一种逆转肝癌细胞耐药性的药物组合物及其应用的制作方法

本发明属医药技术领域，具体涉及一种逆转肝癌细胞耐药性的药物组合物及其应用。

背景技术

原发性肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤。目前肝癌在国内肿瘤发病率排名第三，肝癌防控形势十分严峻。肝癌在诊断、治疗的预后等各方面的进展十分有限，其主要原因是对这些肿瘤发生发展的确切分子机制所知有限，难以设计针对性的方案。

肝癌临床疗效不佳，常表现出肝癌细胞的多药耐药性。近10年多仅有两种获fda批准治疗晚期肝癌的疗法，即为索拉菲尼和regorafenib(瑞戈非尼)药物。这两种均为多激酶抑制剂，主要是抑制肿瘤发生发展中vegfr1-3、kit、ret、pdgfr及fgfr等多种重要激酶的活性，但这些药物对于晚期肝癌的改善并不十分明显，缓解率不超过11％。另外，肝癌常常对标准化疗和放疗方案均不敏感。多柔比星常规用作为晚期hcc单一治疗药物，表现出无效的应答率，约15-20％。肝癌对一般化疗药物如5fu或顺铂的应答率表现更低。肝癌复发或转移在患者中相当普遍。

肝癌耐药或复发的重要因素之一是其肿瘤干细胞的存在。肿瘤干细胞不断增殖分化，成为肿瘤细胞疯狂生长的源泉；同时，肿瘤干细胞具有干细胞的转移性，使肿瘤在机体内蔓延；还有，并具有对化疗药物及靶向药物治疗均不敏感性，易逃避凋亡而生存着。另外，近年来，人们的研究热点慢慢从肝癌细胞转移到肝癌干细胞，但已取的研究成果仍远远不够用来解释肝癌干细胞的生活特性，对肝癌干细胞的认识仍然不足。大部分研究主要针对特定信号通路在肝癌干细胞的耐药性、增殖性、侵袭性和转移性能力的作用。在过去十年的研究，影响肝癌的耐药性的细胞信号通路有stat3(signaltransducerandactivatoroftranscription3)信号通路、notch信号通路、hedgehog信号通路、tgf-β信号通路(transforminggrowthfactor-beta)等，这些信号通路与肝癌细胞的自我更新，分化和存活有着密切关系。从而，阻断肝癌细胞的多药耐药性，寻找出逆转肝癌细胞化疗耐药性的对策，将有助于为肝癌靶向治疗药物研发提供思路和解决方法。

匹莫齐特(pimozide)是fda批准的神经安定药，属于二苯类药物，常用于治疗tourette综合征和精神分裂症。以往的研究表明，pimozide可具备抗肿瘤细胞的活性，如黑色素瘤，乳腺癌，慢性髓系细胞性白血病和急性髓系细胞性白血病。神经安定剂pimozide抑制人乳腺癌细胞系mcf-7的增殖和增强mcf-7细胞对伽马辐射治疗的疗效。还有，pimozide通过抑制细胞转录因子stat5活性进而抑制慢性髓性白血病细胞的自我更新能力。然而，pimozide对肝癌细胞或干细胞样细胞的影响尚未完全确定，甚至是否对耐药性肝癌细胞有抑制作用仍不清楚。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明提供了匹莫齐特在制备杀伤肝癌干细胞或逆转肝癌耐药性的癌症治疗药物中的用途。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种逆转肝癌细胞耐药性的药物组合物，所述药物包含匹莫齐特和药学上可接受的药用载体。

进一步地，所述的药物组合物还包括抗肿瘤药物。

作为本发明所优选的一种实施方式，所述的抗肿瘤药物为多激酶抑制剂，优选地，所述的多激酶抑制剂为索拉菲尼和瑞戈非尼中的一种或两种。

优选地，所述的抗肿瘤药物还可以为顺铂、5-氟尿嘧啶或阿霉素中的一种或多种。

本发明还提供一种上述药物的药物制剂，所述的药物组合物为其口服制剂。所述的口服制剂为其片剂、胶囊剂、颗粒剂或口服液。

本发明还提供一种上述药物组合物的应用，即所述的药物组合物在制备治疗肝癌药物中的用途。所述的药物组合物的活性成分为匹莫齐特或匹莫齐特与抗肿瘤药物的组合物。所述的抗肿瘤药物为顺铂、索拉菲尼、瑞戈非尼、5-氟尿嘧啶或阿霉素的一种或多种。

如上所述的药物组合物的用途，所述的药物组合物能够逆转肝癌细胞耐药性。

如上所述的药物组合物的用途，所述的药物组合物能够杀伤肝癌干细胞。

如上所述的药物组合物的用途，优选地，所述的肝癌为晚期肝癌。

本发明的技术方案具有如下优点：

1)本发明公开了含有匹莫齐特的药物组合物在制备杀伤肝癌干细胞或逆转肝癌耐药性的癌症治疗药物中的用途。所述药物能够杀伤肿瘤干细胞；所述药物含有以匹莫齐特为主的活性成分，并含有药学上可接受的载体。

2)本发明首次提供了匹莫齐特可以用于制备杀伤肝癌干细胞的抗癌药物和逆转肝癌耐药性，其效果优于传统的化疗药物如顺铂、5-氟尿嘧啶和阿霉素等。

3)匹莫齐特还能增加肝癌治疗药物索拉菲尼药物效果。这些为靶向肝癌肿瘤治疗提供了新的药物和方案，对提高肿瘤治疗效果，改善患者生存质量具有重要意义。

附图说明

图1匹莫齐特直接地抑制诱导性耐药性肝癌细胞的生长。其中图a为肝癌细胞在血清培养基和无血清培养基中对抗肿瘤药物的耐药性对比；图b为匹莫齐特增强化疗药物cis，5-fu和dox对肝癌细胞的增殖抑制作用。

图2匹莫齐特抑制肝癌细胞的干性标志物cd133+表达检测图和sp+细胞分析图。其中图a为匹莫齐特与对照组的cd133阳性细胞比例对比图；图b为匹莫齐特与对照组的sp细胞阳性比例对比图。

图3匹莫齐特抑制肿瘤细胞的增殖标志物ki67表达分析图及细胞周期分析图。其中图a为ki67-pe染色后匹莫齐特与对照组的细胞计数，图b为细胞周期分析图。

图4匹莫齐特促使肝癌细胞产生衰老现象分析图。

图5匹莫齐特联用sorafenib抑制huh和hepg2体外增殖比较图。图a为匹莫齐特联用sorafenib对huh7细胞的体外增殖抑制作用，图b为匹莫齐特联用sorafenib对hepg2细胞的体外增殖抑制作用。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。

实施例1匹莫齐特(10um，24hr)抑制耐药性肝癌细胞的生长增殖

成球培养基培养方法能增强hcc细胞对化疗药物cis(顺铂)，5fu(5-氟尿嘧啶)和dox(阿霉素)的耐药性，而匹莫齐特能直接地抑制耐药性肝癌细胞的生长；匹莫齐特能增强化疗药物cis，5fu和dox对肝癌细胞的增殖抑制作用。

成球培养基培养方法：将肝癌细胞接种于低黏附的6孔培养板中，用含egf(20ng/ml)、bfgf(20ng/ml)、b27添加剂、lif(leukemiainhibitoryfactor，10ng/ml)、lg(l-glutamine，2mmol/l)和40u/ml肝素的dmem-f12培养基(sfm)，在37℃、5％co2孵箱中培养。

由图1-a可知，与血清培养基相比，无血清培养基培养方法能增强hcc细胞对化疗药物cis，5fu和dox的耐药性，匹莫齐特能直接地抑制此类诱导性耐药性肝癌细胞的生长；如图1-b所示，匹莫齐特能增强化疗药物cis，5fu和dox对肝癌细胞的增殖抑制作用。虽然cis，5fu和dox在无血清培养基中表现出一定的抑制细胞增殖作用，但联合使用匹莫齐特后抑制效果显著的增强，这表明匹莫齐特能够降低肝癌细胞对于cis，5fu和dox的耐药性，其与这几种药物联合使用后在抑制细胞增殖方面具有显著的协同作用。

实施例2匹莫齐特(10um，24hr)抑制肝癌细胞的干性标志物cd133表达和sp细胞比例

cd133表达检测：采用流式细胞分析；使用流式细胞仪进行细胞分析。细胞染色用pe标记的抗cd133人/1(美天旎，ca，usa)。同型小鼠免疫球蛋白作为对照。

sp+细胞分析：将细胞进行胰蛋白酶处理，悬浮于dmem中有2％fbs和10mmhepes缓冲液。接着，将细胞染色90分钟，用5微克/毫升的hoechst33342染料(invitrogen公司，美国)，50μm维拉帕米处理组为对照组。将细胞温育，之后将它们再悬浮在含有2微克/毫升pi冰冷的pbs。进行流式细胞分析。实验结果如图2。

cd133阳性细胞和sp阳性细胞比例越高越能反映肝癌细胞的耐药性能力越强。若能抑制cd133阳性细胞和sp阳性细胞比例就能直接地抑制肝癌细胞的耐药性能力。如图2所示，匹莫齐特抑制肝癌细胞的干性标志物cd133表达和sp细胞比例。

实施例3匹莫齐特(10um，24hr)抑制肿瘤细胞的增殖标志物ki67表达，并阻滞肿瘤细胞处于静止期g0期

ki67表达分析：使用流式细胞仪进行细胞分析。细胞染色用fitc标记的抗ki67。同型小鼠免疫球蛋白作为对照。

细胞周期分析：先将细胞用4％多聚甲醛固定，细胞染色用apc标记的抗ki67和pi染料。同型小鼠免疫球蛋白作为对照，使用流式细胞仪进行细胞分析。

实验结果如图3所示，由图3可知，匹莫齐特抑制肿瘤细胞的增殖标志物ki67表达，并阻滞肿瘤细胞处于静止期g0期。

实施例4匹莫齐特(5um，96hr)促使肝癌细胞产生衰老现象

衰老现象分析：检测细胞中的β-半乳糖苷酶的活性，对比加药前后药物的比较。实验结果如图4。由图4可知，匹莫齐特促使肝癌细胞产生衰老现象，表现为不可逆的生长抑制。

实施例5匹莫齐特(10um，48hr)联用sorafenib(5um)能更强地抑制肝癌细胞的增殖

mtt法测细胞增殖：将不同的稳定细胞株分别在96孔板中种入2500个细胞，每组设5个复孔，分别在特定的时间点进行mtt检测，检测前每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续孵育4h，弃上清液，然后每孔加入150μldmso溶解沉淀，置于摇床使紫色结晶物全部溶解，最后于490nm波长的酶标仪测定吸光度(od值)。实验结果如图5。

由图5可知，匹莫齐特(10um，48hr)联用sorafenib(5um)能更强地抑制肝癌细胞的增殖，两种组分在抑制肝癌细胞增殖方面具有显著的协同作用。