本发明属于药物领域，并具体涉及内酰胺类化合物及其药物组合物作为药物，尤其是作为抗病毒药物、抗寄生虫药物、抗结核杆菌药物的用途。
背景技术：
病毒按其外壳是否包裹着富含脂质的膜可简单地分为无囊膜病毒与有囊膜病毒两类。无囊膜病毒主要是通过吞饮作用在网格蛋白介导下进入被感染细胞；有囊膜病毒的入侵主要是病毒囊膜与宿主细胞膜的融合过程。目前抗病毒制剂的研宄开发主要基于两方面来设计，一是从病毒浸染层面，二是从宿主细胞防御层面。目前已上市大部分抗病毒药物是基于病毒本身的，即作用受体为病毒本身。干扰素(ifn)是最早开发的一代抗病毒药物，因其具有“干扰”病毒复制的能力而命名。近年来越来越多的抗病毒药物被研发出来，并广泛使用于临床的治疗上。例如，继干扰素之后的另一类能干扰病毒转录或复制的核苷类药物，利巴韦林(ribavirin)，阿昔洛韦(acyclovir)，伐昔洛韦(valacyclovir)，齐多夫定(zidovudine)，替比夫定(telbivudine)等。
虽然许多的抗病毒药物陆续被有效使用于临床，但近年来抗药性病毒也日见浮现。抗药性产生的原因主要是病毒的基因产生突变而使得抗病毒药物丧失其作用的靶点所致。例如：hsv的胸苷激酶基因发生突变，无法将阿昔洛韦(acyclovir)及更昔洛韦(ganciclovir)等在细胞内转化成有效的成份，因此对该些药物产生抗药性；流感a病毒的m2蛋白基因突变，则会对金刚烧胺或金刚乙胺(rimantadine)产生抗药性；hiv逆转录酶或蛋白酶基因的变异亦是导致抗药性产生的主因；hcv的非结构性5a及包膜基因2-糖蛋白的基因变异会使hcv对干扰素产生抗药性。综上所述，开发新型抗病毒药物迫在眉睫。
狭义的热带病即指寄生虫病，是寄生虫侵入人体而引起的疾病。药物可以通过不同机制损害寄生虫。例如：乙胺嘧啶对疟原虫的二氢叶酸还原酶有较大的亲和力，并能抑制其活性，阻断二氢叶酸还原为四氢叶酸，阻碍核酸的合成；苯并咪唑类药物抑制线虫对葡萄糖的摄取，减少糖原量，减少atp生成，妨碍虫体生长发育；青蒿素能抑制异亮氨酸掺入疟原虫蛋白质，从而抑制疟原虫蛋白质合成；氯喹、奎宁等与感染红细胞产生的铁卟啉结合形成复合物，蓄积于感染红细胞内，导致疟原虫和感染红细胞膜的损伤；苯并咪唑类药物选择性地使线虫的体被和脑细胞中的微管消失，抑制虫体对葡萄糖的摄取；减少糖原量，减少atp生成，妨碍虫体生长发育。
由结核杆菌引起的感染性疾病是临床最为常见的疾病之一，因此抗结核杆菌药物也就成为临床应用最广泛的药物之一。然而，随着细菌耐药性的日趋严重，耐药菌株特别是多耐药菌株不断出现，以及免疫缺陷病人的增加细菌感染率持续上升。因此，研发新的抗结核杆菌药物成为临床上十分迫切的重要课题。
技术实现要素：
本发明提供式1-20结构的内酰胺化合物及其药物组合物在制备抗病毒、抗寄生虫、抗结核杆菌等药物中的应用。具体涉及其互变异构体、立体异构体、外消旋体、对映异构体的非等量混合物、几何异构体、溶剂化物、药学上可接受的盐或其盐的溶剂化物。
本发明提供化合物
化合物1-1和2-1已公开于文献
shao,chang-lun;wang,chang-yun;gu,yu-cheng;wei,mei-yan;pan,jia-hui;deng,dong-sheng;she,zhi-gang;lin,yong-cheng.penicinoline,anewpyrrolyl4-quinolinonealkaloidwithanunprecedentedringsystemfromanendophyticfunguspenicilliumsp.bioorganic&medicinalchemistryletters(2010),20(11),3284-3286.
lin,yongcheng;shao,changlun;wang,changyun;zhou,shining;gu,yucheng;she,zhigang.dehydratedmethylationproductofquinolinonealkaloidderivative,itspreparationprocessandapplication.famingzhuanlishenqing(2010),cn101691368a20100407.
el-neketi,mona;ebrahim,weaam;lin,wenhan;gedara,sahar;badria,farid;saad,hassan-elradya.;lai,daowan;proksch,peter.alkaloidsandpolyketidesfrompenicilliumcitrinum,anendophyteisolatedfromthemoroccanplantceratoniasiliqua.journalofnaturalproducts(2013),76(6),1099-1104.
gao,huquan;zhang,lianqing;zhu,tianjiao;gu,qianqun;li,dehai.unusualpyrrolyl4-quinolinonealkaloidsfromthemarine-derivedfunguspenicilliumsp.ghq208.chemical&pharmaceuticalbulletin(2012),60(11),1458-1460.
abe,masaki;imai,tetsuya;ishii,naoki;usui,makio.synthesisofquinolactacideviaanacylmigrationreactionanddehydrogenationwithmanganesedioxide,anditsinsecticidalactivities.bioscience,biotechnology,andbiochemistry(2006),70(1),303-306.
abe,masaki;imai,tetsuya;ishii,naoki;usui,makio;okuda,toru;oki,toshikazu.quinolactacide,anewquinoloneinsecticidefrompenicilliumcitrinumthomf1539.bioscience,biotechnology,andbiochemistry(2005),69(6),1202-1205.
okuda,toru;oki,shunichi;abe,masaki;imai,tetsuya;ishii,naoki.agrochemicalinsecticideoc45159manufacturewithpenicilliumcitrinum.jpn.kokaitokkyokoho(2005),jp2005176684a20050707.
化合物3公开于文献
cho,jeong-yong;bae,sun-hee;kim,hye-kyung;lee,myeong-lyeol;choi,yong-soo;jin,byung-rae;lee,hyoungjae;jeong,hangyeon;lee,yugeon;moon,jae-hak.newquinolinonealkaloidsfromchestnut(castaneacrenatasieb)honey.journalofagriculturalandfoodchemistry(2015),63(13),3587-3592.
化合物4公开于文献
ishihara,yuji;kiyota,yoshihiro;goto,giichi.synthesisofisoindolo[2,1-a]quinolinederivativesandtheireffectsonnitrogen-inducedhypoxia.chemical&pharmaceuticalbulletin(1990),38(11),3024-30
化合物5公开于文献
tratrat,christophe;giorgi-renault,sylviane;husson,henri-philippe.aconvenientroutetoquinolone-fusedimidesandlactams.synthesisofpyrrolo[3,4-b]quinoline-3,9-dionesand-1,3,9-trionesbyoxidationofindolederivatives.synlett(1998),(10),1071-1072.
化合物6公开于文献
alkhathlan,hamadz.;al-lohedan,hameda.spectroscopicstudiesofbenzimidazole,quinoxalineandquinolinederivatives.journalofchemicalresearch,synopses(1995),(1),10-11.
化合物7公开于文献
takada,akihiro;fujiwara,hiroaki;sugimoto,kenji;ueda,hirofumi;tokuyama,hidetoshi.totalsynthesisof(-)-isoschizogaminechemistry-aeuropeanjournal(2015),21(46),16400-16403.
化合物8公开于文献
fourtillan,jean-bernard;fourtillan,marianne.therapeuticcombinationofa5-ht2receptorantagonistanda5-ht2receptoractivator.pctint.appl.(2007),wo2007101863a120070913.
化合物9和10已公开于文献
sokolov,yu.a.;golubovich,v.p.;akhrem,a.a.predictionofthetoxicityofsome8-azasteroids.vestsiakademiinavukbssr,seryyakhimichnykhnavuk(1985),(4),115-16.
化合物11和12公开于文献
nakatsuka,masakatsu;shimamura,takehiko;ishida,tsutomu;totani,yoshiyuki.organicelectroluminescentdevicescontainingheterocyclicderivativesjpn.kokaitokkyokoho(2002),jp2002075652a20020315.
化合物13公开于文献
roma,g.;dibraccio,m.;balbi,a.;mazzei,m.;ermili,a.1,2-fusedpyrimidines.iii.derivativesof12h-pyrido[1',2':1,2]pyrimido[4,5-b]quinoline,anovelheterocyclicsystem.journalofheterocyclicchemistry(1987),24(2),329-35.
化合物14和15公开于文献
nakatsuka,masakatsu;shimamura,takehiko;ishida,tsutomu;totani,yoshiyuki.organicelectroluminescentdevicescontainingheterocyclicderivatives.jpn.kokaitokkyokoho(2002),jp2002075652a20020315.
化合物16公开于文献
tsopmo,apollinaire;kamnaing,pierre;watchueng,jean;gao,jin-ming;konishi,yasuo;sterner,olov.chemicalconstituentsfromthebarkofanisopusmannii.canadianjournalofchemistry(2009),87(2),397-400.
化合物17公开于文献
cincinelli,raffaella;musso,loana;beretta,giangiacomo;dallavalle,sabrina.4-quinolonefusedheterocyclicringsystemsbyintramolecularreactionsof4-quinolone-2-carboxamides.tetrahedron(2014),70(52),9797-9804.
化合物18公开于文献
jones,gurnos;stanforth,stephenp.thevilsmeierreactionoffullyconjugatedcarbocyclesandheterocycles.organicreactions(hoboken,nj,unitedstates)(1997),49,nopp.given.
化合物19公开于文献
kumar,pradeep;dinesh,chimmanamadau.;pandey,bipin.anefficientsynthesisofquinolonesusingn-phenyl(triphenylphosphoranylidene)ethenimine.tetrahedronletters(1994),35(49),9229-32.
化合物20公开于文献
kurbako,v.z.;garbuz,n.i.;lakhvich,f.a.;lis,l.g.;lakhvich,o.f.electronicabsorptionspectraofγ-pyridonesofthe8-azasteroidseries.zhurnalprikladnoispektroskopii(1988),49(6),982-9.
本发明一方面涉及药物组合物，包含本发明的化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、药学上可接受的盐或它们的前药或任选药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物或它们的组合。
本发明一方面涉及预防、处理、治疗或减轻患者由病毒、寄生虫、结核杆菌等引起的疾病的方法，包括使用本发明化合物的药物组合物药学上可接受的有效剂量对患者进行给药。
本发明另一方面涉及本发明的化合物用于制备用于预防、处理、治疗或减轻患者由病毒、寄生虫、结核杆菌等引起的疾病的药物的用途。
本发明另一方面涉及使用一种包含本发明的化合物的药物组合物用于制备用于预防、处理、治疗或减轻由病毒、寄生虫、结核杆菌等引起的疾病的药物的用途。
本发明同样包含治疗或减轻患者由病毒、寄生虫、结核杆菌等引起的疾病，或对此病症敏感的方法，该方法包含使用1-20所代表化合物的治疗有效量对患者进行治疗。
本发明所述的由病毒引起的疾病为由rsv、hsv、ev71、h1n1、h3n2、h5n1、h7n9、cox-b3、hbv、fmdv、sars等病毒及由结核杆菌（tuberclebacillus）、或海分枝杆菌（mycobacteriummarinum）引起的疾病，包括呼吸道疾病、肺炎、龈口炎、角膜结膜炎、脑炎、肝炎、疱疹和疱疹性咽峡炎、肠炎、胃炎、肺结核、肺结核、肾结核、骨结核等疾病。
本发明所述的由间日疟原虫（plasmodiumvivax）、三日疟原虫（plasmodiummalariae）、恶性疟原虫（plasmodiumfalciparum）和卵形疟原虫（plasmodiumovale）、利什曼原虫（leishmaniadonovani）引起的疾病，包括疟疾或利什曼病等
定义和一般术语
本发明将会把确定的具体化的内容所对应的文献详细列出，实施例都伴随有结构式和化学式的解释说明。本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能像权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。有很多文献和相似的物质与本发明申请相区别或抵触，其中包括但绝不限于术语的定义，术语的用法，描述的技术或像本发明申请所控制的范围。
本发明将应用以下定义除非其他方面表明。根据本发明的目的，化学元素根据元素周期表，cas版本和化学药品手册，75，thed，1994来定义。另外，有机化学一般原理见“organicchemistry,”thomassorrell,universitysciencebooks,sausalito:1999,and“march'sadvancedorganicchemistry,”bymichaelb.smithandjerrymarch,john.wiley&sons,newyork:2007,因此所有的内容都融合了参考文献。
本发明的“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括但并不限于：水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。术语“水合物”是指溶剂分子是水所形成的缔合物。
本发明包含本发明化合物及其药学上可接受的盐的应用，用于生产医药产品治疗患者组织或器官纤维化的疾病，包括那些本发明所描述的疾病。本发明包含药物组合物，该药物组合物包括1-20所示的化合物与至少一种药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂、辅剂、媒介物的结合所需的有效治疗量。
除非其他方面表明，本发明的化合物所有的立体异构体、几何异构体、互变异构体、氮氧化物、水合物、溶剂化物、代谢产物、盐和药学上可接受的前药都属于本发明的范围。具体地说，盐是药学上可接受的盐。
术语“药学上可接受的”包括物质或组合物必须是适合化学或毒理学的与组成制剂的其他组分和用于治疗的哺乳动物有关。
本发明的化合物的盐还包括用于制备或纯化式1-20所示化合物的中间体或式1-20所示化合物分离的对映异构体的盐，但不一定是药学上可接受的盐。
如果本发明的化合物是碱性的，则想得到的盐可以通过文献上提供的任何合适的方法制备得到，例如，使用无机酸，如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸和磷酸等等。或者使用有机酸，如乙酸，马来酸，琥珀酸，扁桃酸，富马酸，丙二酸，丙酮酸，草酸，羟乙酸和水杨酸；吡喃糖酸，如葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸；α-羟酸，如柠檬酸和酒石酸；氨基酸，如天门冬氨酸和谷氨酸；芳香族酸，如苯甲酸和肉桂酸；磺酸，如对甲苯磺酸，乙磺酸，等等。
如果本发明的化合物是酸性的，则想得到的盐可以通过合适的方法制备得到，如，使用无机碱或有机碱，如氨（伯氨，仲氨，叔氨），碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，等等。合适的盐包括但并不限于，从氨基酸得到的有机盐，如甘氨酸和精氨酸，氨，如伯氨、仲氨和叔氨，和环状氨，如哌啶，吗啉和哌嗪等，和从钠，钙，钾，镁，锰，铁，铜，锌，铝和锂得到无机盐。
根据另一方面，本发明的药物组合物的特点包括式1-20的化合物和药学上可接受的载体，辅剂，或赋形剂。
本发明的组合物中化合物的量能有效地可探测地治疗或减轻患者由病毒、寄生虫、结核杆菌等引起的疾病。
本发明的化合物存在自由形态，或合适的作为药学上可接受的衍生物。根据本发明，药学上可接受的衍生物包括但并不限于，药学上可接受的前药，盐，酯，酯类的盐，或能直接或间接地根据患者的需要给药的其他任何加合物或衍生物，本发明其他方面所描述的化合物，其代谢产物或他的残留物。
像本发明所描述的，本发明药学上可接受的组合物进一步包含药学上可接受的载体，辅剂，或赋形剂，这些像本发明所应用的，包括任何溶剂，稀释剂，或其他液体赋形剂，分散剂或悬浮剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂，乳化剂，防腐剂，固体粘合剂或润滑剂等等，适合于特有的目标剂型。如以下文献所描述的：inremington:thescienceandpracticeofpharmacy,21stedition,2005,ed.d.b.troy,lippincottwilliamswilkins,philadelphia,andencyclopediaofpharmaceuticaltechnology,eds.j.swarbrickandj.c.boylan,1988-1999,marceldekker,newyork,综合此处文献的内容，表明不同的载体可应用于药学上可接受的组合物的制剂和它们公知的制备方法。除了任何常规的载体媒介与本发明的化合物不相容的范围，例如所产生的任何不良的生物效应或与药学上可接受的组合物的任何其他组分以有害的方式产生的相互作用，它们的用途也是本发明所考虑的范围。
可作为药学上可接受载体的物质包括但并不限于，离子交换剂，铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白，如人血清蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸脂，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯-阻断聚合体，羊毛脂，糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素和它的衍生物如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；树胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；辅料如，可可豆脂和栓剂蜡状物；油如花生油，棉子油，红花油，麻油，橄榄油，玉米油和豆油；二醇类化合物，如丙二醇和聚乙二醇；酯类如乙基油酸酯和乙基月桂酸酯；琼脂；缓冲剂如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原的水；等渗盐；林格（氏）溶液；乙醇，磷酸缓冲溶液，和其他无毒的合适的润滑剂如月桂硫酸钠和硬脂酸镁，着色剂，释放剂，包衣衣料，甜味剂，调味剂和香料，防腐剂和抗氧化剂。
本发明的药物组合物可以是口服给药，注射给药，喷雾吸入法，局部给药，经直肠给药，经鼻给药，含服给药，阴道给药或通过植入性药盒给药。可以是胶囊、片剂、丸剂、粉剂、粒剂和水制悬浮液或溶液。口服给药可以用如下形式：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液、糖浆、和酏剂；以外用方式给药：软膏剂、凝胶、含药胶布等，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式进行非肠胃给药。本发明化合物也可肠胃外或腹腔内给药。也可在适当混合有表面活性剂（如羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮）的水中制备这些活性化合物（作为游离碱或药学上可接受的盐）的溶液或悬浮液。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物生长。
适于注射的药物形式包括：无菌水溶液或分散液和无菌粉（用于临时制备无菌注射溶液或分散液）。在所有情况下，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物（如细菌和真菌）的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇（如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇）、它们的适当混合物和植物油。
化合物可以以局部方式施用，而不以系统方式施用。例如通常以稀释制剂或持续释放制剂的形式将化合物直接注射至器官内。此外，含有本发明化合物的药物组合物可以在靶向药物传递系统中使用，例如在用器官特异性抗体包衣的脂质体中递送。所述脂质体将靶向所述器官并被该器官选择性摄取。此外，含有本发明化合物的组合物可以以快速释放制剂、延时释放制剂或即时释放制剂的形式提供。
对于吸入施用，本发明的化合物可以是气溶胶、气雾剂或粉末形式。本发明化合物的药物组合物可以方便地以气溶胶喷雾剂形式递送，所述气溶胶喷雾剂可以装在压力容器或雾化器中，使用合适的抛射剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适的气体。在压力气溶胶的情况下，剂量单位可以通过阀门进行确定以递送计量量。例如，以胶囊剂和药筒为例，用于吸入器或吹药器的明胶可以制备为含有所述化合物与适当粉末基质例如乳糖或淀粉的粉末混合物。
本发明化合物还可以制备为直肠组合物例如灌肠剂、直肠凝胶剂、直肠泡沫剂、直肠气溶胶、栓剂、凝胶栓剂（gelsuppository）或保留灌肠剂（retentionenema），其中含有常规的栓剂基质例如可可脂或其他甘油酯以及合成聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、peg等。在组合物的栓剂形式中，低熔点蜡例如但不限于脂肪酸甘油酯任选与可可脂的混合物首先被熔化。
此外，本发明化合物还可与其它抗病毒、抗寄生虫及抗结核杆菌等药物联用。具体包括但不限于，病毒唑、盐酸金刚乙胺、盐酸金刚烷胺、阿昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、干扰素、齐多夫定、阿糖腺苷、利巴韦林、替比夫定、氟喹诺酮类药、青蒿素、氯喹、奎宁、乙胺嘧啶、烟肼、链霉素、利福平、乙氨丁醇、异烟肼等。
可以根据常规方式用一种或多种生理学可接受的载体制备药物组合物，其中包括可帮助将活性化合物加工为可药用制剂的赋形剂和辅剂。所选择的施用途径决定适当的剂型。任何熟知的技术、载体和赋形剂都可以根据现有技术中的理解适当的使用。含有本发明化合物的药物组合物可以根据常规方法制备，例如通过常规的混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包囊、包封或压制过程制备。
药物组合物将包含至少一种可药用载体、稀释剂或赋形剂和游离酸、游离碱或可药用盐形式的本发明的化合物作为活性成分。此外，药物组合物还可包括其它医学或药学活性剂、载体、辅剂、例如防腐剂、稳定剂、湿润剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐或缓冲剂。此外，药物组合物还可含有其它有治疗价值的物质。
含有本文所述化合物的组合物的制备方法包括将化合物与一种或多种惰性的可药用赋形剂或载体一起制备为固体、半固体或液体形式。固体组合物包括但不限于散剂、片剂、可分散颗粒剂、胶囊剂、扁囊剂和栓剂。液体组合物包括其中溶解有化合物的溶液剂、含有化合物的乳剂、含有包含本文公开化合物的脂质体、胶团或纳米粒子的溶液剂。半固体组合物包括但不限于凝胶剂、混悬剂和乳膏剂。组合物可以是液体溶液剂或混悬剂形式、适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式或乳剂形式。这些组合物还可以含有少量无毒的辅剂，例如湿润剂或乳化剂、ph缓冲剂等。
本发明的化合物优选地按制剂配方制备成剂量单位型以减轻给药量和剂量的均匀性。术语“剂量单位型”在此处是指患者得到适当治疗所需药物的物理分散单位。然而，应了解本发明的化合物或组合物每日总的用法将通过主治医生根据可靠的医学范围判断来确定。具体的有效剂量水平对于任何一个特殊的患者或有机体将取决于许多因素包括被治疗的病症和病症的严重性，具体化合物的活性，所用的具体组合物，患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食习惯，给药时间，给药途径和所用具体化合物的排泄速率，治疗的持续时间，药物应用于联合用药或与有特效的化合物联用，以及其他一些药学领域公知的因素。
可以将本发明化合物通过附加适宜的官能团进行修饰以提高选择性生物特性。这样的修饰是本领域己知的并且包括向生物腔隙（例如血液、淋巴系统、中枢神经系统）渗透、提高口服有效性、提高溶解性以便可以通过注射给药、改变代谢和改变排泄的修饰。
实施例1
抗病毒活性测试
化合物测试抗病毒活性是依据细胞病变效应的方法进行的，利巴韦林作为阳性对照药物。具体实验方案如下。
首先进行病毒增殖
将测试病毒接种于该病毒的敏感细胞上，将细胞置于无血清的1640培养液中，然后让接种后的细胞在5%二氧化碳、37ºc的温度下培养，至90%的细胞出现感染病毒病变，将病变后的细胞定量分装后冷存在-80ºc冰箱，备用。
其次进行病毒毒力测定
使用细胞维持液对增殖的病毒进行10倍比例的系列稀释。将病毒接种于96孔板内的hep-2上，并纵向重复3次作为对照试验。然后让接种后的细胞在5%二氧化碳、37ºc的温度下培养，每天要观察细胞病变情况。两到三天后，将孔板内的细胞维持液吸弃，并重新在孔板内加入100μl的1%中性红，在37ºc的温度下染色2个小时，后吸弃其染色液，并用洗脱液在37ºc的温度下脱色10分钟。在540nm左右的波长下用酶标仪测定其od值，并用公式计算细胞的病变率和细胞比距，将其细胞比距高于50%的细胞病变率的稀释度的指数加和，用reed-muench方法计算病毒的tcid50值为10-5.5/ml。
细胞存活率=(各组od值–空白对照od值)/(正常细胞od值-空白对照od值)
细胞病变率=1–细胞存活率
细胞比距=(高于50%病变率–50%)/(高于50%病变率–低于50%病变率)
最后进行化合物的病毒抑制活性试验
先准备单层细胞：将细胞用胰酶降解后置于96微孔板中，可使其培养成为单层细胞以备用。
病毒抑制活性实验：将受试化合物按照规格为100μl/管进行准备，备用。根据测试化合物的档案，用适合的溶剂10μl溶解每管测试化合物。用2%细胞培养液(200μl)对化合物进行连续10次的2倍比例的稀释，共需稀释10个梯度。然后将其接种于含有单层细胞的96微孔板中。并将其第11列设为病毒空白对照组，第12列设定为细胞空白对照组。在5%二氧化碳、37ºc的温度下培养。每天要观察细胞病变情况。待病毒对照病变90%，将孔板内的细胞维持液吸弃，并重新在孔板内加入100μl的1%中性红，在37ºc的温度下染色2个小时，后吸弃其染色液，并用洗脱液在37ºc的温度下脱色10分钟。在540nm左右的波长下用酶标仪测定其od值。最后，用公式计算细胞病变率和细胞存活率，用reed-muench方法计算化合物对病毒的半数抑制浓度(ec50)和化合物对细胞的半数中毒浓度(tc50)。
病毒抑制活性数据如下：
表中“a”表示化合物浓度小于0.05μm，“b”表示化合物浓度为0.05-5μm，“c”表示化合物浓度为5-50μm，“d”表示化合物浓度为50-120μm；e表示化合物浓度大于120μm;“++++”表示tc50大于300μm，“+++”表示tc50在100-300μm之间，“++”表示tc50在50-100μm之间，“+”表示tc50在10-50μm之间。
活性测试表明：本发明化合物抗病毒活性强于阳性药或与阳性药相当，显示出较好的应用前景。
实施例2
抗结核杆菌活性测试方法参考文献palomino,j.c.;martin,a.;camacho,m.;guerra,h.;swings,j.;portaels,f.resazurinmicrotiterassayplate:simpleandinexpensivemethodfordetectionofdrugresistanceinmycobacteriumtuberculosis.antimicrob.agentschemother.(2002),46,2720–2722.以异烟肼为阳性药物。
抗海分枝杆菌活性测试方法参考文献cechinel-filhov.2012.plantbioactivesanddrugdiscovery:principles,practice,andperspectives.johnwiley&sons,inc.,hoboken,newjersey.庆大霉素为阳性对照。
活性测试数据
表中“++++”表示mic小于0.001μg/ml之间，“+++”表示mic在0.001-0.01μg/ml之间，“++”表示mic在0.01-10μg/ml之间，“+”表示mic在10-100μg/ml之间。
活性测试表明：本发明化合物抗结核杆菌活性强于阳性药或与阳性药相当，显示出较好的应用价值。
实施例3
抗寄生虫活性测试方法参考文献cross,r.matthew;monastyrskyi,andrii;mutka,tinas.;burrows,jeremyn.;kyle,dennise.;manetsch,roman.endochinoptimization:structure-activityandstructure-propertyrelationshipstudiesof3-substituted2-methyl-4(1h)-quinoloneswithantimalarialactivity.journalofmedicinalchemistry(2010),53(19),7076-7094.以氯喹为阳性药物。
活性测试数据
表中“++++”表示ec50在小于20nm，“+++”表示ec50在20-100nm之间，“++”表示ec50在100-1000nm之间，“+”表示ec50在1000-10000nm之间。
活性测试表明：本发明化合物抗疟活性强于阳性药或与阳性药相当，显示出较好的应用前景。