本发明涉及苯丙烯酸类化合物在制备shp2特异性抑制剂中的用途及其制药用途。
背景技术：
shp2是ptpn11基因编码的胞内非受体蛋白酪氨酸磷酸酶，是ptps家族中的一员，它广泛表达于胚胎和各种成人组织中，是一种进化上保守的蛋白质，其由两个串联的n末端sh2结构域(n-sh2、c-sh2)，一个具有酪氨酸磷酸酶活性的ptp结构域和富含脯氨酸基团和酪氨酸磷酸化位点的c末端组成。shp2的活性调节主要与n-sh2结构域相关，在基础状态下，shp2的n-sh2结构域能够与ptp结构域相互作用，通过分子内的相互抑制，而使其ptp结构域不被暴露，被维持在一种自抑制状态而不具有磷酸酶活性，当含有磷酸化酪氨酸残基的配体与n-sh2结构域结合后，将引起shp2的构象改变，从而使这种自抑制状态消除，进而激活ptp的催化活性。
shp2在细胞信号转导中，既可以发挥正向调控作用也可以发挥负向调控作用，它主要作为由表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、血小板源生长因子(pdgf)、胰岛素类生长因子1(igf-1)、粒细胞巨噬细胞刺激因子(gm-csf)、促红细胞生成素(epo)、干扰素等促发的信号通路的下游信号分子，在这些信号通路的多个位点起作用。shp2既可以直接与egf、pdgf的受体相互作用，也可以与接头蛋白grb2、gab1、gab2等结合。目前经常报道的shp2参与调控的信号通路主要包括ras/erk、pi3k/akt、jak/stat信号通路，从而调控细胞的增殖、分化、迁移和凋亡等。
shp2的广泛表达及参与众多的信号通路调控使shp2与众多的癌症相关，众多研究表明乳腺癌、胃癌、非小细胞肺癌、口腔癌等癌症均与shp2的异常表达或者异常激活相关，shp2功能获得性突变将引起努南综合征、豹斑综合征、青少年粒单核细胞白血病。动物实验证明，敲除shp2基因或抑制shp2的高活性可以阻滞或延缓肿瘤的发生发展。另外，最近研究发现pd-1可以招募shp2，进而参与t细胞受体信号通路的调控，暗示shp2可能作为肿瘤免疫的潜在治疗靶点。总之，shp2是一个很好的药物开发靶点，开发shp2的特异性抑制剂对阐明shp2在相关信号通路发挥调控作用的具体分子机制及治疗shp2引起的相关癌症具有重要的意义。
由于ptps都具有高度保守及带正电荷的ptp结构域，而且shp1与shp2中大约有60％以上的序列是相同的，另外细胞渗透性、生物利用度和选择性都必须克服，开发shp2的特异性抑制剂具有很大的困难，目前还未有shp2的特异性抑制剂进入临床试验，已经发现的shp2抑制剂也并不多，主要包括化学合成的化合物shp099、nsc-87877、phps1和天然产物隐丹参酮、变构酶素、呋莫素酮(fumos)等。天然产物中存在大量的抗癌活性物质，是寻找shp2特异性抑制剂的有效药物来源。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了苯丙烯酸类化合物在制备shp2特异性抑制剂中的用途及其制药用途，对以shp2为靶点的药物开发具有重要的意义。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯在制备shp2特异性抑制剂中的用途，所述苯丙烯酸类化合物如下式所示：
其中，所述苯丙烯酸类化合物为肉桂酸，即r1为-h，r2为-h；
或，所述苯丙烯酸类化合物为异阿魏酸，即r1为-oh，r2为-och3。
一种包括了上述苯丙烯酸类化合物和/或其药学上可接受的盐和/或其药学上可接受的酯的组合物在制备shp2特异性抑制剂中的用途。
一种上述苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯在制备shp2相关疾病的治疗和/或预防药物中的用途。
一种包括了上述苯丙烯酸类化合物和/或其药学上可接受的盐和/或其药学上可接受的酯的组合物在制备shp2相关疾病的治疗和/或预防药物中的用途。
所述shp2相关疾病为癌症、努南综合征、豹斑综合征。
所述癌症包括实体瘤、血液瘤。
所述实体瘤包括乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、白血病、口腔癌。
所述肺癌为非小细胞肺癌。
所述血液瘤包括白血病、淋巴瘤。
所述白血病为青少年粒单核细胞型白血病(jmml)。
本发明所述的“药学上可接受的盐”指的是能够保留药学活性和母体化合物性质的盐，例如包括可药用的金属盐、铵盐、有机胺加成盐、氨基酸加成盐等；其中可药用的金属盐例如包括钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、铝盐、锌盐等；可药用的铵盐例如包括铵盐等；可药用的有机胺加成盐例如包括醇胺盐如乙醇胺盐、二乙醇胺盐、三乙醇胺盐、二乙胺盐、四甲基铵盐、以及吗啉、哌啶等的加成盐等；可药用的氨基酸加成盐例如包括赖氨酸盐、精氨酸盐、甘氨酸盐、苯丙氨酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐等；并不以此为限。
本发明所述的“药学上可接受的酯”指的是能够保留药学活性和母体化合物性质的酯，例如包括可药用的甲酯、乙酯、异丙酯、丁酯、仲丁酯、叔丁酯、戊酯、己酯、环戊酯、环己酯等烷基酯类，或者苯酯、萘酯、苄酯、苯乙酯等芳香酯类等。
本发明所述的“shp2特异性抑制剂”，包括了在实验研究中使用的、非疾病治疗目的的shp2特异性抑制剂，或者是在临床上使用、具有临床疗效的shp2特异性抑制剂。
本发明所述的“组合物”，指的是除包含上述苯丙烯酸类化合物和/或其药学上可接受的盐和/或其药学上可接受的酯外，还可以包括至少一种具有相同或不同药效的药物，即本发明的苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯可以与至少一种药物联合应用，例如常见的化疗药物、靶向药物等。
本发明所述的“预防”指在疾病发生、疾病复发、疾病转移之前就防止疾病发生、疾病复发、疾病转移的出现；本发明所述的“治疗”指在已经出现疾病后，抑制、降低甚至完全消除疾病的发展。
本发明所述的“药物”除了上述苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯外，还可以包括辅料。所述辅料为药学上可接受的稀释剂、溶剂、赋形剂、吸收剂、润湿剂、黏合剂、崩解剂、润滑剂、增溶剂、乳化剂、助悬剂、表面活性剂、成膜剂、抛射剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、杀菌剂、防腐剂等；所述辅料还包括药学上可接受的药物载体，即能够担载药物，并且具有改变药物进入人体的方式和在体内的分布，控制药物释放速度达到控释或缓释，将药物靶向输送至靶器官等作用的体系，例如包括脂质体、微球、微囊、固体分散体、胶束、微乳液、凝胶、缓释型载体、控释型载体、靶向型载体、纳米颗粒材料等。所述苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯，以及包括了苯丙烯酸类化合物、其药学上可接受的盐、其药学上可接受的酯的组合物可直接采用药学上可接受的方法制备成制剂，或者加入上述的药学上可接受的辅料后采用药学上可接受的方法制备成制剂；制剂可以为固体形式或液体形式的制剂，例如片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、注射剂等。
本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：
本发明首次从中药天然单体中发现了两种苯丙烯酸类化合物，异阿魏酸和肉桂酸对shp2具有特异性抑制作用，因此异阿魏酸和肉桂酸可以作为shp2的特异性抑制剂用于实验研究。进一步地，异阿魏酸和肉桂酸可以制备成shp2相关疾病的治疗或预防药物；本发明还验证了在细胞水平上异阿魏酸和肉桂酸均能通过抑制shp2的活性抑制egf诱导下erk的磷酸化，肉桂酸还能够抑制egf诱导下mda-mb-468细胞的迁移，异阿魏酸和肉桂酸有望开发成为预防或治疗乳腺癌、肝癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、胃癌、白血病、口腔癌等shp2相关疾病的药物。
此外，本发明还同时建立了基于pnpp的酶和底物反应的体外高通量筛选ptp-shp2抑制剂的模型，能够实现ptp-shp2抑制剂的高通量筛选，可应用于shp2特异性抑制剂的体外大规模筛选。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为体外分离纯化的ptp-shp2蛋白及ptp-shp2同家族蛋白shp1、vhr、heptp蛋白经sds-page电泳后考马斯亮蓝染色结果。
图2为体外原核表达纯化的人重组ptp-shp2蛋白、vhr蛋白、heptp蛋白、shp1蛋白的体外磷酸酶活性检测结果。
图3为体外高通量筛选shp2抑制剂模型的有效性验证结果。a为20μm的阳性抑制剂phps1对ptp-shp2活性的影响。数值为平均值±标准误(n＝3)，***p<0.001。b为梯度浓度的阳性抑制剂phps1对ptp-shp2的活性影响。
图4为筛选发现的ptp-shp2特异性抑制剂的结构。a为小分子h320(异阿魏酸)结构，b为小分子h335(肉桂酸)结构。
图5为h320(异阿魏酸)降低egf诱导下shp2参与调控的ras/erk通路中p-erk的表达。gapdh为内参，erk为p-erk的本底，control组为阴性对照组。
图6为h335(肉桂酸)降低egf诱导下shp2参与调控的ras/erk通路中p-erk的表达。gapdh为内参，erk为p-erk的本底，control组为阴性对照组。
图7为h335(肉桂酸)减弱egf诱导下mda-mb-468的迁移能力。a为transwell实验检测结果。40μmh335(肉桂酸)处理组为实验组，10μmshp099处理组为阳性对照组，control组为空白对照组。b为迁移至下室的mda-mb-468细胞数的统计结果，***p<0.001。
具体实施方式
下面通过实施例具体说明本发明的内容：
实施例1：体外高通量筛选ptp-shp2蛋白抑制剂的模型的建立
1)ptp-shp2、shp1、vhr、heptp蛋白的原核表达和纯化
pgex4t-1-ptp-shp2、pgex4t-1-shp1、pgex4t-1-vhr、pgex4t-1-heptp质粒(由美国加州大学圣地亚哥分校冯根生教授实验室提供)转化bl21star(de3)感受态细胞后，37℃培养箱过夜培养，挑取单克隆菌落于lb培养基中振荡培养后得到大量菌液。表达ptp-shp2蛋白的大量菌液在20℃下，表达shp1、vhr、heptp蛋白的大量菌液在25℃下，经0.1mmiptg160r/min过夜诱导后，离心收集菌体，重悬后进行超声破碎及纯化，然后用sds-page电泳验证提纯效果。ptp-shp2、shp1、vhr、heptp蛋白经10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行考马斯亮蓝染色，图1显示经gst-4b纯化并用buffere(50mmtris-hclph8.0，10mm谷胱甘肽)洗脱下来的ptp-shp2蛋白、shp1蛋白、vhr蛋白、heptp蛋白，分子量大小分别约为70kd、94kd、45kd、64kd，大小符合预期，纯度符合体外高通量筛选要求。
2)原核表达纯化的人重组ptp-shp2、shp1、vhr、heptp蛋白的蛋白磷酸酶活性测定
先用bradford试剂盒测定所提取的ptp-shp2蛋白的浓度，然后将蛋白稀释到适当浓度(3.84μm)，取0μl、5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的量，以终浓度为1.5mm的对硝基苯磷酸二钠(pnpp)为磷酸酶底物，以标签蛋白gst作为阴性对照，加入55μl反应液(50mmbis-tris，50mmnacl，2mmedta，ph6.5)，室温反应1h后加1mnaoh猝灭，用酶标仪测定在405nm波长下的od值，并用graphpad.prism.v5.0进行作图。如图2所示，在底物pnpp过量的条件下，随着ptp-shp2蛋白的浓度提高，od405nm的值也越来越大。用同样的方法测定体外提取纯化的vhr蛋白、heptp蛋白、shp1蛋白的酶活性，从图2可以看出，随着蛋白浓度的增加，其od405nm的值也逐渐增大。表明体外提取纯化的蛋白均具有酶活性，可用于体外高通量筛选。
3)体外高通量筛选ptp-shp2抑制剂的模型的建立及有效性验证
基于上述人重组ptp-shp2蛋白的体外活性检测结果，确定182nm作为反应的ptp-shp2蛋白酶浓度，筛选体系总体积为100μl，组成为：25μl终浓度为182nm的ptp-shp2蛋白，45μl反应液(50mmbis-tris、50mmnacl、2mmedtaph6.5)，10μl200μm的天然小分子化合物，20μl7.5mmpnpp。以10μl终浓度为20μm的shp2阳性抑制剂phps1为阳性对照，以182nm的ptp-shp2蛋白催化1.5mm的pnpp为空白对照。图3a显示，与空白对照相比，加入20μm的phps1后能够显著降低ptp-shp2的蛋白酶活性。
为进一步检测该模型的有效性，我们测定了梯度浓度的phps1对ptp-shp2的活性影响。phps1稀释至100μm，分别取0μl、0.5μl、1.0μl、2.0μl、4.0μl、8.0μl、12.0μl、16.0μl于96孔板划定的实验孔中，随后分别加入45μl、44.5μl、44μl、43μl、41μl、37μl、33μl、29μl的反应液，然后每孔均加入25μl终浓度为182nm的ptp-shp2蛋白，室温反应30min，最后加入20μl7.5mm的pnpp，室温反应1h后加入1m的naoh猝灭，用酶标仪测定在405nm波长下的od值。每个浓度均重复3次，并用graphpad.prism.v5.0以phps1浓度对ptp-shp2酶活性作图，图3b显示，随着phps1呈梯度浓度增加，ptp-shp2的酶活性逐渐降低，表明该模型能够灵敏的反映ptp-shp2的酶活性，从而反映小分子药物对ptp-shp2的抑制作用。图3结果表明体外高通量筛选ptp-shp2抑制剂的模型构建成功，可用于从天然小分子中筛选ptp-shp2抑制剂。
4)体外筛选发现ptp-shp2特异性小分子抑制剂h320(异阿魏酸)和h335(肉桂酸)的结构及对ptps的ic50测定
应用建立起来的体外高通量筛选ptp-shp2抑制剂的模型，从中药天然单体中筛选发现在20μm浓度下，h320(异阿魏酸)和h335(肉桂酸)对ptp-shp2具有强抑制作用。图4a为小分子h320(异阿魏酸)结构，b为小分子h335(肉桂酸)结构。
将h320(异阿魏酸)稀释至100μm，分别取0μl、1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、11μl于96孔板划定的实验孔中，随后分别加入45μl、43μl、42μl、41μl、40μl、39μl、38μl、37μl、36μl、35μl、34μl的反应液，然后每孔均加入25μl终浓度为182nm的ptp-shp2蛋白，室温反应30min，最后加入20μl7.5mm的pnpp，室温反应1h后加入1m的naoh猝灭，用酶标仪测定在405nm波长下的od值。每个浓度均重复3次，并用graphpad.prism.v5.0以h320浓度对ptp-shp2酶活性作图并计算ic50，用同样的方法检测h320(异阿魏酸)对shp2同家族蛋白shp1蛋白、vhr蛋白、heptp的ic50，结果如表1所示，表1为h320(异阿魏酸)对ptps的ic50及比值，从中可以发现h320(异阿魏酸)特异性的抑制ptp-shp2的活性。
将h335(肉桂酸)稀释至100μm，分别取0μl、2μl、4μl、6μl、8μl、10μl、12μl、14μl于96孔板划定的实验孔中，随后分别加入45μl、43μl、41μl、39μl、37μl、35μl、33μl、31μl的反应液，然后每孔均加入25μl终浓度为182nm的ptp-shp2蛋白，室温反应30min后加入20μl7.5mm的pnpp，室温继续反应1h，最后加入1m的naoh猝灭，用酶标仪测定在405nm波长下的od值。每个浓度均重复3次，并用graphpad.prism.v5.0以h335(肉桂酸)浓度对ptp-shp2酶活性作图并计算ic50，用同样的方法检测h335(肉桂酸)对shp2同家族蛋白shp1蛋白、vhr蛋白、heptp的ic50后发现它们只特异性的抑制shp2的活性，结果如表2所示，表2为h335(肉桂酸)对ptps的ic50及比值，从中可以得出h335(肉桂酸)特异性的抑制ptp-shp2的活性。
同时，h320(异阿魏酸)与h335(肉桂酸)对ptp-shp2的ic50值远低于苯丙烯酸类的咖啡酸(ic50＝26.6±0.17μm)，表明异阿魏酸与肉桂酸对ptp-shp2的抑制效果更佳。
表1h320(异阿魏酸)对ptps的ic50及比值
表2h335(肉桂酸)对ptps的ic50及比值
实施例2：h320(异阿魏酸)对egf诱导下shp2依赖的erk的活化的影响
先前的研究表明，shp2能够参与调控ras/erk信号通路，在细胞中，生长因子egf能够以依赖shp2的方式引起erk通路的级联反应，从而引起erk磷酸化水平的升高。因此，我们在细胞水平检测加入我们高通量筛选得到的ptp-shp2抑制剂h320(异阿魏酸)能否通过抑制shp2的活性对egf诱导下erk磷酸化产生影响。血清过夜饥饿后的293t细胞加入不同浓度的h320(异阿魏酸)(0μm、10μm、20μm、30μm)处理24h后，经egf(2ng/ml)刺激10min，随后加入一定体积的ripa裂解液，收蛋白并进行western。从图5中可以看出，在无药物处理下，egf刺激后p-erk水平显著上调，但当加入不同浓度的h320(异阿魏酸)处理后，p-erk水平明显下调。表明h320(异阿魏酸)能通过抑制shp2的活性而抑制egf诱导下ras-erk信号通路的激活。
实施例3：h335(肉桂酸)对egf诱导下shp2依赖的erk的活化的影响
先前的研究发现shp2对乳腺癌mda-mb-468细胞的相关细胞功能的维持是必须的。我们在mda-mb-468细胞中检测了h335(肉桂酸)对shp2参与调控的ras/erk信号通路的影响。mda-mb-468细胞饥饿16h后加不同浓度h335(肉桂酸)(0μm、10μm、20μm)处理3h，2ng/mlegf诱导10min，western检测p-erk、erk、shp2、gapdh表达水平。图6显示加入不同浓度的h335(肉桂酸)处理mda-mb-468细胞后能够显著降低egf诱导下p-erk的表达水平。接下来我们也检测了h335(肉桂酸)对shp2的抑制效果是否具有时间持续性，结果发现egf诱导不同时间，p-erk均未上调，表明h335(肉桂酸)对shp2的抑制效果也具有一定时间持续性。
实施例4：h335(肉桂酸)对egf诱导下mda-mb-468的迁移能力的影响
先前相关研究证明敲除shp2能够减弱mda-mb-468的迁移能力，接下来我们用transwell实验检测了h335(肉桂酸)通过抑制shp2的活性对egf诱导下mda-mb-468迁移能力的影响。在transwell上室接种200μl无血清dmem高糖培养基重悬的mda-mb-468细胞(2.5x104个)，下室加入800ul含10％fbs的dmem高糖培养基，除空白对照组不加egf外，其余处理组在上室和下室均加10ng/mlegf处理。从图7可以得出，10ng/mlegf诱导能显著增加mda-mb-468细胞的迁移能力，而40μm的h335(肉桂酸)能明显减弱egf诱导下mda-mb-468的迁移能力，阳性对照组10μm的shp099也能显著减弱egf诱导下mda-mb-468的迁移能力。
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。