本发明属于药物新用途
技术领域：
，具体涉及阿司匹林在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。
背景技术：
：椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration，ivdd)是现代社会引起人们腰背痛(lowbackpain，lbp)的主要原因之一，并且给人的生理、心理和经济带来严重的负担，目前对于ivdd发生的具体机制仍不明确，此前研究主要集中于生物力学方向和炎症病理等方向，而近来学者开始关注髓核能量代谢与退变发生的联系。目前临床上非手术治疗的疗效并不明确，大多数患者后期仍需行髓核摘除手术，手术不可避免的具有一定创伤性，因此如何有效地防治ivdd已成为脊柱外科领域的一个重要课题。阿司匹林(aspirin)是最常见的非甾体类抗炎药物，临床应用已百年余，是世界上应用最广泛的解热、镇痛和抗炎药，也是作为比较和评价其他药物的标准制剂。在体内具有抗血栓的作用，它能抑制血小板的释放反应，抑制血小板的聚集，临床上用于预防短暂脑缺血发作、心肌梗死、人工心脏瓣膜和静脉瘘或其他手术后血栓的形成。同时广泛应用于缓解轻度或中度疼痛，如牙痛、头痛、神经痛、肌肉酸痛及痛经，亦用于感冒、流感等发热疾病的退热，治疗风湿痛等。然而，aspirin是否可以抑制椎间盘退变，目前尚未见相关报道，本发明由此而来。技术实现要素：为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供阿司匹林在制备治疗椎间盘退变药物中的应用，从而为预防和治疗椎间盘退变提供了一种新途径。本发明采用以下技术方案：阿司匹林在制备治疗椎间盘退变药物中的应用。一种治疗椎间盘退变的药物制剂，包括治疗有效量的阿司匹林和药学上可接受的辅料。优选的，所述的治疗椎间盘退变的药物制剂中阿司匹林的含量质量计为1～99％。优选的，所述的治疗椎间盘退变的药物制剂中阿司匹林的含量质量计为10～90％。优选的，所述的治疗椎间盘退变的药物制剂为冻干剂、片剂、颗粒剂或胶囊剂。本发明技术方案首先采取脂多糖(lipopolysaccharide，lps)诱导大鼠髓核细胞产生氧化应激，应用aspirin干预来观察是否其能延缓髓核细胞的退变，应用流式细胞技术、细胞免疫荧光、rt-pcr、westernblot等技术测定：活性氧簇(ros)、诱导性一氧化氮合酶(inos)、基质金属蛋白酶3(mmp-3)、ii型胶原(collagenii，colii)、蛋白聚糖(aggrecan)等的水平，评估aspirin对椎间盘退变的影响及其作用机制。体外部分：本发明人通过使用动物手术显微镜，在无菌条件下，提取5只sd大鼠的第7-8尾椎(co7-8)、第8-9尾椎(co8-9)和第9-10尾椎(co9-10)的髓核组织，进行髓核细胞原代培养，并建立细胞模型。细胞实验分组：1.空白组：1mlf12-dmem培养基。2.对照组(vehicle组)：1mlf12-dmem培养基+lps(1μg/ml)。3.实验组：aspirin(25μg/ml或5μg/ml)预处理3h，后更换1mlf12-dmem培养基+lps(1μg/ml)+aspirin(25μg/ml或5μg/ml)，培养12h。应用流式细胞、荧光探针检测各组ros的表达量，应用rt-pcr检测inos、colii、aggrecan基因表达量，应用westernblot检测inos、colii蛋白表达量，应用细胞免疫荧光检测mmp-3、colii在细胞内的分布情况。体内部分：为排除实验动物个体差异，本发明人通过使用20g针头对20只sd大鼠的尾椎进行针扎穿刺来建立椎间盘退变模型。分组如下：第7-8尾椎(co7-8)对照组；第8-9尾椎(co8-9)，阳性对照；第9-10尾椎(co9-10)阴性对照，并将这20只大鼠随机均分为aspirin高剂量组(100μg/ml，n＝10)，aspirin低剂量组(10μg/ml，n＝10)。动物实验过程中，实验组成员在穿刺后低1d、3d、5d进行局部注射操作。于术后7d、14d每组随机选取5只大鼠(n＝5)进行x-ray和mri检查，测量椎间盘高度并分析mri信号强度。随后处死并收集标本进行组织学检查，观察椎间盘的形态学变化，以及通过免疫组化染色测量髓核内colii和mmp-3含量来分析椎间盘退变程度。有益效果：本发明提供了一种阿司匹林在制备治疗椎间盘退变药物中的应用，本发明体外结果表明，lps能够明显增加氧化应激产物ros的表达。与control组相比，aspirin(25μg/ml)能够显著降低ros的表达(p<0.05)。rt-pcr证实lps能够显著增加inos的基因表达，同时降低colii和aggrecan基因的表达。而aspirin能够逆转lps的上述作用，并且在高剂量治疗组效果更明显，与低剂量组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。另外，相比control组，aspirin治疗还有效改善了细胞形态学测量结果：mmp3在细胞质中表达相比对照组明显减少，同时缓解了colii在细胞质中的丢失，且高剂量组较低剂量组改善更为明显，差异有统计学意义(p<0.05)。westernblot证实，与control组相比aspirin能够激活ampk通路，明显改变p-ampk/ampk比例(p<0.05)，同时减低inos的蛋白表达量(p<0.05)，缓解lps导致的colii的蛋白丢失(p<0.05)。本发明体内结果表明，vehicle组与control组相比，椎间盘高度于7d开始出现明显下降(p<0.05)。mri检查同x-ray检查相似，也在7d就开始出现信号强度的减弱(p<0.05)。aspirin治疗有效的延缓了椎间盘高度的下降(p<0.05)，并且相比于vehicle组来说，mri信号强度更强(p<0.05)。在高剂量治疗组作用更明显，与低剂量组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。另外，相比于vehicle组，组织学染色发现，vehicle组和control组相比，髓核容积变小，髓核细胞明显丢失，纤维环呈现皱褶压缩。aspirin治疗有效的保证了髓核细胞的含量，纤维环较vehicle组来说更加规则。通过免疫组化染色发现aspirin治疗组比vehicle组含有更多的colii和更少的mmp3。进一步证明了aspirin治疗对椎间盘退变过程中细胞外基质丢失的保护作用。该发明证实阿司匹林对椎间盘退变有一定的防治作用，可减轻髓核细胞的氧化应激。可作为治疗椎间盘退变的一种新手段。相比采用本领域常规的方法制备成适用于细胞实验的药物制剂，本发明优选通过人工合成的方式制备成aspirin颗粒，用无水乙醇溶解，无菌过滤后，完全培养基稀释进行细胞培养，这样可以避免诸如dmso、丙醇、氯仿等溶剂对细胞带来的潜在毒理作用或对实验的干扰作用，在本发明中aspirin药物组合物的药物制剂中，根据不同的制剂形式或制剂规格，所述组合物在制剂中的含量可以为质量计为1％～99％，优选为10％～90％；本发明所述的药学上可接受的载体为组合物中制剂使用的辅料，可采用本领域常规的辅料，以不和本发明活性成分发生反应或不影响本发明药物的疗效为前提，所述制剂的制备方法可采用本领域常规的制备方法进行制备。相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：本发明中的aspirin作为非甾体代表药物之一，在临床已有广泛的应用，其具有安全，可靠，稳定和廉价等诸多有点，其药理学研究相对深入，相较于其他潜在缓解椎间盘退变的药物，阿司匹林的作用机理更为明确清晰。本发明通过应用lps诱导氧化应激构建椎间盘退变模型，观察阿司匹林(aspirin)对椎间盘退变的治疗作用，通过观察氧化应激和椎间盘退变的各项指标来评估aspirin对于椎间盘退变的治疗作用。并且通过westernblot来证明aspirin减少氧化应激，缓解椎间盘退变的简要机制。椎间盘髓核组织发生氧化应激引起椎间盘退变，aspirin通过抑制髓核组织的氧化应激进而减少细胞基质和二型胶原的分解来延缓椎间盘退变，从而为椎间盘退变的防治提供了新的途径。附图说明图1为髓核细胞中ros被荧光探针标记后，流式细胞记录的荧光强度(a)和倒置荧光显微镜观察到的阳性细胞(b)图。图2为collagenii、aggrecan和inos基因mrna表达水平图。图3为westernblot检测inos、p-ampk和ampk蛋白的表达水平图。图4为各组髓核细胞中colii和mmp3的免疫荧光结果图。图5为大鼠尾椎x-ray扫描图像，％dhi趋势统计图和mri-t2加权像扫描图像图。图6为各实验组大鼠尾椎间盘he染色及番红o快绿染色结果图。图7为各实验组大鼠尾椎间盘髓核内colii和mmp3免疫组化染色结果图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。一、材料与方法1、材料1.1试剂及实验设备1.1.1主要药品及试剂阿司匹林(aspirin)、二甲基亚砜(dmso)、lps(e.coli0111:b4)、(2’,7’-二乙酰二氯荧光素)dcfh-d、dab显色剂、苏木素、伊红，购自sigma，中国上海；f12-dmem培养基、pbs，购自hyclone(美国)；胎牛血清(fbs)、胰酶、青-链霉素，购自gibco(美国)，trizol、depc水、bca试剂盒、一抗稀释液、二抗稀释液、封闭液、洗涤液、wb配胶试剂、tritonx-100、封闭液(quicktimeblock)，购自碧云天(中国)；逆转录试剂盒，购自takara(日本)；itaqtmuniversalsybrgreensupermix，购自bio-rad(美国)；colii、mmp3、(腺苷酸活化蛋白激酶)ampk、(磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶)p-ampk、inos、β-actin抗体、羊抗鼠荧光二抗，购自abcam(美国)；cck8试剂盒，购自dojindo(日本)；compoundc，购自selleck(美国)；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、甲醛，购自国药试剂(中国)。1.1.2主要仪器co2培养箱(thermo，美国)；流式细胞仪(merkmillipore，德国)；超净工作台(sw-cj-1f型，中国)；超纯水过滤机(millipore，美国)；高压蒸汽灭菌锅、温烤箱(八八金，中国)；全波长酶标仪(购自biotek，美国)；振荡器、nanodrop2000、离心机(termofisherscientific，美国)；水浴锅(荣华，中国)；倒置显微镜以及照相系统(carlzeiss，德国)冰箱(panasonic，日本)；-80℃超低温冰箱(sanyo，日本)；微量移液枪(eppendorf，德国)；sim-f140制冰机(sanyo，日本)；real-timepcr扩增仪，westernblot电泳仪，westernblot转膜仪，westernblot曝光成像系统(bio-rad，美国)；微量移液枪(eppendorf，德国)；3ml巴氏吸管、15ml离心管(crystalgen，美国)；直径100mm细胞培养皿、6孔板以及12孔板(corning，美国)；无酶ep管、八连管(crystalgen；美国)；扩增专用八连管(bio-rad，美国)；2000ml烧杯；镊子；药匙；玻璃棒；剪刀；封口膜，手术器械一套等。大鼠髓核细胞(npc)本实验室保存。x-ray和mri检查机器(ge，美国)，石蜡切片机(leica2135，德国)、烤片机(leica1120，德国)、石蜡包埋机(bmj-ⅱ，中国，常州)、axiovert40c光学显微镜(zeiss，德国)1.2实验动物健康sd大鼠40只，雄性，体重450±50g，3个月龄，清洁级，由苏州大学动物实验中心提供。喂养条件如下：2只一笼，室温18～20℃，湿度50～60％，通风良好，自由摄食进水。2、实验方法2.1髓核原代细胞培养2.1.1细胞提取1)随机挑5只sd大鼠，给予过量戊巴比妥钠安乐死，剃毛，70％酒精消毒尾部3遍，无菌刀片从尾椎6-7处切取尾部，70％酒精浸泡10min。2)移至无菌操作台，预热pbs冲洗尾部3遍，去皮，剥离肌肉，预热pbs冲洗3遍。3)动物专用显微镜下沿上极椎体切开椎间隙，显微镜下观察髓核与纤维环分界，眼科镊小心摘取髓核组织放入预热f12完全培养基中，每尾共取7-8、8-9、9-10椎间隙髓核。4)离心去上清，0.25％胰酶消化3min，离心去上清，3％二型胶原酶(含1％fbs)37℃消化1h。5)离心去上清，含15％fbs完全培养基吹打混匀，移至100mm培养皿培养。2.1.2细胞培养1)细胞置于37℃，5％co2培养箱中。2)待细胞融合至80％后，吸取培养基，预热pbs洗3遍，加1ml0.25％胰酶，置于培养箱内消化3min。3)加入2ml完全培养基终止消化，1000rpm离心3min。4)弃上清，1ml完全培养基重悬。5)选取原代培养第二代～第五代细胞的npc为实验所用，细胞种板密度按实验要求选择。2.2大鼠髓核退变模型的制备本发明应用lps诱导氧化应激及退变模型。lps按说明书使用1ml无菌pbs溶解(配置浓度：1mg/ml)，避光储存于1.5ml无菌ep管中。参考文献及预实验数据，使用1μg/ml的lps制备退变模型。依据不同实验，髓核细胞按相应密度种板，24h后细胞完全贴壁生长，吸去培养基，预热pbs洗3遍，f12稀释lps至1μg/ml加入孔板中，处理12h。所有操作均保证无菌原则。2.3荧光探针检测24孔板中，髓核细胞密度为10万/孔。依实验目的，应用lps及aspirin处理对应分组后，预热pbs洗3遍，应用无血清f12培养基按1:1000稀释dcfh-da探针，每孔加入含dcfh-da探针培养基1ml，避光培养箱内孵育20min。1)孵育结束，预热pbs洗3遍，胰酶消化3min，加入培养基终止消化，pbs重悬，流式细胞仪上机检测。2)孵育结束，预热pbs洗3遍，加少许pbs覆盖住细胞，导致荧光显微镜观察。2.4rt-pcr髓核细胞以20万/孔密度接种于6孔板，lps和aspirin处理不同实验组后，trizol裂解，提取rna，实时荧光定量pcr检测以下指标的基因水平：colii、aggrecan、inos、gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，其中gapdh作为内参。2.4.1引物的合成与稀释本发明中所有的引物序列是查阅相关sci文献，并送至苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物的浓度的稀释按说明书，最终引物的工作浓度是10μm，引物序列见表1：表1pcr扩增引物序列2.4.2总rna的提取1)细胞裂解吸去每组培养基，pbs洗3遍，每孔加入1mltrizol裂解10min，用1000μl移液枪吹打数次使细胞碎片脱离板底，吸出置于做好分组标记的1.5mlep管中，室温静置10分钟，用于后续rna的提取或者-80℃保存，待用。2)rna提取每管样品加入0.2ml氯仿并快速摇动30s，在通风橱中静置10min，再放入预冷至4℃的离心机设置转速12000g/min，离心时间15min；离心后共三层，将最上层无色液体转移到另一做同样分组标记的1.5ml去酶ep管中，然后分别加入与上层液同等体积的异丙醇，轻微震荡15s，冰上静置10min，于冷冻离心机12000g/min转速，离心10min，同时用无水乙醇和depc水配置成75％乙醇，放入冰盒预冷待用；离心结束后可以观察到管底有羽毛状的白色沉淀，即为rna；弃上清，每管中加入1ml的预冷的75％乙醇溶液，轻轻将管底rna吹起，但不要打散，并于冷冻离心机中，转速10000g/min，5min；弃上清后置于通风橱中进行风干，待管底的沉淀变为无色，管壁液体全部消失，方可继续下一步实验，在风干过程中，将金属水浴锅升温至58℃；将风干好的每管rna中分别加入22μldepc水溶解rna，快速混匀后放至金属水浴锅10min，使rna完全溶解，溶解后中分混匀，待用。3)rna浓度的测定吸取1μl提取好的rna溶液，通过nanodrop2000测出rna在260nm和280nm处的吸光度值，并得到rna的溶度，通过计算得到1μgrna所需要的体积。4)rna浓度的计算计算每个样本的a260和a280以及他们的比值，比值大约在1.8-2.0之间，说明rna纯度较高，可以进行后续实验；如果比值低于1.8说明蛋白含量较高，比值大于2.0说明dna含量较高。样品rna浓度计算公式：rna＝每个样品a260×2μg/μl，然后向每个样品的rna溶液中加入适量的depc水稀释至1μg/μl，分装后用于后续的逆转录实验或者保存于-80℃冰箱备用。5)逆转录成cdna本实验使用的逆转录体系是20μl，详细见下表2。首先，吸取9μldepc水放入200μlep管中，随后每管中加入2μl的oligo(dt)primer，加完后混匀、离心数秒，使液体全部沉于管底，置于pcr仪上并设置程序：70℃10min，结束后迅速放置冰上2min以上，再继续向ep管中加入如下试剂：5×m-mlvbuffer4μl、dntpmixture(10mm)1μl、rnaseinhibitor0.5μl、rnasem-mlv1μl，最后再加入depc水1.5μl，每个反应体系总体积20μl；放置pcr仪上进行逆转录，设置程序：42℃60min，70℃15min后立即冰上冷却，逆转录样品用于后续试验或者-80℃保存。表2mrna逆转录体系6)real-timepcr反应每个逆转录样品吸取1μl至白色八连管各个孔中，然后每孔加ddh2o7μl，上、下游引物各1μl，bio-radsybrgreenmix10μl，混匀后离心(如表3)，上real-timercr扩增仪进行反应，设置程序：共40个循环，95℃10min，95℃5s，60℃30s，72℃40s，以gapdh作为基因内参(如表4)，每个基因设置3个重复，计算方法采用2-△△ct计算基因的相对表达量。表3实时定量real-timepcr体系表4实时定量real-timepcr扩增体系2.5westernblot细胞按20万/孔密度接种于6孔板，按实验计划lps和aspirin处理后，胰酶消化收集细胞至1.5mlep管中，并做好标记。2.5.1提取蛋白1)每组样品ep管中加入100μl的蛋白裂解液，置于冰上静置20min，4℃，后14.8×103r/min离心20min。2)将上层无色透明液体转移至另一无酶ep管内，通过bca-kit检测各组蛋白浓度，用最低组的浓度来调节其他组的浓度。3)最后加入1/4体积的5×buffer溶液，吹打混匀，离心数秒后。4)100℃的金属水浴锅中加入5min，-80℃保存，备用。2.5.2制胶根据sds-pega水凝胶试剂盒来配制10％分离胶和5％浓缩胶，具体的配制体系如下(表5、6)：表510％分离胶制胶成分体积(ml)蒸馏水4.130％acr-bis(29:1)3.3分离胶缓冲液2.510％apc0.1temed0.004表65％浓缩胶制胶成分体积(ml)蒸馏水2.3330％acr-bis(29:1)0.67分离胶缓冲液110％apc0.04temed0.004清洗1.0mm的双层玻璃板，完全干燥后，加入分离胶，立即用无水乙醇压，30min后，倒掉无水乙醇，加入上层胶(浓缩胶)后，立即插入梳子，室温静置30min左右，放在2-8℃冰箱内放置过夜。2.5.3电泳及转膜1)通过去离子水查漏，若查漏没问题，则分别加入各组样本。2)加入电泳液，首先60v电压15min，转至200v跑至结束。分离玻璃板，切去多余的水凝胶。3)加入转模液，4℃冰箱内，350ma恒流转膜1h，将蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上。2.5.4封闭及孵育1)根据所孵育抗体大小来裁剪条带，室温摇床封闭液封闭1h。2)依实验目的，参照说明书，使用一抗稀释液稀释，加入一抗，4℃冰箱内摇床摇晃过夜。3)次日洗涤液清洗3次，每次10min。4)加入二抗，室温摇床孵育1h。5)洗涤液清洗3次，每次10min。2.5.5曝光及处理1)加入化学发光试剂ecl显影液。通过bio-rad的westernblot成像系统曝光。2)imagelab软件分析条带的灰度值，计算目标蛋白的表达水平。2.6免疫荧光染色细胞按照2万/孔密度接种于24孔板，lps和aspirin分别处理不同组。1)吸去每孔培养基，预冷pbs洗3遍。2)每孔加入0.5ml4％多聚甲醛，4度冰上固定20min。3)预冷pbs洗3遍，每次5min，每孔加入0.5mltritonx-100常温打孔10min。4)预冷pbs洗3遍，每次5min，每孔加入0.5mlquicktimeblock常温封闭1h。5)参照抗体说明书，一抗稀释液稀释抗体，每孔0.5ml覆盖住细胞，4℃摇床孵育过夜。6)回收一抗，预冷pbs洗3遍，每次3min。7)参照抗体说明书，避光稀释荧光二抗，每孔0.5ml覆盖住细胞，常温摇床孵育1h。8)吸去二抗，预冷pbs洗3遍，每次3min。9)每孔加入0.5mldapi染色液，避光孵育15min。10)吸去dapi，预冷pbs洗3遍，每次3min，倒置荧光显微镜下观察。2.7影像学检测所有大鼠在处死前先行x-ray和mri检查。x-ray检查：瞄准仪距大鼠距离：66cm，曝光电流时间积：63mas，穿透电压：35kv。mri使用1.5t磁场强度机器(ge，usa)进行检查获取t2加权像图像：饱和时间：3000ms，回声时间：80ms，视野范围：200mm×200mm，层面厚度：1.4mm。将所得x-ray图像使用东软图像分析系统来测量椎间盘高度，并计算椎间盘高度指数百分比(％dhi)。mri图像根据改良型汤普森评分来评价椎间盘退变程度。2.8组织学染色大鼠尾椎经10％edta脱钙后，常规石蜡包埋。取冠状位，连续切片，片厚5μm。分别行he、番红o快绿、免疫组化染色。2.8.1he染色步骤：1)石蜡切片经二甲苯(15min×2次)脱蜡后，依次经过100％、100％、95％、90％，85％的乙醇至水，每道10min；2)蒸馏水冲洗3min，苏木素溶液染色5min，自来水冲洗2min；3)1％盐酸酒精溶液分化30s，自来水冲洗1min；4)10％氨水溶液中反蓝30s，自来水冲洗1min；5)l％伊红溶液复染5min，自来水冲洗1min；6)常规脱水、透明、封片。2.8.2免疫组化染色：1)石蜡切片脱蜡和水化后，用pbs(0.01m，ph7.5±0.1)冲洗三次，每次3分钟。2)ph6.0柠檬酸缓冲液高温高压修复。3)每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液，室温下孵育10min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。pbs冲洗三次，每次3min。4)除去pbs液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清，室温下孵育10min。5)除去血清，所有切片平均分成3组分别加1滴1∶200稀释的collagenii、mmp3抗体，室温下孵育60min。6)pbs冲洗三次，每次3～5分钟。除去pbs液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体，室温下孵育10min。pbs冲洗三次，每次3min。7)除去pbs液，每张切片加1滴或50μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液，室温下孵育10min。pbs冲洗三次，每次3min。8)除去pbs液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的dab溶液，显微镜下观察3～10min。9)自来水冲洗，苏木素复染，pbs冲洗返蓝。阴性对照片：用0.01mol/lpbs液代替一抗，其余步骤同上。2.9统计学分析结果数据采用spss17.0统计软件分析，数据用均数±标准差表示，多组比较选用单因素方差分析(one-wayanova检验)，两两比较在总体方差齐的条件下，选用lsd及dunnett-t法进行分析。p<0.05为差异有统计学意义。实验结果：1.体外结果1.1ros通过荧光探针标记，被流式细胞仪探测或倒置荧光显微镜下观察：相对于control组，lps能够明显诱导髓核细胞发生氧化应激反应，并产生大量ros。而经过aspirin干预后，ros表达量明显减少(p<0.05)，见图1所示。1.2rt-pcr结果分析相较于control组，vehicle组氧化应激相关基因inos明显增加，退变相关基mmp3明显增加，而colii明显减少。与vehicle组相比，aspirin能够显著减少inos的基因表达，增加colii的表达(p<0.05)，且aspirin高剂量组比低剂量组效果更加明显。见图2。1.3westernblot结果分析aspirin能够激活ampk信号通路，并存在时间依赖性和剂量依赖性。lps可以抑制ampk的活化，而aspirin可以逆转上述现象，其p-ampk/apmk比值明显增加，同时可见经过aspirin处理后inos相比vehicle组有明显的减少。发明人采用ampk特异性抑制剂compoundc后，aspirin激活ampk的作用被阻断，其抗氧化应激作用被显著减弱。见图3。1.4细胞免疫荧光染色结果分析相比control组，vehicle组经过lps处理后，胞质内colii显著减少，表现在荧光强度减弱及分布范围减少，mmp3明显增加，且具有围绕细胞核的特点。aspirin干预后，能够缓解胞质中colii的丢失，同时抑制mmp3的合成，减少其分布。见图4。2体内结果2.1实验动物一般情况各组动物均在术后30～60min内苏醒，可在笼内自由活动，正常进食，精神状态无明显变化。穿刺点无红肿、渗液等炎性反应。实验过程中无动物死亡。2.2影像学检测x-ray图像分析：大鼠尾椎穿刺造模后，相较于control组，vehicle组的椎间盘高度明显下降(p<0.05)，而且高剂量aspirin组相比于低剂量aspirin组效果更明显(p<0.05)。根据图像处理软件测得的椎间盘高度计算出来的椎间盘高度指数百分比(％dhi)也表现出了有意义的统计学差异。见图5a，图5b。mri分析：vehicle组与control组相比，t2加权像信号强度明显降低(p<0.05)，而用aspirin治疗后，其椎体t2加权像信号强度较vehicle组明显提高(p<0.05)，而且高剂量aspirin治疗组相比于低剂量aspirin治疗组信号强度提高更明显(p<0.05)。见图5c，图5d。2.3组织学检测2.3.1he及番红o快绿染色结果：光镜下，control组的髓核呈椭圆而饱满，里面含有丰富的脊索细胞和类软骨细胞，两类细胞通过细胞外基质的网状结构规则的排列，纤维环呈现规则而完整的圆环状包裹着髓核。vehicle组和control组相比，髓核容积变小，髓核细胞明显丢失，纤维环呈现皱褶压缩。aspirin治疗有效的保证了髓核细胞的含量，纤维环较vehicle组来说更加规则。见图6。2.3.2免疫组化染色结果collagenii染色：control组的ii型胶原染色呈现棕色深染成网状交织排列在细胞之间的阳性区域，而vehicle组的阳性区域排列较为稀疏散乱，较control组明显下降(p<0.05)。aspirin治疗组较vehicle组相比具有更丰富的阳性染色区域，颜色也较深(p<0.05)。而且aspirin高剂量组较低剂量组阳性染色区域更广，颜色也更深(p<0.05)。见图7。mmp3染色：大鼠尾椎穿刺造模使vehicle组的椎间盘髓核内mmp3阳性细胞数量明显增多，而control组几乎找不到明显的阳性细胞(p<0.05)。mel治疗较vehicle组有效地减少了阳性细胞的表达(p<0.05)，且高剂量组较低剂量组阳性细胞显著减少(p<0.05)。见图7。本发明人通过腹腔注射外源性的aspirin干预大鼠尾椎间盘退变的模型，结果表明aspirin治疗可有效的减缓椎间盘高度下降及mri信号强度的减弱，对于保持椎间盘组织结构的完整性也发挥着重要的作用，同时减少髓核内colii的丢失。证明aspirin对椎间盘退变有一定的治疗作用。通过以上实验结构得知aspirin对椎间盘退变的作用机制与激活ampk信号通路产生抑制氧化应激有关联。髓核组织的完整性及稳定的生理环境被认为在椎间盘正常生理活动中起着至关重要的作用。一方面，髓核具有可塑性特点，其形态可随脊柱作各种运动时因重心不同而改变，可将力均匀地传递到周围的纤维环，具有平衡应力的作用；另一方面，髓核组织的生理结构决定其本身处于乏氧环境中，相比其他组织更容易发生能量代谢的失调，产生氧化应激等病理反应，这会进一步导致髓核的退变，进而加快椎间盘退变进程。在本实验中，aspirin通过激活ampk信号通路后，能够显著减低lps诱导的氧化应激，减少ros的产生，降低氧化应激及退变相关基因的表达，保护colii减少其丢失，最终缓解椎间盘的退变。同时通过影像学及组织学染色，免疫组化分析，aspirin治疗后，椎间盘的完整性及正常结果都得以保护。当前第1页12