本发明属于药物研究技术领域，涉及一种ezh1/2抑制剂unc1999在制备改善血管再狭窄药物中的应用。
背景技术：
随着人们生活水平的提高和饮食习惯的改变，动脉粥样硬化已经成为我国人民主要的死亡原因。动脉粥样硬化是以内皮细胞发生炎性改变、炎症细胞粘附和浸润以及平滑肌细胞增殖迁移为主要病理改变的慢性炎症过程，其结局是血管腔的狭窄和局部组织器官的缺血，严重时有生命危险。经皮冠状动脉成形术（percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，ptca)已经广泛被用来治疗晚期冠状动脉粥样硬化，但是许多病人在ptca术后会出现血管成形术后的再狭窄。血管再狭窄是动脉血管壁对手术机械损伤的修复应答，主要包括两个的过程：（1）内膜新生；（2）血管重构。血管再狭窄严重影响了介入手术的预后，抑制血管再狭窄可更有效的治疗动脉粥样硬化。血管平滑肌细胞的增殖、迁移以及细胞外基质的沉积是内膜新生的关键病理过程，在血管再狭窄的发生中起着关键性的作用。
组蛋白甲基化是一种重要的表观遗传修饰，它主要发生在核小体组蛋白的n末端。一个核小体包括一个核心组蛋白八聚体，由4种核心组蛋白h2a、h2b、h3和h4的各两个单体组成。组蛋白h3的第4、9、27和36位，h4的第20位赖氨酸，h3的第2、8、l7、26位及h4的第3位精氨酸是组蛋白甲基化的常见位点。组蛋白甲基化的异常在心衰、扩张性心肌病、心肌肥大、心脏纤维化、高血压等心血管疾病的发生发展中发挥了重要的作用。但组蛋白甲基化在血管再狭窄中的作用还缺乏相关研究。
polycombrepressivecomplex2(prc2)可通过促进组蛋白h3第27位赖氨酸（h3k27）的3甲基化来调控基因的表达。prc2复合物主要由enhancerofzestehomolog1/2（ezh1/2）、suz12以及eed三个亚基组成，其中ezh2或ezh1是prc2的催化亚基，ezh2作为经典的prc2催化亚基，在癌症以及生殖发育中受到广泛关注。ezh2和h3k27me3水平的异常是白血病等多种癌症所共有的表观遗传改变，而发生表型转换（phenotypicswitching）的平滑肌细胞所表现出的“类癌细胞”表型使我们将癌细胞与血管再狭窄中的平滑肌细胞联系起来，同时，h3k27的甲基化修饰在血管再狭窄中的改变和作用还未有报道。unc1999是2012年由kyled.konze等研发出来的新ezh1/2抑制剂，该研究小组后续的实验表明，unc1999可以通过抑制白细胞内的ezh1/2来降低h3k27me3的水平，从而缓解混合型髓系白血病（mll）。unc1999已在在小鼠体内证实可通过口服途径给药，且在小鼠尚未观察到药物的副作用。unc1999是2012年由kyled.konze等研发出来的新ezh1/2抑制剂。
目前，抑制ezh1/2是否可用于减轻血管再狭窄还未知。
技术实现要素：
本发明的目的是通过研究h3k27me3在血管平滑肌增殖和迁移中的作用以及其在血管再狭窄中的作用，提供抑制ezh1/2的物质在制备用于改善血管再狭窄药物中的应用。
第一、本发明提供了抑制ezh1/2的物质在制备用于改善血管再狭窄药物中的应用；所述的改善血管再狭窄指的是ezh1/2抑制剂unc1999用来减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管再狭窄。
第二、本发明提供了unc1999在制备用于改善血管再狭窄药物中的应用；所述的改善血管再狭窄指的是ezh1/2抑制剂unc1999用来减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管再狭窄。
第三、本发明提供了抑制ezh1/2的物质在制备用于改善导丝拉伤导致的血管内膜新生，抑制血管再狭窄药物中的应用。
第四、本发明提供了unc1999在制备用于改善导丝拉伤导致的血管内膜新生，抑制血管再狭窄药物中的应用。
第五、本发明提供了抑制ezh1/2的物质制备降低减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管平滑肌增殖和迁移的产品，或者降低减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管平滑肌增殖和迁移。
第六、本发明提供了unc1999制备降低减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管平滑肌增殖和迁移的产品，或者降低减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管平滑肌增殖和迁移。
第七、ezh1/2和/或h3k27me3作为药物靶点在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下1至3中的至少一种：1、减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管再狭窄；2、改善导丝拉伤导致的血管内膜新生；3、减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管平滑肌增殖和迁移。
本发明进一步公开了ezh1/2抑制剂unc1999在制备用于改善血管再狭窄药物中的应用；所述的改善血管再狭窄指的是ezh1/2抑制剂unc1999用来缓解导丝拉伤引起的血管再狭窄。特别是ezh1/2抑制剂unc1999在制备用于改善导丝拉伤导致的血管内膜新生，抑制血管再狭窄药物中的应用。抑制血管再狭窄可更有效的治疗动脉粥样硬化。
ezh1/2抑制剂unc1999的化学结构式：
本发明用导丝拉伤诱导大鼠血管再狭窄，发现新生内膜中血管平滑肌细胞h3k27me3含量显著增加，并且血小板源生长因子（pdgf-bb）增加了人的原代血管平滑肌细胞中h3k27me3水平。体内和体外给予ezh1/2的抑制剂unc1999可以抑制平滑肌细胞的迁移和增殖，同时缓解导丝拉伤引起的血管再狭窄。体内（50mg/kg）和体外（5μm）给予ezh1/2的抑制剂unc1999（实验用unc1999购买于selleck公司，货号为s7165。）结果表明unc1999可通过抑制ezh1/2降低血管再狭窄中平滑肌细胞h3k27me3的含量，从而抑制血管平滑肌的增殖和迁移，最终改善导丝拉伤导致的血管内膜新生，抑制血管再狭窄。ezh2可以作为血管再狭窄的一个治疗靶点，而unc1999也可能成为治疗血管再狭窄的一种新型药物。
附图说明
图1、导丝拉伤14天后血管新生内膜的平滑肌细胞中h3k27me3的含量显著增加；
用红色标记α-sma（平滑肌细胞的标记物）；绿色标记h3k27me3；蓝色为dapi;导丝拉伤14天后，血管平滑肌细胞（红色）中h3k27me3（绿色）的含量增加。
图2、血清和pdgf-bb处理增加了血管平滑肌细胞中h3k27me3和ezh2的含量
人的原代血管平滑肌细胞饥饿48小时后，用10%的胎牛血清或pdgf-bb（40ng/ml）处理36小时：（a）westernblotting检测h3k27me3的含量；（b）westernblotting检测ezh2的含量，*p<0.05；
图3、unc1999显著改善了导丝拉伤导致的血管内膜新生情况；
将大鼠分为假手术组、手术组和手术加药组：（a）免疫荧光显示血管平滑肌内h3k27me3的水平；用红色标记α-sma（平滑肌细胞的标记物）；绿色标记h3k27me3；蓝色为dapi;手术组血管平滑肌细胞（红色）中h3k27me3（绿色）的含量增加，手术加药组h3k27me3（绿色）的含量较手术组显著降低；（b）he染色和（c）evg染色显示血管狭窄情况；（d）分别是大鼠血管中膜面积、新生内膜面积、新生内膜与中膜面积之比、外弹力板周长的统计结果。n=6，*p<0.05vscwi。
图4、unc1999抑制pdgf-bb导致血管平滑肌细胞的增殖和迁移情况；人的原代血管平滑肌细胞饥饿48小时后，给予pdgf-bb处理的同时给或不给浓度为5μm的unc1999处理36小时：（a）westernblotting检测unc1999处理后h3k27me3的含量；（b）qpcr检测细胞增殖相关基因cyclind1和pcna的mrna表达水平；（c）brdu和mts检测细胞的增殖情况；（d）划痕实验和transwell实验检测平滑肌细胞的迁移；（e）是（d）图的统计结果，n=5，*p<0.05。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
大鼠颈动脉导丝拉伤后，迁移至新生内膜的血管平滑肌细胞h3k27me3含量显著增加
将18只200g左右的sd雄性大鼠随机分为2组，即假手术组和手术组。对手术组行左颈总动脉导丝拉伤手术，反复拉导丝6次，结扎颈外动脉；假手术组将颈外动脉开口，结扎，但不拉伤。14天后将大鼠安乐死，取损伤的左颈总动脉，包埋、切片并染色，然后用共聚焦荧光显微镜检测了h3k27me3的表达情况。免疫荧光的结果表明，导丝拉伤引起的血管再狭窄中，新生内膜中有大量的平滑肌细胞。新生内膜平滑肌细胞中的h3k27me3水平较假手术组显著升高（图1a）。对大鼠行左颈总动脉导丝拉伤手术14天后，新生内膜的平滑肌细胞中h3k27me3的含量显著增加。α-sma（平滑肌细胞的特异性标志蛋白）。sham：假手术组；cwi：颈总动脉导丝拉伤组。n=5。
实施例2
血清和pdgf-bb均可增加人的原代血管平滑肌细胞中h3k27me3的含量
血清和pdgf-bb刺激可以诱导平滑肌细胞的表型转换，使其由静止的平滑肌细胞转化为增殖和迁移能力强的平滑肌细胞。于是，我们将人的原代血管平滑肌细胞饥饿48小时后，用10%的胎牛血清或pdgf-bb（40ng/ml）处理36小时。westernbloting结果显示，血清和pdgf-bb均可显著增加平滑肌细胞中的h3k27me3和ezh2的水平显著增加（图2a-b）。以上结果表明血清或pdgf-bb可通过增加ezh2的表达从而增加h3k27me3的含量。
实施例3
ezh1/2的抑制剂unc1999显著改善了导丝拉伤导致的血管内膜新生（主要用来治疗减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管再狭窄）
为了研究h3k27me3含量增加在血管再狭窄中的作用，我们将18只200g左右的sd雄性大鼠随机分为三组，即假手术组、手术组及手术加药组。组行左颈总动脉导丝拉伤手术。假手术组将颈外动脉开口，结扎，但不拉伤。假手术和手术组灌胃给予unc1999溶剂，手术加药组给予unc1999（50mg/kg/天）灌胃，持续14天。将大鼠安乐死，取左颈总动脉，剔去多余结缔组织，oct包埋，冰冻切片，分别进行he、evg和免疫荧光染色。免疫荧光染色表明，unc1999可在体降低h3k27me3的水平（图3a）。而he和evg染色表明，unc1999可以显著缓解血管再狭窄（图3b-d）。
将大鼠分为假手术组、手术组和手术加药组：（a）免疫荧光显示血管平滑肌内h3k27me3的水平，α-sma（平滑肌细胞的特异性标志蛋白）；（b）he染色和（c）evg染色显示血管狭窄情况；（d）分别是大鼠血管中膜面积、新生内膜面积、新生内膜与中膜面积之比、外弹力板周长的统计结果。n=6，*p<0.05vscwi。
实施例4
prc2的抑制剂unc1999显著改善了pdgf-bb导致的血管平滑肌细胞增殖和迁移
为了在体外证明unc1999对治疗血管再狭窄的机制，我们用unc1999和pdgf-bb共同处理平滑肌细胞。体外检测表明，用5μm的unc1999处理平滑肌细胞，能将pdgf-bb上调的h3k27me3的水平降低到对照组水平（图4a）。将平滑肌细胞饥饿48h，然后用pdgf-bb和unc1999（5μm）同时处理36h，qpcr检测细胞周期蛋白cyclind1和pcna的表达（图4b），并用brdu和mts检测细胞的增殖（图4c），结果表明，pdgf-bb使平滑肌细胞的增殖能力增强，而unc1999则能够有效逆转这些作用。划痕和transwell实验则表明，unc1999可以缓解pdgf-bb引起的平滑肌细胞迁移能力增加（图4d-e）。以上结果表明，unc1999可通过抑制h3k27me3的含量抑制pdgf-bb导致血管平滑肌细胞的增殖和迁移（主要用来治疗减轻经皮冠状动脉成形术过程中由于机械损伤引起的血管再狭窄）。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。