本发明涉及组织工程技术领域，且特别涉及一种具有三维取向结构的神经移植物及其制备方法和制作设备。
背景技术：
随着社会经济发展，机械化程度日益提高，人口流动性高，交通事故和运动意外等均可造成周围神经损伤。人的周围神经自我修复能力有限，周围神经损伤往往是永久性的，周围神经损伤后的修复与功能重建一直以来都是临床医学界研究的一大难题。临床治疗短距离的神经缺损可以通过端对端的缝合，但对于中长距离的神经缺损则需要神经移植物来桥接修复。目前，外周神经损伤修复的标准是自体神经移植。
自体神经移植可以为损伤部位提供充足的有利于神经轴突再生的细胞，自体神经腔内的径向通道也为轴突再生提供良好的物理引导作用。然而自体神经移植用于治疗具有很多限制，例如：神经移植物来源少，供体部位病变，供体神经尺寸不吻合和需要进行多次手术等。(nerveguidanceconduitsbasedondouble-layeredscaffoldsofelectrospunnanofibersforrepairingtheperipheralnervoussystem)因此，基于组织组织工程原理，发展人工构造的神经移植物替代自体移植是有必要、有意义的，可以为周围神经缺损治疗提供一种新策略。
理想的神经桥接物应该是具有以下特点：(1)良好的生物相容性和体内降解性能；(2)具有可塑性，尺寸可调节并且具有一定的机械强度；(3)对神经迁移和轴突再生具有物理引导作用；(4)提供神经再生所需要的营养因子，调节神经细胞生长、分化，提高轴突生长速度。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种具有三维取向结构的神经移植物，其能够提供较佳的力学支撑和物理引导细胞的作用，有效引导神经再生。
本发明的另一目的在于提供一种具有三维取向结构的神经移植物的制备方法，操作可控、方便、可靠。
本发明的另一目的在于提供一种制备具有三维取向结构的神经移植物的制作设备，结构简单，同时有效提高制备具有三维取向结构的神经移植物的效率。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种具有三维取向结构的神经移植物的制备方法，其包括：
将聚合物溶液经静电纺丝形成纤维并落入接收液，其中，接收液定向流动呈层流或过渡流状态。
接收液选自环己烷、c1-c6的醇中的任意一种，优选为甲醇、乙醇或丙醇。
本发明提出一种具有三维取向结构的神经移植物，其由上述制备方法制得。
本发明提出一种制备上述具有三维取向结构的神经移植物的制作设备，其包括静电纺丝设备以及旋转接收设备，旋转接收设备包括底座、电机以及转盘，底座与转盘可拆卸连接，底座设有安装槽，电机设置于安装槽内且电机与转盘同轴连接用于驱动转盘转动，电机设有速度控制器。
转盘远离底座的一侧具有容纳腔，容纳腔设有突出于其底壁的固定轴，固定轴为圆柱体，固定轴与容纳腔之间形成环状的液槽，静电纺丝设备包括注射针头，注射针头位于液槽的上方且与液槽间隔设置。
本发明实施例的具有三维取向结构的神经移植物及其制备方法和制作设备的有益效果是：
向聚合物溶液(纺丝液)施加高电压，带同种电荷的聚合物溶液互相排斥形成小液滴溶剂不断挥发形成喷流，同时受到电场力的拉伸作用，快速形成纤维向接收板(低电场处)喷射。纤维在空气飞行过程中随着溶剂蒸发而逐渐固化，最终落到旋转接收设备中的定向流动呈层流或过渡流状态的接收液中。纤维在接收液中处于悬浮状态，并随着液流方向定向流动，液流对纤维具有拉伸取向作用，由于旋转接收设备中部是圆柱状的固定轴，从而使旋转时，液槽中液体稳定的定向流动不会形成漩涡，最终纤维形成一圈成具有一定直径的纤维束，形成三维取向结构。
同时，旋转液体接收操作简单，可以高效制备具有三维结构的取向静电纺丝纤维材料。制得的取向微米纤维可以对神经细胞、血旺细胞迁移、生长提供物理引导作用。同时人工合成聚合物制备的三维取向纤维材料力学强度高，支撑效果佳。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的旋转接收设备的结构示意图；
图2为本发明实施例2提供的在纯水中浸泡待用的神经移植物的实物图；
图3a为本发明实施例2提供的冻干后的神经移植物的实物图；
图3b为图3中神经移植物的扫描电镜微观结构图；
图4为本发明实施例3提供的pdnm预凝胶溶液的实物图；
图5为本发明实施例3提供的pdnm-gel实物图；
图6为本发明实施例3提供的pdnm-gel的微观结构图；
图7a为本发明实施例3提供的冻干前的神经移植物的实物图；
图7b为本发明实施例3提供的冻干前的神经移植物的实物图；
图8为本发明实施例3提供的冻干后的神经移植物的扫描电镜图。
图标：10-旋转接收设备；11-底座；111-安装槽；12-电机；13-转盘；131-容纳腔；133-固定轴；135-液槽。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的具有三维取向结构的神经移植物及其制备方法和制作设备进行具体说明。
由于与无规取向纤维支架相比，轴突在取向纤维上长得更好，取向纤维更有利于神经干细胞的延长和轴突的生长。同时，纤维直径也会影响神经细胞的分化，纳米纤维更有利于神经干细胞的分化。
因此，本发明提供一种具有三维取向结构的神经移植物，其由以下方法制得：
s1.将聚合物溶液经静电纺丝形成纤维并落入接收液，其中，接收液定向流动呈层流或过渡流状态，从而得到具有三维取向结构的微米纤维。
上述作用机理为：向聚合物溶液(纺丝液)施加高电压，带同种电荷的聚合物溶液互相排斥形成小液滴溶剂不断挥发形成喷流，同时受到电场力的拉伸作用，快速形成纤维向接收板(低电场处)喷射。纤维在空气飞行过程中随着溶剂蒸发而逐渐固化，最终落到定向流动呈层流或过渡流状态的接收液中。纤维在接收液中处于悬浮状态，并随着液流方向定向流动，液流对纤维具有拉伸取向作用，同时定向流动不会形成漩涡，最终纤维形成一圈成具有一定直径的纤维束。
其中，需要注意的是，接收液需经定向流动，从而有效避免形成漩涡，形成层流或过渡流状态，使最终纤维形成一圈成具有一定直径的纤维束，形成三维取向结构。
本发明较佳的实施例中，接收液经40～60r/min。例如43r/min、45r/min、46r/min、48r/min、53r/min或55r/min的搅拌速率形成层流或过渡流状态；形成的层流或过渡流状态使得最后形成的具有三维取向结构的微米纤维的结构佳。
进一步地，本发明较佳的实施例中，接收液选自接收液选自环己烷、c1-c6的醇中的任意一种。优选为甲醇、乙醇或丙醇，一方面便于后续去除，同时无毒，另一方面便于获取。
本发明较佳的实施例中，聚合物选自左旋聚乳酸、聚己内酯、聚乙醇酸以及聚乙丙交酯中的任意一种；其生物相容性佳，可降解，提供较佳的力学支撑。其中，聚合物溶液，是指将聚合物与溶剂混合所得，其作为纺丝液。其中，溶剂为无毒，同时对于聚合物的溶解度较佳的试剂，例如三氟乙醇等，此处可参考现有的技术。
优选地，聚合物溶液于静电纺丝前超声振荡，去除聚合物溶液中的空气，使得后续得到的具有三维取向结构的微米纤维质量均一。
本发明采用静电纺丝技术，有效得到微米和/或纳米纤维，静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液在强电场中进行喷射纺丝，在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即“泰勒锥”)，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝，这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。
本发明较佳的实施例中，静电纺丝中纺丝液的注射速度为1～4ml/h，例如1～3ml/h、2～4ml/h或1.5～3.5ml/h。优选地，静电纺丝的针尖距离接收液的液面距离为4～10cm，例如4cm、5cm、6cm、7.5cm、8.5cm或9cm等，针头接电压为+10kv～+15kv的高压电。上述条件下，静电纺丝效果佳。
本发明较佳的实施例中，还包括去除微米纤维的表面的接收液；防止接收液影响后续神经细胞的活性，或对神经细胞造成一定的副作用。
优选地，本发明较佳的实施例中，去除微米纤维的表面的接收液包括：先用乙醇冲洗，随后浸泡于纯水中，浸泡完成后吸干微米纤维的表面附着的水分。
本发明较佳的实施例中，还包括在去除接收液后于-30～-50℃下预冷1～2h，让水结冰保持住支架材料的形状结构，随后冷冻干燥，得到干燥后的骨架，便于后续进行科学研究以及储藏、运输等。同时，采用预冷以及冷冻的形式，有效干燥的同时，抑制其在干燥过程中的收缩率，便于更精准的进行后续操作。例如-45℃、-47℃或-50℃，在冷冻的状态下抽真空，让材料中的冰块升华最后得到干燥的材料。冻干与常温干燥相比，能较好的保持材料结构，防止材料坍塌。
上述得到的具有三维取向结构的微米纤维可以作为神经移植物提供较佳的力学支撑和物理引导细胞的作用，有效引导神经再生。但是，理想的神经桥接物应该是具有提供神经再生所需要的营养因子，调节神经细胞生长、分化，提高轴突生长速度。同时单一的物理引导作用，缺乏生物活性和生物营养物质的桥连支架不利于长段神经的修复。
因此，本发明较佳的实施例中，还包括：
s2.将具有三维取向结构的微米纤维浸泡于预凝胶溶液中，凝胶化。有效解决上述问题。需要说明的是，预凝胶溶液是指水凝胶未凝胶化之前呈溶液状态的凝胶溶液，其在凝胶化后，才呈现水凝胶状态。
水凝胶的引入，与具有三维取向结构的微米纤维结合，形成微-纳米多级结构，多级结构促进神经细胞分化，同时去细胞基质水凝胶以及生物凝胶具有良好的生物活性，提高了材料的生物相容性等。此时，人工合成聚合物制备的三维取向纤维材料力学强度高，在神经移植物中作为骨架材料，可以弥补水凝胶强度弱的不足。
其中，预凝胶溶液中为去细胞基质预凝胶溶液中或生物预凝胶溶液，生物预凝胶溶液选自明胶的预凝胶溶液、胶原的预凝胶溶液和多肽预凝胶溶液中的任意一种。例如生物预凝胶溶液为rada多肽预凝胶溶液或明胶的预凝胶溶液等。本发明较佳的实施例中，去细胞基质预凝胶溶液例如去细胞基质预凝胶溶液为猪、牛或羊等容易大规模取材的动物上的某些组织通过脱细胞处理的材料经脱细胞并制作成预凝胶溶液。同时，去细胞基质预凝胶溶液包括脑、脊髓、小肠黏膜下层或心包等组织。
优选地，本发明较佳的实施例中，去细胞基质预凝胶溶液为神经去细胞基质预凝胶溶液；优选地，去细胞基质预凝胶溶液优选为猪源性周围神经去细胞基质预凝胶溶液(pdnm-gel)。pdnm-gel的引入，与三维结构的取向静电纺丝纤维材料结合，形成微-纳米多级取向结构，有效促进神经细胞分化，同时pdnm-gel具有良好的生物活性，进一步提高了生物相容性等。
其中，需要说明的是，去细胞基质水凝胶可直接购买于市面或按照现有的方法制得，本领域人员可根据实际需求进行限定，在此不做具体的限定。
优选地，于温度小于37℃的条件下，优选2～10℃，例如3、4、5或6℃等，将具有三维取向结构的微米纤维浸泡于预凝胶溶液中，随后于37℃的条件下凝胶化所得。其中，此处的37℃的条件下凝胶化是指预凝胶溶液的凝胶化，即固化的温度为37℃。于温度小于37℃的条件下其为溶胶状态，有效提高浸泡的效率以及充分性。
可选地，凝胶化后，刮除得到的材料表面多余的水凝胶，即可。
本发明较佳的实施例中，还可以根据需求进行神经营养因子的添加，有利于长段神经缺损再生。
本发明较佳的实施例中，还包括凝胶化之前，于预凝胶溶液中加入神经营养因子；此时加入，有效使得神经营养因子与溶液状的预凝胶溶液混合均匀，负载于具有三维取向结构的微米纤维，提高神经移植物的质量的均一性。
本发明较佳的实施例中，优选地，神经营养因子在预凝胶溶液的含量为1ug/ml～20mg/ml，例如10ug/ml、30ug/ml、60ug/ml、10mg/ml、40mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、14mg/ml、17mg/ml、19mg/ml等。
本发明较佳的实施例中，优选地，神经营养因子包括神经神经营养因子、碱性成纤维神经营养因子、脑源神经营养因子、神经营养因子3和胶质细胞源神经营养因子中的至少一种。例如神经营养因子为神经神经营养因子或碱性成纤维神经营养因子，或脑源神经营养因子和神经营养因子3的混合物等。
本发明还提供一种制备上述具有三维取向结构的神经移植物的制作设备，其包括静电纺丝设备以及旋转接收设备，旋转接收设备包括底座、电机以及转盘，底座与转盘可拆卸连接，底座设有安装槽，电机设置于安装槽内且电机与转盘同轴连接用于驱动转盘转动，电机设有速度控制器。
具体地，转盘远离底座的一侧具有容纳腔，容纳腔设有突出于其底壁的固定轴，固定轴为圆柱体，固定轴与容纳腔之间形成环状的液槽，静电纺丝设备包括注射针头，注射针头位于液槽的上方且与液槽间隔设置。
优选地，容纳腔为圆柱状的容纳腔，固定轴的直径为容纳腔的直径的1/4～2/5。上述制作设备结构简单，同时有效提高制备具有三维取向结构的神经移植物的效率。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
请参阅图1，本实施例提供一种制备具有三维取向结构的神经移植物的制作设备(图未示)，其包括静电纺丝设备(图未示)以及旋转接收设备10。
其中，静电纺丝设备为现有的设备，在此不做具体的赘述。静电纺丝设备包括具有注射针头的注射器(图未示)，用于在电场作用下，针头处的聚合物溶液在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即“泰勒锥”)，并从圆锥尖端延展得到微米或纳米级直径的聚合物细丝。
旋转接收设备10包括底座11、电机12以及转盘13，底座11与转盘13可拆卸连接，本实施例中，优选为底座11与转盘13卡接。
底座11设有安装槽111，电机12设置于安装槽111内，电机12的输出轴与转盘13同轴连接用于驱动转盘13与电机12同步转动，电机12设有速度控制器(图未示)。
转盘13远离底座11的一侧具有容纳腔131，容纳腔131设有突出于其底壁的固定轴133，固定轴133与容纳腔131之间形成环状的液槽135，注射针头位于液槽135的上方且与液槽135间隔设置。
固定轴133为圆柱体，容纳腔131为圆柱状的容纳腔131，固定轴133的直径为容纳腔131的直径的1/4～2/5，本实施例中，固定轴133的直径为容纳腔131的直径的1/3。可选地，固定轴133可以为空心，也可以为实心，在此不做限定。固定轴133的轴线与容纳腔131的轴线重合，即固定轴133位于与容纳腔131的中心设置，使得转动过程中，位于液槽135内的液体流动更为稳定。也即是，液槽135的截面呈圆环状。
实施例2
一种具有三维取向结构的神经移植物，其采用实施例1提供的制作设备，采用以下方法制得：
将特性粘度为3.8的聚乳酸作为有效成分，采用三氟乙醇作为溶剂，配置浓度为10％(0.1g/ml)的plla溶液，常温下搅拌溶解24小时，制得聚合物溶液，也即是纺丝液。
静电纺丝前通过超声波振荡的方法除去纺丝液中的气泡后，将纺丝液加入静电纺丝设备中的注射器，使用国标9号的平口针头。
静电纺丝装置开启前，向液槽内加入乙醇作为接收液，其中，乙醇加入的量为液槽深度的一半。然后开启旋转接收设备，电机带动转盘旋转，旋转速度约为1圈/秒，从而使液槽内的接收液旋转，形成层流或过渡流。
静电纺丝注射器置于液槽中的液体上部，针尖距离液面约4cm，针头接上高压电，电压为+10kv～+15kv，旋转接收设备接地。纺丝液注射速度为1ml/h。
纺丝过程中，纺丝液喷出，形成泰勒锥，纤维形成后落入液槽固化，同时在乙醇溶液中均匀悬浮分散，并随着液流形成取向结构。
静电纺丝结束后，成条取出液槽中的静电纺丝纤维，用75％，50％，25％梯度乙醇洗涤，每种浓度各洗涤2小时，最后置于纯水中浸泡待用，神经移植物实物图如图2所示。
需要说明的是，静电纺丝的尺寸(长度、直径)可以根据实际需要通过控制纺丝液的用量和后期剪裁控制。
将纯水中浸泡待用的神经移植物经过-40摄氏度预冷1小时，使用冻干机冷冻干燥48小时后的得到干燥的神经移植物，其实物图如图3a所示，其扫描电镜图如图3b所示。
根据图3b所示，证明得到的神经移植物具有取向结构，且单根纤维直径约1um。
实施例3
本发明提供一种具有三维取向结构的神经移植物，其采用实施例2提供的在纯水中浸泡待用的神经移植物负载脱去细胞基质水凝胶所得。
具体地，本实施例中，去细胞基质水凝胶为猪源性周围神经去细胞基质水凝胶(pdnm-gel)，需要说明的是：猪周围神经去细胞基质，英文为porcinedecellularizednervematrix,简称pdnm，猪源性周围神经去细胞基质水凝胶简称为pdnm-gel，下文均以简称指代。
猪源性周围神经去细胞基质水凝胶由以下方法制得：
1)pdnm的制备：
猪的外周神经取才自雄性长白猪的四肢，在手术显微镜下减去表面的脂肪组织和部分神经外膜。按照制备全程无菌化原则，取材后立即放入预冷的消毒液中。消毒液的准备：无菌pbs+0.1％v/v过氧乙酸+4％v/v乙醇，经0.22μm孔径过滤器过滤后转入无菌培养基瓶中，组织块体积不超过消毒液体积的1/3。无菌pbs冲洗外周神经组织2次，每次10分钟，去除残余消毒液成分。处理后的外周神经浸泡在含有2％双抗(青霉素-链霉素：penicillin-streptomycin)，10μg/ml庆大霉素(gentamicin)，2.5μg/ml两性霉素b(amphotericinb)的无菌pbs中，4h后进行下一步处理。经过消毒和灭菌后的神经组织置蒸馏水中震荡、漂洗6h。然后用化学萃取的方法完成去细胞的过程：将神经放入3％的tritonx100水溶液中振荡12h(室温，25℃)，在无菌蒸馏水中漂洗3次(室温，25℃)；再放入4％的脱氧胆酸钠水溶液中震荡24h(室温，25℃)，最后在无菌蒸馏水中漂洗3次(室温，25℃)，如此一个循环为萃取1次，一共进行2次循环。完成萃取流程后的外周神经一次冻干，再用v乙醇/v二氯甲烷＝1/2的混合溶剂进行脱脂，无菌蒸馏水多次洗涤(除去残留的有机溶剂)。二次冻干，利用迷你粉碎机(wileywill)粉碎，经40目筛子接收后，密封，4℃储存备用，制得的pdnm的预凝胶溶液如图4所示。
2)pdnm-gel制备：
称取一定量的pdnm粉末，置于胃蛋白酶的盐酸溶液，消化24h。其中pdnm粉末与胃蛋白酶的质量比为10:1，根据pdnm的浓度适当调节盐酸浓度。pdnm经一定时间消化后，超速离心(根据pdnm浓度适当增加转速)除去未消化的颗粒物(质量分数小于5％)，得到的消化液-40℃冻存备用。
3)凝胶制备方法：4℃下首先利用naoh溶液调节pdnm消化液ph≥8，再将ph调回7.4，然后引入1/9消化液体积的10×pbs得到pdnm溶胶(如图4所示)，pdnm预凝胶溶液升温至37℃发生溶胶-凝胶化转变，37摄氏度恒温20分钟以后得到如图5以及图6所示的pdnm-gel。以上制备过程均在无菌环境下操作，使用到的所有溶剂均在无菌环境下，经0.22μm孔径过滤器过滤。制得溶液状的猪源性周围神经去细胞基质水凝胶。
pdnm-gel与plla三维取向微米纤维材料复合方法，包括：
用镊子将浸泡在纯水中的plla三维取向微米纤维材料取出，用无菌滤纸将表面吸附的水吸干，放置在培养皿中，加入pdnm预凝胶溶液浸泡，使得plla三维取向微米纤维材料完全浸润在预凝胶溶液中。整体放入4摄氏度冰箱低温浸泡12小时，转移到37摄氏度恒温箱中20分钟，pdnm-gel即成胶。刮除材料表面多余的pdnm-gel，即得最终的神经移植物，如图7中所示。
将如图7a中所示的神经移植物在-40摄氏度下预冷1小时，用冻干机进行冷冻干燥48小时后，得到干燥的神经移植物，如图7b所示。
将如图7a得到的神经移植物用2％戊二醛浸泡固定2小时，再洗涤冻干后进行扫描电镜表征，微观结构图如图8所示，证明该神经移植物具有微-纳米多级纤维结构。
实施例4
其与实施例3提供的神经移植物的区别在于：猪源性周围神经去细胞基质水凝胶还包括神经营养因子，神经营养因子包括：神经神经营养因子和碱性成纤维神经营养因子，其中，神经营养因子加入pdnm预凝胶溶液的含量为1mg/ml。
其中，神经营养因子在pdnm-gel成胶前加入，即在上述猪源性周围神经去细胞基质水凝胶的制备方法中，在升温至37℃前的预凝胶溶液中加入。
综上，本发明实施例提供的具有三维取向结构的神经移植物，其能够提供较佳的力学支撑和物理引导细胞的作用，有效引导神经再生。其制备方法，操作可控、方便、可靠。制备上述具有三维取向结构的神经移植物的制作设备，结构简单，同时有效提高制备具有三维取向结构的神经移植物的效率。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。