低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物纳米系统的制备方法及应用与流程

本发明涉及纳米药物制剂技术领域，具体涉及低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米系统及其制备方法和应用。

背景技术：

化疗药物是临床上治疗肿瘤疾病的常用手段之一，但是游离药物在全身无选择性地分布和对细胞的杀伤是化疗药物引起严重毒副作用的重要原因，如盐酸阿霉素可在心脏分布从而引起心脏毒性，严重者可出现心力衰竭，从而大大制约了其应用和发展。

纳米递送系统具有缓释、被动靶向、提高生物利用度、延长体内循环时间、改善药动学行为及减少疾病用药过程中的毒副作用等优点，从而成为近几十年来抗肿瘤药物递送系统研究的重要方向。但是，常见的纳米递送载体中，存在制备过程复杂、载药量低、部分载体材料会引起明显不良反应等缺点，因此限制了其发展和应用

低分子肝素是由普通肝素降解得到的分子量较低的肝素片段，具有良好的生物相容性，除了用作抗凝血制剂外，研究表明低分子肝素在抑制恶性肿瘤增殖、抑制肿瘤新生血管生成以及抑制肿瘤转移和浸润方面，有显著的作用，有望成为一种新的有效地抑制恶性肿瘤的方法。然而，低分子肝素在用作抗肿瘤药物时表现出的出血的毒副作用，是限制其在临床中用于肿瘤抑制的重要因素。

低分子肝素与抗肿瘤药物通过静电相互作用而形成的自组装静电复合物纳米系统，具有纳米给药系统的优势，同时解决了低分子肝素用作载体时存在的出血的副作用，并且具有较高的载药量和良好的稳定性，具有极好的应用前景。

技术实现要素：

本发明克服现有技术的不足，提供一种低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物纳米系统及其制备方法和应用。通过低分子肝素与抗肿瘤药物之间的静电相互作用，可通过简单的方式制备得到两者的静电复合物，进一步通过静电复合物的自组装形成纳米系统，并且通过改变低分子肝素与抗肿瘤药物的质量比可制备高载药量的纳米系统。本发明的目的在于通过低分子肝素与抗肿瘤药物形成静电复合物纳米系统的方式，既保证了抗肿瘤药物的肿瘤抑制作用和肿瘤部位的递送效果，又降低了低分子肝素作为载体的出血副作用。

第一方面，本发明涉及低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米系统。

一种低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米系统，所述纳米系统包括低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物以及含水溶液。

优选地所述纳米系统由低分子肝素与抗肿瘤药物通过静电相互作用形成的复合物以及含水溶液组成。

所述的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物由低分子肝素与抗肿瘤药物通过静电相互作用形成。

所述低分子肝素为普通肝素降解而得到的分子量小于7000道尔顿，优选为3000-7000kda的肝素片段。所述低分子肝素优选依诺肝素钠、那屈肝素钠、达肝素钠、速碧林。更优选依诺肝素钠。

本发明所述的抗肿瘤药物包括但不限于喜树碱类、长春新碱类、抗生素类、抗雌激素类抗肿瘤药物等。

本发明所述的抗肿瘤药物优选阿霉素或其盐、柔红霉素或其盐、托瑞米芬或其盐。本发明所述的抗肿瘤药物更优选盐酸阿霉素、盐酸柔红霉素、枸橼酸托瑞米芬。

所述低分子肝素与抗肿瘤药物的质量比选自40:1～1:40，优选20:1～1:20，优选15:1至1:2，更优选12:1至1:1.2，优选10:1至1:1，更优选10:1～1:10，最优选10:1～1:1，例如10:1，5:1，2:1，1:1。

所述的自组装载药系统优选为纳米载药系统，所述自组装载药系统的粒径优选小于1000nm，更优选小于900nm，小于800nm，小于700nm，小于600nm，小于500nm，小于400nm，小于300nm，小于200nm，小于100nm，小于50nm。更优选：30-500nm，30-400nm，30-300nm，30-200nm，30-100nm，30-60nm。更优选：30-50nm,或50-100nm，或100-150nm。所述的粒径是指平均粒径。

第二方面，本发明提供了可用于自组装系统的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物及其制备方法。

所述低分子肝素包含但不限于依诺肝素钠、那屈肝素钠、达肝素钠、速碧林等。

所述的抗肿瘤药物包含但不限于喜树碱类、长春新碱类、抗生素类、抗雌激素类抗肿瘤药物等。

所述静电复合物的制备方法包括如下步骤：

所述方法包括：

(1)将一定量低分子肝素溶解在去离子水中，一定量的抗肿瘤药物溶解在去离子水中，将两者混合搅拌；

(2)离心，弃去上清液，所得沉淀重悬于二甲基亚砜中，即得低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的二甲基亚砜溶液；

步骤1中所述的搅拌速度可选50～1500转/分，100～1200转/分，100～1000转/分，100～800转/分，100～500转/分，300～1200转/分，300～1000转/分，300～800转/分；优选300～500转/分。

步骤1中所述的低分子肝素与抗肿瘤药物的质量比为50:1～1:50，优选10:1～1:10，更优选10:1～1:1。

步骤(2)中所述的离心转速为500～10000g，1000～10000g；优选8000～10000g。

第三方面，本发明涉及低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米系统的制备方法，在制备静电复合物的步骤(1)和(2)的基础上，额外包括如下步骤：

(3)将低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入一定体积的去离子水中，并不断搅拌。

(4)用去离子水透析出去二甲基亚砜。

(5)任选地，通过超滤离心，葡聚糖凝胶柱层析，超滤离心所用的滤液或葡聚糖凝胶柱层析所用的层析液，选自纯水、5％葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液，即可得到含水溶液的自组装纳米系统。

步骤(3)中中所述低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的二甲基亚砜溶液与水溶液的体积比为1:1～1:∞，优选1:2～1:50，更优选1:4～1:30，最优选1:10～1:20。

步骤(3)中所述搅拌转速可选50～1500转/分，100～1200转/分，100～1000转/分，100～800转/分，100～500转/分，300～1200转/分，300～800转/分；优选300～500转/分。

步骤(4)中所述的透析时间可选1～24h，优选2～12h，更优选3～6h。

步骤(5)中所述的超滤离心所使用的超滤离心滤膜孔径为1000～100000道尔顿，优选3000道尔顿～50000道尔顿，更优选10000道尔顿～30000道尔顿。

步骤(5)中所述葡聚糖凝胶型号为g-25至g-200，最优选g-50。上样体积不应超过柱体积的十分之一，上样体积越小越优。

步骤(5)中所述的含水溶液可选纯水、5％葡萄糖溶液、生理盐水、磷酸盐缓冲液等，优选纯水。

第四方面，本发明还涉及包含上述静电复合物自组装纳米系统的药物制剂，所述的药物制剂选自：口服剂型、胃肠外给药剂型，优选口服液、注射剂、眼用制剂、喷雾剂、缓释制剂等。

第五方面，本发明还涉及上述低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米系统或包含所述自组装纳米系统的药物制剂在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的肿瘤包括前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤、白血病、鼻咽癌、淋巴瘤、子宫癌。优选前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌和脑胶质瘤。

在本发明中，体外释放实验操作如下：

(1)制备低分子肝素-抗肿瘤药物复合物自组装载药系统，取一定量所述载药系统于透析带中，将其置入一定量的透析介质中。

(2)在设定的时间点，取透析介质，测定其中的抗肿瘤药物含量。

(3)释放实验结束后，将透析袋剪破，分散于透析介质中，作为抗肿瘤药物完全释放时的抗肿瘤药物的含量，释放速率＝设定时间点的抗肿瘤药物含量/完全释放时的抗肿瘤药物的含量。

体外释放实验显示：低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒具有很好的稳定性，且对抗肿瘤药物有缓释作用。

在本发明中，通过对肿瘤细胞体内外生长抑制试验表明：本发明所述低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统在体外对肿瘤细胞均有极好的抑制作用。

本发明中采用的体外药效测定方法为文献报道的磺酰罗丹明b(srb)比色法，具体操作如下：

(1)将肿瘤细胞以适宜细胞密度接种于96孔板中，孵育24h备用。

(2)自组装载药系统的分散液经0.2微米无菌滤膜过滤除菌后，用培养基稀释成一系列浓度的稀释液。

(3)弃去原培养基后，分别加入各浓度稀释液，以加入完全培养基为对照，孵育72小时后，弃去各浓度稀释液，10％三氯乙酸固定细胞1小时(4℃)，用蒸馏水反复洗涤，空气中自然晾干，0.4％srb染液在室温染色20分钟，0.1％乙酸反复洗涤，空气中自然晾干后加入10微摩尔/升tris-base溶液，置摇床震荡30分钟后，用酶标仪测定各组在540nm处的吸光值。

(4)计算存活率：存活率＝(加药组细胞平均吸光度值/对照组细胞平均吸光度值)×100％与最后通过曲线拟合求出ic50。

结果显示低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统在体外对多种肿瘤细胞均有较好的抑制生长作用。

本发明的体内抑瘤实验表明，本发明的体内动物药效显著提高。

本发明采用的体内抑瘤实验方法的具体操作如下：

(1)构建肿瘤动物模型，将癌细胞系皮下注射到balb/c裸鼠的腋下部位，培养21天。

(1)在接种21天后给药，分别给予5％葡萄糖注射液对照组，抗肿瘤药物溶液组，抗肿瘤药物溶液组，低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统，低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统，每两天给药一次，给药四次，每两天测量一次瘤体积，根据时间变化做出肿瘤体积的变化图。结果显示：本发明所制备的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物有较好的体内抗肿瘤药效。

本发明的优点：

(1)本发明提供的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装载药系统，相比于传统的游离型抗肿瘤药物制剂而言，具有被动靶向能力，可提高化疗药物的生物利用度，延长其体内循环时间，改善其药动学行为以及减少抗肿瘤药物治疗过程中的毒副作用等优点

(2)本发明提供的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米载药系统，较传统的纳米给药系统而言，载药量更高、粒径更小、稳定性等优点。

(3)本发明克服了低分子肝素用作载药系统时存在的抗凝血和溶血的副作用，具有更高的安全性，并且作为一种内源性的分子，低分子肝素用作载体具有更好的生物相容性和生物安全性。

(4)本发明所述的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物的自组装纳米系统不仅具有很好的抗肿瘤效果，还具有制备方法简单，易于工业化生产等优势。

附图说明

图1:低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装载药系统的透射电镜图

图2:低分子肝素-托瑞米芬静电复合物自组装载药系统的透射电镜图

图3:低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装载药系统的体外释放结果图

图4:低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装载药系统的体内动物药效图

具体实施方法

实施例1：低分子肝素-阿霉素静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg)溶解于适量的去离子水中，将阿霉素盐酸盐(10mg，以阿霉素盐酸盐计)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将阿霉素盐酸盐溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例2：低分子肝素-阿霉素静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg)溶解于适量的去离子水中，将阿霉素盐酸盐(20mg，以阿霉素盐酸盐计)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将阿霉素盐酸盐溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例3：低分子肝素-阿霉素静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg，以阿霉素盐酸盐计)溶解于适量的去离子水中，将阿霉素盐酸盐(50mg)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将阿霉素盐酸盐溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例4：低分子肝素-阿霉素静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg)溶解于适量的去离子水中，将阿霉素盐酸盐(100mg，以阿霉素盐酸盐计)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将阿霉素盐酸盐溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例5：低分子肝素-柔红霉素静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg)溶解于适量的去离子水中，将柔红霉素盐酸盐(10mg，以柔红霉素盐酸盐计)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将柔红霉素盐酸盐溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-柔红霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例6：低分子肝素-托瑞米芬静电复合物的制备

将低分子肝素(100mg)溶解于适量的去离子水中，将枸橼酸托瑞米芬(10mg，以枸橼酸托瑞米芬计)溶解于适量的去离子水中，搅拌下将枸橼酸托瑞米芬溶液快速加入低分子肝素溶液中，继续室温搅拌12小时。离心分离沉淀物，将所得沉淀物分散于二甲基亚砜中，即得到低分子肝素-托瑞米芬静电复合物的二甲基亚砜溶液。

实施例7：低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例1中的200μl低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

实施例8：低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例2中的200μl低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

实施例9：低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例3中的200μl低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

实施例10：低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例4中的200μl低分子肝素-阿霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

实施例11：低分子肝素-柔红霉素静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例5中的200μl低分子肝素-柔红霉素静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

实施例12：低分子肝素-托瑞米芬静电复合物自组装纳米粒的制备

取实施例6中的200μl低分子肝素-托瑞米芬静电复合物的二甲基亚砜溶液，逐滴滴入2ml的纯水中，并不断搅拌，随后转入透析袋中，利用去离子水透析3-6小时除去二甲基亚砜，即得。

试验例1：低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒的结构表征

(1)利用马尔文粒度仪通过动态光散射测定通过实验例7-12制备得到纳米粒的粒径分布和ζ电位(如图表1)，测定样品体积：1ml；测定温度25℃；分散介质:水。

表1、低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒的粒径分布和ζ电位

(2)利用jem-1400plus透射电子显微镜观察通过实施例7(图1)和

实施例12(图2)制备得到纳米粒的形态。

结果显示，低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装形成的纳米粒为均匀的球形纳米粒，随着抗肿瘤药物的不同，粒径也会不同，形成的纳米粒成电负性，表明低分子肝素能够保护抗肿瘤药物，进行自组装形成纳米系统。

随着抗肿瘤药物比例的逐渐增加，低分子肝素仍能与抗肿瘤药物进行静电复合并且自组装形成纳米粒，且表面呈电负性。

试验例2：低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒的体外释放

(1)将0.4ml的低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒溶液(实施例7)置于透析袋中，并将透析袋置于40ml的透析介质(1％的吐温80的pbs缓冲液)中；

(2)在预定的时间点(0.25h，0.3h，1h，2h，4h，8h，24h)，取0.2ml的透析介质，测定其中抗肿瘤药物的浓度；

(3)在透析结束时，将透析袋剪破，分散于透析介质中，测定其中的抗肿瘤药物的浓度；

(4)通过下列公式计算释放速率：

预定时间点的释放速率＝(预定时间点的透析介质药物含量/试验结束时的透析介质药物含量)×100％。并根据释放速率得到药物的释放曲线结果如图3。

阿霉素的分子量为543.52da，低分子肝素的平均分子量为4500da，800-1200da的透析袋只能允许阿霉素通过而不能允许阿霉素与低分子肝素的复合物通过，8000-14000da的透析袋可以允许低分子肝素-阿霉素的复合物通过，通过两个分子量透析袋下的低分子肝素-阿霉素纳米粒的释放情况，以确定是以阿霉素形式释放出来的还是以低分子肝素-阿霉素复合物的形式释放出来的。图3的结果表示低分子肝素-抗肿瘤药物复合物能够明显地减慢药物的释放，起到缓释的作用，并且能够以原形药物的形式将药物释放出来，从而发挥抗肿瘤药效。

试验例2：低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒(lmhp-doxnps)的体外抑制肿瘤细胞生长效应评价

(1)将人高转移前列腺癌pc-3m细胞(8×10³细胞/孔)，人低转移前列腺癌pc-3细胞(1.2×10⁴细胞/孔)，人乳腺癌细胞mda-mb-231细胞(1×10⁴细胞/孔)，人乳腺癌mcf-7细胞(1×10⁴细胞/孔)，人非小细胞肺癌h460细胞(1×10⁴细胞/孔)分别接种于96孔板中，孵育24小时备用。

(2)纳米粒分散液经0.2微米无菌滤膜除菌后，用培养基稀释成0.001～100μm的纳米粒稀释液。

(3)弃去原培养基后，分别加入纳米粒稀释液，以加入完全培养基为对照，孵育48小时后，弃去纳米粒稀释液，10％三氯乙酸固定细胞1小时(4℃)，用蒸馏水反复洗涤，空气中自然晾干，0.4％srb染色在室温染色20分钟，0.1％乙酸反复洗涤，空气中自然晾干后加入10微摩尔/升tris-base溶液，置摇床震荡30分钟后，用酶标仪测定各组在540nm处的吸光度值。

(4)通过下列公式计算生存率：

(5)利用graphpadprism6计算ic50，低分子肝素-阿霉素(10:1)静电复合物自组装纳米粒体外抑制不同肿瘤细胞生长情况：

表2低分子肝素-阿霉素(10:1)静电复合物自组装纳米粒体外抑制不同肿瘤细胞生长情况(n＝3)

*p<0.05vsdox；**p<0.01vsdox

其中dox表示盐酸阿霉素溶液组，由盐酸阿霉素溶液溶解于水中，过0.2微米无菌滤膜后得到；

lmhp-doxnps表示通过实施例7制备得到的低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒组。

结果显示低分子肝素-阿霉素静电复合物自组装纳米粒在多种肿瘤细胞株上都有好的肿瘤细胞生长抑制做作用，具有很好的抗肿瘤活性。

试验例4:低分子肝素-阿霉素静电复合物载药系统的体内药效

(1)构建肿瘤动物模型，将人高转移前列腺癌pc-3m细胞悬液(1×10⁷细胞/毫升)200μl皮下注射到balb/c裸鼠的腋下部位，培养21天。

(2)在接种21天后给药，分别给予5％葡萄糖注射液对照组，抗肿瘤药物溶液组5mg/kg，抗肿瘤药物溶液组25mg/kg，低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统5mg/kg(剂量以阿霉素计算)，低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装载药系统25mg/kg(剂量以阿霉素计算)，每两天给药一次，给药四次，每两天测量一次瘤体积。得到药物的体内抑瘤实验结果图4。在低剂量情况下(5mg/kg)，低分子肝素-阿霉素静电复合物载药系统与阿霉素溶液有相近的肿瘤抑制作用；但是在高剂量情况下(25mg/kg)，低分子肝素-阿霉素静电复合物载药系统组有更好的肿瘤抑制作用，且安全性更好(阿霉素组在第三次给药后全部死亡，而低分子肝素-阿霉素静电复合物组没有死亡的情况)。

结果表明低分子肝素-抗肿瘤药物静电复合物自组装纳米粒载药系统具有很好的体内抑制肿瘤生长的能力，且安全性提高，具有广阔的应用前景。

上文中已经用一般性说明、具体实施方法和试验对本发明做了详尽的描述，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。