本发明涉及医药化工领域，尤其涉及一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药及其制备方法与应用。
背景技术：
阿霉素(doxorubicin，dox)，又叫多柔比星、羟基红比霉素或羟基柔红霉素。阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制rna和dna的合成，其作用机理主要是dox嵌入dna/rna而抑制核酸的合成，对rna的抑制作用更强，抗瘤谱较广，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。临床上用于治疗急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。阿霉素为广谱抗肿瘤药，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用，对正常组织细胞同样具有较高的细胞毒性，因此使用阿霉素治疗癌症具有以下副作用与缺点：
1)常见脱发、骨髓抑制、口腔溃疡、食欲减退、恶心甚或呕吐；
2)少数患者注射该品后，原先的放射野可出现皮肤发红或色素沉着；
3)白血病和恶性淋巴瘤患者应用该品时，特别是初次用该品者，可因瘤细胞大量破坏引起高尿酸血症，而致关节疼痛或肾功能损害；
4)该品具有心脏毒性，可引起迟发性严重心力衰竭。
富勒烯是由碳原子形成的一系列笼状、球形纳米分子，可广泛应用于各种领域，目前富勒烯及其衍生物在药学领域越来越受到关注，因它们不仅具有抗氧化、抗病毒作用，还具有抗肿瘤和免疫调节作用。例如，一些羟基化c60和c60-丙二酸极易与体内自由基发生反应，被喻为吸收自由基的海绵，可保护细胞免受氧化应激反应所致的损伤。而在高浓度和在紫外光的照射下，c60水溶性衍生物可产生单线态活性氧，引起肿瘤细胞死亡，却对正常细胞没有明显损伤。而在非光照条件下c60也被证明具有抗肿瘤活性及免疫调节性，如中国科学院国家纳米科学中心发现富勒醇c(60)o(x)h(y)(10＜y≤x＜50)和羧基化富勒烯具有抑制肿瘤生长和抑制肿瘤转移的优点，且用量小，毒性低。另有文献报道，c60富勒醇及其衍生物在体内外均具有抗肝癌细胞的活性，富勒醇c60(oh)x可显著激活巨噬细胞，并抑制肿瘤的生长。另外，还发现富勒醇c60(oh)20能降低血管生成因子在肿瘤组织中的表达，起到抗肿瘤转移的作用等。此外，c60分子具有优越的化学可修饰性，由于其结构中的双键可以发生狄尔斯-阿尔德反应(diels-alderreaction)，宾格尔(bingel)反应等，可方便地制备得到一系列衍生物，是药物设计的理想基体，可以根据需要接上多种基团。
叶酸受体是一种糖基化磷脂酰基醇连接的膜糖蛋白，在大部分恶性肿瘤中都高度表达，如卵巢癌、乳癌、脑癌、肺癌等。叶酸受体在这些组织上比正常组织高100-300倍，它可以与叶酸及其类似物特异性结合，通过介导细胞内吞将其摄入细胞胞浆。将叶酸引入前药结构中，可以叶酸受体为作用靶点，前药可被主动靶向摄入肿瘤细胞中，从而提高药物在肿瘤细胞内的分布。
技术实现要素：
为解决现有阿霉素作为广谱抗肿瘤药具有毒副作用大的缺点，本发明提供一种毒副作用小、能靶向治疗且疗效好的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药、叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法及应用。
本发明提供了一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药由1分子引入酰肼基团的富勒醇通过腙键结合1分子阿霉素及通过酰胺键结合1分子叶酸形成，具有如下结构式：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6。
本发明还提供一种上文所述的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)在溶剂水中，将富勒醇与草酰二肼发生加成反应生成肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇的结构式如下：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
(2)以碳二亚胺edc为催化剂，将叶酸与n-羟基琥珀酰亚胺nhs反应生成叶酸琥珀酰亚胺酯；
(3)将步骤(1)生成的肼基化富勒醇与步骤(2)生成的叶酸琥珀酰亚胺酯通过酰化反应生成叶酸接枝肼基化富勒醇，所述叶酸接枝肼基化富勒醇的结构式如下：
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
(4)将阿霉素与步骤(3)生成的叶酸接枝肼基化富勒醇通过缩合反应生成叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
在本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法一较佳实施例中，所述步骤(1)具体为：将富勒醇溶解于溶剂水中，加入草酰二肼，然后在25～50℃条件下，搅拌反应3～7天，再以水为溶剂进行透析，冷冻干燥后得到黑褐生色固体，即肼基化富勒醇。
在本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法一较佳实施例中，所述步骤(2)具体为：将叶酸fa溶于溶剂二甲基亚砜dmso中，加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs和碳二亚胺edc，惰性气体保护下，室温避光条件下反应制得叶酸琥珀酰亚胺酯。
在本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法一较佳实施例中，所述步骤(3)具体为：将所述步骤(1)制得的肼基化富勒醇溶于水和二甲基亚砜dmso组成的混合溶剂中，加入步骤(2)制得的叶酸琥珀酰亚胺酯，室温避光条件下，搅拌反应4～8小时制得叶酸接枝肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇与所述叶酸琥珀酰亚胺酯的物质的量之比为1：1。
在本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法一较佳实施例中，所述步骤(4)具体为：将阿霉素溶于溶剂二甲基亚砜dmso中，加入至步骤(3)制得的叶酸接枝肼基化富勒醇中，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，然后加入甲醇或乙醇，析出沉淀抽滤得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述阿霉素与所述叶酸接枝肼基化富勒醇的物质的量之比为(1～1.3)：1。
在本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法一较佳实施例中，所述步骤(4)具体为：将盐酸阿霉素加入至步骤(3)制得的叶酸接枝肼基化富勒醇中，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，然后加入甲醇或乙醇，析出沉淀抽滤得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述阿霉素与所述叶酸接枝肼基化富勒醇的物质的量之比为(1～1.3)：1。
本发明还一种权利要求1所述的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
(1)在溶剂水中，将富勒醇与草酰二肼发生加成反应生成肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇的结构式如下：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
(2)将阿霉素与步骤(1)生成的肼基化富勒醇通过缩合反应得到富勒醇载阿霉素前药；
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
(3)以碳二亚胺edc为催化剂，将叶酸与n-羟基琥珀酰亚胺nhs反应生成叶酸琥珀酰亚胺酯；
(4)将步骤(2)生成的富勒醇载阿霉素前药与步骤(3)生成的叶酸琥珀酰亚胺酯通过酰化反应生成叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
本发明还提供一种上文所述的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药在制备抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药及其制备方法与应用具有以下有益效果：
一、叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药以水溶性富勒醇为药物载体，结构中引入小分子酰肼基团，与叶酸通过酰胺键相连，与阿霉素通过腙键相连形成，到达肿瘤组织后，利用肿瘤细胞膜的叶酸受体介导吞噬，利用细胞内涵体的弱酸性环境使腙键解离，释放出药物和载体，毒副作用小，能靶向治疗且疗效好。
二、所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药分子结构简单，易于合成，反应条件温和，操作方法简便。
三、通过接枝叶酸使阿霉素前药具有肿瘤靶向性，通过与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，可主动介导前药进入富叶酸受体的肿瘤细胞内。
四、腙键介导的肿瘤细胞内药物具有快速释放功能，在内涵体ph条件下可触发酸敏感腙键的水解，使药物在肿瘤细胞内能被快速释放，疗效好。
五、载体富勒醇具有良好水溶性，可提高前药分子的溶解性，且载体富勒醇本身具有抗肿瘤作用，可与阿霉素起到协同作用。
【附图说明】
图1为本发明实施例一提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法的步骤流程图；
图2为本发明实施例一提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的合成反应路线图；
图3为本发明实施例二提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法的步骤流程图；
图4为本发明实施例二提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的合成反应路线图；
图5为采用傅立叶红外光谱法对原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药进行检测得到的红外图谱；
图6为采用1h核磁共振法对原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药进行检测得到的1h-nmr图谱；
图7为采用差示扫描热量法对原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药进行检测得到的dsc图谱；
图8为本发明实施例三制备的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药在不同ph条件下pbs溶液中的体外溶出曲线图谱。
【具体实施方式】
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药由1分子引入酰肼基团的富勒醇通过腙键结合1分子阿霉素及通过酰胺键结合1分子叶酸形成，具有如下结构式：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6。
所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，以水溶性富勒醇为药物载体，结构中引入小分子酰肼基团，与叶酸通过酰胺键相连，与阿霉素通过腙键相连形成，其中，腙键由肼基与阿霉素中的羰基缩合形成，酰胺键由肼基与叶酸结构中的活化羧基反应形成。通过接枝叶酸使阿霉素前药具有肿瘤靶向性，通过与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，可主动介导前药进入富叶酸受体的肿瘤细胞内，腙键介导的肿瘤细胞内药物具有快速释放功能，在内涵体ph条件下可触发酸敏感腙键的水解，使药物在肿瘤细胞内能被快速释放，疗效好。
实施例一
请参阅图1和图2，本发明提供一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法，该方法包括如下步骤：
s11、在溶剂水中，将富勒醇与草酰二肼发生加成反应生成肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇的结构式如下：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
具体地：将富勒醇溶解于溶剂水中，加入草酰二肼，然后在25～50℃条件下，搅拌反应3～7天，再以水为溶剂进行透析，冷冻干燥后得到黑褐生色固体，即肼基化富勒醇。
s12、将叶酸与n-羟基琥珀酰亚胺nhs和碳二亚胺edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺简称)反应生成叶酸琥珀酰亚胺酯；其中，碳二亚胺edc作为催化剂；
具体地：将叶酸fa溶于溶剂二甲基亚砜dmso中，加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs和碳二亚胺edc，惰性气体保护下，室温避光条件下反应制得叶酸琥珀酰亚胺酯。
s13、将步骤s11生成的肼基化富勒醇与步骤s12生成的叶酸琥珀酰亚胺酯通过酰化反应生成叶酸接枝肼基化富勒醇，所述叶酸接枝肼基化富勒醇的结构式如下：
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
具体地：将所述步骤s11制得的肼基化富勒醇溶于水和二甲基亚砜dmso组成的混合溶剂中，加入步骤s12制得的叶酸琥珀酰亚胺酯，室温避光条件下，搅拌反应4～8小时制得叶酸接枝肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇与所述叶酸琥珀酰亚胺酯的物质的量之比为1：1，混合溶剂水和二甲基亚砜dmso的体积比为1：1。
需要说明的是，在具体操作过程中，也可通过tlc分析法确定反应终点，具体为：展开剂为异丙醇：氨水：水＝9:1:2(也可以采用其他展开剂)，以步骤s12生成的叶酸琥珀酰亚胺酯为对照，tlc法观察步骤s13的反应液，当tlc板层显示，反应液中游离的叶酸琥珀酰亚胺酯基本消失，可以结束反应。
s14、将阿霉素或盐酸阿霉素与步骤s13生成的叶酸接枝肼基化富勒醇通过缩合反应生成叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
具体地：在以阿霉素为原料时，将阿霉素溶于溶剂二甲基亚砜dmso中，加入至步骤s13制得的叶酸接枝肼基化富勒醇中，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，然后加入甲醇或乙醇，析出沉淀抽滤得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述阿霉素与所述叶酸接枝肼基化富勒醇的物质的量之比为(1～1.3)：1；在以盐酸阿霉素为原料时，将盐酸阿霉素直接加入至步骤s13制得的叶酸接枝肼基化富勒醇中，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，然后加入甲醇或乙醇，析出沉淀抽滤得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述阿霉素与所述叶酸接枝肼基化富勒醇的物质的量之比为(1～1.3)：1。
需要说明的是，步骤s11和s12在本发明申请中不分先后顺序，在具体制备过程中，可以同时进行，肼基化富勒醇的制备和叶酸琥珀酰亚胺酯的制备互不关联。
实施例二
请参阅图3和图4，本发明还提供一种叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的制备方法，该制备方法与实施例一的区别在于，富勒醇引入小分子酰肼基团后，首先与阿霉素发生缩合反应得到富勒醇载阿霉素前药，然后再将富勒醇载阿霉素前药与叶酸琥珀酰亚胺酯发生酰化反应生成叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，即在将引入小分子酰肼基团的富勒醇与叶酸和阿霉素连接时，反应顺序不同，实施例一，首先将引入小分子酰肼基团的富勒醇与叶酸连接，再与阿霉素连接，而实施二，首先将引入小分子酰肼基团的富勒醇与阿霉素连接，再与叶酸连接。
该方法包括如下步骤：
s21、在溶剂水中，将富勒醇与草酰二肼发生加成反应生成肼基化富勒醇，所述肼基化富勒醇的结构式如下：
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
具体地：将富勒醇溶解于溶剂水中，加入草酰二肼，然后在25～50℃条件下，搅拌反应3～7天，再以水为溶剂进行透析，冷冻干燥后得到黑褐生色固体，即肼基化富勒醇。
s22、将阿霉素或盐酸阿霉素与步骤s21生成的肼基化富勒醇通过缩合反应得到富勒醇载阿霉素前药；
其中，
n为整数，且n＝24～28；
m为整数，且m＝2～6；
具体地：在以阿霉素为原料时，首先将阿霉素溶于溶剂二甲基亚砜dmso中制得阿霉素溶液，然后将步骤s21制得的肼基化富勒醇溶于水和dmso混合溶剂中得到肼基化富勒醇溶液，再将阿霉素溶液投入肼基化富勒醇溶液中，以冰乙酸为催化剂，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，制得富勒醇载阿霉素前药，所述肼基化富勒醇与所述阿霉素的物质的量之比为1：(1～1.3)；在以盐酸阿霉素为原料时，首先将步骤s21制得的肼基化富勒醇溶于水和dmso混合溶剂中得到肼基化富勒醇溶液，再将盐酸阿霉素直接加入至肼基化富勒醇溶液中，以冰乙酸为催化剂，室温避光条件下，搅拌反应3～4天，制得富勒醇载阿霉素前药，所述肼基化富勒醇与所述阿霉素的物质的量之比为1：(1～1.3)。
s23、将叶酸、n-羟基琥珀酰亚胺nhs和碳二亚胺edc在避光反应条件下反应生成叶酸琥珀酰亚胺酯；其中，碳二亚胺edc作为催化剂；
具体地：将叶酸fa溶于溶剂二甲基亚砜dmso中，加入n-羟基琥珀酰亚胺nhs和碳二亚胺edc，惰性气体保护下，室温避光条件下反应制得叶酸琥珀酰亚胺酯。
s24、将步骤s22生成的富勒醇载阿霉素前药与步骤s23生成的叶酸琥珀酰亚胺酯通过酰化反应生成叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
具体地：将步骤s23制得的叶酸琥珀酰亚胺酯溶液适量，投入步骤s22制得的富勒醇载阿霉素前药溶液中，室温避光条件下，搅拌反应4～8小时，反应液加入甲醇或乙醇，析出沉淀，抽滤得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药，所述富勒醇载阿霉素前药与所述叶酸琥珀酰亚胺酯的物质的量之比为1：1。
实施例三
制备叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药
制备肼基化富勒醇：取0.1g富勒醇溶解在10ml纯净水中，加入0.05g草酰二肼，搅拌，室温反应7天，再将反应液置于透析袋(mw1000)中透析三次，透析液冻干后，得到黑褐色固体；制备叶酸琥珀酰亚胺酯溶液：将叶酸1.0g(2.23mmol)投入50ml圆底烧瓶中，加入40ml二甲基亚砜(dmso)，超声至完全溶解，再加入nhs0.28g(2.48mmol)和edc0.56g(2.48mmol)，充入n2保护，避光，在室温下搅拌反应夜，抽滤除去不溶物，得到橙红色溶液即叶酸琥珀酰亚胺酯溶液；称取制备的黑褐色固体肼基化富勒醇100mg，溶于5ml水和5mldmso混合溶液中，并加入制备的叶酸琥珀酰亚胺酯溶液1.6ml，室温避光条件下，搅拌反应24小时，得到叶酸接枝肼基化富勒醇反应液；取盐酸阿霉素80mg，冰醋酸1滴，投入制备得到的叶酸接枝肼基化富勒醇反应液中，室温避光条件下，搅拌反应4天，最后加入50ml无水甲醇，析出沉淀，抽滤，用甲醇洗三次，得到红褐色固体，即叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
实施例四
请参阅图5，采用傅立叶红外光谱法对原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药进行检测。
取富勒醇、叶酸、阿霉素和叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药适量，分别与kbr混匀碾磨，压片，进行红外光谱扫描，扫描范围为400-4000cm-1。
曲线1对应富勒醇：富勒醇的特征峰有：ftir(cm-1)1600,1384,1087；曲线2对应叶酸:叶酸的特征峰有：ftir(cm-1)1695,1607,1512,1485,1408,1339,1229；曲线3对应阿霉素:阿霉素的特征峰有：ftir(cm-1)1730,1618,1583,1526,1414,1286,1212,1115,1073；曲线4对应叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药:叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药的特征峰有：ftir(cm-1)1638，1615,1584,1512,1407,1380,1283,1211,1115,1081。从图中可见，产物基本包括了原料的结构，1615,1584,1283,1211,1115是阿霉素的特征峰，其中，阿霉素在1730处的羰基峰消失，转变为腙键后，峰位右移，在1638，属于腙键的c＝n双键的特征吸收峰。另外1512，1407符合叶酸的结构特征；1380，1081反映了富勒醇的特征结构。
实施例五
请参阅图6，采用1h核磁共振法检测原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
1hnm光谱检测在500mhz核磁共振仪上进行，以四甲基硅烷(tms)为内参，富勒醇使用d2o为溶剂，叶酸、阿霉素和叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药使用氘代dmso为溶剂，分别进行1h-nmr分析，
1：富勒醇在δ3.26，1.07有弱质子峰；2：叶酸在δ8.65,8.15,7.64,6.95,6.66,4.50,4.33,2.32,2.04,1.91有质子峰；3：阿霉素在δ7.90，7.67,5.47,5.30，4.93,4.88,4.60,4.37,4.20,3.99,3.60,3.02,2.98,2.91,2.86,2.16,2.09,1.89,1.70,1.17,1.06有质子峰；4：叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药在δ8.65，8.09,7.93,7.65，6.94,6.65,4.50,4.34，4.00,3.00,2.68,2.33,1.91,1.24,1.15,0.98有质子峰。其中8.65，7.65，6.94,6.65,4.50,4.34，1.91，属于叶酸的特征峰；7.93,4.00,3.00,1.15，属于阿霉素的特征峰，判断产物结构中已连接了叶酸和阿霉素结构，佐证了红外图谱的结果。
实施例六
请参阅图7，采用差示扫描量热法检测原料富勒醇、叶酸和阿霉素及实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
检测条件为30-300℃，升温速率15℃/min，n2流100ml/min，氧化铝坩埚。
产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药4与富勒醇1、叶酸2、阿霉素3有明显差别：富勒醇在73℃和217℃有两个明显的吸热峰；叶酸在148℃有一较大吸热峰，201℃，269℃有弱吸热峰；阿霉素在210℃和237℃有两个吸热峰。产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药在67℃有一个较大吸热峰，与以上三种原料都不相同。dsc图谱说明产物与原料非同一物质，也非原料的混合物，而是形成了共价键。
实施例七
请参阅图8，体外溶出速率检测实施例三制备的产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药。
体外溶出速率检测方法：将产品叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药用dmso充分溶解，并过滤膜，滤液用荧光分光光度计检测其中阿霉素浓度，根据标准曲线计算阿霉素的含量，滤液中阿霉素的浓度约为500mg/l。取2ml投入透析袋(透过相对分子质量1000)内，再加入磷酸缓冲液(pbs，ph7.4，ph5.8，ph4.9)2ml，束紧袋口，投入装有26ml相应ph值的pbs溶液的锥形瓶中，置恒温水浴锅中，保持37℃。按设定时间间隔取出pbs溶液0.5ml，用荧光分光光度计检测其中阿霉素浓度，并补充相同体积的新鲜pbs溶液。
产物的体外溶出结果：叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药在生理条件ph＝7.4的释放速率明显低于在酸性条件ph＝5.8和ph＝4.9的释放速率。在ph＝7.4的条件下，8h的累积释放量只有18％，24h是22％，72h是27％；ph＝5.8条件下，8h的累积释放量为30％，24h是39％，72h是45％；ph＝4.9条件下，8h的累积释放量为36％，24h是52％，72h是78％。这个结果符合腙键的降解特性。产物叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药因有靶向配体叶酸，所以对叶酸受体有较高表达的肿瘤组织有主动靶向性。该产物在正常组织中释放速度慢，而一旦被肿瘤细胞吞噬，进入胞内的内涵体后，在内涵体的酸性环境下(ph≈5.0)，阿霉素可快速释放。
本发明提供的叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药及其制备方法与应用具有以下有益效果：
一、叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药以水溶性富勒醇为药物载体，结构中引入小分子酰肼基团，与叶酸通过酰胺键相连，与阿霉素通过腙键相连形成，到达肿瘤组织后，利用肿瘤细胞膜的叶酸受体介导吞噬，利用细胞内涵体的弱酸性环境使腙键解离，释放出药物和载体，毒副作用小，能靶向治疗且疗效好。
二、所述叶酸接枝富勒醇载阿霉素前药分子结构简单，易于合成，反应条件温和，操作方法简便。
三、通过接枝叶酸使阿霉素前药具有肿瘤靶向性，通过与肿瘤细胞表面的叶酸受体结合，可主动介导前药进入富叶酸受体的肿瘤细胞内。
四、腙键介导的肿瘤细胞内药物具有快速释放功能，在内涵体ph条件下可触发酸敏感腙键的水解，使药物在肿瘤细胞内能被快速释放，疗效好。
五、载体富勒醇具有良好水溶性，可提高前药分子的溶解性，且载体富勒醇本身具有抗肿瘤作用，可与阿霉素起到协同作用。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。