本发明属于银杏黄酮提取工艺技术领域，具体涉及一种银杏黄酮提取方法。
背景技术
银杏叶中化学成分复杂，主要的生物活性成分有黄酮类化台物、银杏内酯化台物、有机酸类、酚酸、烷基酚及烷墓酚酸类等物质。其中黄酮类物质的含量较高，主要有三类黄酮类物质：黄酮及黄酮苷、双黄酮、儿茶素。其中黄酮和黄酮苷多数由槲皮素、山奈素、异鼠李素及其苷组成。
银杏叶中的黄酮类化合物具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒，防治心血管疾病及增强人体免疫能力等多种活性功能，在当前医药和保健食品领域有很广泛的需求和应用。
银杏活性成份的提取量直接决定着银杏叶的医药价值。目前，从银杏叶中提取黄酮类化合物的常用方法有：水煮，溶剂浸提和超临界流体萃取等，工业上多使用乙醇-水溶液作为提取溶剂，但提取效率不高，工艺比较费时、耗能。近年来，生物酶法提取中药有效成分具有提取效率高，不易造成有限资源的浪费和污染的特点，成为近年来现代提取方法的研究热点。银杏黄酮类化合物几乎被以纤维素为主构成的细胞壁所包围，传统的水提和醇提法不利于溶剂进入细胞壁内部微孔隙内，致使提取效果受到很大的限制，资源浪费严重。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有的问题，提供了一种银杏黄酮提取方法，本发明的银杏黄酮提取方法具有提取效率高，最终产物中无其他残留物，不会破坏银杏黄酮自身的活性，保证了银杏黄酮提取物的品质，有很好的市场推广价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种银杏黄酮提取方法，包括以下步骤：
（1）银杏叶的处理：取新鲜的银杏叶片置于真空冷冻干燥机进行干燥，真空条件下，通入氦气，冷冻的温度为-65~-55℃，冷冻的时间为12~16min，干燥的温度为38~44℃，干燥的时间为28~34min；
（2）粉碎处理：将步骤（1）中干燥后的银杏叶片置于深冷式粉碎机，粉碎机的转速为4000~5000rpm，粉碎机内的温度控制为-20~-16℃，粉碎35~45min后过500目筛；
（3）连续闪爆处理：将步骤（2）中粉碎后的银杏叶置于连续式螺杆闪爆机内进行连续闪爆，连续闪爆处理的次数为3~5次；
（4）酶的处理：将步骤（3）中处理后的银杏叶粉末置于三角瓶中，向三角瓶中加入银杏叶粉重量份5~7倍的稀土复合物溶液中，搅拌均匀后，再向三角瓶中加入银杏叶粉重量份0.2~0.3倍的复合酶，将三角瓶置于水浴锅类加热，加热的温度为49~53℃，酶处理的时间为10~16h，同时进行超声波处理；
（5）浸提：向步骤（4）中酶处理后的三角瓶中加入70%的酒精，酒精的重量份为银杏叶粉的7~8倍，此时将水浴锅的温度控制为78~86℃，浸提2~4h后过滤得滤液；
（6）浓缩：将步骤（5）中获得的滤液进行旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的温度为60~70℃，旋转蒸发的时间为10~14min，得浓缩液即为银杏黄酮提取物。
进一步的，所述步骤（1）中真空冷冻干燥机内的真空度控制为75~85pa。
进一步的，所述步骤（4）中稀土复合物溶液的制备，包括以下步骤：
1）取一个烧杯置于磁力搅拌器上，然后向烧杯中加入26-30份去离子水，再称取2-3份碳酸镧和4-5份碳酸钠置于烧杯中，磁力搅拌器的转速为400~500rpm，磁力搅拌的时间为40~60min；
2）称取3-4份三氯化铈置于操作1）处理后的溶液中，继续搅拌，磁力搅拌器的转速为280~320rpm，搅拌的时间为30~36min；
3）微波活化处理：将操作2）处理后的溶液置于微波炉中进行微波活化，微波的频率为80~120ghz，微波活化的时间为18~22min。
进一步的，步骤（4）所述复合酶由以下重量份组分组成：纤维素酶0.1~0.3份、β-葡聚糖酶0.1~0.2份、木聚糖酶0.1~0.2份、果胶酶0.2~0.3份。
进一步的，所述步骤（4）中超声波处理，超声波的频率为40-50khz，超声处理的时间为18-24min。
本发明相比现有技术具有以下优点：
本发明在现有的银杏黄酮提取方法上做了很大的改善，本发明首先将新鲜银杏叶片置于真空冷冻干燥机内进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥法能排除95%～99%以上的水分，产品能长期保存而不变质，并且由于此方法是将银杏叶片冷冻到冰点以下，使水转变为冰，然后在真空度下将冰转变为蒸气而除去水的干燥方法；干燥之后置于深冷式粉碎机中进行粉碎，使用液氮作为研磨介质，实现超低温粉碎，粉碎细度可达到10-700目，甚至达到微米等细度，从一定程度上提高了提取效率，而且深冷式粉碎机系统在物料粉碎过程中，其冷源形成一个闭路循环系统，使能源得到充分利用，节省能耗，与真空冷冻干燥技术产生协同效应，能够最大限度的保证银杏叶片中的活性成分不被破坏；闪爆处理可以有效地改善生物对纤维成分的化学反应可及性，增加细胞壁的渗透性，提高酶解效率，促使半纤维素和木素的溶出，纤维素无定型区的降解，超声波利用其空化效应破坏植物细胞壁，从而使有效成分的溶出，在物理作用的同时，本发明添加复合酶，促进细胞壁的溶解，添加稀土复合溶液，la3+和ce3+可与细胞质膜上物质分子的配位键合作用，直接影响其分子的原有结构，并可通过细胞膜的信号转导和基
因调控而影响银杏叶细胞组成、结构和功能，两种物理作用加上化学试剂的协同效应，银杏叶细胞壁破碎，细胞膜通透性增加，细胞内的有效成分得到最大限度的释放，从很大程度上提高了银杏黄酮的提取效率；本发明最后将银杏叶粉进行酒精浸提、过滤、浓缩，得到的银杏黄酮提取物纯度高，浓度大。本发明的银杏黄酮提取方法具有提取效率高，最终产物中无其他残留物，不会破坏银杏黄酮自身的活性，保证了银杏黄酮提取物的品质，有很好的市场推广价值。
具体实施方式
实施例1
一种银杏黄酮提取方法，包括以下步骤：
（1）银杏叶的处理：取新鲜的银杏叶片置于真空冷冻干燥机进行干燥，真空条件下，通入氦气，冷冻的温度为-65℃，冷冻的时间为12min，干燥的温度为38℃，干燥的时间为28min；
（2）粉碎处理：将步骤（1）中干燥后的银杏叶片置于深冷式粉碎机，粉碎机的转速为4000rpm，粉碎机内的温度控制为-20℃，粉碎35min后过500目筛；
（3）连续闪爆处理：将步骤（2）中粉碎后的银杏叶置于连续式螺杆闪爆机内进行连续闪爆，连续闪爆处理的次数为3次；
（4）酶的处理：将步骤（3）中处理后的银杏叶粉末置于三角瓶中，向三角瓶中加入银杏叶粉重量份5倍的稀土复合物溶液中，搅拌均匀后，再向三角瓶中加入银杏叶粉重量份0.2倍的复合酶，将三角瓶置于水浴锅类加热，加热的温度为49℃，酶处理的时间为10h，同时进行超声波处理；
（5）浸提：向步骤（4）中酶处理后的三角瓶中加入70%的酒精，酒精的重量份为银杏叶粉的7倍，此时将水浴锅的温度控制为78℃，浸提2h后过滤得滤液；
（6）浓缩：将步骤（5）中获得的滤液进行旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的温度为60℃，旋转蒸发的时间为10min，得浓缩液即为银杏黄酮提取物。
进一步的，所述步骤（1）中真空冷冻干燥机内的真空度控制为75pa。
进一步的，所述步骤（4）中稀土复合物溶液的制备，包括以下步骤：
1）取一个烧杯置于磁力搅拌器上，然后向烧杯中加入26份去离子水，再称取2份碳酸镧和4份碳酸钠置于烧杯中，磁力搅拌器的转速为400rpm，磁力搅拌的时间为40min；
2）称取3-4份三氯化铈置于操作1）处理后的溶液中，继续搅拌，磁力搅拌器的转速为280rpm，搅拌的时间为30min；
3）微波活化处理：将操作2）处理后的溶液置于微波炉中进行微波活化，微波的频率为80ghz，微波活化的时间为18min。
进一步的，步骤（4）所述复合酶由以下重量份组分组成：纤维素酶0.1份、β-葡聚糖酶0.1份、木聚糖酶0.1份、果胶酶0.2份。
进一步的，所述步骤（4）中超声波处理，超声波的频率为40khz，超声处理的时间为18min。
实施例2
一种银杏黄酮提取方法，包括以下步骤：
（1）银杏叶的处理：取新鲜的银杏叶片置于真空冷冻干燥机进行干燥，真空条件下，通入氦气，冷冻的温度为-60℃，冷冻的时间为15min，干燥的温度为41℃，干燥的时间为31min；
（2）粉碎处理：将步骤（1）中干燥后的银杏叶片置于深冷式粉碎机，粉碎机的转速为4500rpm，粉碎机内的温度控制为-18℃，粉碎40min后过500目筛；
（3）连续闪爆处理：将步骤（2）中粉碎后的银杏叶置于连续式螺杆闪爆机内进行连续闪爆，连续闪爆处理的次数为4次；
（4）酶的处理：将步骤（3）中处理后的银杏叶粉末置于三角瓶中，向三角瓶中加入银杏叶粉重量份6倍的稀土复合物溶液中，搅拌均匀后，再向三角瓶中加入银杏叶粉重量份0.25倍的复合酶，将三角瓶置于水浴锅类加热，加热的温度为51℃，酶处理的时间为13h，同时进行超声波处理；
（5）浸提：向步骤（4）中酶处理后的三角瓶中加入70%的酒精，酒精的重量份为银杏叶粉的7.5倍，此时将水浴锅的温度控制为82℃，浸提3h后过滤得滤液；
（6）浓缩：将步骤（5）中获得的滤液进行旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的温度为65℃，旋转蒸发的时间为12min，得浓缩液即为银杏黄酮提取物。
进一步的，所述步骤（1）中真空冷冻干燥机内的真空度控制为80pa。
进一步的，所述步骤（4）中稀土复合物溶液的制备，包括以下步骤：
1）取一个烧杯置于磁力搅拌器上，然后向烧杯中加入28份去离子水，再称取2.5份碳酸镧和4.5份碳酸钠置于烧杯中，磁力搅拌器的转速为450rpm，磁力搅拌的时间为50min；
2）称取3.5份三氯化铈置于操作1）处理后的溶液中，继续搅拌，磁力搅拌器的转速为300rpm，搅拌的时间为33min；
3）微波活化处理：将操作2）处理后的溶液置于微波炉中进行微波活化，微波的频率为100ghz，微波活化的时间为20min。
进一步的，步骤（4）所述复合酶由以下重量份组分组成：纤维素酶0.2份、β-葡聚糖酶0.15份、木聚糖酶0.15份、果胶酶0.25份。
进一步的，所述步骤（4）中超声波处理，超声波的频率为45khz，超声处理的时间为21min。
实施例3
一种银杏黄酮提取方法，包括以下步骤：
（1）银杏叶的处理：取新鲜的银杏叶片置于真空冷冻干燥机进行干燥，真空条件下，通入氦气，冷冻的温度为-55℃，冷冻的时间为16min，干燥的温度为44℃，干燥的时间为34min；
（2）粉碎处理：将步骤（1）中干燥后的银杏叶片置于深冷式粉碎机，粉碎机的转速为5000rpm，粉碎机内的温度控制为-16℃，粉碎45min后过500目筛；
（3）连续闪爆处理：将步骤（2）中粉碎后的银杏叶置于连续式螺杆闪爆机内进行连续闪爆，连续闪爆处理的次数为5次；
（4）酶的处理：将步骤（3）中处理后的银杏叶粉末置于三角瓶中，向三角瓶中加入银杏叶粉重量份7倍的稀土复合物溶液中，搅拌均匀后，再向三角瓶中加入银杏叶粉重量份0.3倍的复合酶，将三角瓶置于水浴锅类加热，加热的温度为53℃，酶处理的时间为16h，同时进行超声波处理；
（5）浸提：向步骤（4）中酶处理后的三角瓶中加入70%的酒精，酒精的重量份为银杏叶粉的8倍，此时将水浴锅的温度控制为86℃，浸提4h后过滤得滤液；
（6）浓缩：将步骤（5）中获得的滤液进行旋转蒸发浓缩，旋转蒸发的温度为70℃，旋转蒸发的时间为14min，得浓缩液即为银杏黄酮提取物。
进一步的，所述步骤（1）中真空冷冻干燥机内的真空度控制为85pa。
进一步的，所述步骤（4）中稀土复合物溶液的制备，包括以下步骤：
1）取一个烧杯置于磁力搅拌器上，然后向烧杯中加入30份去离子水，再称取3份碳酸镧和5份碳酸钠置于烧杯中，磁力搅拌器的转速为500rpm，磁力搅拌的时间为60min；
2）称取4份三氯化铈置于操作1）处理后的溶液中，继续搅拌，磁力搅拌器的转速为320rpm，搅拌的时间为36min；
3）微波活化处理：将操作2）处理后的溶液置于微波炉中进行微波活化，微波的频率为120ghz，微波活化的时间为22min。
进一步的，步骤（4）所述复合酶由以下重量份组分组成：纤维素酶0.3份、β-葡聚糖酶0.2份、木聚糖酶0.2份、果胶酶0.3份。
进一步的，所述步骤（4）中超声波处理，超声波的频率为50khz，超声处理的时间为24min。
对比实施例1
对比实施例1与实施例2相比，将步骤（1）中的真空冷冻干燥方式换成普通的烘箱干燥方式，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例2
对比实施例2与实施例2相比，省去步骤（3）连续闪爆处理，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例3
对比实施例3与实施例2相比，省去步骤（4）酶的处理，除此外的方法步骤均相同。
对比实施例4
对比实施例4与实施例2相比，省去步骤（3）连续闪爆处理和步骤（4）酶的处理，除此外的方法步骤均相同。
对照组
申请号为201710843471.2公开的一种从银杏叶中提取精制高纯度银杏黄酮的方法。
为了对比本发明效果，本发明选取生长状况几乎完全一致的银杏叶片作为实验对象，将他们随机分成5组，每组分别用实施例2、对比实施例1、对比实施例2、对比实施例3、对比实施例4、对照组的方法提取银杏黄酮，从中国药品生物制品检定所购芦丁标准品，参照中国药典2015版银杏叶中芦丁hplc测定方法，测定提取物黄酮含量。
具体实验结果如下表1：
表1
由上表1可以看出，本发明的银杏黄酮提取方法具有提取效率高，最终产物中无其他残留物，不会破坏银杏黄酮自身的活性，保证了银杏黄酮提取物的品质，有很好的市场推广价值。