本发明属于中药提取与应用领域，尤其涉及一种金银花总黄酮提取物的制备方法及其在蜜炼余甘子枇杷膏中的应用。
背景技术：
蜜炼余甘子枇杷膏具有润肺化痰、止咳平喘、清热凉血、调心降火等功效，主要含有枇杷、余甘子、金银花等活性成分。金银花又名双花，大量研究表明金银花具有清热解毒等功效，是我国著名的中草药之一，已有上千年的用药历史，在我国广泛种植。金银花含有有机酸类、多糖、黄酮类、挥发油等多种化合物。近年来，随着对金银花深入的研究，人们发现金银花中的黄酮类化合物具有很高的研究价值，在抗菌、抗病毒、增强免疫力、抗癌防癌、心肌保护等方面具有显著疗效。开发利用好金银花中黄酮的有效成分具有重要的经济价值和社会效益。本发明通过提高与改进金银花中总黄酮的提取率，并评价所提取的总黄酮在心肌纤维化细胞改善方面的作用，对药物防治心肌纤维化等多种心脏病具有积极的作用。目前，有关金银花黄酮类提取工艺及其应用研究较少，本发明结合传统工艺与现代工艺，细化工艺参数，在浸提时辅助微波提取，其工艺具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、有效成分收率高的特点。
技术实现要素：
本发明提供了金银花中总黄酮的提取与应用。本发明将传统工艺与现代工艺相结合，细化工艺参数，在浸提时辅助微波提取，其工艺具有选择性高、操作时间短、溶剂消耗小、有效成分收率高的特点。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种金银花总黄酮提取物的制备方法，包括以下步骤：
（1）对原料进行处理，将金银花使用万能粉碎机粉碎，过30目筛网；
（2）按照料液比加入石油醚混合均匀，去脂30分钟；
（3）将去脂后的料液进行过滤，滤渣挥干；
（4）在挥干的滤渣中加入乙醇溶液，辅助微波超声提取；
（5）将乙醇提取液合并抽滤，滤液浓缩呈膏状，在-80℃下冷冻干燥得黄酮化合物粗品；
（6）将黄酮化合物粗品溶于纯化水，浓度40mg/ml，过柱加入2～3倍湿树脂体积的乙醇溶液洗脱，流速1.2～1.5ml/min，室温洗脱；
（7）将洗脱后的溶液减压或真空浓缩，浓缩后的溶液在-80℃下冷冻干燥18～24小时制得金银花总黄酮提取物。
优选的，所述步骤（2）中金银花与石油醚的料液比为1：10～1:20（g/ml）。
优选的，所述步骤（4）中滤渣与乙醇料液比为1:10~1:25（g/ml）。
优选的，所述步骤（4）中乙醇溶液浓度为40%～80%。
优选的，所述步骤（4）中采用微波辅助乙醇溶液进行提取，其微波温度为30～60℃，微波辐射时间30～75分钟。
优选的，所述步骤（4）中采用微波辅助乙醇溶液进行提取，微波提取次数为2~3次。
优选的，所述步骤（5）中滤液采用真空或负压条件进行浓缩，真空度为-0.085～0.09mpa。
优选的，所述步骤（5）中滤液浓缩至原料液的20%～30%。
优选的，所述步骤（6）中黄酮化合物粗品采用d101大孔树脂进行洗脱。
优选的，所述步骤（6）中黄酮化合物粗品采用75%~85%的乙醇进行洗脱。
本发明方法简便易行，与现有技术相比，本专利所述的一种金银花总黄酮提取物的制备方法及应用具有以下有益效果。本发明将传统工艺与现代工艺相结合，采用乙醇溶液提取，在浸提时辅助微波提取，操作时间短，总黄酮得率提高；减少溶剂用量，大孔树脂可循环多次使用，降低成本，减少对环境的污染。本发明制备的金银花总黄酮提取物在蜜炼余甘子枇杷膏中发挥了较强的对心肌纤维化细胞的增殖抑制作用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化或等同替换，均应属于本发明的保护范围。
实施例一
对原料进行处理，将金银花使用万能粉碎机粉碎，过30目筛网；按照料液比1：10（g/ml）加入石油醚混合均匀，去脂30分钟；将去脂后的料液进行过滤，滤渣挥干；在挥干的滤渣中按照料液比1：10（g/ml）加入40%乙醇溶液进行提取，提取过程采用微波辅助，控制微波温度30℃，微波辐射提取30分钟，提取2次；将乙醇提取液合并抽滤，滤液在真空度为0.09mpa的条件下浓缩至原料液的20%，呈膏状，在-80℃下冷冻干燥得黄酮化合物粗品；将黄酮化合物粗品溶于纯化水，浓度40mg/ml，过d101大孔吸附树脂。加入2～3倍湿树脂体积75%乙醇溶液洗脱，流速1.2～1.5ml/min，室温洗脱；洗脱后的溶液减压或真空浓缩，浓缩后的溶液在-80℃下冷冻干燥18小时，得到金银花总黄酮提取物，提取物收率4.87%，总黄酮纯度83.3%。
实施例二
对原料进行处理，将金银花使用万能粉碎机粉碎，过30目筛网；按照料液比1：15（g/ml）加入石油醚混合均匀，去脂30分钟；将去脂后的料液进行过滤，滤渣挥干；在挥干的滤渣中按照料液比1：15（g/ml）加入60%乙醇溶液进行提取，提取过程采用微波辅助，控制微波温度40℃，微波辐射提取45分钟，提取3次；将乙醇提取液合并抽滤，滤液在-0.085mpa的负压条件下浓缩至原料液的30%，呈膏状，在-80℃下冷冻干燥得黄酮化合物粗品；将黄酮化合物粗品溶于纯化水，浓度40mg/ml，过d101大孔吸附树脂。加入2～3倍湿树脂体积85%乙醇溶液洗脱，流速1.2～1.5ml/min，室温洗脱；洗脱后的溶液减压或真空浓缩，浓缩后的溶液在-80℃下冷冻干燥24小时，得到金银花总黄酮提取物，提取物收率5.21%，总黄酮纯度85.4%。
实施例三
对原料进行处理，将金银花使用万能粉碎机粉碎，过30目筛网；按照料液比1：20（g/ml）加入石油醚混合均匀，去脂30分钟；将去脂后的料液进行过滤，滤渣挥干；在挥干的滤渣中按照料液比1：25（g/ml）加入80%乙醇溶液进行提取，提取过程采用微波辅助，控制微波温度60℃，微波辐射提取60分钟，提取3次；将乙醇提取液合并抽滤，滤液在真空度为0.09mpa，的条件下浓缩至原料液的20%，呈膏状，在-80℃下冷冻干燥得黄酮化合物粗品；将黄酮化合物粗品溶于纯化水，浓度40mg/ml，过d101大孔吸附树脂。加入2～3倍湿树脂体积85%乙醇溶液洗脱，流速1.2～1.5ml/min，室温洗脱；洗脱后的溶液减压或真空浓缩，浓缩后的溶液在-80℃下冷冻干燥24小时，得到金银花总黄酮提取物，提取物收率5.14%，总黄酮纯度82.6%。
实施例四
对原料进行处理，将金银花使用万能粉碎机粉碎，过30目筛网；按照料液比1：20（g/ml）加入石油醚混合均匀，去脂30分钟。去脂后的料液进行过滤，滤渣挥干备用。在挥干的滤渣中按照料液比1：20（g/ml）加入60%的乙醇水溶液进行提取，辅助微波超声，微波温度40℃，微波辐射时间45分钟，提取2次。提取后的乙醇水溶液合并抽滤，滤液在-0.085mpa负压条件下浓缩至原料液的30%，呈膏状，在-80℃下冷冻干燥得黄酮化合物粗品。黄酮化合物粗品溶于纯化水，过d101大孔吸附树脂。加入2～3倍湿树脂体积75%乙醇水溶液洗脱，流速1.2～1.5ml/min，室温洗脱。洗脱后的溶液减压真空浓缩，浓缩后的溶液在-80℃下冷冻干燥18小时，得到金银花总黄酮提取物，提取物收率5.37%，总黄酮纯度86.6%。
实施例1-4所得提取物的活性测试
分离、培养大鼠心肌成纤维细胞，分为心肌纤维化组、金银花总黄酮提取物组，取对数生长期的心肌纤维化细胞，将细胞混悬液按每孔1×104个细胞接种于96孔板中，37℃、5%co2及饱和湿度下培养24h后换无血清培养基，继续培养24h后，使细胞进入生长静止期。吸弃各孔培养基，心肌纤维化组加入空白培养基，金银花总黄酮提取物低、中、高剂量组分别加入含200μg.ml-1、400μg.ml-1、600μg.ml-1的总黄酮提取物，继续培养，48h后取出96孔板，每孔加入cck-8溶液20μl，继续孵育30min。酶标仪测定450nm处各孔的吸光值（a），计算抑制率，结果见表1。
表1金银花总黄酮提取物对大鼠心肌成纤维细胞增殖的影响（n=6）
由表1可以看出，蜜炼余甘子枇杷膏中金银花总黄酮提取物对心肌纤维化细胞的增殖具有明显的抑制作用。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。