本发明涉及医药技术领域，具体地说，是法米替尼在制备eml4-alk蛋白激酶抑制剂中的应用，以及法米替尼在制备治疗eml4-alk融合基因突变肿瘤药物中的应用。
背景技术：
苹果酸法米替尼片(famitinibl-malate，c23h27fn4o2·c4h6o5，以下简称法米替尼)是我国自主研制的1.1类新药，对多种受体酪氨酸激酶如c-kit、kdr、pdgfr、vegfr、flt1、ret、flt3、c-src均有很好的抑制活性，ⅰ期临床结果表明，法米替尼针对肾癌、胃肠间质瘤、肺癌等多种实体瘤均具有较好的疗效(参见文献：a.zhou,w.zhang,c.chang,etal.phaseistudyofthesafety,pharmacokineticsandantitumoractivityoffamitinib.cancerchemotherpharmacol,2013,72(5):1043-1053.)，提示法米替尼具有良好的应用前景。
肺癌目前是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，通常分为非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌(nsclc)发病率最高，约占总发病率的80％且大多数患者发现时已处于中晚期，需采取药物治疗。在已开展的法米替尼ⅰ期以及其治疗非小细胞肺癌ⅱ期临床试验中,法米替尼对肺癌患者具有较好的疗效然而通过与临床前研究以及临床试验的综合比较，我们认为法米替尼的抗肺癌作用机制存在疑义：1)临床前实验结果显示法米替尼对中国nsclc患者人群中突变率最高的驱动基因表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor,egfr)的ic50值>10000，说明法米替尼对该靶点没有抑制效果，即法米替尼并非靶向egfr从而发挥其抗nsclc的疗效；2)一项将法米替尼联合多西他赛作为egfr野生型转移性非小细胞肺癌二线治疗方案的ib期临床试验中，获pr评价的患者共4例(23.5％)，获sd评价的共11例(64.7％)，且获pr的患者均来源于20mg组，中位pfs为4.35个月，表明法米替尼对晚期egfr野生型的肺癌患者具有较好的疗效(参见文献：sren,cxsuetal.aphase1bstudyoffamitinibplusdocetaxelas2ndlinesettinginpatientswithmetastaticnon-squamousnon-smallcelllungcancerandegfrwildtype.2016)
eml4-alk融合基因作为肺癌的驱动基因，其引起癌变的机制主要是由于eml4激活alk酪氨酸激酶区从而导致了细胞的恶性增殖。该突变存在于多种实体瘤，包括非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肾髓质癌和晚期肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神经细胞瘤(参见文献：sugawarae,togashiy,kurodan,etal.identificationofanaplasticlymphomakinasefusionsinrenalcancer:large-scaleimmunohistochemicalscreeningbytheintercalatedantibody-enhancedpolymermethod.[j].cancer,2012,118(18):4427-4436；line；lil；guany；sorianor；riverscs；mohans；panditaa；tangj；modrusanz.exonarrayprofilingdetectseml4-alkfusioninbreast,colorectal,andnon-smallcelllungcancers[j].molecularcancerresearch,2009,7(9):1466-1476.)。但该突变在nsclc中突变率最高，约占所有nsclc的5％左右，尤其是在我国egfr、kras基因野生型的腺癌患者中alk阳性比例可高达30％-42％。
目前尚未有文献报道法米替尼对eml4-alk蛋白激酶的抑制作用，也未见文献报道法米替尼对eml4-alk融合基因突变肿瘤患者的治疗作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供法米替尼的新作用靶点和适应症，即其可以作为eml4-alk蛋白激酶抑制剂，并通过抑制eml4-alk蛋白激酶发挥治疗eml4-alk融合基因突变肿瘤的作用。
本发明的第一方面，提供法米替尼在制备eml4-alk蛋白激酶抑制剂中的应用。
本发明发现了法米替尼能够明显抑制alk及其下游蛋白akt、erk、stat3的磷酸化，从而选择性抑制alk蛋白激酶的活性，具体见实施例6。同时法米替尼能通过上调caspase3蛋白以促进肿瘤的凋亡从而协同发挥抗肿瘤作用。
本发明的第二方面，提供法米替尼在制备治疗eml4-alk融合突变肿瘤药物中的应用。
优选的，所述的eml4-alk融合突变肿瘤包括eml4-alk突变非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、肾髓质癌和晚期肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、炎性成肌纤维细胞瘤、成神经细胞瘤。
优选的，所述的法米替尼在制备治疗eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌药物中的应用。本发明发现了法米替尼通过抑制eml4-alk活性发挥其对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用。
优选的，所述的法米替尼在制备治疗eml4-alk突变的肿瘤药物中的应用，所述的应用具体是，法米替尼在给药前，先检测肿瘤样本中alk基因是否与eml4发生融合突变。
本发明的第三方面，提供检测eml4-alk融合突变的试剂在制备eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四方面，提供一种治疗eml4-alk融合突变肿瘤的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括法米替尼，以及药学上可以接受的辅料或载体。
本发明从体外细胞培养、体内动物实验方面研究了法米替尼对eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌的抑制作用。通过临床前体外实验发现，法米替尼能有效抑制eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌细胞系的增殖及迁移，使细胞周期阻滞在g0/g1期并能促进细胞的凋亡。实验还表明，法米替尼主要作用机制为抑制alk及其下游信号通路蛋白akt、erk、stat3的活化，从而发挥其抑制增殖的作用，另一方面通过上调caspase3蛋白以促进肿瘤的凋亡从而协同发挥抗肿瘤作用。体内实验发现，法米替尼能显著抑制nci-h2228肿瘤在裸鼠皮下的生长速度，且效果优于alk靶向制剂克唑替尼。
本发明为法米替尼提供了新的靶点和适应症。本发明也为eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤的治疗提供了新的思路。
附图说明
图1：法米替尼对携带eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株在体外的生长具有明显的抑制作用；
图2：法米替尼能明显增加eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株的凋亡率。
图3：法米替尼能将eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株的细胞周期阻滞在g0/g1期。
图4：法米替尼能显著抑制eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株的迁移。
图5：法米替尼能显著抑制alk及其下游akt、erk、stat3蛋白的磷酸化，进而下调细胞周期相关蛋白如cyclind1蛋白的表达，同时可以促进细胞凋亡相关蛋白caspase-3的表达，且具有剂量依赖性。
图6：法米替尼能显著抑制eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株nci-h2228在裸鼠体内的生长。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1.法米替尼对多种激酶的体外抑制作用筛查
取法米替尼用dmso配制100nm溶液，基于rbc公司的fret激酶酶谱筛查平台对275个蛋白激酶(包含酪氨酸激酶和丝/苏氨酸激酶)库进行筛查。结果显示，除对已知靶点vegfr、c-kit、pdgf外，法米替尼对eml4-alk融合的蛋白激酶具有较好的抑制活性，抑制率为69％。
实施例2.法米替尼对人非小细胞肺癌细胞株体外生长的抑制作用
取对数生长期的nci-h2228细胞，使用胰酶消化的方法制备单细胞悬液，用含10％fbs的rpmi1640完全培养基调整细胞密度至1×105个/ml，将细胞接种到96孔细胞培养板，每孔添加100μl细胞悬液，轻晃培养板使之分布均匀，正常条件下置培养箱过夜培养。隔夜培养后，使用完全培养基进行全量换液，按照终浓度添加克唑替尼及法米替尼(克唑替尼终浓度分别为0，5，10，20，40，80nm；法米替尼终浓度分别为0，5，10，20，40，80nm)，正常条件下培养48小时后进行活性检测。每孔细胞加入10μlcck-8，轻晃使之分布均匀，将培养板放在培养箱内(37℃和5％co2浓度)孵育4h，然后将96孔培养板中液体转移至另一个96孔板。上机，使用酶标仪测定在450nm处的吸光度，根据吸光度值计算细胞抑制率并计算ic50。
结果如图1所示，克唑替尼和法米替尼对nci-h22228细胞的ic50值分别19.8和26.8nm，提示法米替尼对eml4-alk融合突变的人非小细胞肺癌细胞株nci-h2228有较强的抑制作用。
实施例3.法米替尼对人非小细胞肺癌细胞株凋亡的影响
实验采用双染试剂盒：annexinv：fitcapoptosisdetectionkitii，操作步骤如下：
(1)凋亡检测细胞样本的处理
1)用dpbs洗涤细胞2次(2000×g离心5分钟)收集细胞沉淀；
2)加入500μl的bindingbuffer重悬细胞沉淀；
3)加入5μlannexinv-fitc混匀后，混匀室温、避光、反应10分钟；
4)加入5μl溴化乙锭(pi)，混匀室温、避光、反应5分钟；
5)上机检测
(2)流式细胞仪分析(facscalibur，bd)
用流式细胞仪检测，激发波长ex＝488nm，annexinv-fitc的绿色荧光通过fitc通道(fl1)检测，pi红色荧光通过pi通道(fl2)检测。
结果如图2所示，经法米替尼处理48h后，nci-h2228细胞凋亡显著增加，细胞给予20nm法米替尼处理后其凋亡率与对照组相比差异有统计学意义(p<0.01)，表明法米替尼具有促凋亡的作用。
实施例4.法米替尼对人非小细胞肺癌细胞株周期的影响
使用胰酶(不含edta)消化的方法收集nci-h2228细胞。用预冷pbs(ph＝7.4)洗细胞两次，离心收集细胞沉淀，之后加入预冷70％乙醇，于4℃放置过夜。检测前离心收集细胞，以1ml的pbs洗细胞两次，1000×g离心5分钟收集细胞沉淀，加入100ulpbs(含50ug/mlpi、100ug/mlrnasea)，4℃避光常温孵育30分钟，流式细胞仪上机检测。
结果如图3所示，经法米替尼处理后，细胞周期变化比较显著，与对照组相比，g0/g1期细胞比例显著上升(p<0.05)，比例高达72.38％，g2期细胞则显著下降(p<0.01)，比例仅为1.2％，说明nci-h2228细胞被法米替尼阻滞在g0/g1期。
实施例5.法米替尼对人非小细胞肺癌细胞株迁移的影响
划痕法考察细胞迁移能力，具体步骤如下：
(1)fn配制：铺板前1小时，使用dpbs稀释fn至使用浓度(10ug/ml)；
(2)铺板：六孔板每孔加入fn(10ug/ml)400ul，轻晃使其分布均匀，4℃过夜放置；
(3)接种细胞：使用前，每孔添加1mldpbs洗孔底一次。胰酶消化法制备细胞悬液，接种细胞到六孔培养板，每孔1×105个细胞。之后正常条件培养；
(4)细胞培养24小时后，使用无菌200μl枪头划痕，在使用无血清培养液冲洗两次，加入含1％血清培养液2ml，正常条件培养；
(5)48小时后显微镜拍照。
结果如图4所示，法米替尼处理细胞后第2天和第3天，nci-h2228细胞的迁移能力同空白对照组受到了显著的抑制作用。
实施例6.法米替尼对alk信号通路的抑制作用
取对数生长期的人非小细胞肺癌nci-h2228细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，离心收集细胞沉淀，用含10％fbs的rpmi1640完全培养基(法米替尼终浓度为5、10、20nm)调整细胞密度至1×105个/ml，接种细胞到6孔细胞培养板，每孔添加2ml细胞悬液，轻晃培养板使分布均匀，37℃和5％co2条件下培养，并于接种后3小时去掉培养基，向培养板中加入1mldpbs洗细胞两遍后，加入1ml的m-per试剂(使用前已加入蛋白酶抑制剂)，使用1ml移液器反复吹打，直至液体变得黏稠，4℃条件下10000×g离心5分钟，收集上清液进行细胞总蛋白的抽提，bca法定量细胞总蛋白浓度。定量后的细胞总蛋白，通过westernblot法进行机制研究，步骤如下：
(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶；
(2)配胶：先配制10％分离胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶，然后胶上加一层水当水和胶之间出现一条折射线时，再等3分钟使胶充分凝固后，再配制4％的浓缩胶，加入temed后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后根据样品数选择合适孔的梳子插入浓缩胶中。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出；
(3)上样：用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中取出上样样品至200μl的干净离心管中，加入5×sds上样缓冲液至终浓度为1×。将样品于沸水中煮5分钟使蛋白变性，冰上冷却，用微量进样器取10μl蛋白样品上样，缓慢加入；
(4)电泳：80v恒压，样品跑至分离胶；改120v恒压样品跑到底。终止电泳，进行转膜；
(5)转膜：将pvdf膜切成与凝胶尺寸大小一致，置于甲醇中浸透10秒钟，立即转入预先配置的转膜液中平衡20分钟。用三张滤纸贴于两张多孔垫料，将pvdf膜胶夹于中间。pvdf膜朝正极，转膜条件为400ma转膜120min。立春红染色，观察膜上目的条带是否存在。用dh2o冲洗膜的表面；
(6)杂交：转膜结束后，将pvdf膜用溶解有5％脱脂奶粉的tbst封闭：常温封闭2小时，摇床缓慢混匀。将封闭的膜用tbst冲洗两遍，每次5分钟，加入一抗，4℃孵育过夜。tbst洗膜三次，每次10min，加入二抗，室温孵育1小时；
(7)化学发光试剂检测：二抗孵育完成后，取出pvdf膜，tbst洗膜三次，每次10min。添加化学发光液反应底物，将pvdf膜放至暗室曝光，放射自显影：曝光3分钟；显影后清水漂洗，再定影。统计目的条带光密度值并比较蛋白磷酸化水平变化。实验进行3次独立生物学重复。
实验结果如图5所示，加入不同浓度的法米替尼处理nci-h2228细胞后，细胞上调表达的蛋白为caspase-3，且随着法米替尼剂量的增加，其上调水平越为明显；下调表达的蛋白有p-alk、p-akt、p-stat3、p-erk和cyclind1，其中p-alk、p-akt、p-stat3、p-erk和cyclind1蛋白的下调水平比较明显，且存在一定的剂量依赖性，随着给药量的增加而下调越明显。以上结果表明，法米替尼可以显著抑制alk及其下游细胞信号通路蛋白的磷酸化水平，如p-akt、p-stat3、p-erk等，进而下调细胞周期相关蛋白如cyclind1蛋白的表达，同时可以促进细胞凋亡相关蛋白caspase-3的表达，表现出法米替尼对eml4-alk融合基因突变细胞株的增殖抑制和促凋亡作用。
实施例7.法米替尼对nci-h2228细胞株体内生长的抑制作用
扩增并收集对数生长期的nci-h2228细胞，将1×107细胞接种于雌性裸鼠(6周龄，购自南京)皮下，待肿瘤长至100-150mm3时，将裸鼠随机分为空白溶剂对照组、克唑替尼对照组(100mg/kg，p.o，qd)和不同剂量法米替尼处理组(2.5，5，10，20mg/kg，p.o，qd)，每组各6只。每周2次测量肿瘤体积大小(肿瘤体积大小的计算公式为：体积＝1/2×肿瘤长径×短径2)。
结果如图6所示，经法米替尼处理后，nci-h2228细胞在小鼠皮下的生长速度均明显减慢。随着法米替尼浓度的提高，法米替尼对nci-h2228细胞在小鼠皮下的生长抑制作用逐渐增强，且抑制效果优于eml4-alk靶向制剂维克唑替尼，证明法米替尼对eml4-alk融合突变的非小细胞肺癌细胞系在小鼠体内的成瘤能力具有较好的抑制作用。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。