本发明属于纳米材料领域，涉及一种cpg药物及其制备方法和应用。
背景技术：
免疫治疗目前被认为是继放疗，化疗及手术后第四大肿瘤治疗方法，通过激活肿瘤患者的免疫系统能够实现对肿瘤的有效杀伤和治疗。其中很多已经进入临床试验，但是其中只有少部分获得了fda批准。其中一个重要原因是患者的差异以及肿瘤的异质性，肿瘤免疫治疗能在部分患者体内能起到非常好的治疗作用而对于有的患者则没有明显的治疗效果；另一方面，则是由于免疫疗法需要调动机体的免疫系统，容易出现系统性的副作用。
tlr9寡聚核苷酸是一类具有典型鸟嘌呤-胞嘧啶二核苷酸序列的核苷酸片段，20世纪90年代就被发现，而且一直备受关注，该种序列具有很好的免疫刺激作用。在免疫佐剂、抗肿瘤和抗感染等方面发挥的作用也在逐渐被揭示。在cpg的抗肿瘤治疗研究中发现，cpg往往是作为一类非特异性的免疫调节剂联合其他药物进行使用；由于其对机体免疫系统强烈的刺激作用，在安全剂量下显示出来的治疗效果相对有限；而且其在体内循环的稳定性也并不如人意，相比于系统递送，cpg直接递送至肿瘤部位能产生更明显的治疗效果。因此，cpg在近些年的研究和应用进展比不显著。
针对这些问题，一些cpg的药物递送体系也逐渐被开发，但其设计都是从材料学的角度切入，缺乏对改造后的cpg的性质探索，以及对cpg应用的对接。
cn103789315a公开了一种疫苗和肿瘤免疫治疗给药系统领域的peg修饰的cpg寡核甘酸及其应用，通过peg将cpg进行修饰，但是此设计的应用有限，仅局限于应用在免疫调节剂方面的作用，不利于进一步推广应用。
cn103861118a公开了一种石墨烯-cpg制备方法，将功能化的石墨烯与寡核苷酸cpg结合，制备出的产品可明显抑制乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的生长，此方法对于cpg的应用也仅仅局限于乳腺肿瘤和结直肠肿瘤的药物中的应用，缺乏对于应用的进一步对接。
cn104127886a公开了一种cpg核酸药物输送系统，包含载体及储存在所述载体中的cpg核酸药物，1mg所述载体中储存有50～155μg的所述cpg核酸药物，其中，所述载体为用氨基硅烷偶联剂修饰的介孔氧化硅纳米颗粒，颗粒粒径为50nm～100nm，介孔孔径为2nm～15nm，所述cpg核酸药物为cpg寡脱氧核苷酸，含有12～72个碱基对，此方法也是仅仅从材料学的角度切入，缺乏对于改造后的cpg相关应用的进一步开发。
因此，如何打破cpg固有的作为免疫佐剂的应用范围，拓展其直接作为药物的应用，这对于cpg药物的开发具有非常重要的意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种cpg药物及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种cpg药物，所述cpg药物包括载体、多肽和cpg，所述载体与多肽相连接，所述cpg负载于载体上。
本发明提供的cpg药物，通过将cpg负载于载体上，连接多肽，实现功能化，通过被动靶向和肿瘤微环境的epr效应，实现药物在肿瘤部位的富集，并且在肿瘤病灶部位，酶的高表达触发的药物递送，实现了高效低毒的递送效果。
cpg高效低毒地递送到肿瘤微环境区域，一方面解决了cpg在体内的稳定性差的问题，另一方面，也减少了cpg在体内由于非特异性免疫效应产生的副作用；在高效低毒地递送cpg的基础上，其抗肿瘤相关的生物学功能也能得到进一步探究。
在本发明中，通过cpg介导tlr9阳性肿瘤细胞的自噬，导致肿瘤死亡，从而产生治疗效果；此外，由于cpg本身还能激活体内的固有免疫细胞，进而增强免疫监控，实现对肿瘤更好的杀伤，相比于现有依赖于纳米材料的cpg药物运送策略，本发明不拘泥于纳米材料，并且特异性作用于tlr9阳性肿瘤细胞。
在本发明中，cpg即为cpg-odn，指的是非甲基化cpg寡核苷酸。
优选地，所述载体包括无机金属材料、无机非金属材料或有机高分子材料中的任意一种或至少两种的组合，优选为有机高分子材料。
在本发明中，优选使用有机高分子材料，对于cpg的递送效果更好。
优选地，所述无机金属材料包括金纳米颗粒、银纳米颗粒，四氧化三铁纳米颗粒或金属框架材料中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述无机非金属材料包括介孔硅、碳纳米管或石墨烯中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述有机高分子材料包括水凝胶、脂质体、聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯或聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述有机高分子材料为聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯和/或聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯。
进一步优选地，所述有机高分子材料为聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的组合。
在本发明中，通过使用聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯共组装形成胶束，作为cpg的载体，相比于其他材料，共组装的胶束能实现对cpg的动态保护，即血液循环或者未到达肿瘤部位的时候，cpg是被聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯保护起来无法暴露的，到达肿瘤部位后，由于特异性酶切导致聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯亲疏水性质改变，相变温度变低，聚合物分子塌缩，因此将cpg分子暴露出来，整个过程对cpg具有动态保护作用。
在本发明中，通过活性/可控自由基聚合的方法合成共组装胶束，优选使用可逆加成-断裂链转移聚合(raft)的方法，其中raft聚合的链转移试剂包括n,n'-二甲基n,n'-二(4-吡啶基)秋兰姆二硫化物、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、双(十二烷基硫烷基硫代羰基)二硫化物、2-氰基-2-丙基十二烷基三硫代碳酸酯、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸、氰甲基十二烷基三硫代碳酸酯、2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯、氰甲基甲基(苯基)氨基二硫代甲酸酯、甲基-2-丙酸甲基(4-吡啶)氨基二硫代甲酸酯、2-氰基-2-丙基苯并二硫、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、甲基-2-(十二烷基三硫代碳酸酯)-2-甲基丙酸酯或2-苯基-2-丙基苯并二硫中的任意一种，进一步优选2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸。
在本发明中，聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的结构如式i所示，所述聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的结构如式ii所示：
其中，式i与式ii中x的值均独立地选自1-80(例如可以是1、10、20、30、40、50、60、70或80)，式i与式ii中y的值均独立地选自100-1000(例如可以是100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000)，且满足y与x的比值为5-50。
优选地，式i中x为31，y为155。
优选地，所述聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的分子量为5-50kd，例如可以是5kd、10kd、15kd、20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd或50kd，优选35kd。
优选地，式ii中x为35，y为246。
优选地，所述聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的分子量为5-50kd，例如可以是5kd、10kd、15kd、20kd、25kd、30kd、35kd、40kd、45kd或50kd，优选为20kd。
在本发明中，x和y的取值均为整数值，并且优选为上述取值，才能形成良好的胶束结构。
优选地，所述多肽为亲疏水性质转变多肽。
优选地，所述亲疏水性质转变多肽的序列为gplgvrgsss、gplgvrgsssss或gplgvrgsssssss中的任意一种或至少两种的组合，优选为gplgvrgsssssss。
在本发明中，plgvrg底物序列是已知多肽。s是丝氨酸，具有羟基，有较好的亲水性而且正常生理条件下没有明显的正负电荷干扰，通过调节s的个数，可以在避免电荷等因素的干扰下，单纯地调节多肽的亲水性质，即聚合物的相变温度。
在本发明中，gplgvrg中的第一个氨基酸g是起到间隔的作用，避免聚合物与功能肽段太近，产生影响。
在本发明中，多肽亲水性质的改变可以调节聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯中的n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯单体的相转变温度，实现cpg的保护与暴露；此外，亲疏水性改变的触发因素是由肿瘤部位特异性的微环境引起的，包括肿瘤微环境中过表达的mmp家族、肿瘤相关层纤维细胞膜过表达的蛋白酶fap-α；进一步为肿瘤弱酸性微环境等。
进一步地，亲疏水性改变的触发因素是具有肿瘤微环境特异性的过表达酶，例如mmp，底物响应序列为plgvrg，fap-α响应序列gpa；进一步优选为肿瘤微环境特异性的过表达酶为基质金属蛋白酶mmp-2，底物序列为plgvrg。
优选地，所述cpg负载于载体的方式包括共价负载和/或非共价负载。
优选地，所述cpg负载于载体的方式为非共价负载。
在本发明中，非共价修饰对cpg结构产生的干扰更小，负载率可达到45.89％-53.33％，而如果使用其他的负载方式，cpg药物活性可能会受到影响。
在本发明中，cpg的非共价负载是通过非共价的静电吸附的形式进行负载。
在本发明中，可以通过多肽的电荷性质调节聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的电性，进而调节其对cpg药物负载能力，多肽序列可以为grdrgrs、grrdrgrs或grrrdrgrs；优选的多肽序列为grrrdrgrs。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的cpg药物的制备方法，所述制备方法包括将载体与多肽反应形成载体-多肽连接物，继续将载体多肽连接物进行共组装形成胶束，而后将cpg于溶剂中负载于胶束上得到所述cpg药物。
优选地，所述载体与多肽的质量比为1:200-1000，例如可以是1:200、1:300、1:400、1:500、1:700、1:900或1:1000。
优选地，所述cpg与载体的摩尔比为1:600。
在本发明中，首先将多肽进行合成，而后合成载体，载体与多肽的连接在pb缓冲液中，氮气保护下进行，然后进行透析、热沉淀得到载体-多肽连接物，而后将载体-多肽连接物溶于二甲基亚砜中，并缓慢向溶液中加入水，进行自组装，而后再进行透析，得到载体-多肽连接物胶束，最后向胶束中加入cpg溶液、经过搅拌、透析得到所述cpg药物。
第三方面，本发明提供了一种cpg药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的cpg药物与自噬诱导剂。
在本发明中，cpg药物与自噬诱导剂联用无需明确配比，但是需满足提前使用自噬诱导剂诱导自噬，然后使用有效剂量的cpg引发免疫反应，进而发挥药效。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的cpg药物或第三方面所述的cpg药物组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤包括肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、宫颈癌、神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、tlr9阳性肿瘤或tlr9阴性肿瘤中的任意一种。
优选地，所述肿瘤为tlr9阳性肿瘤。
本发明提供的cpg药物对tlr9阳性肿瘤细胞具有较好的杀伤效果，而且cpg联合自噬诱导剂雷帕霉素在tlr9阴性肿瘤中也有类似于toll样受体9阳性肿瘤细胞的治疗效果。
本发明通过这种药物设计，更好地开发了cpg药物分子的新功能。一方面，通过区分肿瘤类型，明确了cpg在肿瘤治疗中的应用，符合“精准医疗”的肿瘤治疗理念；另一方面，通过对功能的解读，拓展了cpg在肿瘤治疗中的作用，打破了肿瘤表面受体的差异性对治疗效果的限制，丰富了cpg药物功能，为其进一步发展提供了新方向。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的cpg药物，通过将cpg负载于载体上，连接多肽，实现功能化，通过被动靶向和肿瘤微环境的epr效应，实现药物在肿瘤部位的富集，并且在肿瘤病灶部位，酶的高表达触发的药物递送，实现了高效低毒的递送效果。
cpg高效低毒地递送到肿瘤微环境区域，一方面解决了cpg在体内的稳定性差的问题，另一方面，也减少了cpg在体内由于非特异性免疫效应产生的副作用；在高效低毒地递送cpg的基础上，其抗肿瘤相关的生物学功能也能得到进一步探究。
本发明开发了cpg药物分子的新功能。一方面，通过区分肿瘤类型，明确了cpg在肿瘤治疗中的应用，符合“精准医疗”的肿瘤治疗理念；另一方面，通过对功能的解读，拓展了cpg在肿瘤治疗中的作用，打破了肿瘤表面受体的差异性对治疗效果的限制，丰富了cpg药物功能，尤其对于tlr9阳性肿瘤细胞具有较好的杀伤效果，而且cpg联合自噬诱导剂雷帕霉素在tlr9阴性肿瘤中也有类似于toll样受体9阳性肿瘤细胞的治疗效果，为其进一步发展提供了新方向。
附图说明
图1是本发明是实施例1中制备的聚n-异丙基丙烯酰胺和聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的核磁共振氢谱图谱。
图2是本发明实施例1中制备的n-羟乙基丙烯酰胺和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的核磁共振氢谱图谱。
图3是本发明实施例2中tlr9阳性肿瘤细胞b16和tlr9阴性肿瘤细胞llc1在被不同剂量的不同分子作用24小时后的细胞存活率。
图4是本发明实施例2中细胞被不同分子处理后胞内lc3bii蛋白的表达量变化图。
图5是本发明实施例2中细胞被分子4与自噬诱导剂联合处理后的细胞生存率。
图6a是本发明实施例3中tlr9阳性肿瘤b16荷瘤鼠在被不同分子治疗处理后，结束治疗时的肿瘤体积大小图。
图6b是本发明实施例3中和tlr9阴性肿瘤llc1荷瘤鼠在被不同分子治疗处理后，结束治疗时的肿瘤体积大小图。
图7a是本发明实施例3中tlr9阳性肿瘤荷瘤鼠在被不同分子治疗处理后肿瘤的生长状况曲线图。
图7b是本发明实施例3中tlr9阴性肿瘤荷瘤鼠在被不同分子治疗处理后肿瘤的生长状况曲线图。
图8a是本发明实施例3中tlr9阳性肿瘤荷瘤鼠在被分子4治疗处理后肿瘤组织的自噬标志物lc3bii的表达情况图。
图8b是本发明实施例3中tlr9阴性肿瘤荷瘤鼠在被分子4治疗处理后肿瘤组织的自噬标志物lc3bii的表达情况图。
图9a是本发明实施例4中tlr9阳性肿瘤荷瘤鼠在被分子4和自噬诱导剂联合治疗处理后肿瘤的生长状况曲线图。
图9b是本发明实施例4中tlr阴性肿瘤荷瘤鼠在被分子4和自噬诱导剂联合治疗处理后肿瘤的生长状况曲线图。
图10是本发明提供的cpg药物作用于细胞过程示意图。
在本发明的附图中，图3、图4、图6a、图6b、图7a和图7b中均涉及到的编号：c为对照组；1为分子1；2为分子2；3为分子3；4为分子4。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
在本发明以下实施例中，为了方便描述，具有微环境响应性但是没有负载任何药物的胶束分子命名为分子1，不具有微环境响应性但负载了药物分子的胶束命名为分子2(对照本发明所述cpg药物，仅亲疏水性质调节多肽gplgvrgsssssss更换为gpmgmrgsssssss，其余不变)，具有微环境响应性但负载的是对照药物分子的胶束命名为分子3(对照本发明所述cpg药物，仅cpg由cpg1826更换为cpg2138，其余不变)，具有微环境响应性且负载了药物的胶束分子命名为分子4；其中药物分子为cpg，未做任何修饰；剂量指的是药物分子cpg的浓度。
其中微环境响应性为聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物共组装胶束。
实施例1
本实施例通过以下步骤制备cpg药物
(1)多肽的合成：合成亲疏水性质不同的mmp-2底物多肽，通过调节多肽c端亲水氨基酸丝氨酸的个数来调节多肽亲疏水性质，合成序列分别为gplgvrgsss，gplgvrgsssss，gplgvrgsssssss的三段多肽。
(2)聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯的合成
聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯：将n-异丙基丙烯酰胺加入到圆底烧瓶中，然后加入2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯及偶氮二异丁腈，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，浓度为1.5g/ml，搅拌溶解后，密封体系，通入氮气30分钟，恒温65℃反应10小时；将反应后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末状固体。通过核磁确定聚合物结构及分子量。
将丙烯酸甲酯加入到圆底烧瓶中，然后加入获得的聚n-异丙基丙烯酰胺及偶氮二异丁腈，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，浓度为1.5g/ml，搅拌溶解后，密封体系，通入氮气30分钟，恒温65℃反应10小时；将反应后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末状固体。通过核磁确定聚合物结构及分子量。
结构表征如图1所示，通过图1可知，聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯合成成功。
聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯：将聚n-羟乙基丙烯酰胺加入到圆底烧瓶中，然后加入2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸及偶氮二异丁腈，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，浓度为1.5g/ml，搅拌溶解后，密封体系，通入氮气30分钟，恒温65℃反应10小时；将反应后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末状固体。通过核磁确定聚合物结构及分子量。
将丙烯酸甲酯加入到圆底烧瓶中，然后加入获得的聚n-羟乙基丙烯酰胺及偶氮二异丁腈，以n,n-二甲基甲酰胺(dmf)溶解，浓度为1.5g/ml，搅拌溶解后，密封体系，通入氮气30分钟，恒温65℃反应10小时；将反应后的溶液加入透析袋中，透析3天，冷冻干燥得到淡黄色粉末状固体。通过核磁确定聚合物结构及分子量。
结构表征如图2所示，通过图2可知，聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯合成成功。
(3)载体-多肽连接物的合成：
将多肽分子分别与步骤(2)中得到的聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯、聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯按照摩尔比1.2:1置于1mlph＝8.0的pb缓冲溶液中，并置于反应容器中，搅拌溶解，密封体系，通入氮气30分钟，恒温37℃反应3天；将反应后的溶液加入透析袋中，透析24小时，通过热沉淀的方法得到纯的温敏聚合物-多肽连接物，冷冻干燥得到粉末状固体。得到的聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物。
(4)胶束的制备和药物的负载
将聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物溶于二甲基亚砜(dmso)，通过注射泵向其中缓慢匀速的加入水溶液，持续搅拌3小时。将反应后的溶液加入透析袋中，透析12小时，即得到聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物共组装胶束。
将共组装胶束置于反应器并水浴加热分子4至40℃，向其中加入cpg溶液，搅拌12小时；将反应后的溶液加入透析袋中，室温透析12小时，即得到负载了药物cpg的聚n-异丙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物和聚n-羟乙基丙烯酰胺-b-甲基丙烯酸甲酯-多肽聚合物共组装胶束(分子4)，即cpg药物。
实施例1中制备的cpg药物作用于细胞过程示意图如图10所示。
实施例2
本实施例通过使用实施例1中得到的共组装胶束，测试诱导tlr9阳性肿瘤细胞的自噬性死亡
首先，使用tlr9阳性的b16肿瘤细胞和tlr9阴性的llc1肿瘤细胞为研究对象，观察不同分子在不同剂量下对tlr9受体表达具有差异性的肿瘤细胞杀伤效果。将b16和llc1细胞按6×103接种在96孔板中，在37℃以及5％co2的条件下待其贴壁和生长12小时；将药物及不同分子按照一定浓度梯度配制并加入培养基中(药物分子cpg浓度0.4μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、10μg/ml、20μg/ml)，再培养24小时；去除含有药物和不同药物分子的培养基，并用磷酸盐缓冲液(pbs)润洗细胞两次，去除培养基及药物分子的残留，再将cck-8试剂按照10％(v/v)浓度稀释于培养基，孵育2小时后用酶标仪检测各孔吸光值，根据公式i计算细胞生存率。
细胞生存率(％)＝(样品孔吸光值-空白孔吸光值)/(对照孔吸光值-空白孔吸光值)×100％............................................................公式i
胶束对tlr9阴性或者阳性的肿瘤细胞杀伤效果如图3所示(其中柱状图每一组测试数据中的6个柱形，从左至右依次代表0.4μg/ml柱、1μg/ml柱、2μg/ml柱、4μg/ml柱、10μg/ml柱、20μg/ml柱，图3中cpg指的是单独使用的cpg分子)，随着分子4浓度的升高，对tlr9阳性的肿瘤细胞主线表现出杀伤效果，而对于tlr9阴性的肿瘤细胞，则没有类似的剂量效应。单独的药物分子或者其他药物分子对细胞均没有明显的毒性作用。
由于cpg和tlr9信号通路的紧密相关性以及细胞自噬的产生，通过蛋白印迹实验检测了不同处理组细胞中自噬标志物蛋白lc3ii的表达，图4显示(其中图4中c代表对照组，具体为生理盐水)，在不同分子的处理下，细胞的自噬水平变化与tlr9受体的情况有关。在tlr9阳性肿瘤细胞中，相比于其他分子，分子4明显导致了自噬标志物蛋白lc3ii的升高，而对于tlr9阴性肿瘤细胞llc1细胞，其自噬标志物的变化并不明显。自噬水平的变化，表面tlr9受体情况及细胞存活率存在一定相关性，在tlr9阳性细胞中，自噬水平的升高伴随着细胞生存率的下降，而对于tlr9阴性细胞，药物分子并不会引起自噬水平的变化，其细胞生存率也无明显变化。
进一步通过分子4与自噬调控剂或凋亡抑制剂的联合使用，观察细胞生存率的情况，如图5所示(图5中柱状图每一组浓度中的柱，从左至右依次为分子4与hcqb16、分子4与rapallc1、分子4与z-vad-fmkb16、分子4与rapaz-vad-fmkb16)。对于tlr9阳性细胞，分子4联合自噬抑制剂羟化氯喹(hcq)处理细胞，抑制细胞的自噬效应；通过分子4联合凋亡抑制剂半胱天冬酶家族抑制剂(z-vad-fmk)处理细胞，抑制细胞凋亡效应；对于tlr9阴性细胞，通过分子4联合自噬诱导剂雷帕霉素(rapa)处理细胞，诱导细胞自噬效应；通过分子4联合自噬诱导剂rapa和z-vad-fmk处理细胞，诱导细胞自噬并去除其中凋亡产生的影响；通过分子4联用小分子药物调节细胞内的相关过程，结果显示对于tlr9阳性肿瘤细胞，分子4联合自噬抑制剂后加入细胞，细胞存活率相比单独使用分子4细胞存活率回升，而加入凋亡抑制剂后，分子4引起的细胞存活率下降没有变化。说明在tlr9阳性细胞中，分子4的确诱导了细胞自噬性的死亡。而对于tlr9阴性的肿瘤细胞，分子4联合的处理没有其细胞存活率的变化，其可能是tlr9受体水平较低，单独分子4无法有效地进入细胞，即使与小分子调节剂联用，仍不会产生明显的毒性效果。
实施例3
本实施例使用实施例1制备的cpg药物用于tlr9阳性肿瘤细胞的治疗测试
将b16肿瘤组织块和llc1肿瘤组织块接种于小鼠右后肢，约5天后，待小鼠接种的肿瘤长到大小约为200mm3开始进行肿瘤治疗。间隔一日静脉给药并检测肿瘤大小，所给药物为满足上述方法实施并制备的分子4，同时给予其他组小鼠对照药物分子(对照药物分子包括图中的c所示生理盐水、单独cpg药物分子、分子1、分子2、分子3和分子4)，进行为期约2周的治疗；观察治疗结束后肿瘤的大小(图6a和图6b所示)，并持续记录肿瘤体积大小(如图7a和图7b所示)和生存情况(如表1所示)。可以看到分子4对tlr9阳性肿瘤显示出非常好的治疗效果，结束治疗后肿瘤体积虽然会缓慢增长，但是其生存期得到了显著延长，但是对于tlr9阴性肿瘤，药物与分子的干预并没有产生明显的治疗效果。通过对分子4治疗的tlr9阳性和阴性肿瘤进行免疫切片观察(如图8a和图8b所示)，其治疗效果的确与自噬的水平有明显的相关性，在tlr9阳性的肿瘤中，自噬标志物的水平较高，治疗效果也更好，而对于tlr9阴性的肿瘤，自噬的水平很低，其治疗效果也不显著。
表1
实施例4
本实施例通过使用实施例1制备的cpg药物联合应用用于tlr9阴性肿瘤的治疗
将llc1肿瘤组织块接种于小鼠右后肢，约5天后，待小鼠接种的肿瘤长到大小约为200mm3开始进行肿瘤治疗。间隔一日静脉给药并检测肿瘤大小，如图x，所给药物为满足上述方法实施并制备的分子4，同时给予其他组小鼠分子4以及自噬调控剂作为联合用药，进行为期约2周的治疗；持续记录肿瘤体积大小(如图9a和图9b所示)和生存情况(如表2，表3所示，在表2和表3中c为对照组，hcq为自噬抑制剂羟化氯喹，rapa为自噬诱导剂雷帕霉素，cpg-m为分子4)。结果显示分子4通过与自噬诱导剂rapa的联合使用，在tlr9阴性肿瘤中也能产生很好的治疗效果，该效果与单独使用分子4在tlr9阳性肿瘤中产生的治疗效果相当，而且经过分子4和rapa联合使用的小鼠生存周期有了明显的延长。
表2
表3
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的cpg药物及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。