本发明属于中药制备领域，尤其涉及一种消渴降糖胶囊的制备方法。
背景技术：
目前，消渴降糖胶囊的提取工艺仍以煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法等传统方法为主，其主要原因是操作简便，对工艺、设备的要求不高，但传统方法提取时间长、能耗大、杂质多等缺点，已经限制了提取工艺的现代化进程。
在近年的提取工艺中，逐渐出现采用CO2超临界萃取法的方式，但是该反应需在高温高压的条件下进行，对设备要求相当高且能耗巨大，操作不易。
微波-超声波联合提取方法这种技术正是随着现代科学的发展，越来越受到重视，在提取工艺中得到应用。其提取过程方法简便、高效节能、且提取物纯度高，日益显示其优越性。同时，我们也看到，新技术新设备目前在应用上有一定局限性，发展很不平衡，这就需要我们结合生产实际，对其工艺流程、设备条件等影响因素等进行全面细致的研究与探索，逐步提高产品质量和工艺水平，推进生产产品的现代化进程。超声波-微波协同提取新技术将超声与微波两种作用方式相结合，充分利用超声波振动的空化作用以及微波的高能作用，克服了常规超声波和微波提取之不足，实现了低温常压条件环境下，对固体样品进行快速、高效、可靠的预处理。
因此，利用微波-超声波联合提取方法研究一种适用于消渴降糖胶囊二次开发的新工艺，对本领域技术人员来说具有十分重要的意义。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种消渴降糖胶囊的制备方法，本发明仅使用超声波与微波这两种能耗较低的提取方法，操作简便，能耗低，更利于工业生产。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种消渴降糖胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，通过超声波-微波联合辅助提取，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液采用大孔吸附树脂柱进行吸附，依次用水、乙醇洗柱，得到乙醇洗脱液；
(4)将所述步骤(3)后得到的乙醇洗脱液进行减压浓缩、干燥，得到的粉末装入胶囊壳，即得到所述的消渴降糖胶囊。
超声波能产生强烈振动，并产生高速度、强烈的空化效应和搅拌作用，能破坏植物药材的细胞，使溶媒渗透到药材细胞中，从而加速药材中的有效成分溶解，提高有效成分的提取率。与传统提取法相比，超声提取不会改变有效成分的结构，并且提取方法操作简单、提取时间短、得率高、无需加热等优点。微波辅助提取是利用微波能来提高提取效率的新技术，微波加热属内部加热过程，经过微波辐射后能富集药材中有效成分，具有选择性高、操作时间短、溶剂耗量少、有效成分得率高的特点。本发明的番石榴叶主要为黄酮类物质，微波加热并不会影响它的活性。超声-微波协同萃取新技术及装置将直接超声振动与开放式微波两种作用方式相结合，充分利用超声波振动的空穴作用以及微波的高能作用，克服了常规超声波和微波萃取之不足。具有速度快、能耗小、溶剂用量小，回收率高等优点外，还有利于极性和热不稳定性组分的萃取，避免长时间高温高压条件下萃取或合成反应引起的分解，从而不破坏所萃取的有机物分子的结构。
大孔吸附树脂(MAR)由可聚合单体、交联剂等可聚合成分与致孔剂、分散剂等添加剂经悬浮或反相悬浮聚合反应制备而成，它是一种不含交换基团，且有大孔结构的高分子吸附分离材料。MAR具有吸附容量大、一定的选择性、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点。MAR的品种很多，不同MAR对不同物质的选择性也有差异。MAR的选择性不仅表现在对某些物质吸附程度的差别，有时还直接表现为对目标物质的吸附与这样，MAR可用于对混合物的分离、纯化。吸附树脂对混合物的分离原理可分为：
(1)物理吸附：选择性差，分离纯度不高；
(2)键合吸附：吸附选择性很高，使用特殊的吸附树脂，使被吸附的物质
与树脂上的官能团进行键合，从而实现与不能键合的物质相分离；
(3)化学吸附：不常用于分离，多用于分析；
(4)筛分作用：MAR的筛分作用源于其中相互贯通的孔结构。与无机分子筛的筛分作用相类似，直接根据分子大小与孔径的匹配程度对物质进行分离。但MAR对有机物具有良好的吸附能力。具有筛分作用的MAR，其孔径较小，只能吸附分子尺寸较小的有机物，在一定情况下可用于分离分子尺寸不同的物质。
上述的制备方法，优选的，所述步骤(1)中，过筛为过40目筛。
优选的，所述步骤(2)中，超声波-微波联合辅助提取采用乙醇为浸提剂，番石榴叶与浸提剂的料液比为1:15-1:20g/mL。
优选的，所述步骤(2)中，超声波的时间为30min，超声波的功率为500-600W。
优选的，所述步骤(2)中，微波的时间为2-3min，微波的功率为200-300W。
优选的，采用聚苯乙烯型极性大孔吸附树脂柱进行吸附，所述吸附的具体操作步骤如下：首先对大孔吸附树脂进行预处理，然后树脂上柱，样液上柱，经大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理。
优选的，所述步骤(3)中，乙醇为体积浓度为70-95％的乙醇。
优选的，所述步骤(4)中，胶囊壳以明胶为主要成型材料，加入甘油和山梨醇，通过溶胶、蘸胶制坯、干燥、拔壳、截割及整理后制成。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明的制备方法通过超声波-微波联合辅助技术对番石榴叶进行提取，比传统热水浸提具有耗时短、效率高等优势，由超声波、微波技术协同作用，其超声和微波功率、时间、温度都为可控状态，有效提高番石榴叶中有效成分的收率，提取得到的番石榴叶提取物经过检测，收率平均在90％以上，制备得到的消渴降糖胶囊进行了3个月的初步室温稳定性考察，产品性状、鉴别、含量等均与0月相比没有明显改变，表明通过本发明制备得到的消渴降糖胶囊工艺稳定，产品性状稳定，质量可控，制备得到的消渴降糖胶囊具有较好的降血糖效果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的消渴降糖胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过40目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，采用乙醇为浸提剂，番石榴叶与浸提剂的料液比为1:20g/mL，通过超声波-微波联合辅助提取，超声波的时间为30min，超声波的功率为600W，微波的时间为3min，微波的功率为200W，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液通过聚苯乙烯型中、低极性大孔吸附树脂柱进行吸附，首先对大孔吸附树脂进行预处理，然后树脂上柱，样液上柱，经大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理，然后依次用水、体积浓度为70-95％％的乙醇洗柱，得到乙醇洗脱液；
(4)空气净化条件下，将所述步骤(3)后得到的乙醇洗脱液进行减压浓缩、干燥，得到的粉末装入胶囊壳，药物填充，套合、封口，胶囊剂的整理与抛光，包装，质检，成品，即得到所述的消渴降糖胶囊。
所述胶囊壳以明胶为主要成型材料，加入甘油和山梨醇，通过溶胶、蘸胶制坯、干燥、拔壳、截割及整理后制成。
本发明制备得到的消渴降糖胶囊，分别采用福林酚检测法检测多酚类物质的含量，采用硝酸铝检测法检测黄酮的含量，采用紫外分光光度法检测萜类物质的含量。
福林酚检测法：
以没食子酸为标准品，采用Folin-ciocalteu(福林-酚，FC)法测定标准曲线。准确称取没食子酸0.0100g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，得到浓度为0.1mg/ml的没食子酸标准液，准确吸取0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8ml置于50ml的棕色容量瓶中，分别加入福林-酚试剂4.0ml，混匀，在0.5-5min内加入4ml的10％Na2CO3溶液，充分摇匀后定容，室温下于避光处放置l h，以蒸馏水代替标准液作为空白对照，在760nm波长下测定其吸光度值，每个样品平行测定三次。以没食子酸在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
福林-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐在碱性条件下可被酚类化合物还原，产生深蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，碳酸钠溶液主要用于提供碱性环境。由于福林酚试剂中含有H+，加入碳酸钠溶液后会产生CO2气泡，CO2过多可能在酶标仪微孔板上产生气泡，影响吸光度的测定，所以碳酸钠溶液应当适量，并在加入碳酸钠溶液后充分震荡，使气泡释放完全。
福林-酚试剂制备方法如下：于250ml圆底烧瓶中，加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)20g，钼酸钠(NaMoO4·2H2O)5g，蒸馏水100ml，溶解摇匀。再加入85％的磷酸10ml，浓盐酸20ml，文火回流2h。冷却后除去回流装置，加入硫酸锂(Li2SO4)3g，摇匀，加入几滴液溴，再煮沸15min，以除去残溴及除去其颜色，溶液应呈浅黄色，澄清无浑浊。若溶液有绿色，则再加数滴液溴，之后煮沸除去。试剂冷却后定容至250ml，置于棕色瓶中保存。溴水的氧化力低于液溴，且氧化力较低，若使用溴水进行试剂配制应适当多加，如加入15ml溴水等。回流2h后必须冷却再加入硫酸锂，防止暴沸。福林-酚试剂仅在酸性条件下稳定，当加入福林-酚试剂时，必须立即混匀，使还原反应在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏前完成，否则显色程度将会减弱，影响实验结果。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml，用移液枪准确吸取0.1ml提取液于10ml比色管中，加入1ml福林-酚试剂，0.5min-8min内加入1ml 10％碳酸钠溶液，蒸馏水定容，摇匀后于暗处放置1h。以蒸馏水代替提取液配置空白溶液，在760nm波长处测定样品溶液的吸光值。
硝酸铝检测法：
以芦丁为标准品，采用硝酸铝显色法测定标准曲线。准确称取芦丁0.0200g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，得到质量浓度为0.2mg/ml的标准液，准确吸取0，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8ml置于10ml比色管中，先加入50g/L的亚硝酸钠溶液0.2ml，振荡混匀，6min后加入0.2ml 100g/L的硝酸铝溶液，充分混合，6min后加入1ml 40g/L的NaOH溶液，定容至10ml，以不加标准液的溶液为空白对照，在500nm波长下测定吸光度值，每个样品平行测定三次。以芦丁标准品在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
硝酸铝显色法测定总黄酮的原理为：在亚硝酸钠存在的中性或弱碱性溶剂中，黄酮类化合物可与铝盐反应生成螯和物，加入NaOH溶液后，反应体系显红橙色，在500nm波长处有吸收峰，可根据定量分析的比尔定律来计算相应的黄酮浓度。在使用该法测定黄酮含量时，应注意黄酮浓度不应过大，否则易形成红橙色沉淀，致使分光度值测定不准确。有文献报道，使用氯化铝代替硝酸铝可避免沉淀形成。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml，用移液枪吸取0.4ml于10ml比色管中，加入0.2ml 50g/L NaNO2溶液，振荡摇匀，6min后加入50g/L Al2NO3溶液，振荡摇匀，静置6min后加入1ml 40g/L NaOH溶液，振荡，加蒸馏水定容，摇匀后在500nm波长处测定样品溶液的吸光值，以上述方法配置空白溶液，计算样品中黄酮含量。
紫外分光光度法：
以熊果酸为标准品，使用5％香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法测定萜类含量。方法如下：精确称量20mg标准品，置于100ml容量瓶中，加入冰乙酸溶解定容，精密吸取供试品溶液各0ml、0.5ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml置于10ml比色管中，水浴蒸干，再分别加入0.4ml 5％香草醛-冰乙酸和1.6ml高氯酸，置于65℃条件下水浴45min。之后加入3ml或7ml冰醋酸，摇匀，在548nm处测定溶液吸光度，以不加标准液的溶液为空白对照，以熊果酸在反应体系中的质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
取1g番石榴叶干粉，加入溶剂后回流提取，番石榴叶乙醇提取液用蒸馏水定容至100ml，用移液枪吸取0.1ml于10ml比色管中，加入0.4ml 5％香草醛-冰乙酸和1.6ml高氯酸，置于65℃条件下水浴45min。之后加入冰醋酸定容，摇匀，在548nm处测定溶液吸光度，以不加提取液的溶液为空白对照，摇匀后在500nm波长处测定样品溶液的吸光值，计算样品中萜类含量。该测定过程为无水测定，有水混入则结果不准确。
经多次平行实验测定，得到黄酮、多酚和萜类三种物质检测的标准曲线如下：
多酚：y＝0.1119x+0.0015(R2＝0.99934，x:没食子酸浓度μg/L，y:Ab)
黄酮：y＝0.01411x+0.00021(R2＝0.99919，x:芦丁浓度μg/L，y:Ab)
萜类：y＝0.04844x+0.01559(R2＝0.99924，x:熊果酸浓度μg/L，y:Ab)
经测量，消渴降糖胶囊中多酚、黄酮和萜类物质的含量，按质量百分数分别为7.23％，6.19％和3.56％。
评价消渴降糖胶囊对2型糖尿病的降血糖作用：使用db/db糖尿病小鼠作为实验对象，用消渴降糖胶囊对小鼠每日给予灌胃，共4周，每周测量各组空腹血糖的变化情况。结果显示，与灌胃2周时的血糖(18.0mol/L)相比，灌胃4周后小鼠血糖明显下降(15.0mol/L)
通过超声波-微波联合辅助技术对番石榴叶进行提取，经过检测，提取物的收率平均在90％以上；进行了3个月的初步室温稳定性考察，消渴降糖胶囊的性状、鉴别、含量等均与0月相比没有明显改变。表明工艺稳定，产品性状稳定，质量可控。
实施例2：
一种本发明的消渴降糖胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过40目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，采用乙醇为浸提剂，番石榴叶与浸提剂的料液比为1:20g/mL，通过超声波-微波联合辅助提取，超声波的时间为30min，超声波的功率为500W，微波的时间为2min，微波的功率为300W，经纱布过滤去除残渣收集提取液；
(3)将所述步骤(2)收集后得到的提取液通过聚苯乙烯型中、低极性大孔吸附树脂柱进行吸附，首先对大孔吸附树脂进行预处理，然后树脂上柱，样液上柱，经大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理，然后依次用水、体积浓度为70-95％的乙醇洗柱，得到乙醇洗脱液；
(4)空气净化条件下，将所述步骤(3)后得到的乙醇洗脱液进行减压浓缩、干燥，得到的粉末装入胶囊壳，药物填充，套合、封口，胶囊剂的整理与抛光，包装，质检，成品，即得到所述的消渴降糖胶囊。
所述胶囊壳以明胶为主要成型材料，加入甘油和山梨醇，通过溶胶、蘸胶制坯、干燥、拔壳、截割及整理后制成。
测量了消渴降糖胶囊中多酚、黄酮和萜类物质的含量，按质量百分数分别为7.12％，6.29％和3.47％。
评价消渴降糖胶囊对2型糖尿病的降血糖作用：使用db/db糖尿病小鼠作为实验对象，用消渴降糖胶囊对小鼠每日给予灌胃，共4周，每周测量各组空腹血糖的变化情况。结果显示，与灌胃2周时的血糖(21.0mol/L)相比，灌胃4周后小鼠血糖明显下降(17.0mol/L)。
得到的番石榴叶提取物经过三批中式初步研究，收率平均在90％以上；初步质量控制研究，包括(1)黄酮类化合物的盐酸-镁粉显色反应；(2)番石榴叶对照药材和槲皮素对照品的薄层色谱鉴别；(3)HPLC发槲皮素含量测定，方法学的阴性干扰、线性关系、加样回收考察；
进行了3个月的初步室温稳定性考察，产品性状、鉴别、含量等均与0月相比没有明显改变。表明工艺稳定，产品性状稳定，质量可控。
对比例：
一种消渴降糖胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶洗净后烘干、粉碎成粉末后，过40目筛；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，采用乙醇为浸提剂，番石榴叶与浸提剂的料液比为1:20g/mL；
(3)在60℃的条件下回流3次，每次3h，过滤，滤去粉末滤渣，得到番石榴叶乙醇提取物；
(4)空气净化条件下，将所述步骤(3)后得到的乙醇洗脱液进行减压浓缩、干燥，得到的粉末装入胶囊壳，药物填充，套合、封口，胶囊剂的整理与抛光，包装，质检，成品，即得到所述的消渴降糖胶囊。
测量了消渴降糖胶囊中多酚、黄酮和萜类物质的含量，按质量百分数分别为4.12％，2.29％和1.47％。
评价消渴降糖胶囊对2型糖尿病的降血糖作用：使用db/db糖尿病小鼠作为实验对象，用消渴降糖胶囊对小鼠每日给予灌胃，共4周，每周测量各组空腹血糖的变化情况。结果显示，与灌胃2周时的血糖(20.0mol/L)相比，灌胃4周后小鼠血糖并未明显下降(19.0mol/L)。