GnRH-防御素重组去势疫苗及其制备的制作方法

本发明涉及分子疫苗学领域，具体的说是gnrh-防御素重组去势疫苗及其制备方法。

背景技术

动物所用的去势技术一直是手术去势，对动物应激很大，一般需要7-10天才能恢复，而且有时候会因为伤口感染引起宠物死亡。此外对雌性宠物的手术法去势，不仅感染风险较大，而且对操作人员的技术和体力均有很高的要求。此外，在很多国家和地区，动物福利中的激进分子一直施加压力以制止进行手术去势。而一种替代手术去势方法的选择就是采用gnrh去势疫苗接种，消除促性腺激素释放因子（gnrh，也称为lhrh）在体内的影响，使动物体不能性成熟，与手术去势相比，安全方便，减少感染机会。

促性腺激素释放激素(gnrh)是从垂体前叶释放的肽类激素，主要负责调节卵泡刺激激素(fsh)和促黄体生成激素(lh)的合成和释放。gnrh也被称为gnrh1、促黄体生成激素释放激素(lhrh)、促性腺素释放素原-1和促性腺素释放素原-1前体。术语“gnrh”包括gnrh类似物和变体，包括含有取代、缺失或插入的gnrh分子。在雄性和雌性中，gnrh从下丘脑释放到血液中并通过血液移动到垂体，它在那里诱导促性腺激素分别诱导促黄体生成激素(lh)和促卵泡激素(fsh)的释放。在生长的雄性动物中，lh促进睾丸发育和睾丸甾类的合成。在生长的雌性动物中，fsh刺激卵巢发育和其中的卵泡发育、卵巢甾类的合成和排卵，从而保证了动物的生殖能力。故控制动物繁殖的一条途径可以通过免疫gnrh，诱导gnrh的抗体，体内中和gnrh，法减少gnrh水平，导致lh和fsh合成减少，而伴随发情周期和精子生成的破坏，从而达到绝育的目的。

凡有免疫原性的物质，多属大分子胶体。一般而言，分子量越大，免疫原性越强。天然蛋白质的分子量多在10kd以上，才具有良好的免疫原性；分子量小于4kd的，一般不具有较好的免疫原性。由于gnrh肽为十肽分子量仅1.2kd，其免疫原性极低。单独免疫该肽，或者简单的重复串联，都不能引起较好的免疫反应，其无法有效地起到控制生殖的目的。

为了在受激动物中引发明显的免疫应答，小蛋白或内源物质可以和适当的载体结合。载体的作用是非特异地刺激t辅助细胞活性并与主要组织相容性复合物（mhc）的分子结合以引导抗原在抗原呈递细胞的细胞表面对该肽的加工和呈现。有报道利用白喉毒素蛋白作为载体连接四联gnrh蛋白，能够有效的提高gnrh的免疫效果。因此本专利采取四联gnrh蛋白提高蛋白分子量的同时，并引入防御性连接多肽，串联四个四联gnrh蛋白，进一步提高了其分子量，提高了其免疫原性。

防御素是一类富含精氨酸和半胱氨酸残基的小分子、多功能的阳离子多肽；一般由18-45个氨基酸残基构成。防御素可分为5种类型，即α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素。哺乳动物只表达α-防御素和β-防御素。β-防御素可以诱导肥大细胞脱颗粒并释放组胺。β-防御素可以募集并促进未成熟树突状细胞和记忆性t细胞的成熟，并激活特定的免疫反应。β-防御素可以加强巨噬细胞吞噬反应，促进中性粒细胞募集，调节补体激活，趋化未成熟t细胞和树突状细胞。已有文献报道防御素和疫苗（如乙肝疫苗、rsvf蛋白疫苗）共同注射对机体的免疫刺激增强，免疫效果更好。但是以上防御素都是作为佐剂单独使用，其多肽的性质导致其容易降解，并不容易保存，导致其制备的疫苗需要通过保护剂和特殊包装方式才能发挥佐剂效果。

本发明采取抗原同防御素多级融合串联的方式，同抗原串联表达，提高了低分子量抗原免疫原性的同时，也引入了防御肽作为佐剂，避免了多肽不稳定的现象，提高了防御素稳定性，增强了其在体外和体内的稳定性，提高了抗原的免疫效果；同时本发明使用的是单一融合有hdp-gnrh蛋白，减少了多肽合成和制剂成本，使用更加便利。故本发明采用gnrh与防御素多级串联融合蛋白表达方式，作为制备动物去势疫苗的一种方法，其表达量高，免疫原性好、疫苗制剂简单，能够有效的提高其免疫效果，使节育技术更优化。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种gnrh-防御素重组去势疫苗及其制备。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

gnrh-防御素重组去势疫苗，疫苗抗原为序列表seqidno.1中的氨基酸序列所示。所述重组蛋白疫苗为含有列表seqidno.1的原核重组表达质粒pet28agnrh-防御素。所述重组蛋白疫苗为含有列表seqidno.1的gnrh-防御素转化大肠杆菌表达的重组蛋白。

gnrh-防御素重组去势疫苗及其制备是以根据ncbi查找家犬的β-防御素前序列为序列表seqidno.2中的氨基酸序列所示和gnrh序列为序列表seqidno.3中的氨基酸序列所示，设计重组蛋白序列为一个与选定的gnrh八体为序列表seqidno.4中的氨基酸序列所示融合的防御素多肽，按照设计的重组蛋白序列采用密码子优化系统来设计dna序列合成带ndeⅰ和ecorⅰ酶切位点的dna序列，合成dna序列经ndeⅰ和ecorⅰ双酶切产物与同样酶切的载体pet28a见图2连接，连接液转化入大肠杆菌dh5α，筛选质粒pet28agnrh-hdp，质粒pet28agnrh-hdp转化大肠杆菌表达的含序列表seqidno.1中的氨基酸的重组蛋白，并制备成疫苗。

gnrh-防御素重组去势疫苗的应用，其特征在于：用于免疫宠物抑制宠物的生育力。

附图说明

图1为本发明实施例提供的pet28a空载质粒图谱。

图2为本发明实施例提供的pet28agnrh十六体质粒图谱。

图3为本发明实施例提供的pet28agnrh-hdp质粒图谱。

图4为本发明实施例提供的纯化的疫苗蛋白(泳道2)。泳道1，分子量标准。

图5为本发明实施例提供的实验动物免疫后产生的抗gnrh抗体滴度

图6为本发明实施例提供的实验动物免疫后体内孕酮/睾酮含量。a：为雌性免疫实验动物体内孕酮含量。b：为雄性免疫实验动物体内睾丸酮含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法：

1.质粒提取及双酶切电泳回收均使用“深圳康体生命科技有限公司”的相应试剂盒。

2.质粒、dna连接液转化进入大肠杆菌皆用hanahan方法(sambrookandrussell：molecularcloning：alaboratorymannual.coldspringharborlaboratorypress2001)；

3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”。

实施例1

gnrh-防御素疫苗表达载体的构建方法：质粒pet28agnrh-hdp的构建：将从苏州金唯智生物科技有限公司合成的带ndeǀ和ecorǀ酶切位点的dna序列（序列为seqidno.5和seqidno.6）冻干粉按照说明书用灭菌超纯水溶解，溶解的dna和pet28a质粒同时分别用ndeǀ和ecorǀ进行双酶切，双酶切体系见下表：

37℃，酶切2h，核酸电泳分离目的片段，用手术刀将目的条带切下来，用凝胶回收试剂盒进行纯化。

将gnrh十六体/gnrh-hdp基因片段和pet28a载体片段按照下表进行连接

4℃连接过夜，连接混合液转化大肠杆菌dh5α后在含有50ug/ml卡那霉素(kan⁺)的lb固体培养基上培养过夜，挑取几个单克隆测序，选择序列正确的菌提取质粒，即为质粒pet28agnrh十六体和质粒pet28agnrh-hdp。

实施例2

gnrh十六体多肽蛋白和gnrh-防御素疫苗蛋白的诱导表达和纯化：

1、菌的制备：将上述的质粒pet28agnrh十六体和质粒pet28agnrh-hdp质粒pet28agnrh-hdp用常规方法转化大肠杆菌bl21，在含有kan⁺(50ug/ml)的lb固体培养基上培养过夜小时，挑取一个转化子，将其分别命名为bl21/pet28agnrh十六体和bl21/pet28agnrh-防御素。将bl21/pet28agnrh十六体和bl21/pet28agnrh-防御素于含有kan⁺(50ug/ml)的lb液体培养基中过夜培养；取1ml过夜后的培养菌液，加入100ml新鲜的含有kan⁺(50ug/ml)的lb液体培养基中，于37℃下转速200rpm摇动培养至od600为0.6时，加入终浓度为0.4mm的iptg，37℃继续以转速160rpm摇动培养2-4h，以5000g，4℃离心10min，收集菌沉淀。

2、破菌：100ml菌沉淀加入5ml包涵体缓冲液，先用超高压连续流细胞破碎机循环破碎4次(1300bar)，再用超声细胞粉碎机再次破碎超6s，停9s，功率42%（10号探头），超声10min。，直至菌悬液变澄清为止。

3、gnrh十六体多肽蛋白和gnrh-防御素疫苗蛋白洗杂：破菌混合装入50ml高速离心管中，配平，12000rpm，10min，4度离心弃上清。包涵体沉淀用等体积的包涵体缓冲液洗涤一次，配平，12000rpm，10min，4度离心弃上清。包涵体沉淀用等体积的包涵体洗涤液洗涤两次，配平，12000rpm，10min，4度离心弃上清。

4、gnrh十六体多肽蛋白和gnrh-防御素疫苗蛋白：根据沉淀量加入包涵体溶解液（1g/20ml），室温震荡溶解30min，18000rpm，10min，4度，取上清，纯化的蛋白经sds-page电泳检测(80v电压下电泳30-35min，随后120v电压下电泳50-60min)，测定其分子量大小(参见图3)。将纯化的蛋白经质谱分析，证实其为具有序列表seqidno1中的氨基酸序列的抗原蛋白pet28agnrh-hdp。所述包涵体溶解液为终浓度的10mmnah2po4、10mmna2hpo4和8m尿素，ph8.0。

实施例3

疫苗的应用

疫苗制剂的制备：采用油包水佐剂进行疫苗的制备。

gnrh-防御素疫苗蛋白表达高，100ml菌液能得到0.1ggnrh-防御素疫苗蛋白（按照1g/2ml溶解）为2ml，本疫苗免疫原性强，25ug/剂，能生产400支，按照每剂为100ul，故总体积为400ml，gnrh-防御素疫苗蛋白最终稀释200倍。由于稀释倍数高，可以采用包涵体溶解液直接滴加入油包水佐剂进行稀释复性同时制备成疫苗。

gnrh-防御素疫苗的免疫应用:将在雄性和雌性（猫）中测试gnrh-防御素疫苗诱导针对gnrh的免疫应答的能力。取40只动物分四组，每组由10只动物组成(5只雄性和5只雌性)。在第0天进行接种第一组接种gnrh-防御素疫苗，第二组接种gnrh十六体蛋白，第三组接种gnrh十六体蛋白和防御素多肽混和物，第四组接种安慰剂（pbs）(接种方式：接种量为100ul，通过肌肉内注射至左前腿中)。将在第0天、随后在前两个月每周一次以及此后每月一次收集血液。测试血清中抗gnrh抗体的存在，同时也将测量gnrh、孕酮和睾酮的水平。每日观察所有参与实验的动物，如果出现发情情况，就把该发情的实验动物与未免疫的异性同笼，以观察其能否受孕或者使异性受孕，以评价其绝育效果。

gnrh-防御素疫苗的免疫结果评估：到1年的观察期结束时，gnrh-防御素疫苗组被免疫动物有100％保持不育，检测的抗gnrh抗体滴度（见图5）有明显升高及孕酮/睾酮含量（见图6）显著降低。gnrh十六体蛋白对照动物有70%成功繁殖，gnrh+防御素对照动物有60%具有生育能力，安慰组动物有90%具有生育能力（表1）。结果证明gnrh-防御素融合疫苗，能够提高gnrh的免疫效果，并能起到绝育效果。

表1gnrh-防御素疫苗免疫效果评价表：

序列表

<110>广州源博医药科技有限公司

<120>gnrh-防御素重组去势疫苗及其制备

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