本发明涉及生物医药领域，具体是一种靶向性介孔二氧化硅纳米药物及其制备方法。
背景技术：
介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)由于其在纳米医学领域特别是在癌症化疗方面应用的潜力而引起了科学界的兴趣。介孔二氧化硅纳米颗粒的主要优点在于其制备方法简单，可体内降解，可控制粒径和孔道的大小，成本低廉以及具有较大的孔体积和表面积，并且获得了美国fda的批准在临床试验中可用于癌症治疗或成像应用。目前介孔二氧化硅纳米颗粒的制备方法主要为模板法，模板法是利用高分子或表面活性剂胶束作为模板剂，在碱性条件下正硅酸乙酯缓慢水解缩合形成二氧化硅纳米颗粒，最后用烧结法或酸醇回流法除去模板剂得到介孔二氧化硅纳米颗粒。但这两种除模板剂的方法都有很大的缺点，烧结法制备的介孔二氧化硅纳米颗粒在人体内难以降解，不适合做纳米载体；而酸醇回流法做出来的介孔二氧化硅纳米颗粒结构易塌陷且后续载药量较低。
介孔二氧化硅纳米颗粒的诸多优点决定了其在纳米载药领域有广泛的应用前景。但由于在人体内血液循环时间短，对肿瘤细胞靶向性差等缺陷限制了其在癌症化疗方面的大规模应用，因此研究如何提高介孔二氧化硅纳米颗粒的血液长循环能力及肿瘤细胞靶向能力是决定其能否大规模应用的关键。
技术实现要素：
本发明的目的在于解决上述现有技术中存在的问题，提供一种稳定性好、血液循环时间长的靶向性介孔二氧化硅纳米药物；
本发明的另一目的在于提供一种所述靶向性介孔二氧化硅纳米药物的制备方法。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：
一种靶向性介孔二氧化硅纳米药物，包括表面包裹有聚多巴胺介导层的介孔二氧化硅纳米颗粒和修饰在所述聚多巴胺介导层上的羧基封端聚乙二醇及两性离子聚合物，还包括偶联在所述羧基封端聚乙二醇链末端的靶向分子和分散在所述介孔二氧化硅纳米颗粒内部的疏水性药物；所述两性离子聚合物的结构式为：
其中，r1为两性离子基团，r2为羧基或活性酯基团，x为1～20的整数，n:m＝1:(2～20)。
优选的，所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、10-羟基喜树碱、多西他赛、异长春花碱或奥沙利铂中的一种或数种。
优选的，所述两性离子基团r1为磷酰胆碱、磺酸甜菜碱或羧酸甜菜碱。
一种上述靶向性介孔二氧化硅纳米药物的制备方法，包括以下步骤：
(1)将疏水性药物、阳离子表面活性剂和三乙醇胺溶解于醇水混合液中，搅拌下滴加正硅酸乙酯，然后滴加蒸馏水稀释反应液并继续反应制备载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒，得到溶液a；
(2)向所述溶液a中加入多巴胺盐酸盐，搅拌下反应制备聚多巴胺包裹的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒，经纯化得到溶液b；
(3)向所述溶液b中加入羧基封端的聚乙二醇和两性离子聚合物，通过酰胺化反应在所述聚多巴胺包裹的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒表面修饰聚乙二醇和两性离子聚合物，经纯化得到溶液c；所述两性离子聚合物的结构式为：
其中，r1为两性离子基团，r2为羧基或活性酯基团，x为1～20的整数，n:m＝1:(2～20)
(4)向所述溶液c中加入含有氨基的靶向分子，通过酰胺化反应将所述靶向分子偶联到所述聚乙二醇的末端羧基上，经纯化得到所述靶向性介孔二氧化硅纳米药物。
优选的，步骤(1)中所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、10-羟基喜树碱、多西他赛、异长春花碱或奥沙利铂中的一种或数种。
优选的，步骤(1)中所述醇水混合液中醇水的体积比为1:5～10；阳离子表面活性剂、三乙醇胺和正硅酸乙酯的摩尔比为1:0.5～1:1～8，疏水性药物与阳离子表面活性剂的摩尔比≤0.9。
优选的，步骤(2)中向所述溶液a中加入多巴胺盐酸盐后，多巴胺盐酸盐的浓度为0.2～2mg/ml。
优选的，步骤(3)中所述两性离子基团r1为磷酰胆碱、磺酸甜菜碱或羧酸甜菜碱；所述两性离子聚合物的浓度为1～5mg/ml；所述羧基封端聚乙二醇的分子量为1000～8000。
优选的，步骤(4)中所述靶向分子为叶酸、rgd(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)、rgdm(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸类似物)、crgdyk(环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-赖氨酸)或rgdfc(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸)。
优选的，所述纯化采用超滤方法进行。
本发明的有益效果是：本发明所述靶向性介孔二氧化硅纳米药物在介孔二氧化硅纳米颗粒表面包裹有聚多巴胺介导层，能够有效提高所述纳米药物的结构稳定性，在所述聚多巴胺介导层上修饰有聚乙二醇和两性离子聚合物，能够大幅提高其血液循环半衰期，偶联在聚乙二醇链末端的靶向分子能够促进其在肿瘤部位的富集，达到精准治疗癌症的目的；本发明所述纳米药物的制备方法通过在制备介孔二氧化硅纳米颗粒时加入疏水性药物，实现同时制备介孔二氧化硅纳米颗粒和负载疏水性药物，易于实现药物的负载且负载量大，通过在介孔二氧化硅纳米颗粒表面包裹聚多巴胺，能够有效提高其结构稳定性，再利用酰胺化反应在所述聚多巴胺介导层上修饰聚乙二醇和两性离子聚合物以及在所述聚乙二醇链末端偶联靶向分子，能够大幅提高其血液循环半衰期以及在肿瘤部位的富集，提高抗癌药物利用率，减轻癌症化疗毒副作用。
附图说明
图1.聚多巴胺包裹的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒的sem图；
图2.不同改性载香豆素-6介孔二氧化硅纳米颗粒被l929和hela细胞吞噬2h后的倒置荧光显微镜图像；
图3.不同改性载香豆素-6介孔二氧化硅纳米颗粒被l929细胞吞噬2h后的荧光强度图；
图4.不同改性载香豆素-6介孔二氧化硅纳米颗粒被hela细胞吞噬2h后的荧光强度图；
图5.不同改性载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒与l929(a)及hela(b)细胞培养48小时的细胞存活率图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中，所使用的两性离子聚合物的结构式为：
实施例
(1)在100ml三口瓶中加入0.75g十六烷基三甲基氯化铵，0.3g阿霉素盐酸盐(dox·hcl)，18mlh2o和2.4ml无水乙醇，在50℃油浴下快速磁力搅拌使十六烷基三甲基氯化铵充分溶解；将0.315g三乙醇胺溶于2mlh2o中，快速加入上述三口烧瓶中，充分搅拌均匀；在50℃和高速搅拌(>1200rpm)下，将4.38ml正硅酸乙酯用恒压滴液漏斗滴加入三口烧瓶中，5秒一滴，约30min滴完；然后将50mlh2o加入滴液漏斗中，一秒一滴，约30min滴完；继续保持温度和转速条件下，反应2h后得到载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒；
(2)向上述溶液中加入200mg多巴胺盐酸盐，调节ph至8.5，室温反应30min后得到聚多巴胺包裹的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒msn/pda，制得纳米颗粒的sem如图1所示；
(3)取2mg/ml聚多巴胺包裹的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒溶液50ml，加入20mg分子量2000的羧基封端聚乙二醇、6mgn-羟基琥珀酰亚胺、9mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，35℃搅拌反应30min后加入250mg含活性酯基团的两性离子聚合物pmen，将ph调至7，35℃搅拌反应12小时后，12000rpm离心20min，弃去上清液并将离心后的沉淀再分散于蒸馏水中，得到pmen修饰的msn/pda，即msn/pda/pmen；
(4)向步骤(3)得到的溶液中加入6mgn-羟基琥珀酰亚胺、9mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和50mg氨基化的叶酸(fa-nh2)，35℃磁力搅拌反应24小时后12000rpm离心20min，弃去上清液并将沉淀再分散于蒸馏水中即得到所述介孔二氧化硅纳米药物msn/pda/pmen/fa。
测试例1
不同改性载香豆素-6的介孔二氧化硅纳米颗粒的细胞摄取研究
采用与实施例步骤(1)和(2)相同的方法制备msn/pda，只是步骤(1)中不加入阿霉素盐酸盐；以得到的msn/pda通过实施例步骤(3)和(4)的方法分别制备msn/pda/pmen和msn/pda/pmen/fa30；以得到的msn/pda通过与实施例步骤(3)和(4)相同的方法制备msn/pda/pmen/fa5，只是在步骤(3)中羧基封端聚乙二醇的反应时间为5min。
取上述制备的msn/pda、msn/pda/pmen、msn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30各100mg分别分散于100ml蒸馏水中并剧烈搅拌，分别将200μl1mg/ml香豆素-6的dmso溶液缓慢滴加于上述溶液中，10min后即得到载香豆素-6的msn/pda、msn/pda/pmenmsn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30。
利用倒置荧光显微镜定性观察小鼠成纤维细胞l929和人宫颈癌细胞hela摄取不同改性载香豆素-6的介孔二氧化硅纳米颗粒的情况，将l929和hela细胞在24孔板中培养，每孔1ml培养液中含有1×105个细胞，在5％co2和37℃的条件下培养24h使细胞贴壁。后用含有0.2mg/ml负载香豆素-6的改性介孔二氧化硅纳米颗粒的培养液替换原培养液，在5％co2和37℃的条件下培养2h后，吸出培养液，用pbs清洗两次，用倒置荧光显微镜分别拍摄细胞的明场和荧光场照片，定性判断l929和hela细胞对改性介孔二氧化硅纳米颗粒的吞噬情况，结果如图2所示。由图2可知，l929和hela两种细胞对msn/pda均有明显吞噬，但对msn/pda/pmen均无吞噬，只有hela细胞对msn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30有大量吞噬，说明msn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30的靶向效果显著。
通过流式细胞仪定量测定l929和hela细胞摄取负载香豆素-6的改性介孔二氧化硅纳米颗粒，l929和hela细胞在24孔板中培养，每孔1ml培养液中含有1×105个细胞，在5％co2和37℃的条件下培养24h使细胞贴壁。然后用含有0.2mg/ml负载香豆素-6的改性介孔二氧化硅纳米颗粒的培养液替换原培养液，在5％co2和37℃的条件下培养2h后，吸出培养液，用pbs清洗两次，用0.25％的edta-胰蛋白酶溶液消化并分散于1mlpbs溶液中。使用novocyted2040r(aceabiosciences，inc.)流式细胞仪在421nm分析细胞的平均荧光强度，结果如图3和4所示。图3中较低的荧光强度说明所有这些载香豆素-6改性介孔二氧化硅纳米颗粒被l929细胞吞噬较少；与图3相比，图4显著增强的荧光强度说明hela细胞对msn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30纳米颗粒的吞噬数量显著增大，由此表明msn/pda/pmen/fa5和msn/pda/pmen/fa30的靶向作用明显。
测试例2
不同改性载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒的细胞毒性
采用实施例制备的载阿霉素msn/pda/pmen、msn/pda/pmen/fa和msn/pda进行细胞毒性实验，使用l929细胞和hela细胞通过四唑盐比色法(mtt)评价其细胞毒性，并用等浓度的游离阿霉素溶液(freedox)作为对照。l929细胞在dmem高糖培养液中培养，hela细胞在rpmi-1640培养基中培养，两种细胞均在饱和湿度的含有5％co2的37℃恒温培养箱中培养。所有细胞毒性的测定均在96孔板中进行，每孔约1×104个细胞，在孔板中培养12小时待细胞完全贴壁后，吸出培养液，加入200μl不同浓度的载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒溶液，分散于dmem或不含叶酸的rpmi-1640培养基中，其中阿霉素的浓度分别为0.002、0.005、0.010、0.020mgml-1。继续培养48小时后，吸出培养基，贴壁细胞用无菌pbs洗涤两次，在避光的条件下向每孔加入20μl浓度5mgml-1的mtt溶液，在37℃下继续培养4小时后，吸出mtt溶液，加入200μl色谱纯二甲亚砜溶解生成的甲瓒，在37℃恒温摇床震荡15min混匀后使用酶标仪测定各孔的光密度(od)sample值，取未处理的细胞作为对照组(od)control，利用下式计算细胞存活率，
cellviability(％)＝(od)sample/(od)control×100％
不同浓度载阿霉素介孔二氧化硅纳米颗粒及游离阿霉素溶液对正常细胞l929和癌细胞hela的毒性如图5所示。由图可知，游离阿霉素对l929和hela两种细胞均有明显毒性，但msn/pda/pmen/fa只对hela细胞产生强烈毒性，对l929正常细胞无明显毒性。例如，0.002mg/ml及0.004mg/ml载阿霉素msn/pda/pmen/fa对l929细胞的毒性(3％～11％)仅为hela细胞毒性(51％～56％)的约20％。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。