中可被肠胃吸收，降解性能良好并且不产生任何毒害物质；
（2）本发明以水热合成法制备出具有网格状微孔结构的钛基钛酸盐纳米线基体，所得的钛基钛酸盐纳米线基体微孔为2~10μm，形貌规则且分布均匀，能够为骨细胞的生长提供场所，为了改善其生物相容性、生物活性，通过电泳沉积以氧化石墨烯纳米片为沉积物对钛酸盐纳米线基体进行规整、均匀的修饰，并以多孔结构的钛酸盐纳米线薄膜为基底，向外衍生，形成三维的氧化石墨烯孔洞结构，不仅增大了支架材料的粗糙度以及细胞的接触点，也提高了材料的机械强度，为细胞的粘附、生长、增殖以及新骨的长入提供一个良好的环境，通过氯乙酸、1，3-丙二胺等对氧化石墨烯的羟基、氨基、羧基的功能化进一步提高了氧化石墨烯修饰的钛酸盐纳米线支架材料的alp活性，提高了未功能化的支架材料骨诱导能力，且酪蛋白中所含钙、磷元素为骨细胞繁殖提供前期充足养料，应用前景广阔。
具体实施方式
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗10～15min，控制超声频率为30～35khz，将清洗后的钛片放入设定温度为70～80℃的烘箱中干燥4～5h后转移至装有10～15ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至200～240℃，保温反应7～8h，得到钛基钛酸盐纳米线基体；将0.2～0.3g石墨粉和0.12～0.13g硝酸钠加入到装有10～12ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应30～45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应1～2h，向烧杯中加入10～15ml去离子水和20～25ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入20～25ml质量分数为8%的硫酸溶液和10～15ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应45～50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为60～70℃的烘箱中干燥20～24h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散10～15min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2～3mg/l，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散1～2h，得到羧基化氧化石墨烯胶体，控制超声频率为30～33khz；将1～2g三羟甲基氨基甲烷加入上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散30～35min，得到混合液，向混合液中继续加入2～3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3～4g1，3-丙二胺，反应3～4h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以钛基钛酸盐纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到仿生支架，再将包膜液作为新沉积液，控制沉积液的ph为7.00～8.50，沉积电压为1.0～1.3v，沉积时间为5～10min，对仿生支架进行电泳沉积，得到高生物活性支架材料。
实例1
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗15min，控制超声频率为35khz，将清洗后的钛片放入设定温度为80℃的烘箱中干燥5h后转移至装有15ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至240℃，保温反应8h，得到钛基钛酸盐纳米线基体；将0.3g石墨粉和0.13g硝酸钠加入到装有12ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应2h，向烧杯中加入15ml去离子水和25ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入25ml质量分数为8%的硫酸溶液和15ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为70℃的烘箱中干燥24h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散15min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为3mg/l，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散2h，得到羧基化氧化石墨烯胶体，控制超声频率为33khz；将2g三羟甲基氨基甲烷加入上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散35min，得到混合液，向混合液中继续加入3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4g1，3-丙二胺，反应4h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以钛基钛酸盐纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到仿生支架，再将包膜液作为新沉积液，控制沉积液的ph为8.50，沉积电压为1.3v，沉积时间为10min，对仿生支架进行电泳沉积，得到高生物活性支架材料。
实例2
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗13min，控制超声频率为33khz，将清洗后的钛片放入设定温度为75℃的烘箱中干燥4.5h后转移至装有13ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至220℃，保温反应7.5h，得到钛基钛酸盐纳米线基体；将0.25g石墨粉和0.12g硝酸钠加入到装有11ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应38min，撤去冰水浴常温下搅拌反应1.5h，向烧杯中加入13ml去离子水和23ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入23ml质量分数为8%的硫酸溶液和13ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应47min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为65℃的烘箱中干燥22h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散13min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为2.5mg/l，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散1.5h，得到羧基化氧化石墨烯胶体，控制超声频率为31khz；将1.5g三羟甲基氨基甲烷加入上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散33min，得到混合液，向混合液中继续加入2.5g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和3.5g1，3-丙二胺，反应3.5h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以钛基钛酸盐纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到仿生支架，再将包膜液作为新沉积液，控制沉积液的ph为7.8，沉积电压为1.2v，沉积时间为7min，对仿生支架进行电泳沉积，得到高生物活性支架材料。
实例3
将钛片置于超声清洗机中，依次用无水乙醇和丙酮清洗15min，控制超声频率为35khz，将清洗后的钛片放入设定温度为80℃的烘箱中干燥5h后转移至装有15ml质量分数为40%的氢氧化钠溶液的高压反应釜中，加热升温至240℃，保温反应8h，得到钛基钛酸盐纳米线基体；将0.3g石墨粉和0.13g硝酸钠加入到装有12ml质量分数为85%的浓硫酸溶液的烧杯中，将烧杯置于冰水浴中，搅拌反应45min，撤去冰水浴常温下搅拌反应2h，向烧杯中加入15ml去离子水和25ml质量分数为10%的双氧水，继续搅拌反应直至无气泡产生；继续向上述烧杯中加入25ml质量分数为8%的硫酸溶液和15ml质量分数5%的双氧水，搅拌反应50min后真空抽滤除去滤液得到滤饼，并用去离子水冲洗所得滤饼直至洗涤液为中性，将冲洗后的滤饼放入设定温度为70℃的烘箱中干燥24h，得到固态氧化石墨烯；将上述制备的固态氧化石墨烯置于超声分散机中，加入蒸馏水超声分散15min，使得到的氧化石墨烯悬浊液质量浓度为3mg/l，取10ml氧化石墨烯悬浊液，向其中加入1.2g氢氧化钠和1.0g氯乙酸超声分散2h，得到羧基化氧化石墨烯胶体，控制超声频率为33khz；将2g三羟甲基氨基甲烷加入上述羧基化氧化石墨烯胶体中，超声分散35min，得到混合液，向混合液中继续加入3g1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4g1，3-丙二胺，反应4h，得到石墨烯纳米片悬浮液；将质量分数为20%的丝素蛋白原液、酪蛋白按质量比为5:1混合得到包膜液，在二电极池反应池中将石墨烯纳米片悬浮液作为沉积液，以钛基钛酸盐纳米线基体作为工作电极，铂片电极作为对电极，进行电泳沉积，得到仿生支架，再将包膜液作为新沉积液，控制沉积液的ph为8.50，沉积电压为1.3v，沉积时间为10min，对仿生支架进行电泳沉积，得到高生物活性支架材料。
对比例
以上海市某公司生产的支架材料作为对比例
对本发明制得的高生物活性支架材料和对比例中的支架材料进行检测，检测结果如表1所示：
材料的表征
采用扫描电子显微电镜观察制备材料的宏观结构、沉积矿化以及细胞铺展。采用透射电子显微镜观察材料的介孔结构。采用氮气等温吸附-脱附测定材料的微孔结构，并通过bet计算材料的比表面积和孔容，根据公式计算平均孔径。采用激光共聚焦观察材料表面的细胞形貌和渗透。采用x-射线仪检测骨缺损处新骨生成情况。
力学性能测试
将本发明制得的高生物活性支架材料和对比例中的支架材料制成10mm×10mm×10mm的矩形条样，然后在万能材料试验机上进行抗压测试，压缩速度为1mm/min。
孔隙率测试
支架材料的孔隙率根据排水法测定。孔隙率p=（w2-w3+ws）/（w1-w3），其中ws为样品质量；w1为称量充满无水乙醇的比重瓶的质量；w2为将样品放入比重瓶中的总质量；w3为将样品取出后，比重瓶的质量。
体外细胞培养
将鼠骨髓间充质干细胞（rbmscs）培养于含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的α-mem培养液中，于37℃、5%co2培养箱内传代培养。将支架高温灭菌后置于24孔细胞培养板中，rbmscs分别接种到材料表面，加入培养基。孵育至培养结束后使用mtt测定法检测细胞活性和细胞增殖，向每孔加入100μl的四甲基偶氮唑盐试剂，37℃继续孵育4h后，吸弃上清液，加入1mldmso，轻轻震荡20min，使结晶物溶解，使用连续光谱酶标仪在490nm处测定溶液的光吸收值。
表1性能测定结果
由表1数据可知，本发明制得的高生物活性支架材料，具有很好的力学性能，能很好地满足骨修复部位的受力支撑需求，且孔隙率高，生物活性和生物相容性好，宏观级和微观级孔洞结构明显，有利于细胞的增殖和分化，明显优于对比例产品。因此，具有广阔的使用前景。