本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的β-环糊精包合物及其制备方法。
背景技术：
结核病(tuberculosis，tb)是一种主要由结核分枝杆菌引起的，通过呼吸道传播的慢性传染性疾病。结核杆菌主要感染肺部，称为肺结核(pulmonarytuberculosis，ptb)，其在世界众多国家和地区流行。2015年who在结核病实况报道第104号指出：“结核病仅仅是继艾滋病病毒/艾滋病之后，在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手，受到结核病影响的大多数处于生产力最强的年轻人。”目前，我国有4亿人曾感染结核杆菌，结核病患者总数在世界上排名第二。
吡嗪酰胺(pyrazinamide,pza)又名氨甲酰基哌嗪，分子式为c5h5n3o，相对分子质量123.11，熔点188-192℃，通常为白色粉末，常温条件下在水中的溶解度较小，在有机溶剂氯仿和二氯甲烷中有较好的溶解度。吡嗪酰胺的结构式如下式所示：
吡嗪酰胺是结核病治疗中重要的一线口服抗结核药物，其最早发现于1936年，在1952年发现其具有抗菌活性。吡嗪酰胺在临床上使用广泛，与利福平、异烟肼一起作为结核病短程化疗中最有效的抗菌药物，能将结核病疗程从9-12个月缩短到6个月。此外，吡嗪酰胺还具有较好的抗癌性，可有效抑制肿瘤细胞的分裂，减少癌细胞数量，使肿瘤细胞从腹水中消失。然而直接服用吡嗪酰胺存在发生率较高的不良反应，容易引起肝脏损害，因此用药期间需要定期检查肝功能。
通过对结核病治疗药物的了解，发现利福平和异烟肼常作为复方-异福片使用。在复方制剂过程中，产生了少量的杂合物——异烟肼利福霉素腙(英文名hyd)，其结构式如下式所示：
异烟肼利福霉素腙在2015版《中国药典》中作为复方异福片制备过程中产生的杂质之一出现。人体服用该复方后检测发现，在胃液、粪便和尿液中有hyd残留，同时在血液中未检测到该物质。通过实验室前期对该杂合物的了解，以及在其他杂合抗生素合成过程中总结的经验，我们怀疑hyd对结核杆菌有一定的抑制作用，然而并未有相关文献介绍其合成方法和理化特性。因此我们尝试合成了hyd，并对其生物活性进行了检测，结果表明异烟肼利福霉素腙的杀菌效果与利福平相当，这对抗结核药物的研究与开发具有重要的意义和经济价值。
考虑到hyd的理化性质与利福平相似并且水溶性较差，可采用环糊精将其包合后提高其溶解性。已经有相关文献报道，利福平通过β-环糊精包合后，可以改变其溶解性能，促进药物的吸收，提高药物生物利用度。此外根据“鸡尾酒疗法”，将几种不同单一靶点药物联用或选择使用，作用于多个分子靶标的“多靶点”药物治疗复杂疾病时会有较佳疗效。基于此通过药剂学中包合的方法，将具有不同靶点的药物分子包合起来形成多靶点药物，由于两个药物分子缺少共性，因此在体内可各自保留原来分子的全部或部分结构特征，然后通过特定的给药方式，到达指定的给药部位，包合物分散开，两个或多个药物分子分别作用于各自的靶点而发挥作用。基于上述原理，本申请人较早前公开了一种胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物，具体参见中国专利cn107261106a。
在上述基础上，本申请人利用β-环糊精对吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙进行包合，制得了单一的包合物或者多种包合物构成的组合物，活性测试结果表明这些包合物均具有较好的抗菌活性，并且普遍好于单一组分的抗菌活性。
技术实现要素：
本申请的目的在于提供一种吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的β-环糊精包合物及其制备方法，通过将目前临床上广泛使用的抗结核药物吡嗪酰胺、自制的异烟肼利福霉素腙与β-环糊精进行包合，改善了小分子药物的药代动力学性质，满足了直接将药物送达肺部病灶部位的要求，实现了减少药物毒副反应、提高其生物利用度、降低耐药性、满足临床用药需求的目的。为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的β-环糊精包合物，由吡嗪酰胺-β-环糊精包合物、异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物以及吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物中的任意一种或其中几种按照任意比混合而成。
进一步的，吡嗪酰胺-β-环糊精包合物中吡嗪酰胺与β-环糊精的摩尔比为1-3:1，异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物中异烟肼利福霉素腙与β-环糊精的摩尔比为1-3:1，吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物中吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙、β-环糊精的摩尔比为1-3:1-3:1。
进一步的，吡嗪酰胺-β-环糊精包合物、异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物以及吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物均为纳米颗粒。
上述吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的β-环糊精包合物的制备方法，具体过程如下：
(a)采用饱和水溶液法或冷冻干燥法制备吡嗪酰胺-β-环糊精包合物；
或者(b)采用饱和水溶液法或干研磨法制备异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物；
或者(c)将异烟肼利福霉素腙的碱溶液与吡嗪酰胺的碱溶液混合均匀，再加入三聚磷酸钠的水溶液，将所得混合溶液缓慢滴加到饱和β-环糊精醋酸溶液中，充分搅拌后置于-5至4℃静置冷藏24-48h，得到吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物；
或者(d)将吡嗪酰胺-β-环糊精包合物、异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物、吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物中的至少两种按照任意比混合均匀，得到包合物组合物。
进一步的，所述饱和水溶液法具体为：首先配制β-环糊精的饱和水溶液，接着将药物(吡嗪酰胺或异烟肼利福霉素腙等)溶解于8-15倍质量的乙醇中，然后将两种溶液混合搅拌均匀，将混合液置于0-4℃下静置冷藏18-48h，最后依次经过滤、洗涤、35-55℃干燥即可。
进一步的，所述冷冻干燥法具体为：首先将β-环糊精溶解于50倍质量、温度为70-100℃的热水中，接着向其中加入药物(吡嗪酰胺等)并充分搅拌，然后将所得混合溶液置于-5至5℃的低温环境下冷冻8-15h，最后取出并用二氯甲烷洗去未包入的药物，除去二氯甲烷即可。
进一步的，所述干研磨法具体为：将β-环糊精和药物(异烟肼利福霉素腙等)混合后充分研磨，接着置于35-60℃环境中干燥8-12h即可。
进一步的，步骤(c)中将所得混合溶液缓慢滴加到饱和β-环糊精醋酸溶液中，形成的混合溶液中β-环糊精的浓度为1.5-6.0g/l。实验结果表明，只有在特定浓度范围内，即反应液中β-环糊精浓度范围在1.5-6.0g/l时才能够形成β-环糊精纳米颗粒。
进一步的，步骤(c)中配制异烟肼利福霉素腙的碱溶液以及吡嗪酰胺的碱溶液所使用的碱选自naoh、koh、na2co3、k2co3、叔丁醇钠、叔丁醇钾中的一种。
进一步的，步骤(c)中所述异烟肼利福霉素腙的碱溶液浓度为0.001-0.004g/ml，吡嗪酰胺的碱溶液浓度为0.01-0.02g/ml，三聚磷酸钠的水溶液浓度为0.001-0.004g/ml。
与现有技术相比，本发明具有以下预料不到的有益效果：
(1)开发了吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙包合物的制备方法，将原本作为复方异福片制备过程杂质的异烟肼利福霉素腙开发成一种新型抗结核包合物，并取得了较好的效果；
(2)通过简单的包合作用将不同作用靶点的药物(吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙)包合在一起，得到了吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的β-环糊精包合物及其组合物，实验表明其对结核分枝杆菌的抑菌效果比吡嗪酰胺、利福霉素、异烟肼等传统药物或其混合物更好；
(3)通过特定的给药方式将制得的包合物送达给药部位后，包合物分散开两个或多个药物分子分别作用于各自的靶点而发挥作用，有效的避免了药物在体内代谢的首过效应，在保证药效的同时减少了药物的服用量；
(4)吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙的复合包合物与单一包合物相比耐药性减弱，效果更优。
附图说明
图1为吡嗪酰胺(a)、β-环糊精(b)、吡嗪酰胺与β-环糊精物理混合物(c)以及实施例1制得的吡嗪酰胺-β-环糊精包合物(d)的dsc图。
具体实施方式
为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。
本发明对包合物的收率及包合率的计算方法如下(平行测定三次，取平均值)：
其中，客体分别指吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙、吡嗪酰胺+异烟肼利福霉素腙等，主体指β-环糊精。
实施例1
分别采用“饱和水溶液法”和“冷冻干燥法”制得了吡嗪酰胺-β-环糊精包合物，具体过程如下：
(1)饱和水溶液法
在烧杯中加入1gβ-环糊精，再加入适量的水搅拌成饱和溶液。精密称量与β-环糊精摩尔数相等的吡嗪酰胺(约0.108g)，将其加入到3ml乙醇中，微微加热使其溶解，得到吡嗪酰胺的乙醇溶液。在搅拌条件下，逐滴将吡嗪酰胺的乙醇溶液加入到上述β-环糊精的饱和溶液中，搅拌0.5-1h后置于0-4℃环境冷藏静置18-24h，过滤后用少量蒸馏水洗涤，接着转入35-55℃烘箱中干燥即得包合物。所得包合物在密闭干燥处低温存放。
按照上述方法测定包合物的包合率和收率，结果分别为84.5％、82.13％。
(2)冷冻干燥法
称取1gβ-环糊精并用70-100℃的热水溶解，向其中加入与β-环糊精摩尔数相等的吡嗪酰胺(约0.108g)搅拌0.5-1h，将混合溶液置于-5至0℃的冰箱过夜冷冻干燥，用二氯甲烷洗去未包入的吡嗪酰胺，最后除去残留溶剂得白色包合物粉末。所得包合物在密闭干燥处低温存放。
按照上述方法测定包合物的包合率和收率，结果分别为81.33％、85.37％。
实施例2
分别采用“饱和水溶液法”和“干研磨法”制得了异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物，具体过程如下：
(1)饱和水溶液法
在烧杯中加入0.1gβ-环糊精，再加入适量的水搅拌成饱和溶液。精密称量与β-环糊精摩尔数相等的异烟肼利福霉素腙(约0.074g)并用少量乙醇溶解，将异烟肼利福霉素腙的乙醇溶液加入到上述β-环糊精的饱和溶液中，搅拌0.5h后置于0-4℃环境冷藏静置24h，过滤后用少量乙醇洗涤，接着转入40℃烘箱中干燥即得包合物。所得包合物在密闭干燥处低温存放。
按照上述方法测定包合物的包合率和收率，结果分别为81.47％、81.107％。
(2)干研磨法
称取0.1gβ-环糊精置于研钵中，向其中加入与β-环糊精摩尔数相等的异烟肼利福霉素腙(约0.074g)，边加边研磨，加完后继续研磨30-60min直至充分研磨，接着将混合物转入35-55℃烘箱中干燥得包合物。所得包合物在密闭干燥处低温存放。
按照上述方法测定包合物的包合率和收率，结果分别为71.95％、87.03％。
实施例3
制备吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物的方法具体如下：
a.将10mgβ-环糊精溶于5ml体积分数为0.25％的醋酸溶液中，充分溶胀24小时，直至β-环糊精全部溶解，得到β-环糊精溶液；
b.取1.7mg吡嗪酰胺溶解在0.1ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中，充分溶解后得到吡嗪酰胺溶液；
c.取3mg异烟肼利福霉素腙溶于1ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中，从中取出0.3ml加入到步骤b制备的吡嗪酰胺溶液中，再加入1ml浓度为2g/l的三聚磷酸钠(tpp)水溶液，搅拌均匀得到混合溶液；
d.将步骤c制得的溶有吡嗪酰胺、异烟肼利福霉素腙、tpp的混合溶液缓慢滴加到步骤a所得溶胀后的β-环糊精溶液中，室温搅拌30min，再加入少量乳糖做保护剂，然后在-5至0℃冷冻干燥36-48h，得到吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物。所得包合物在密闭干燥处低温存放。
按照上述方法测定包合物的包合率和收率，结果分别为79.85、82.235％。
实施例4
将实施例1制得的吡嗪酰胺-β-环糊精包合物与实施例2制得的异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物等质量混合，得到包合物组合物。
dsc分析测试
分别对吡嗪酰胺(a)、β-环糊精(b)、吡嗪酰胺与β-环糊精物理混合物(吡嗪酰胺与β-环糊精的摩尔比为1:1，c)以及本实施例1制得的吡嗪酰胺-β-环糊精包合物(d)进行了dsc分析，分析过程如下：
精密称取约4-5mg干燥好的各样品，将其均匀铺满放于dsc测试专用铝箔盒中，用压片机压盖密封，并使用空白铝箔盒作为对照进行测试，扫描速度为20℃/min，范围为25-240℃。所得dsc热谱图见图1，其中a为吡嗪酰胺，b为β-环糊精，c为两者的物理混合物，d为吡嗪酰胺-β-环糊精包合物。
由图1可知，吡嗪酰胺在熔点190℃有一吸热峰，为熔点峰；β-环糊精在温度约为105℃处出现吸热峰；两者的物理混合物在105℃和190℃有2个吸热峰，这说明物理混合物只是简单的混合而没有形成新的物质。反观实施例1制得的包合物，其dsc曲线中吡嗪酰胺的熔点峰消失，这表明的确形成了吡嗪酰胺-β-环糊精包合物。实施例2-3制得的包合物也进行了类似的测试，得出了同样的结论。
耐药性测试
以实施例2制备的异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物为样品，将其冻干物稀释至不同的倍数，分别测试其对培养好的结核分枝杆菌菌株的耐药性，并与利福霉素和异烟肼的物理混合物(利福霉素与异烟肼质量比为1:1)进行对比。
实验方法：把上述包合物及混合物分别配制成浓度为1mg/ml的药液，经灭菌后，用无菌膜密封起来备用。
(1)在无菌96孔板(1-12孔)中每孔加7h9培养基100μl。第1孔加适当稀释的抗结核药原液100μl，对倍连续稀释至第12孔。各孔药物最终浓度:利福霉素和异烟肼的混合物，17-0.017μg/ml，异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物，17-0.017μg/ml。
(2)在玻璃磨菌器底部加入2滴10％(质量分数)tween-80生理盐水及临床分离的2-3周菌龄的新鲜培养物，研磨至呈乳酪样，用生理盐水稀释成1号麦氏比浊管的浊度(1mg/ml)，用7h9培养基1:20倍稀释后1-8孔每孔接种100μl。空白孔为培养基对照。
(3)用无菌膜封板，放入湿盒内，37℃培养5d，第6天加入过滤除菌、0.1g/l刃天青显色液30μl至第12孔，继续温育24h。如空白孔(未加药物)变成粉红色，则加同量刃天青显色液至其他各孔，24h后记录颜色变化。如空白孔仍为蓝色，分别在第7、9天观察。颜色从蓝色变为粉色即预示细菌生长。
将实施例2制备的异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物稀释成不同浓度后测试其对结核分枝杆菌的耐药性，并与同等浓度下的利福霉素和异烟肼的混合物进行对比，测试结果见表1。
表1异烟肼利福霉素腙与β-环糊精的包合物及混合物耐药性对比表
备注：r为对结核分枝杆菌的耐药性，即无活性；s为对结核分枝杆菌的敏感性，即为有活性(浓度单位为μg/ml)。
从表1可知，异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物浓度在0.133μg/ml的时候就开始出现抑菌效果，而利福霉素和异烟肼的混合物浓度在1.063μg/ml的时候才出现抑菌效果，可认为异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物比利福霉素和异烟肼混合物的抑菌效果好。
抗菌活性实验
分别选取同样包合比例的左氧氟沙星-壳聚糖包合物、吡嗪酰胺-β-环糊精包合物、异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物、吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精包合物进行了抗菌活性对比试验。该试验用抗结核药物的7h9培养基由武汉市传染病医院提供。用不含抗结核药物的7h9培养基作空白对照，实验方法为微孔显色法，采用盲法编排测试。以不加抗结核药物的培养基为对照组，以hr37v标准菌株为标本，随着时间推移，观察培养基的显色情况，培养基的显色情况反映了不同种结核杆菌的生长情况，进一步说明了药物对结核杆菌的抑菌活性。培养基能显示蓝色的最低浓度为药物的mic值。mic值越小，说明药效越强；mic值越大，说明药效越差。抗菌活性实验结果如下表2所示：
表2不同包合物的抗菌活性结果表
由表2可知，四种包合物均有较好的杀菌活性，与我们所预期的一致。其中新制得的三种包合物与现有的左氧氟沙星-壳聚糖包合物相比，有一定的优势；吡嗪酰胺-异烟肼利福霉素腙-β-环糊精具有吡嗪酰胺-β-环糊精、异烟肼利福霉素腙-β-环糊精两者的相关特性。