本发明属于生物医药领域，具体涉及莲子心提取物的制药用途，及包含莲子心提取物的保健品。
背景技术：
：睡眠与觉醒的周期性变化是人和高等动物依赖于中枢神经活动维持正常生理功能的一种生理现象。睡眠由两个不同时相所组成，一个是快速动眼运动睡眠(rapideyesmovement，rem)，另一个是非快速动眼运动睡眠(non-rapideyesmovement，nrem)，两种时相交替进行，用于恢复体力与脑力。一旦这种周期变化出现紊乱，便会出现失眠。失眠是一种常见的睡眠障碍，表现为难以入睡和睡眠维持困难，并常常伴发多种躯体和精神障碍。世界卫生组织who资料显示，全球有近1/4的人受失眠困扰。中华医学会调查资料显示，我国睡眠障碍患病率达42％，约有3亿中年人患有睡眠障碍。长期失眠，会造成机体疲劳，精神萎靡不振、情绪低落、易烦易怒，导致注意力不集中、记忆力减退、认知功能障碍、精神抑郁，甚至破坏免疫系统功能，引起机体机能的严重破坏。药物治疗是缓解失眠患者痛苦的一种有效方法，但经美国食品药品监督管理局(fda)认证的治疗药物主要为苯二氮卓类(bzds)、非苯二氮卓类(nbzds)、褪黑素受体激动剂(mra)及个别组胺h1受体拮抗剂。bzds可作用于gabaa上不同的α亚基及β和γ2亚基等来发挥镇静催眠作用，但缺乏选择性，易产生不可避免的不良反应，如：日间困倦、头昏、肌张力减退、跌倒、认知功能减退、反跳性失眠、戒断症状等。nbzds同bzds一样，也可以强化中枢神经系统抑制神经递质gaba的活性而发挥作用，但是也具有较大的不良反应，如呼吸抑制、记忆紊乱、疲乏、头晕、嗜睡、噩梦，存在药物依赖性以及停药后的戒断反应的风险。mra能模拟由松果体分泌的褪黑素的生理作用，有助于调节睡眠周期，改善睡眠质量，但由于它半衰期短以及使用量少的原因，个人主观上的睡眠质量并未得到改善，而且临床数据显示其效果差于其他催眠药。中药防治失眠有一定的特色，仍然存在组方复杂，处方剂量大，研究不系统、临床应用少、改善失眠作用有限等特点。因此，寻找副作用小、机制新颖的失眠治疗药物具有积极的临床意义。莲子心(plumulanelumubinis)为睡莲科莲属植物莲(nelumbonuciferagaertn.)成熟种子中的绿色幼叶及胚根，其主要产地为我国湖南、湖北、福建、江苏、浙江、江西等省。莲子心气微，味苦，归心、肾经，是我国传统的中药之一，历代医药书籍均有记载，明《本草纲目》谓其苦寒无毒，《大明一统志》记载“清心去热”，《全国中草药汇编》中载，其具有清心火，退热，降血压，强心等功用。莲子心提取物是指采用适当的溶剂(如水、酸水、乙醇、甲醇、三氯甲烷等)及提取方法(如煎煮、回流、渗漉、浸渍、超声等)所获取的含有莲子心中某一种或多种有效成分的产品，可用于高血压、心律失常等疾病的治疗，但目前并未发现莲子心提取物及其具体有效成分莲子心总生物碱、甲基莲心碱等物质可用于制备治疗失眠的药物，也没有对其治疗失眠的机制的研究。食欲素(orexin)由yanagisawa等在1998年发现，由下丘脑外侧orexin神经元合成和分泌，包括orexina和orexinb，是负责调节中枢觉醒及回馈系统的关键神经肽[9–10]。orexin1受体(orexin1receptor，ox1r)和orexin2受体(orexin2receptor，ox2r)是响应orexin信号的两种受体，在orexin调节睡眠-觉醒中发挥重要作用，其中ox1r主要调节快速动眼运动(rapideyesmovement，rem)，而ox2r主要调节非快速动眼运动(non-rapideyesmovement，nrem)，同时一定程度上也参与rem的调节。orexin受体拮抗剂可以通过双重抑制ox1r和ox2r受体或者单独抑制ox2r受体促进睡眠，从而用于治疗失眠以及扰乱睡眠-觉醒生理节奏的疾病。与目前上市的苯二氮卓类镇静催眠药相比，orexin受体拮抗剂可以暂时阻断orexin的功能，增加rem和nrem的维持时间，更接近生理睡眠，副作用较少。2014年美国fda批准了第一种用于失眠治疗的食欲素受体拮抗剂suvorexant，使orexin受体拮抗剂成为了开发失眠症治疗药物的一条新途径。技术实现要素：本发明旨在提供一种莲子心提取物在制备用于治疗失眠的药物中的应用。莲子心提取物具有能与orexin受体结合而发挥治疗失眠功效的作用机制，应用莲子心提取物治疗失眠的药物副作用小。本发明还提供一种含有莲子心提取物的具有安眠作用的保健品。本发明人在研究中令人意外地发现，莲子心提取物中生物碱和黄酮类成分能与orexin受体结合，具有镇静催眠的生物活性，并具有较好的成药性，可用于制备治疗失眠的药物。本发明提供一种莲子心提取物在制备用于治疗失眠的药物中的应用。进一步地，所述莲子心提取物是莲子心水提取物、或莲子心醇提取物。进一步地，所述莲子心提取物为莲子心总生物碱。进一步地，所述莲子心提取物为甲基莲心碱。进一步地，所述莲子心提取物单独或与其他药物组合，用于制备治疗失眠的药物或保健品中。进一步地，所述治疗失眠的药物可以制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂或丸剂。进一步地，所述莲子心提取物的有效使用剂量为：醇提取物剂量为100mg/kg～400mg/kg，水提取物剂量为100mg/kg～400mg/kg，总生物碱剂量为1.0mg/kg～8mg/kg，甲基莲心碱剂量为1.0mg/kg～8.0mg/kg。本发明还提供一种含有莲子心提取物的具有安眠作用的保健品。其中所述莲子心提取物可以为莲子心水提取物、莲子心醇提取物、莲子心总生物碱、甲基莲心碱。莲子心提取物可以用于具有安眠作用的保健品中。本发明中，所述莲子心提取物是通过本
技术领域：
常规技术手段和方法得到的，含有莲子心中一种或多种有效成分的物质。所述莲子心提取物是指采用适当的溶剂(如水、酸水、乙醇、甲醇、三氯甲烷等)以及提取方法(如煎煮、回流、渗漉、浸渍、超声等)所获取的含有莲子心中某一种或多种有效成分的产品。本发明中，所述莲子心水提取物是指，以水或含0.1-3％无机酸或有机酸的水溶液为提取溶剂，经提取所获得的产品。本发明中，所述莲子心醇提取物是指，以30％～95％乙醇或者甲醇为提取溶剂，经提取所获得的产品。本发明中，所述莲子心总生物碱是指，莲子心提取物如莲子心水提取物或醇提取物经离子交换柱色谱，硅胶柱色谱，反相硅胶柱色谱富集得到的总生物碱，或莲子心提取物如水提取物或醇提取物经有机溶剂萃取或酸溶碱沉等方法获得的生物碱。本发明中，所述提取制备方法包括煎煮、回流、渗漉、浸渍和超声等。附图说明图1.莲子心提取物对咖啡因所致pc12细胞活性变化的保护作用。图2.莲子心提取物对咖啡因所致pc12细胞形态变化的保护作用。图3.莲子心提取物在hoechst33342核染色实验中对pc12细胞的保护作用。图4.莲子心提取物对咖啡因致pc12细胞内cleavedparp表达的影响。图5a)为orexin1蛋白结构示意图，b)为orexin1口袋残基相互作用示意图。图6a)为orexin2蛋白结构示意图，b)为orexin2口袋残基相互作用示意图。图7甲基莲心碱与orexin1受体残基结合图。图8甲基莲心碱与orexin2受体残基结合图。图9化合物lemorexant与orexin1受体残基结合图。图10化合物lemorexant与orexin2受体残基结合图。图11a)nef与hs_hcrtr2蛋白的浓度梯度特异性结合曲线，b)空白溶剂结合曲线具体实施方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。(一)小鼠自主活动实验和阈上剂量、阈下剂量戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠实验(1)剂量对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间的影响通过对icr雄性小鼠腹腔注射给予不同剂量的戊巴比妥钠后，观察小鼠的入睡情况来确定最大阈下剂量和最小阈上剂量。实验结果表明最大阈下剂量为25mg/kg，最小阈上剂量为35mg/kg(见表1)。表1戊巴比妥钠剂量对icr雄性小鼠睡眠的影响(n＝10)剂量(mg/kg)小鼠入睡数量(只)入睡率(％)2500302203510100401010045101005010100(2)莲子心提取物对最小阈上剂量的戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响实验空白组为腹腔注射给予1％吐温80水溶液，阳性对照组为给予2.0mg/kg的地西泮注射液，给药组为不同剂量的莲子心提取物的1％吐温80溶液。结果表明：与空白组比较，莲子心醇提取、水提取物、总生物碱和甲基莲心碱对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的睡眠潜伏期影响不大；莲子心醇提取物(200mg/kg和400mg/kg组)、水提取物(200mg/kg和400mg/kg组)、总生物碱(4.0mg/kg和8.0mg/kg组)、以及甲基莲心碱的高剂量(8.0mg/kg组)都能明显延长小鼠的睡眠持续时间，提高睡眠质量，具有统计学差异；总生物碱(1.0mg/kg组)能延长小鼠的睡眠持续时间，详见表2。表2莲子心提取物对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠潜伏期和睡眠持续时间的影响(n＝10)注：与空白组比较：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。(3)莲子心提取物对最大阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠协同睡眠实验空白组为腹腔注射给予1％吐温80水溶液，阳性对照组为给予2.0mg/kg的地西泮注射液，给药组为不同剂量的莲子心提取物的1％吐温80溶液。结果表明：与空白组比较，莲子心醇提物、水提物的100mg/kg、200mg/kg和400mg/kg组和总生物碱和甲基莲心碱的4.0mg/kg和8.0mg/kg组都能明显协同戊巴比妥钠提高小鼠入睡率，有助于改善睡眠，详见表3。表3莲子心提取物对戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的协同作用(n＝10)注：与空白组比较：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。(4)莲子心提取物对小鼠自主活动的影响空白组为腹腔注射给予1％吐温80水溶液，阳性对照组为给予2.0mg/kg的地西泮注射液，给药组为不同剂量的莲子心提取物的1％吐温80溶液。结果表明：与空白组比较，莲子心醇提物、水提物、总生物碱、甲基莲心碱的3个剂量组都能减少走动时间和前肢向上抬举次数，明显抑制小鼠的自主活动，促使小鼠加快睡眠。但莲子心醇提物、水提物200mg/kg和400mg/kg剂量组和总生物碱、甲基莲心碱的8.0mg/kg剂量组的抑制作用具有统计学意义，详见表4。表4莲子心提取物对小鼠自主活动的影响(n＝10)注：与空白组比较：*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。(二)莲子心提取物对咖啡因诱导的神经损伤的保护作用失眠会引起神经细胞损伤，本实验基于pc12细胞(一种具有神经细胞特性且对神经毒性高度敏感的细胞)的咖啡因神经损伤模型，发现了莲子心提取物(莲子心醇提取物，莲子心水提取物，莲子心总生物碱，甲基莲心碱)对咖啡因造成的神经损伤具有保护作用，为莲子心镇静安眠等中枢作用的研究提供了基础。实验分组：将培养好的pc12细胞分为以下组：正常对照组：仅用dmem完全培养基培养,只加入溶剂dmso；咖啡因损伤模型组：培养液中加入终浓度5mmol/l的咖啡因；莲子心提取物干预组：先用各莲子心提取物(莲子心醇提取物，莲子心水提取物，甲基莲心碱，莲子心总生物碱)预处理细胞6h后加入终浓度5mmol/l的咖啡因，各组细胞培养24小时后分别进行以下各项指标测定，来研究莲子心提取物对咖啡因神经损伤的潜在保护作用。实验方法及观测指标：mtt(噻唑蓝法)检测细胞存活率；倒置显微镜下细胞形态观测；hoechst33342核染色分析；蛋白印迹法检测细胞内cleavedparp。数据处理：所有结果以mean±sem表示,应用spss软件,采用单因素方差分析及t检验分析处理数据。结果：(1)通过运用mtt(噻唑蓝法)检测pc12细胞存活率，其中，a:正常对照组，b:模型组(5.0mmol/l咖啡因)；c:甲基莲心碱组(6.25mg/ml)；d:莲子心总生物碱组(3mg/ml)；e:莲子心醇提取物组(3mg/ml)；f:莲子心水提取物组(3mg/ml)。结果表明：模型组细胞存活率明显降低，而莲子心提取物剂量依赖性地抑制了咖啡因导致的细胞存活性降低(见图1)。与正常对照组比较**p<0.01；与模型组比较#p<0.05，##p<0.01；咖啡因浓度：5.0mmol/l；提取物浓度如图1所示，单位为mg/l。)。(2)倒置显微镜下pc12细胞形态观测，结果表明：从细胞形态观察看出，正常对照组pc12细胞形态正常。模型组的细胞则形态异常，甲基莲心碱，莲子心醇提物和莲子心水提物预处理组形态则与正常对照组接近(见图2)。(3)hoechst33342核染色分析。a:正常对照组；b:咖啡因模型组(5.0mmol/l)；c:低剂量甲基莲心碱组(1.88mg/ml)；d:高剂量甲基莲心碱组(6.25mg/ml)；e:莲子心醇提取物组(3mg/ml)；f:莲子心水提取物组(3mg/ml)。结果表明：相比正常对照组，模型组细胞数量明显降低，而莲子心提取物(甲基莲心碱，莲子心醇提取物，莲子心水提取物)处理组的细胞数量明显高于咖啡因处理组(见图3)。(4)蛋白印迹法检测细胞内cleavedparp。cleavedparp是细胞的一种降解产物，反应细胞受损的程度。结果表明：细胞内cleavedparp实验看出，相比正常对照组，咖啡因使细胞cleavedparp表达明显增强，而莲子心提取物预处理的细胞内cleavedparp表达明显降低(见图4)。(三)分子对接虚拟筛选运用molecularoperatingenvironment软件(moe，chemicalcomputinggroup公司，version2012)，构建莲子心中生物碱(结构式1至式36)及黄酮类成分(结构式37至式71)、底物多肽的二维结构，并进行能量优化。采用蛋白质数据库(proteindatabank)中所报道的orexin1与其小分子抑制剂的共结晶结构(pdbcode：4zjc)(图5)以及orexin2与其小分子抑制剂的共结晶结构(pdbcode：4s0v)(图6)的三维结构，进行加氢处理并优化，找到关键的活性氨基酸残基，然后将orexin1和orexin2的结构导入moe软件进行分子对接。图5中口袋外条带代表orexin1蛋白肽链；口袋外面棒状物代表口袋周围的氨基酸残基；口袋内棒状物代表蛋白共结晶中的orexin1抑制剂(sb-674042)，sb-674042化学结构如式72所示。图6中口袋外条带代表orexin2蛋白肽链；口袋外棒状物代表口袋周围的氨基酸残基；口袋内棒状物代表蛋白共结晶中的orexin2抑制剂(suvorexant)，suvorexant已经美国fda批准上市，其化学结构如式73所示。结果表明莲子心中生物碱和黄酮类成分能与orexin受体结合，一些双苄基异喹啉类生物碱和黄酮类成分与orexin两个受体的结合能力比食欲素受体拮抗剂lemorexant，sb-674042和suvorexant都强，结果见表6和表7。甲基莲心碱与lemorexant相似，能很好的嵌入orexin1和orexin2的口袋，与两个受体拮抗性结合，其中甲基莲心碱13位羟基能与orexin1受体以氢键的方式结合；甲基莲心碱中苯环能与orexin2受体以p-π共轭的形式结合发挥作用。甲基莲心碱、lemorexan与orexin受体残基结合图见图7、图8、图9和图10。表6.莲子心中生物碱类成分与orexin1和orexin2受体分子对接筛选结果aa：表中sb-674042和suvorexant为已经报道的orexin受体拮抗剂；b：s值越小表明配体小分子(生物碱)与受体(orexin1或orexin2)结合越强。表7.莲子心中黄酮类成分与orexin1和orexin2受体分子对接筛选结果a：表中sb-674042和suvorexant为已经报道的orexin受体拮抗剂；b：s值越小表明配体小分子(生物碱)与受体(orexin1或orexin2)结合越强。(四)薛定鄂软件预测莲子心中生物碱类化合物的药动学及相关活性参数从表8的结果可以看出：根据lipinski’s五规则，除了化合物1,3～9以外，其他28个化合物的具有较好的潜在成药性。根据预测的中枢神经系统的活性结果，除了第14到第20个化合物之外，其外25个化合物都具有潜在的中枢神经活性。它们透过血脑屏障的能力及与血浆蛋白的能力都在合理的范围内，此外，其他的性质如脂水分布系数、水溶性、渗透性等也比较理想。(五)表面等离子共振技术分析甲基莲心碱与orexin2受体的亲和力通过表面等离子共振技术(surfaceplasmonresonance,spr)测定化合物甲基莲心碱(nef)与orexin2受体(hs_hcrtr2)的结合情况并分析亲和力参数以及相互作用的动力学参数(ka，kd)及亲和力参数(kd)。结果显示，nef与hs_hcrtr2具有较强的亲和力，结合情况见图11(其中图11a为nef与hs_hcrtr2蛋白的浓度梯度特异性结合曲线，b为空白溶剂pbs_7.0结合曲线)，亲和力数据见表9。表9.nef与hcrtr2蛋白的亲和力数据简表avgka(1/ms)：ka表示单位时间内结合形成了的ab占解离前初始ab的比例，ka能表示结合反应的快慢，ka越大代表结合越快，ka越小代表结合越慢；单位为1/ms。avg表示3个浓度梯度及3组平行试验测得值的平均值。avgkd(1/s)：kd表示单位时间内解离了的ab占解离前初始ab的比例，kd能表示解离反应的快慢，kd越大代表解离越快，kd越小代表解离越慢；单位为1/s。avgkd：平衡解离常数，kd＝kd/ka，kd单位是m(mol/l)；kd可以表示处于平衡状态时ab的解离程度，kd越大说明解离越多，代表ab之间亲和力越弱，kd越小说明解离越少，代表ab间亲和力越强；int.intensitylevel：对亲和力的判定。10-13至10-8之间为极强结合，10-8至10-5之间为强结合，10-5至2×10-2之间为中弱结合，2×10-2至100之间为极弱结合。abs(tr_kd)：绝对亲和系数。abs(tr_kd)＝abs(log2(kd))，数值越高，亲和力越高。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12