本发明属于纳米技术及抗肿瘤药物技术领域，具体涉及一种抗肿瘤无机含硒纳米颗粒及其制备方法和应用。
背景技术：
硒作为人类和动物维持生命所必须的微量元素之一，广泛分布于人体肝肾中，其次是肌肉、骨骼和血液中，脂肪组织中含量最少。在生物体内，硒是唯一受基因调控的微量元素，硒及其化合物在提高免疫力、抗氧化及抗肿瘤等方面发挥着重要作用。大量调查资料和实验研究表明硒在体内的含量与癌症发生几率呈显著负相关(kimiw,baesm,kimyw,etal.serumseleniumlevelsinkoreanhepatomapatients[j].biologicaltraceelementresearch,2012,148(1):25-31.
鉴于硒在抗肿瘤过程所起的积极作用，含硒纳米材料成为抗肿瘤纳米材料领域研究的热点。硒的生物活性与硒的化学形态和吸收剂量相关。亚硒酸钠作为who建议的常用补硒制剂，对多种肿瘤细胞具有杀伤作用，但其使用剂量较难控制，易引起机体毒副作用。为了减弱其毒性作用，大量具有抗癌活性的有机硒被合成出来，如硒醚、硒氰及硒杂环化合物等。但均存在难以精确控制使用剂量，易造成毒副作用等问题。因而，探索新型硒形态、研究其抗肿瘤活性及作用机制成为多学科领域的研究热点。
近年来，随着纳米技术的发展，新型的纳米硒制剂生物活性的发现，纳米硒材料的研制引起了科研者的关注。在无机纳米硒研究方面，纳米单质硒的研究在肿瘤预防和治疗等方面显示出极大的优势。但是传统观念认为，零价硒很难被吸收利用，且纳米单质硒极易聚集沉淀，导致其抗肿瘤活性因纳米尺度的改变大大降低，这就限制了纳米单质硒发展成为新型的抗肿瘤药物。
因此，开发新型形态的含硒物质，特别是开发介于亚硒酸钠和纳米单质硒化学形态之间的含硒无机纳米微球，具有较好的前景，也面临着较高的挑战。
技术实现要素：
针对现有技术的缺点，本发明的目的之一在于提供一种抗肿瘤无机含硒纳米颗粒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)向氯化钙和肌醇六磷酸的混合水溶液中加na2seo3·5h2o，调节ph至2.3，溶液澄清后置于顶部留有细孔的密闭容器中；
(2)将浓氨水置于另一个顶部留有细孔的密闭容器中；
(3)将步骤(1)和步骤(2)所得物置于同一个密闭干燥器中，于室温下反应至步骤(1)所述顶部留有细孔的密闭容器的底部有沉淀物产生，然后取所得沉淀物，洗涤、离心、干燥后即得所述抗肿瘤无机含硒纳米颗粒。
本发明通过实验摸索后，最终采用肌醇六磷酸有机小分子为模板剂，采用有机小分子肌醇六磷酸作为调控剂，制备得到了含硒无机纳米颗粒，所得含硒无机纳米颗粒可以有效控制硒的释放，实现了对肿瘤细胞的抑制作用，同时降低含硒颗粒对正常细胞的毒副作用。
肌醇六磷酸(即植酸)，它存在于天然的全谷食物中，如米、燕麦、玉米、小麦以及青豆等。肌醇六磷酸以其盐的形式广泛存在于植物种子内，是对人体有益的营养品，在人体内可以水解为肌醇和磷脂，而肌醇具有抗衰老的作用，磷脂是人体细胞的重要组成部分。本发明采用其作为模板剂，使得本发明的原料具有易得、安全的优势。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中，所述氯化钙的浓度为0.01mol/l～0.1mol/l。
作为本发明进一步的优选方案，步骤(1)中，所述氯化钙与na2seo3·5h2o的物质的量之比为1。
作为本发明的优选方案，步骤(1)中，所述肌醇六磷酸在所述混合水溶液中的体积分数0.03％～0.3％。
在本发明的研究过程中，发明人发现，当水溶液中存在钙离子和亚硒酸根离子，且无肌醇六磷酸时，得到的亚硒酸钙为薄片状纳米颗粒；当加入肌醇六磷酸时，产物形貌发生变化。随着肌醇六磷酸加入量的增加，无机含硒纳米颗粒形貌由薄片状向球状过渡。当肌醇六磷酸加入的体积分数小于0.17％时，产物为薄片状和球形纳米颗粒共存。当加入体积分数大于等于0.17％时，产物为球形颗粒。
在实际工作中，为了便于反应，步骤(1)中，所述溶液澄清后，静置过夜以去除溶液中的气泡。
步骤(3)中，于室温下反应2～48小时。
作为本发明的优选方案，步骤(3)中，进行所述干燥时，干燥温度为80℃。
本发明的另外一个目的在于提供由上述方法制备得到的抗肿瘤无机含硒纳米颗粒，其为薄片状纳米颗粒、薄片状与球形纳米颗粒的混合物或球形纳米颗粒。
本发明还有一个目的在于提供上述抗肿瘤无机含硒纳米颗粒在制备抗肿瘤药物方面的应用，所述肿瘤包括乳腺瘤，肝瘤和食管瘤。
本发明的有益效果：
1、本发明所得的无机含硒纳米颗粒的形态介于亚硒酸钠和纳米单质硒化学形态之间，可实现对硒的有效控制释放；
2、本发明所得的无机含硒纳米颗粒可以显著抑制肿瘤细胞的增值；
3、本发明的无机含硒纳米颗粒的制备工艺简单，原料易得、安全，具有良好的实际应用前景。
附图说明
图1为本发明所获得实施例3中所获得的无机含硒微球的扫描电镜图；其中(a)中无肌醇六磷酸添加，(b)中的肌醇六磷酸添加量为0.03％(v/v)，(c)中的肌醇六磷酸添加量为0.17％(v/v)；
图2不同样品在磷酸盐缓冲液中的硒离子释放曲线；其中a：缓冲液ph＝7.4，b：缓冲液溶液ph＝5.8；p0为无肌醇六磷酸添加产物组，p1为肌醇六磷酸添加量为0.17％(v/v)产物组；
图3为cck-8法检测无机含硒纳米颗粒对正常细胞(het-1a，人食管上皮细胞)和肿瘤细胞(eca-109，人食管癌细胞)增值的抑制作用曲线图；其中control为无材料添加的空白对照组，noip6为无肌醇六磷酸添加的产物组，ip6-0.03％为肌醇六磷酸添加量为0.03％(v/v)的产物组，ip6-0.17％为肌醇六磷酸添加量为0.17％(v/v)的产物组，ip6-0.3％为肌醇六磷酸添加量为0.3％(v/v)的产物组；
图4为不同样品与肿瘤细胞共培养的活死细胞染色结果图；其中，(a)为无材料添加的空白对照组，(b)无肌醇六磷酸添加组，(c)肌醇六磷酸添加量为0.17％(v/v)组；
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
i、将cacl2溶于蒸馏水中，加入一定量的肌醇六磷酸，搅拌均匀。
ii、往步骤i中加入na2seo3.5h2o，溶解后，通过加入hno3或naoh将溶液的ph调节至2.3。搅拌澄清后转入锥形瓶中，放置过夜以除去气泡，然后用铝箔封口，针刺若干小孔。另一方面取浓氨水置于锥形瓶中，铝箔封口后刺若干小孔。将上述两个锥形瓶同时置入干燥器中，密封，室温下反应2天。
iii、反应结束后，倾倒上清液，取下层沉淀物，将沉淀物洗涤，离心，80℃干燥即得无机含硒纳米颗粒。
上述方案中，cacl2浓度为0.1mol/l，na2seo3.5h2o浓度为0.1mol/l。肌醇六磷酸(浓度为50％)在水溶液中的体积百分比为0.17％。
实施例2
除了cacl2浓度为0.05mol/l，na2seo3.5h2o浓度为0.05mol/l，肌醇六磷酸(浓度为50％)在水溶液中的体积百分比为0.17％之外，其余与实施例1一致。
实施例3
除了cacl2浓度为0.01mol/l，na2seo3.5h2o浓度为0.01mol/l，肌醇六磷酸(浓度为50％)在水溶液中的体积百分比为0.17％之外，其余与实施例1一致。
对比例1～3
除了在步骤(1)中不添加肌醇六磷酸之外，其余分别与实施例1～3一致。
实验例1
对实施例3所得无机含硒纳米颗粒进行扫描电镜、离子释放、细胞毒性、肿瘤细胞抑制能力方面的测试，结果如图1至图4所示。
如图1所示，当肌醇六磷酸在水溶液中的体积分数为0.17％时，所得无机含硒纳米颗粒的形状为球形，可更利于相应制剂的制备。
如图2所示，含硒纳米颗粒在微酸性环境中较中性环境中释放加快，且添加肌醇六磷酸更利于控制硒离子的释放速度。
从图3和图4可知，本发明所得无机含硒纳米颗粒对肿瘤细胞具有显著的抑制作用。