本发明属于中药技术领域，具体涉及一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
肺癌是以咳嗽、咯血、胸痛、发热、气急等为其主要临床表现的一类恶性疾病。其发病率和病死率均居恶性肿瘤首位。肺癌的组织学亚型主要包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌，分别占肺癌的85％和15％。据文献报道，今年来，由于吸烟、大气污染、室内环境污染等发病因素，肺癌的发病率持续增高。迄今为止，西医治疗有手术、化疗和靶向药物等治疗手段。但在现有治疗模式下肺癌患者的总体治愈率＜20％，晚期患者5年生存率＜5％，治疗效果并不理想，并且因其药物毒副反应及高昂的费用，给患者生存质量带来影响。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种治疗肺癌的中药组合物及其制备方法和应用，该中药组合物能最大程度控制肿瘤，提高治愈率，改善患者生活质量，延长生存期。
为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼15-20份、白花蛇舌草15-20份、生牡蛎15-20份、法半夏9-15份、浙贝母9-15份、瓜蒌皮9-15份、仙鹤草9-15份、薏苡仁15-30份、夏枯草9-15份、莪术9-12份、陈皮9-12份、桔梗9-12份、山慈菇15-20份、太子参15-20份、南沙参9-15份、北沙参9-15份，生黄芪15-20份。
进一步优选的方案中，重楼15份、白花蛇舌草15份、生牡蛎15份、法半夏10份、浙贝母15份、瓜蒌皮15份、仙鹤草15份、薏苡仁30份、夏枯草15份、莪术10份、陈皮10份、桔梗10份、山慈菇15份、太子参15份、生黄芪15份、南沙参15份、北沙参15份。
进一步地，该中药组合物对原料组分提取有效物后制成药液、颗粒、膏药或药学上可接受的其他剂型。
本发明还涉及制备所述组合物的方法，包括以下步骤：将所有原料按配比混合，加水没过药材，然后慢火煎煮至水沸后再煮20分钟，过滤后得到药汁，重复上述煎煮及过滤过程两次，将所得药汁混合即得治疗肺癌的中药组合物的汤剂。
本发明还涉及所述的中药组合物在制备治疗肺癌的药物中的应用。
肺癌属祖国医学“肺积”、“痞癖”、“咳嗽”、“咯血”、“胸痛”等病症范畴。其病位在肺，但因脾胃功能虚衰，胃气败，谷气绝而不治；另肺金肾水，母子相生，二者生理病理相互联系，故与脾、肾关系密切。其病因病机复杂，多数医家认为本病是由内因(正气虚损)、外因(六淫邪毒、七情内伤、饮食劳倦)等多种因素共同作用的结果，但各家侧重点各有不同，尚无统一观点。治疗应以扶正祛邪、标本兼治为治则。
本发明所用重楼是百合科重楼属的植物七叶一枝花的干燥根茎。重楼具有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效。
本发明所用白花蛇舌草是茜草科耳草属植物的全草。白花蛇舌草具有清热解毒，利湿通淋的功效。
本发明所用生牡蛎是牡蛎科动物长牡蛎、大连湾牡蛎或近江牡蛎的贝壳。生牡蛎具有平肝潜阳；重镇安神；软坚散结；收敛固涩的功效。
本发明所用法半夏是天南星科植物半夏的块茎。法半夏有燥湿化痰的功效。
本发明所用浙贝母是为百合的功效与作用科植物浙贝母的鳞茎。浙贝母有有清热化痰，散结消痈的功效。
本发明所用瓜蒌皮是葫芦科植物栝楼及中华栝楼的果皮。瓜蒌皮具有清肺化痰、利气宽胸散结的功效。
本发明所用仙鹤草是蔷薇科植物龙芽草的地上部分。仙鹤草具有收敛止血,解毒疗疮,杀虫,涩汗,止咳的功效。
本发明所用薏苡仁是乔本科植物薏苡的干燥成熟种子。薏苡仁具有利水消肿，渗湿，健脾，除痹，清热排脓的功效。
本发明所用夏枯草是唇形科植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草具有清热泻火，明目，散结消肿的功效。
本发明所用莪术是姜科植物莪术的根茎。莪术具有行气解郁，破瘀，止痛的功效。
本发明所用陈皮是为芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮。陈皮具有理气健脾，燥湿化痰的功效。
本发明所用桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根。桔梗具有宣肺，利咽，祛痰，排脓的功效。
本发明所用山慈菇是为兰科植物杜鹃兰、独蒜兰或云南独蒜兰的干燥假鳞茎。山慈菇具有清热解毒，化痰散结的功效。
本发明所用太子参是为石竹科植物孩儿参的干燥块根。太子参具有益气健脾，生津润肺的功效。
本发明所用黄芪是为豆科黄芪属植物膜荚黄芪及内蒙古黄芪的根。生黄芪具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮生肌的功效。
本发明所用南沙参是桔梗科植物轮叶沙参.或沙参的干燥根。南沙参具有养阴清肺，益胃生津，化痰，益气的功效。
本发明所用北沙参为伞形科植物珊瑚菜的根。北沙参具有养阴清肺，益胃生津的功效。
方中选用生牡蛎取其软坚散结力强；法半夏重在燥湿化痰且毒性小，生黄芪偏重于扶正托毒，用在肺癌的治疗上更合适。
本发明的中药组合物具有组方精准，疗效确切，简便廉效等优点。南沙参、北沙参、太子参、陈皮、生黄芪为扶正类，余为攻下类。其中重楼、白花蛇舌草清热解毒，生牡蛎、法半夏、浙贝母、夏枯草软坚散结，陈皮、桔梗、瓜蒌皮、薏苡仁、桔梗、莪术行气化痰，太子参、黄芪、南沙参、北沙参、仙鹤草益气健脾。诸药合用，协同增效，共奏清热解毒、软坚散结、益气健脾、养阴生津之功效。该技术具有组方科学、疗效显著、辩证下药、机制明晰等优点。临床观察本发明对肺癌患者具有延缓肿瘤进展，甚至逆转肿瘤进展的作用。所用中药都是常见中药，给药方式简便，因此适合于基层医院，特别是不发达地区的推广应用。
附图说明
图1：mtt法检测中药组合物对a549细胞增殖的影响(注：同一浓度下组间比较比较#p＜0.05；##p＜0.01)。
图2：mtt法检测中药组合物对h1299细胞增殖的影响(注：同一浓度下组间比较比较#p＜0.05；##p＜0.01)。
图3：本发明中药组合物对人肺癌细胞a549迁移能力的影响(中药组合物低：0.5mg/ml；中药组合物高：1mg/ml；对照组：ddp1ug/ml)。
图4：本发明中药组合物对人肺癌细胞h1299迁移能力的影响(中药组合物低：0.5mg/ml；中药组合物高：1mg/ml；对照组：ddp1ug/ml)。
图5：中药组合物作用后人肺癌细胞a549的形态学变化(光镜下放大4倍，10倍，20倍，40倍)。
图6：中药组合物作用后人肺癌细胞h1299的形态学变化(光镜下放大4倍，10倍，20倍，40倍)。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐明本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。
实施例1：
一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼15份、白花蛇舌草15份、生牡蛎15份、法半夏10份、浙贝母15份、瓜蒌皮15份、仙鹤草15份、薏苡仁30份、夏枯草15份、莪术10份、陈皮10份、桔梗10份、山慈菇15份、太子参15份、生黄芪20份、南沙参15份、北沙参15份。
实施例2：一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼20份、白花蛇舌草15份、生牡蛎15份、法半夏10份、浙贝母15份、瓜蒌皮15份、仙鹤草15份、薏苡仁30份、夏枯草15份、莪术10份、陈皮10份、桔梗10份、山慈菇15份、太子参15份、生黄芪20份、南沙参15份、北沙参15份。
实施例3：一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼15份、白花蛇舌草15份、生牡蛎15份、法半夏10份、浙贝母15份、瓜蒌皮15份、仙鹤草15份、薏苡仁15份、夏枯草15份、莪术10份、陈皮10份、桔梗10份、山慈菇15份、太子参15份、生黄芪20份、南沙参15份、北沙参15份。
实施例4：一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼20份、白花蛇舌草15份、生牡蛎15份、法半夏12份、浙贝母15份、瓜蒌皮15份、仙鹤草15份、薏苡仁30份、夏枯草15份、莪术10份、陈皮10份、桔梗10份、山慈菇15份、太子参15份、生黄芪15份、南沙参15份、北沙参15份。
实施例5：一种治疗肺癌的中药组合物，包括按重量份计的以下组分：重楼18份、白花蛇舌草20份、生牡蛎20份、法半夏15份、浙贝母9份、瓜蒌皮9份、仙鹤草9份、薏苡仁20份、夏枯草9份、莪术12份、陈皮12份、桔梗12份、山慈菇20份、太子参20份、生黄芪18份、南沙参9份、北沙参9份。
临床资料
1、一般资料病例均为宜昌市中心医院专家门诊2016年5月-2017年11月。21例胸部ct及病理切片诊断为肺癌纳入标准，男13例，女8例，年龄45-80岁，平均年龄55岁，病程3个月到10年，平均2年。
2、诊断标准
(1)近期发生的呛咳、顽固性干咳持续数周不愈，或反复咯血痰，或不明原因的顽固性胸痛、气急、发热，或伴消瘦、疲乏等。
(2)年龄在40岁以上，大多数为有长期吸烟史的男性。
(3)慢性咳嗽者，当咳嗽性质发生改变，肺部局限性炎症反复发作。
(4)痰脱落细胞学检查是早期诊断肺癌的简单而有效的方法。
(5)胸部x线检查、ct、支气管碘油造影，纤维支气管镜检查。
(6)对长期吸烟、慢性咳嗽，有家族肿瘤病史者，以及对某些有害物质长期接触史者。
(7)对诊断为肺结核者，经抗痨治疗无效或治疗后病灶好转而又出现新的病灶者。
3、治疗方法采用中药组合物重楼15g、白花蛇舌草15g、生牡蛎15g、法半夏10g、浙贝母15g、瓜蒌皮15g、仙鹤草15g、薏苡仁30g、夏枯草15g、莪术10g、陈皮10g、桔梗10g、山慈菇15g、太子参15g、生黄芪20g、南沙参15g、北沙参15g。两日一剂，水煎，每日3次内服。
4、患者在治疗期间注意养成良好的生活习惯，均避免高脂饮食，戒烟酒，忌过劳，避免精神紧张，消除顾虑。14天为一个疗程，2到3个疗程后观察疗效。
5、疗效版定标准根据治疗前后症状总分，按公式求出疗效指数以判定疗效。疗效指数(治疗前症状总分-治疗后症状总分)/治疗前症状总分×100％。疗效指数<25％为无效；26％-50％为好转；51％-85％为显效；>86％为临床治愈。
6、治疗结果治疗21例肺癌患者后统计疗效，经本发明中药治疗1月以上后，14例患者咳嗽，咳血，咳痰，胸闷有好转，12例患者口干口苦，纳差，乏力等全身症状好转，症状改善者14例，有效率66.7％。经本发明中药治疗6月以上后，16例患者咳嗽，咳血，咳痰，胸闷有好转，15例患者口干口苦，纳差，乏力等全身症状好转，症状改善者16例，有效率76.2％。经本发明中药治疗1年以上后，20例患者咳嗽，咳血，咳痰，胸闷有好转，21例患者口干口苦，纳差，乏力等全身症状好转，症状改善者21例，有效率100％。治愈3例(14.3％)，显效12例(57.1％)，好转6例(28.6％)。该中药组合总有效率达100％。
治疗前后患者情况比较如表1所示。
表1
以下是本发明的典型病例：
病例一：龙学凤，女，53岁，于2016年8月9日就诊，刻下：咳嗽，黄痰，咯血，咽干，胸闷口干口苦，纳差，肋骨、背部及头部疼痛，大便不畅，神疲乏力，舌暗红苔白，脉弦滑。2016年6月20日临床诊断患者左下肺低分化腺癌ⅳ(痰热阻肺)。无手术，放化疗，持续使用药物靶向治疗。服用本发明的中药水煎液，每日3次，1次250ml，服用14天后，咳嗽咳痰减轻，偶有咯血，胸闷好转，仍有肋骨、背部及头部疼痛，大便不畅；继续服用30天后，咳嗽咳痰明显好转，胸闷气短乏力减轻，疼痛症状减轻，精神转佳。服药3月后偶有咳嗽咳痰，无口干，偶有口苦，肋骨、背部及头部疼痛明显改善，纳食佳，大小便正常，睡眠佳。患者继续服药6个月，无咳嗽咳痰，无咯血，偶有肋骨、背部及头部疼痛，全身症状转佳。
ct：2016年6月15日于宜昌市中心医院查，ct：双肺转移瘤，肝右叶转移瘤、双肺感染。2016年9月22日，中心医院查胸片ct(ct890527)，双肺可见多发团块状、结节状密度增高影，边缘不光整，可见毛刺，大小不等，部分融合，较大一个位于右上肺，直径4.1cm，另见多发厚壁空洞形成。双肺可见片状密度增高影，边缘模糊，纵隔及淋巴结轻度肿大。肝脏形态正常，肝右叶可见类椭圆形低密度灶，大小4.2*2.6cm，边界欠清。较前片(2016.08.16)，肝右叶病灶缩小。双肺多发结节影及团片影减少，部分明显缩小，密度减低。双肺片状影范围较前片明显缩小。1、右肺癌并双肺转移治疗后，较前明显好转2、纵隔及肺门淋巴结轻度肿大3、肝右叶转移瘤，较前缩小。2017年1月11日，宜昌市中心医院胸部ct(ct932505)，较前片(2016-09-22)复查，右上肺肿块较前片略有缩小，最大横截面积25mm*33mm(肺窗)，余双肺结节及片状影较前大致相仿。肺内结节低密度灶较前缩小，直径32mm，纵隔及肺门增大淋巴结较前缩小。
病例二：姜远琼，女，74岁，于2016年11月15日就诊，刻下：咳嗽无力，咳黄痰黏稠，咳血，颜面萎黄暗淡，头晕头痛，纳呆肉削，口干，失眠，小便频数，舌红苔白厚，脉细。临床诊断右下肺癌(气阴两虚)。采取本发明的中药水煎液，每日3次，1次250ml，服用30天后，咳嗽无力缓解，偶有咳血；继续服用3个月后，咳嗽胸闷明显减轻，头晕头痛减轻，食欲转佳，睡眠质量转好；连续服用6个月后，偶有咳嗽，无咳血，无失眠、口苦口干症状，纳食佳，精神好转。继续服药1年左右，患者偶有咳嗽，无其他明显症状。
ct：2016年12月20日宜昌市中心医院查，冠脉搭桥、左上肺切除术后复查：左肺容积缩小、左上见楔形稍高密度影。右肺新见数枚小结节影，双肺纹理增多，双肺可见结节状及条索密度增高影，局部胸膜肥厚粘连；右下肺见淡薄模糊影。纵隔淋巴结未见明显肿大。部分胸椎骨质密度不均。胸骨内固定中。较前片(2016.3.9)右下肺病灶部分吸收，左侧胸腔积液吸收。2017年8月14日于宜昌市中心医院双肺常规ct:左肺部分切除术后：双肺纹理增多，双肺见条索状及结节状稍高密度影，纵隔未见明显肿大淋巴结影。部分椎体及左侧部分肋骨骨质密度欠均。较前片(2017.6.21)，左下肺小结节较前稍缩小，右下肺斑片状稍吸收，余大致相仿。
病例三：苏友新，男，65岁，于2016年8月16日就诊，刻下：咳嗽，咳痰粘稠，气短乏力，胸闷，皮肤瘙痒，纳食差，股骨疼痛，舌红苔少，脉细。临床诊断右上鳞癌术后4月t2n0m0ⅱa期(气阴两虚)。采取本发明的中药水煎液，每日3次，1次250ml，服用10天后，咳嗽咳痰减轻，胸闷好转。服药30天后，偶有咳嗽胸闷，无气短乏力，皮肤瘙痒好转，偶感股骨疼痛。服药3个月后，患者无咳嗽，纳食佳，无明显全身症状。继续服药6月，患者自述无明显症状。
ct:2016年9月12日，住院查：1.右上肺术后，右侧肋骨术后，右侧胸腔积液部分包裹，较前减少2、慢性支气管炎，肺气肿，考虑双肺陈旧性肺结核3、双肺纤维增殖灶，钙化灶4、双侧胸膜肥厚粘连伴钙化。2017年2月17日中心医院查胸部ct：右上肺切除术后，双肺纹理增多、紊乱，右侧肺门结构欠清，其内见钙化。双肺可见多发结节状和条片状密度增高影，部分伴钙化，边界不清。双侧胸膜肥厚粘连伴钙化。纵隔淋巴结增多，部分轻度增大。右侧胸腔内见低密度液性区，部分包裹。右侧多发肋骨术后改变。较前片(2016-09-12)，右侧胸腔积液略有减少。
病例四：吴德华，男，49岁，于2017年3月17日就诊，刻下：咳嗽频繁，咳黄痰黏稠，咳血，口干，胸闷乏力，失眠，小便频数，大便干，发热盗汗，舌红苔白厚，脉细数。临床诊断左上肺鳞癌术2年余，术后复发pt2n2m1ⅳ期(气阴两虚)。采取本发明的中药水煎液，每日3次，1次250ml，服用14天后，咳嗽减轻，偶有咳血，胸闷好转，仍盗汗失眠，大便干；继续服用30天后，咳嗽咳血明显减轻，偶有胸闷乏力，睡眠质量转佳，大小便正常；连续服用3个月后，偶有咳嗽，无咳血，无胸闷、乏力盗汗，纳食佳，夜寐安，精神佳。继续服药6个月，患者无明显自觉症状。
ct：2017年3月16日于宜昌市中心医院查，胸部ct(957637)：左肺术后，气管纵隔左移，左侧胸腔少量积液。右肺见少许小结节影，支气管隆突下淋巴结略增大。右主支气管局部稍变窄，管腔不光整。增强扫描双肺内未见明显异常强化灶。与前片(2017-01-23)，右肺中叶小斑片影基本吸收。1、左肺术后，左侧胸腔少量积液伴胸膜肥厚。右肺少许纤维增殖灶。2、隆突下淋巴结稍增大，右主支气管局部管腔稍变窄3、右肺多发小结节。2017年5月11日于宜昌市中心医院查，胸部ct(983212)：左肺术后，气管纵隔左移，左侧胸腔少量积液。右肺见少许小结节影，右下肺见小斑片状模糊影。支气管隆突下淋巴结稍增大。较前片(2017.03.16),右肺下叶小斑片影稍增大。2017年6月8日于宜昌市中心医院查胸部ct(995705)，左肺术后，气管纵隔左移，左侧胸腔少量积液。右肺见少许结节影，右下肺见小斑片状模糊影。支气管隆突下淋巴结稍增大。较前片(2017-05-11)，大致相仿。2017年8月10日中心医院胸部常规ct(ct1025998)：左肺术后，气管纵隔左移，左侧胸腔少量积液。右肺见少许小结节影，右下肺见小斑片状模糊影。支气管隆突下淋巴结稍增大。较前片(2017-06-08)，右下肺斑片影稍吸收，余大致相仿。2017年10月23日宜昌市中心医院查胸部ct：左肺术后，气管纵隔左移，左侧胸腔少量积液。右肺见少许小结节影，右下肺见少许索条影。支气管隆突下淋巴结稍增大。较前片(2017-08-10)，右下肺模糊影大部分吸收，余大致相仿。
实验研究
本发明中药组合物对人肺癌a549、h1299细胞抑制作用的实验研究
扶正固本、功毒散结是肺癌的主要治疗原则，本实验部分首先通过临床经验用药筛选出对应作用并效果显著的17味药作为因素，以抑制肺癌细胞生长、迁徙及诱导其形态学变化为指标，确定本发明组成抑制肺癌的效果。
1、实验材料
1.1实验原料与试剂北沙参，南沙参，太子参，陈皮，法半夏，黄芪，重楼，仙鹤草，夏枯草，白花蛇舌草，山慈菇，桔梗，生牡蛎，薏苡仁，浙贝母，莪术，瓜蒌皮由宜昌市中心人民医院提供。rpmi1640培养基，胎牛血清，双抗，磷酸缓冲生理盐水pbs，胰蛋白酶(gibco公司)；dmso(二甲基亚砜，上海生工生物工程有限公司)；塞唑蓝(mtt,sigma公司，批号m2128)。
1.2细胞人肺癌a549、h1299细胞本校三级研究室保存
主要实验仪器蒸发器re-52a(上海亚荣生化仪器厂)；kq-250b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；kdm型调温电热套(山东鄄城永光仪器厂)；中草药粉碎机(中国)；dk-s26电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；微量取样器(200μl，1000μl各一)；光学显微镜，日本olympus公司；型号：xs-213；全波长酶标仪，thermo公司，型号：mutiskanspectrum；co2恒温细胞培养箱，日本sanyo公司，型号：mco175
2、实验方法
2.1本发明中药组合物药物选用
选择标准：临床证实治疗肝癌有效。
选用药物：北沙参15g,南沙参15g，太子参15g,陈皮10g，法半夏10g，黄芪15g，重楼15g，仙鹤草15g，夏枯草15g，白花蛇舌草15g，山慈菇15g，桔梗10g，生牡蛎10g，薏苡仁30g，浙贝母15g，莪术10g，瓜蒌皮15g。
2.2本发明中药组合物提取：将本发明中药组合物放入圆底烧瓶中，加水没过药材，浸泡半小时，将圆底烧瓶放入加热套上，装上冷凝管等装置进行加热。慢火煎煮，待水沸腾后调至小火煮半小时，过滤后得药汁，重复上述步骤2次，混合所得药汁。将所得药汁再通过过滤器过滤1-2遍。将滤后的药汁置80℃恒温水浴锅中蒸发，直至液体浓缩至100ml，取50ml进行冷冻干燥后称重为22.57g，制备成含10％胎牛血清450mg/ml的药物培养液。用药前用培养基稀释后用0.22um微孔滤膜过滤灭菌后使用。
2.3mtt法测定药物a549、h1299细胞增殖实验影响
取对数生长期的a549、h1299细胞，用胰酶消化后制备细胞悬液，细胞计数并调整细胞浓度为4×104/ml；使用移液器将细胞悬液接种至96孔板中(100μl/孔)，然后将96孔板放置在37℃、含5％co2的细胞培养箱中培养孵育24h；而后向每孔中加入100μl药物，并设置空白组、正常对照组、不同浓度中药组合物组，每个浓度设置5个复孔，然后分别培养24h、48h；将药物吸出并加入pbs清洗，然后每孔加入100ulmtt溶液(mtt：无血清培养基稀＝1:9)，将培养板放置在细胞培养箱中继续孵育4h；用酶标仪测定570nm波长处各孔的吸光度值(od值)，并根据下列公式计算细胞生长抑制率(％)＝(对照组od值-实验组od值)/(对照组od值-空白组od值)×100％。
2.4细胞迁移实验
用marker笔沿着直尺在6孔板背面画横线穿过孔横线，线与线之间间隔0.5cm，每个孔划5条平行横线；取对数生长期的a549、h1299细胞制备细胞悬液，细胞计数并调整细胞浓度至5×105/ml；将细胞悬液按2ml/孔加入到6孔板中，培养适当时间，当细胞铺满6孔板90％左右密度后，用10μl枪头沿着直尺垂直于培养板背后的横线划痕，用pbs轻轻冲洗2次以去除被划掉的细胞；然后在6孔板中加入无血清的培养基，设置正常组、对照组(ddp1μg/ml)和不同浓度用药组，在倒置显微镜下拍取0h时各组细胞划痕区的照片，再按照分组不同加入各自对应的药物，在37℃，含5％co2培养箱中继续培养24h和48h后，分别再在倒置显微镜下拍取细胞划痕区照片，本次实验重复3次。
2.5形态学实验
取对数生长期的人肺癌细胞a549、h1299，胰酶消化后用完全培养基重悬细胞，将重悬细胞接种至一次性细胞培养皿，分为中药组合物和正常对照组，分别加入0.5mg/ml的中药组合物制备液和等量的培养基至细胞培养液中，将培养皿放入细胞培养箱培养24h后，用倒置显微镜观察不同放大倍数下细胞的形态学改变。
2.6数据统计处理
运用spass18.0统计软件进行统计分析。数据以均数标准差(±s)表示，两组间的两两比较，方差齐性时用lsd法进行分析，方差不齐时，用tamhane法进行分析。p<0.05认为有统计学意义，p<0.01认为有显著统计学意义。
3、结果
3.1本发明中药组合物提取液对a549与h1299细胞增殖抑制率
如表2和图1所示，以mtt法检测不同药物浓度中药组合物提取液在24h、48h两个时间点的细胞抑制率。结果显示，不同药物浓度在不同时间点对人肺癌细胞a549细胞的生长表现出不同的抑制效果。其中，随着浓度的增大，抑制率显著提高，与正常组比较，差异有显著统计学意义(p＜0.01)。并且在同样浓度下，48h的抑制率明显高于24h(p＜0.05)。当中药组合物提取液的浓度为1mg/ml时，其48h抑制率就达到84.64％。
如表3和图2所示，以mtt法检测不同药物浓度中药组合物提取液在24h、48h两个时间点的对h1299细胞抑制率。结果显示，不同药物浓度在不同时间点对h1299细胞的生长表现出不同的抑制效果，随着浓度的增大，抑制率上升，与正常组比较，有显著统计学差异(p＜0.01)。同一浓度下，48h抑制率与24h抑制率差异无明显统计学意义。当中药组合物提取液的浓度为0.5mg/ml时，其48h抑制率就达到66.86％。
表2不同浓度中药组合物对a549细胞24h及48h生长的抑制率
注:组内比较，与正常组od值比较*p＜0.05，**p＜0.01；相同浓度24h与48h的od值比较#p＜0.05，##p＜0.01。
表3不同浓度中药组合物对h1299细胞24h及48h生长的抑制率
注:组内比较，与正常组od值比较*p＜0.05，**p＜0.01；组间比较比较#p＜0.05；##p＜0.01。
3.2本发明中药组合物提取液对肺癌细胞a549、h1299迁移能力的影响
根据mtt实验结果，选用0.5mg/ml和1mg/ml的中药组合物处理a549细胞，a1299细胞，分为正常组，中药组合物低剂量组，中药组合物高剂量组，对照组(ddp1μg/ml)。应用倒置显微镜观察人肺癌细胞a549、h1299细胞在24h及48h之内划痕区的变化情况。其结果显示：空白对照组的划痕区有大量细胞重新迁移覆盖，与空白对照组比较，中药组合物低剂量及高剂量组划痕区有少量细胞重新迁移覆盖，但发生迁移的细胞数目明显减少，重新被细胞覆盖的面积不明显，因此本发明中药组合物能抑制a549、h1299细胞迁移，并且结果具有显著性，结果见图3，图4。
3.4本发明中药组合物提取液对肺癌细胞a549、h1299形态学的影响
如图5，图6所示，正常对照组细胞排列规则，连接紧密，细胞形态及细胞膜界限清晰，核呈圆形并位于细胞中央；而用1mg/ml本发明中药组合物作用后，细胞数量明显减少，细胞间距增大，形态不规则，内部颗粒增多，部分细胞变圆、皱缩，并出现脱落死亡细胞，细胞逐渐破碎死亡。
4、讨论
肺癌高发病率和病死率，预后差易转移复发。目前治疗手段有手术与放化疗，伴随严重不良反应，预后差。中药治疗肺癌的特点在于控制病情，使患者长期“带瘤生存”，改善生活质量，延长生存期。
对肺癌的病因分析，祖国医学认为为正气本虚，邪毒内侵所致。在治法方面，各个医家都有不同的总结，中医理论结合中药现代研究给我们提供的许多微观资料成为我们选方的依据。我们选用临床上治疗有效的中药来做实验研究，初步确定17味中药，有清热解毒，散结消肿，补益正气，活血化瘀等几类功效。
本发明中药组合物对21例患者的临床研究发现，所有患者在治疗14天后躯体功能、情绪功能、总健康状况及食欲丧失、气促、咳嗽、胸闷症状均得到明显改善，有效率达100％。其中典型病例ct显示其病灶较前明显吸收缩小，肺癌标志物也明显趋于正常。
现代研究表明，许多疾病的发生与细胞凋亡过程密切相关，因此细胞凋亡在抗肿瘤药物评估方面有重要意义。细胞凋亡是在某些生理或病理情况下细胞受到某种信号的刺激后主动参与的由基因编码程序的细胞死亡过程。细胞凋亡是机体为保持自身组织稳定，保持细胞的增殖和死亡之间的平衡，在有关基因的调控下，细胞内的死亡级联反应被触发所致的主动性死亡过程。研究表明，不少抗肿瘤中药都可通过干扰肿瘤细胞生长、代谢、增殖等过程，最终触发肿瘤细胞凋亡来达到治疗肿瘤的目的，所以细胞凋亡亦成为评估疗效的一项新指标。
本实验是应用人肺癌细胞a549、h1299体外培养，探究本发明中药组合物对肺癌细胞凋亡的影响。选用人肺癌细胞a549、h1299。由本校三级实验室保存。细胞培养均严格执行无菌操作。
我们应用实验研究本发明中药组合物不同质量浓度对不同肺癌细胞的体外研究。通过mtt实验结果发现，本发明中药能明显抑制肺癌细胞增长，且呈剂量依赖性。浓度越高，对于细胞的抑制率越高。当浓度为0.5mg/ml，对于h1299细胞24h的抑制率达50％。当浓度为1mg/ml时，对于a549细胞24h抑制率达55.83％。此外对于细胞迁移实验发现，当浓度为0.5mg/ml时，本发明中药组合物能够抑制a549细胞与h1299细胞迁移。形态学观察是判断细胞凋亡最直观的方法。光镜下观察可看到细胞的形态学特点来判断细胞凋亡直观且较为简单易行。凋亡细胞在形态学上将发生特征性的变化：首先是细胞的皱缩，细胞密度的增加，然后由于核纤层和细胞骨架的解体，染色质高度浓缩，浓缩的染色质可围绕于核周边(称为边聚)或形成新月体结构，浓缩的核还常常裂解为几个大的碎片，分散于细胞的不同部位；随后通过细胞膜内陷或发泡、出芽等方式，细胞裂解为数个凋亡小体。本实验光镜下观察中细胞明细皱缩，染色质高度浓缩，随后裂解死亡。
肺癌的发生发展是多因素、多阶段、多位点的变化过程，其发生的病理、分子机制复杂而中医药与此相应具有多成分、多系统、多靶点综合抗肝肿瘤效应的特点。