本发明涉及一种中药抗流感病毒活性成分的提取技术领域，特别是涉及一种草珊瑚抗流感病毒活性提取物及其制备方法。
背景技术：
流行性感冒病毒简称流感病毒，是正粘病毒科(orthomyxoviridae)的代表种，包括人流感病毒和动物流感病毒，主要通过空气中的飞沫、易感者与感染者之间的接触或与被污染物品的接触而传播。近年来各种流感病毒如sars、甲型h7n9、甲型h1n1、禽流感等频繁入侵，传染性强、传播迅速，易造成大流行，每一次流感病毒爆发都给人类带来巨大恐慌，因此采用科技手段高效找到合适的抗流感病毒药物意义重大。
流感病毒是带有节段、单股负链rna基因组的包膜病毒，其中甲型流感病毒外膜上镶嵌着3种膜蛋白，分别为神经氨酸酶(na)、血凝素(ha)和m2蛋白。目前神经氨酸酶抑制剂是流感治疗药物研究的热点，神经氨酸酶又称唾液酸酶是分布于流感病毒被膜上的一个呈蘑菇状的四聚体糖蛋白，具有抗原性，可以催化唾液酸水解，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色，因此，神经氨酸酶成为流感治疗药物的一个作用靶点，针对神经氨酸酶设计的奥司他韦是最著名的抗流感药物之一。
西药作用途径单一、易使人体产生耐药性，且存在较大的副作用。中药为多成分复杂体系，具有多途径、多环节、多靶点的作用特点，在新型抗流感病毒药物研制中日益受到重视。
草珊瑚，又名肿节风、九节茶、接骨金粟兰等，为金粟兰科草珊瑚属植物草珊瑚sarcandraglabra(thunb.)nakai的干燥全草，主产于福建、江西等长江以南各省。现代医学研究表明，草珊瑚中主要含有黄酮、香豆素、有机酸、萜类、挥发油等类化学成分。药理学和毒理学研究表明，草珊瑚具有抗菌消炎，抑制多种人畜病原菌及流感病毒、抗肿瘤、促进骨折愈合、镇痛、安全无毒等多种活性，对多种人、畜疾病均有较好的治疗效果，是一种极具研究和开发利用价值的植物药。因草珊瑚具有清热凉血、活血消斑、祛风通络、接骨及消肿止痛等功效，常用于制备风湿中药膏药、保健凉茶、洁齿健齿牙膏、养殖饲料等产品。
现有公开的文献中提到草珊瑚具有抗流感病毒作用，但目前针对草珊瑚抗病毒作用的研究分析或对流感病毒的抑制效果观察多采用动物体内接种病毒株及一些应用于中草药指纹分析的方法。马梅香等通过体外抗病毒实验，观察草珊瑚的抗病毒作用，并以肺指数、病毒致小鼠死亡率等为指标，以利巴韦林作为阳性药物对照，观察其治疗效果，发现草珊瑚的水提取物具有良好的体内抗流感病毒作用，且对甲型流感病毒感染小鼠的细胞免疫系统有良好的调节作用，可以显著减低fm1感染小鼠的肺指数。龙维英等采用草珊瑚浸膏对鸡胚进行毒性测定，以感冒灵、金刚烷胺合剂、吗啉双胍作为对照药物，发现10％过柱草珊瑚浸膏液对流感病毒a/京科/1/68(h3n2)15eid50感染量具有灭活作用。中国专利cn200610163255.5采用毛细管电泳电化学法(ce-ed)质量分析和鉴别草药和中药，将中药指纹图谱分析与指标成分含量测定相结合，从而达到对草药肿节风及由它所制成的三种中药：复方草珊瑚含片、清热消炎宁胶囊和血康口服液的科学的质量评价和监制。
以上方法多是给予药物对动物活体或离体组织的定性或定量药理实验，存在影响因素多、精密度低、费用高、周期长和重现性差等缺点，且均是对草珊瑚抗病毒作用或流感病毒抑制效果或以草珊瑚为原料制成的药物的质量评价，对于草珊瑚中抗流感病毒活性及其分离提取方法则未见报道。
段营辉等采用大孔树脂diaionhp20柱色谱、反相ods柱色谱、sephadexlh20柱色谱、反相hplc等手段通过多种柱色谱方法，从草珊瑚的水提取物中分离得到10个化合物，利用波谱学方法鉴定该水提取物的化学结构。但他们的研究目的是确定草珊瑚的有效化学成分，为制定草珊瑚提取物质量标准作基础工作，并未对草珊瑚抗流感病毒特定化合物的提取方法做出针对性的研究。
技术实现要素：
为此，需要提供一种草珊瑚抗流感病毒活性及其分离提取方法，来快速、简便、精确地分离提取草珊瑚中的抗流感病毒活性，以填补从草珊瑚中提取抗流感病毒活性的空白，为草珊瑚等中草药制剂在抗流感病毒方面的推广应用提供解决途径。
为实现上述目的，发明人提供了一种草珊瑚抗流感病毒活性提取物，所述抗流感病毒活性提取物含有：
相对于所述提取物总重量0.020～0.040重量％的绿原酸、0.000～0.008重量％的异嗪皮啶、0.025～0.060重量％的槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和0.083～0.158重量％的迷迭香酸。
进一步地，所述的槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷相对于所述提取物总重量的含量为0.029～0.045重量％。
区别于现有技术，上述技术方案具有如下优点：提供了草珊瑚抗流感病毒活性提取物的绿原酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸的含量，为草珊瑚提取物在抗流感方面的应用提供了帮助。
发明人还提供了一种从草珊瑚中提取草珊瑚抗流感病毒活性提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括制备草珊瑚水提取物和纯化洗脱，
所述制备草珊瑚水提取物包括以下步骤：以草珊瑚为原料，干燥后将其粉碎为粉末，以去离子水回流提取，得到第一提取液，往所述第一提取液中加入乙醇进行混合沉淀，经固液分离，得到第二上清液，将第二上清液进行浓缩，得到干浸膏；
所述纯化洗脱包括以下步骤：将所述干浸膏用去离子水溶解，将该溶解物往大孔吸附树脂柱进样，然后用体积分数为15％～25％的乙醇溶液进行洗脱，得到洗脱液，收集所述洗脱液，即得所述草珊瑚抗流感病毒活性提取物。
进一步地，所述纯化洗脱用的所述乙醇溶液体积分数为20％，用量为3～5倍的所述吸附树脂柱体积。
进一步地，所述大孔吸附树脂柱为非极性大孔吸附树脂，包括hp20、hpd100、hpd300和d101大孔吸附树脂中的一种或多种。
进一步地，所述制备水提取物步骤所加入所述乙醇的体积分数为50％～95％。
进一步地，所述初提取液加入乙醇混合沉淀之后，静置8～24小时。
进一步地，所述干浸膏中含草珊瑚固含量质量浓度0.5～1g/ml。
进一步地，所述制备草珊瑚水提取物以去离子水回流提取时，包括以去离子水第一次回流提取和第二次回流提取，所述以去离子水第一次回流提取的工艺条件是，所述粉末与去离子水的质量比例为1:40～1:20，回流提取时间为1～3小时；所述以去离子水第二次回流提取的工艺条件是，所述粉末与去离子水的质量比例为1:30～1:15，回流提取时间为0.5～2小时。
一种草珊瑚抗流感病毒活性提取物，其含有相对于所述提取物总重量0.020～0.040重量％的绿原酸、0.000～0.008重量％的异嗪皮啶、0.025～0.060重量％的槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和0.083～0.158重量％的迷迭香酸，所述提取物按照权利要求3的方法制备。
区别于现有技术，上述技术方案具有如下优点：(1)采用流感病毒神经氨酸酶抑制效价检测试剂盒对草珊瑚水提取物进行神经氨酸酶抑制效价的比对，相比传统的小鼠或鸡胚等动物体内接种病毒株以分析草珊瑚水提取物中抗流感病毒作用的方法大大缩短分析时间；(2)流感病毒神经氨酸酶抑制效价检测试剂盒的针对性强，分离的抗流感病毒活性部位比传统方法的精确，而且能避免体内接种病毒株测试中草药提取物过程中其他非神经氨酸酶抑制剂的干扰；(3)从草珊瑚提取物中筛选分离最强抗流感病毒活性部位时处理步骤简便易操作，可定量且重复性好，适合后期将该提取物应用于药物的大规模工业化生产过程。
附图说明
图1为本实施例一种草珊瑚抗流感病毒活性提取物的制备方法具体操作步骤简单示意图；
图2为本实施例中绿原酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸混合对照品的hplc色谱图；
图3为本实施例中0％乙醇洗脱液hplc色谱图；
图4为本实施例中20％乙醇洗脱液hplc色谱图；
图5为本实施例中25％乙醇洗脱液hplc色谱图；
图6为本实施例中30％乙醇洗脱液hplc色谱图；
图7为本实施例中50％乙醇洗脱液hplc色谱图；
图8为本实施例中70％乙醇洗脱液hplc色谱图；
1、绿原酸；
2、异嗪皮啶；
3、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷；
4、迷迭香酸。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、方法步骤、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
本实施例采用的草珊瑚药材来源于福建省三明市三元区岩前，经鉴定为金粟兰科植物草珊瑚sarcandraglabra(thunb.)nakai的干燥全草。采用的大孔吸附树脂(diaionhp20、hpd100、hpd300和d101)由沧州宝恩吸附材料科技有限公司提供；绿原酸、异嗪皮啶、迷迭香酸均购自上海源叶生物科技有限公司；槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷购自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，磷酸、甲酸为分析纯，甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇均购自国药集团化学试剂有限公司；阳性药帕拉米韦注射液(3mg/ml)购自广州南新制药有限公司；去离子水为自制超纯水；流感病毒神经氨酸酶抑制效价检测试剂盒(内含纯化的神经氨酸酶、神经氨酸酶底物、缓冲液和终止液)购自上海碧云天生物技术有限公司(生产批号：170609，由北京解放军第302医院全军中医药研究所研制)。
本实施例采用的仪器设备如下：agilent1200series高效液相色谱仪、真空脱气机、四元泵、二元泵、柱温箱、紫外检测器、hp1200化学工作站由美国安捷伦科技有限公司提供；数控超声波清洗器kq-500de型由昆山市超声仪器有限公司提供；shb-iii循环水式多用真空泵由郑州长城科工贸有限公司提供；hh-4数显恒温水浴锅由国华电器有限公司提供；dkz系列电热恒温振荡水槽由上海一恒科技有限公司提供；re-52旋转蒸发器由上海亚荣生化仪器厂提供；低温冷却液循环泵由郑州长城科工贸有限公司提供；ahaus万分之一电子分析天平由奥豪斯仪器(常州)有限公司提供；mettlertoledo电子分析天平(精密度为十万分之一)；milli-q超纯水系统由美国millipore公司提供；)，ts-ns-100多功能提取浓缩机组由上海顺仪实验设备有限公司提供，zf-2型三用紫外分析仪由上海安亭电子仪器厂提供，利穗中压制备色谱，岛津lc-8a高压制备色谱仪；多通道移液器(量程20-200μl，2-10μl)，单通道移液器(量程2-l0μl，20-200μl，100-1000μl)及各规格吸头，具有荧光检测功能的酶标仪，96孔荧光酶标板，恒温孵育箱，加液槽。
实施例一
本实施例提供一种草珊瑚抗流感病毒活性的分离提取方法，包括制备草珊瑚水提取物和纯化洗脱；
所述制备草珊瑚水提取物包括以下步骤：以草珊瑚为原料，置于真空中草药干燥机中干燥1小时，然后用粉碎机将干燥后的草珊瑚粉碎，过《中国药典》(2015版)3号标准药筛，所得粉末即为粒度小于或者等于50目的草珊瑚粉末，取该草珊瑚粉末5g置于洁净的圆底烧瓶中，用150ml去离子水浸泡30分钟，接着回流提取2小时，收集第一次提取液，备用；往圆底烧瓶中加入125ml去离子水浸泡30分钟，接着回流提取2小时，收集第二次提取液，将第一次提取液与第二次提取液进行混合得到初提取液，往上述初提取液中加入95％乙醇搅拌混合使之沉淀，静置12小时，再经过抽滤、减压浓缩，然后在65℃水浴中蒸干，得到干浸膏，干燥之后于4℃冰箱中储存备用；
为验证上述干浸膏具有抗流感病毒的效果，本实施例中以抗流感病毒抑制剂帕拉米韦注射液(3mg/ml)用去离子水稀释成1mg/ml的阳性参比液；精密称取上述干浸膏加去离子水溶解配成1mg/ml的母液，经超声处理，离心后取上清液，制得药材供试品溶液。采用流感病毒神经氨酸酶抑制效价检测试剂盒(该试剂盒的测定原理为：使用纯化的神经氨酸酶，与特异性的荧光底物4-methylumbelliferyl-α-d-n-acetylneuraminicacid反应，生产产物4-mu，在355nm激发波长，460nm吸收波长下，荧光吸收强度评估神经氨酸酶活性。)测定草珊瑚水提取物抗流感病毒活性，为验证草珊瑚水提取物的抗流感病毒特性时做了三个批次草珊瑚实验，表1显示三个批次草珊瑚提取物得率及抗流感病毒效价，该结果表明草珊瑚水提取物具有抗流感病毒活性，且三批草珊瑚药材实验结果差异不大，rsd值小于2％。
表1提取物得率及抗流感病毒效价
在所述纯化洗脱需对大孔吸附树脂预处理：取20gdiaionhp20大孔树脂，用95％乙醇在室温下密封浸泡48小时，充分溶胀后，湿法装柱，用95％乙醇在柱子上流动清洗，洗至洗出液加适量纯水无白色浑浊现象，再用大量的纯水洗至无醇味，备用；
所述纯化洗脱为称取1.4g上述母液，调节ph值为6，以每小时流速为1bv向预处理好的diaionhp20大孔吸附树脂进样，吸附0.5小时，用20％乙醇4bv，以每小时流速2bv进行洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥成粉即得所述草珊瑚抗流感病毒活性。
大孔吸附树脂在中药化学成分分离中运用广泛，其具有快速、高效、选择性好、灵敏度高、可循环利用等优势，能有效富集中药的有效成分，使中药有效单体成分或复方中某一单体成分的指标得到提高。本实施例在确定以20％乙醇作为洗脱剂从所述草珊瑚水提取物分离提取所述草珊瑚抗流感病毒活性前，进行了大量的实验比较研究和探索。先通过对草珊瑚水提物用0％乙醇、20％乙醇、25％乙醇、30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇进行大孔吸附树脂纯化，得到不同乙醇浓度梯度洗脱液。
分别精密称取异嗪皮啶、迷迭香酸、绿原酸、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷对照品0.01g置于10ml量瓶中，加甲醇定容至量瓶的定容刻度线配制成对照品储备液。然后精密移取各对该照品储备液1ml置于10ml量瓶中，加甲醇定容，制成每1ml含绿原酸101.5μg、异嗪皮啶113.6μg、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷81.30μg、迷迭香酸105.2μg的混合对照品溶液。将上述不同乙醇浓度梯度洗脱液与混合对照品溶液用hplc在色谱条件为：dikmadiamonsil十八烷基硅烷键合硅胶(c18)色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(a)-0.2％磷酸溶液(b)，梯度洗脱(0～10分钟，15％a；10～15分钟，15％a→20％a；15～25分钟，20％a；25～40分钟，20％a→40％a)；流速：1.0ml每分钟；柱温：35℃；检测波长：344nm，进样量：10μl下进行测定，该草珊瑚水提取物不同乙醇浓度洗脱部位有效成分含量测定结果如表2所示，混合对照品溶液的hplc色谱图如图2所示，不同乙醇浓度洗脱部位洗脱液hplc色谱图分别如图3、图4、图5、图6、图7和图8所示，不同乙醇浓度洗脱部位洗脱液抗流感病毒效价结果如表3所示。
表2草珊瑚不同洗脱部位有效成分含量测定结果(mg/g)
接着，再将草珊瑚水提取物不同乙醇浓度洗脱液稀释至不同质量浓度，采用上述流感病毒神经氨酸酶抑制效价检测试剂盒分别测定，抑制率通过式(一)计算：
式中，荧光值为上述检测过程中各孔的荧光读数。
表3不同部位洗脱液抗流感病毒效价
由上述实验结果对比可知，体积分数为20％乙醇洗脱剂洗脱部位收集到的洗脱液中槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷的含量最高，该部位按不同倍数稀释所得的洗脱液抑制率比其他洗脱部位高，抗流感病毒效价大大高于其他洗脱部位。由此确定从大孔吸附树脂洗脱草珊瑚水提取物分离提取本发明的目的产物抗流感病毒活性——神经氨酸酶抑制剂过程中，以20％乙醇浓度作为洗脱剂。
实施例二
本实施例提供一种草珊瑚抗流感病毒活性的分离提取方法，包括制备草珊瑚水提取物和纯化洗脱；
与实施例一不同的是，所述制备草珊瑚水提取物包括以下步骤：以草珊瑚为原料，置于真空中草药干燥机中干燥1.5小时，然后用粉碎机将干燥后的草珊瑚粉碎，过《中国药典》(2015版)3号标准药筛，所得粉末即为粒度小于或者等于50目的草珊瑚粉末，取该草珊瑚粉末6g置于洁净的圆底烧瓶中，用180ml去离子水浸泡30分钟，接着回流提取2小时，收集第一次提取液，备用；往圆底烧瓶中加入150ml去离子水浸泡30分钟，接着回流提取2小时，收集第二次提取液，将第一次提取液与第二次提取液进行混合得到初提取液，往上述初提取液中加入70％乙醇搅拌混合使之沉淀，静置12小时，再经过抽滤、减压浓缩，然后在65℃水浴中蒸干，得到干浸膏，干燥之后于4℃冰箱中储存备用；
本实施例中采用diaionhpd100吸附树脂进行纯化洗脱；
所述纯化洗脱为称取2g上述干浸膏粉末，用去离子水调节成质量浓度为1.0g/ml母液，调节ph值为6，以每小时流速为1bv向预处理好的diaionhpd100吸附树脂进样，吸附0.5小时，用20％乙醇4bv，以每小时流速1.5bv进行洗脱，收集该洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥成粉即得所述草珊瑚抗流感病毒活性。
本实施例中草珊瑚水提取物不同乙醇浓度洗脱部位有效成分含量测定结果如表4所示，不同乙醇浓度洗脱部位洗脱液抗流感病毒效价结果如表5所示。
表4草珊瑚不同洗脱部位有效成分含量测定结果(mg/g)
表5不同部位洗脱液抗流感病毒效价
由此可知，不同的树脂对水提取物进行纯化洗脱，仍然是20％乙醇浓度的洗脱部位抗流感病毒有效成分含量最高，神经氨酸酶的抑制率最高，抗流感病毒效价最高。
采用本实施例的技术方案所制成的草珊瑚抗流感病毒活性经hplc色谱法验证，同样含有绿原酸、异嗪皮啶、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。