本发明涉及生物抑菌
技术领域：
：，具体涉及一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物及其制备方法。
背景技术：
：：痤疮作为一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病，好发于青春期，因此也被称为“青春痘”。痤疮多发生在面部和胸背等皮脂溢出部位，常表现为黑白粉刺、丘疹、脓疱、结节、瘢痕。国外研究表明，12～24岁的青少年痤疮发病率高达85%。痤疮不仅影响人的美观，对人的情绪和心理健康以至行为方式也产生一定的影响，它已成为一个不可忽视的心身疾病。病因调查发现，痤疮是一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤疾病。痤疮的发病主要与皮脂分泌增加、微生物感染、炎症反应和毛囊皮脂腺开口处过度角化四大原因相关。其中细菌过度增殖和炎症反应在痤疮的多个致病因素中起核心作用。痤疮丙酸杆菌(propionibacteriumacnes)，也称痤疮杆菌，革兰氏阳性厌氧杆菌，是一种细胞内寄生菌，是造成青春痘的主要细菌。而在痤疮病患中表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)和金黄色葡萄球菌的检出率与痤疮丙酸杆菌接近，且应用葡萄球菌菌苗治疗痤疮收到了良好的效果。另外，有研究认为痤疮是一种原发性的炎症性疾病，炎症反应贯穿了痤疮的发病过程，因此抗炎治疗也将是开辟痤疮治疗新方向的途径。而目前，治疗寻常性痤疮的外用制剂多为抗生素类的化学药物制剂，如罗红霉素、红霉素、林可霉素等。对于严重的痤疮，需口服异维a酸和复方醋酸环丙孕酮片等激素类药物。这些药物虽然具有一定的疗效，但是耐药菌株的出现、较强的副作用和安全性差限制了这些药物的应用。技术实现要素：本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，即现有痤疮治疗中用到的抗生素易产生耐药性，容易复发，无法长期使用，副作用强，安全性较差的一些缺陷，提供了一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物及其制备方法。本发明采用的苦豆草提取物与槐定碱和苦豆碱，豆瓣菜提取物，榆绣线菊提取物组合物均为纯中药，副作用小，且单体组合物有很好的协同效应，为苦豆草提取物增加了一个新用途，同时也为痤疮的治疗提供了一种新的治疗药物。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由按照重量份计的以下组分制备得到的：苦豆草提取物10份，豆瓣菜提取物0-5份，榆绣线菊提取物0-5份；或苦豆碱2-8份、槐定碱3-7份、豆瓣菜提取物0-5份，榆绣线菊提取物0-5份。进一步的，上述的一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由按照重量份计的以下组分制备得到的：苦豆草提取物10份，豆瓣菜提取物2份，榆绣线菊提取物2份；或苦豆碱7份、槐定碱4份、豆瓣菜提取物1份，榆绣线菊提取物2份。进一步的，上述的一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由按照重量份计的以下组分制备得到的：苦豆草提取物10份；或苦豆碱3份、槐定碱3份。进一步的，上述的一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，所述苦豆草提取物，是将苦豆草粉碎成1-2cm的段状，加150000u/g的纤维素酶以酶用量为2mg/g，保温3h，再加入0.1%盐酸回流提取2次，每次1h，过滤，浓缩至稠膏状，即可得到苦豆草提取物；所述苦豆碱，分子式为c15h24n2，分子量为232.365，分子结构式如式（i）所示：式（i）；所述槐定碱，分子式为c15h24n2o，分子量为248.37，分子结构式如式（ii）所示：式（ii）。进一步的，上述的一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，所述药物剂型为软膏剂、乳膏剂、搽剂、凝胶剂或祛痘化妆品。本发明的第二个目的是提供了上述一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物的制备方法，包括以下步骤：按照配比称取苦豆草提取物、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物，加入适当的纯化水，搅拌溶解后离心取上清过滤，即得到原料液；所述操作温度为20-80℃，搅拌速度控制为20-110r/min；离心转速为3000-5000r/min，离心时间为15-30min；过滤过程采用的过滤孔径为0.22-10微米，液体流速为0.1-10l/min，温度为10-50℃，气压为0.1-1mpa；或按照配比称取苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物，以弱极性溶剂加热搅拌溶解苦豆碱，得到苦豆碱溶解液；以纯化水加热搅拌溶解槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物，得到其余组分溶解液；将苦豆碱溶解液和其余组分溶解液充分混合后，离心取上清，过滤后即得到原料液；所述操作温度为20-80℃，搅拌速度控制为20-110r/min；离心转速为3000-5000r/min，离心时间为15-30min；过滤过程采用的过滤孔径为0.22-10微米，液体流速为0.1-10l/min，温度为10-50℃，气压为0.1-1mpa。细菌过度增殖、炎症反应和油脂分泌过多在痤疮的多个致病因素中起主要作用，而组合物中的苦豆碱有较强的抑制痤疮致病菌生长和增殖的作用，且槐定碱有明显的抗炎效果。苦豆草提取物或苦豆碱和槐定碱按5:5比例配伍制备的组合物，可抑制痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌生长和繁殖，并具有抗炎的作用。表明该组合物对痤疮致病因素有明显的作用。将两者配伍使用可以起到协同作用，效果更好。同时豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物具有去油脂、保湿的功效。本发明的有益效果为：本发明提供的一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物及其制备方法，其为天然药物提取物或单体复方组合物，具有天然性好、副作用小、不易产生耐药性等优异效果。经试验证明，苦豆草提取物、苦豆碱和槐定碱组合物的抑菌抗炎作用较好，抑制痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌生长和繁殖及消炎，且具备了抑菌及抗炎的功效，长期使用对皮肤刺激性小。同时将苦豆碱和槐定碱组方使用，可以起到协同作用，达到更好的抑菌抗炎治疗效果，将在治疗痤疮的领域中取得一定成果。豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物具有去油脂、抑菌杀菌作用，2种提取物与苦豆碱和槐定碱同时使用，具有相应的协同效果，能够在一定程度上协同增效消炎抑菌作用，同时还可以有效去除油脂，使皮肤湿润，减少皮脂腺过度角化，进而达到有效治疗痤疮的目的。现有专利cn201010230053.4中，提供了一种治疗痤疮的中药组合物，其中，中药组合物成分有大黄、野菊花、射干、白花蛇舌草、白芷、牛蒡子、熟石膏、黄柏等十余种原料，成分复杂，副作用强，质量稳定性和安全性不能保证。与其相比，本发明中药提取物只有一种苦豆草经常规酶法提取就可获得原料，单体组合物仅有苦豆碱和槐定碱两种，按一定配比即可制备并实现抑菌的效果，豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物均具有去除油脂的效用，同时还可以与苦豆碱、槐定碱协同抑菌、消炎，能够实现从多个治疗方向同时治疗痤疮，且其原料来源广泛，试验证明，其均有很好的抑菌和抗炎效果，与痤疮的发病机制完全吻合，可以起到良好的治疗效果。具体实施方式豆瓣菜提取物：购自servicechemicalinc.。榆绣线菊提取物：购自西安迪诺生物科技有限公司产品。实施例1：一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由以下组分制备得到的：苦豆草提取物10g，豆瓣菜提取物2g，榆绣线菊提取物2g；或苦豆碱7g、槐定碱4g、豆瓣菜提取物1g，榆绣线菊提取物2g。实施例2：一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由以下组分制备得到的：苦豆草提取物10g，豆瓣菜提取物3g，榆绣线菊提取物2g；或苦豆碱8g、槐定碱4g、豆瓣菜提取物1g，榆绣线菊提取物3g。实施例3：一种用于防治痤疮的外用天然药物组合物，是由以下组分制备得到的：苦豆草提取物10g；或苦豆碱3g、槐定碱3g。实施例4：以下就是对本发明的药物苦豆草提取物、豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物、槐定碱、苦豆碱及其不同配比进行了体外抑菌试验。1.试验菌株：痤疮的致病菌株痤疮丙酸杆菌（atcc11827）、金黄色葡萄球菌（atcc29213）和表皮葡萄球菌（atcc12228）3株，均为标准菌株。2.试剂：受试药物贮存液制备：采用50%甲醇配制受试物贮存液，受试物贮存液浓度为50mg·ml-1。配制好的受试物贮存液置于4℃保存。对照药物：红霉素(红霉素a含量92.3%),均由中国药品生物制品检定所提供。用分析天平精确称取红霉素5.0mg，溶于100ml的无菌蒸馏水，其浓度为50μg·ml-1。培养基：肉汤液体培养基、营养琼脂固体培养基、痤疮丙酸杆菌液体和固体培养基。3.试验过程（1）肉汤培养基制法：各称取牛肉膏3g，氯化钠5g，蛋白胨10g，加入蒸馏水1000.0ml。充分溶解后，121℃压力灭菌20分钟备用。4℃保存备用。（2）营养琼脂培养基制法：肉汤培养基各成分，琼脂1.8～2.2g。在培养基高压灭菌前，加入琼脂煮溶，再高压高压。冷却并无菌检查后，4℃保存备用。（3）痤疮丙酸杆菌液体培养基制法：各称取胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，葡萄糖5g，氯化钠5g，酵母膏3g，乙酸钠3g，可溶性淀粉1g，l-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水溶解后调ph至6.8，定容至1000ml，121℃灭菌20分钟备用。（4）痤疮丙酸杆菌固体培养基制法：痤疮丙酸杆菌液体培养基各成分，琼脂18-20g，加热溶解后调ph至6.8，定容至1000ml，121℃灭菌20分钟备用。（5）菌液制备：表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌菌种在营养琼脂平板上划线培养16～18小时。用接种环挑取单个菌落，接种于2～3ml的肉汤培养基中，37℃孵育10～16h。菌悬液比浊仪测浓度后，用无菌水稀释至106cfu·ml-1，制得供试菌液。痤疮丙酸杆菌冻干菌种在痤疮丙酸杆菌固体培养基上37℃厌氧培养48h。后接种于痤疮丙酸杆菌液体培养基中，37℃厌氧培养48h，菌悬液用无菌水稀释至106cfu·ml-1，制得供试菌液。（6）采用试管二倍稀释法进行抗菌药最小抑菌浓度（mic）测定。对于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌：取无菌试管（13×100mm）10支，排成一排，除第一管外，其余每管加入mh肉汤0.5ml，在第1管和第2管加入受试药物和红霉素贮存液0.5ml并混匀，然后从第2管吸取0.5ml加至第3管，混匀后再吸取0.5ml加至第4管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取0.5ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。此时各管受试药物浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0mg·ml-1。最后在每管内加入上述稀释好的菌液各0.5ml，使每管最终菌液浓度约为5×105cfu·ml-1。第1管至第9管受试药物浓度分别为25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.09、0mg·ml-1。而红霉素的终浓度为12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.09、0.04、0μg·ml-1。其中受试药物分别为苦豆草提取物、苦豆碱和槐定碱与豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物的不同配比，药物对照（药物＋营养肉汤）、培养基对照（营养肉汤）、阳性对照（菌+培养基）。每药重复3次。对于痤疮丙酸杆菌：采用二倍稀释法将受试药物分别稀释配制成终浓度为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0mg·ml-1的含药痤疮丙酸杆菌液体培养基,同时,将红霉素配制成终浓度为25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.08、0μg/ml的含药痤疮丙酸杆菌液体培养基。取微量96孔板,将a，b，c，d，e，f按药物浓度从高到低的顺序分别依次加入含苦豆碱、红霉素2种药物的含药痤疮丙酸杆菌液体培养基，每孔180μl，设3次重复。此外,另备2孔加空白痤疮丙酸杆菌液体培养基180μl。将制备好的痤疮丙酸杆菌菌液加入微量96孔板含药痤疮丙酸杆菌液体培养基以及1孔空白痤疮丙酸杆菌液体培养基中，每孔加20μl菌液，每孔中菌的终浓度为1×105cfu·ml-1。苦豆草提取物的终浓度依次为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0mg·ml-1，苦豆碱、槐定碱、苦豆碱和槐定碱一定比例（1:1、1:3、3:1）的终浓度依次为25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.08、0mg·ml-1，红霉素的终浓度为12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19、0.08、0.04、0μg·ml-1。其中受试药物为苦豆草提取物、苦豆碱和槐定碱与豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物的不同配比，及药物对照（药物＋液体培养基）、培养基对照（液体培养基）、阳性对照（菌+液体培养基）。4.试验结果：表1显示为最低抑菌浓度试验结果（n=3）。表1金黄色葡萄球菌表皮葡萄球菌痤疮丙酸杆菌阴性对照阳性对照苦豆草提取物mic（mg·ml-1）6.256.256.25-+槐定碱mic（mg·ml-1）6.256.2512.5-+苦豆碱mic（mg·ml-1）1.560.783.12-+槐定碱配比豆瓣菜提取物（4：1）（mg·ml-1）mic12.56.256.25-+槐定碱配比榆绣线菊提取物（4：1）（mg·ml-1）mic6.256.253.12-+苦豆碱配比豆瓣菜提取物（4：1）（mg·ml-1）mic6.256.256.25-+苦豆碱配比榆绣线菊提取物（4：1）（mg·ml-1）mic3.121.561.56-+苦豆草提取物：豆瓣菜提取物（5：1）（mg·ml-1）mic6.256.256.25-+苦豆草提取物：榆绣线菊提取物（5：1）（mg·ml-1）mic6.256.253.12-+苦豆草提取物：豆瓣菜提取物：榆绣线菊提取物配比（5：1：1）（mg·ml-1）mic6.256.253.25-+苦豆碱和槐定碱配比（1:1）mic（mg·ml-1）0.780.780.78-+苦豆碱和槐定碱配比（1:3）mic（mg·ml-1）1.560.781.56-+苦豆碱和槐定碱配比（3:1）mic（mg·ml-1）0.780.780.39-+苦豆碱和槐定碱（1:1）配比豆瓣菜提取物1.560.781.56-+苦豆碱和槐定碱（1:1）配比榆绣线菊提取物1.560.781.56-+苦豆碱和槐定碱（3:1）配比豆瓣菜提取物1.560.783.12-+苦豆碱和槐定碱（3:1）配比榆绣线菊提取物0.783.123.12-+苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物配比（5:3:1:1）（mg·ml-1）mic0.781.560.78-+苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物配比（5:5:1:2）（mg·ml-1）mic0.780.780.78-+苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物配比（7:4:1:2）（mg·ml-1）mic0.780.780.39-+红霉素mic（μg·ml-1）12.56.2512.5-+由表1可以看出，苦豆碱和槐定碱配比（1:1）和苦豆碱和槐定碱配比（3:1）的抑菌效果相对更好，同时，从结果对比也可以看出，苦豆碱、槐定碱和豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物之间确实具有一定的协同作用，但苦豆碱、槐定碱单体之间的相互协同作用效果更为明显。以下就是对本发明的药物苦豆草提取物、槐定碱、苦豆碱及一定配比的苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物进行了小鼠耳肿胀抗炎试验。．供试药品（1）供试药品：编号1、3、6、8（2）阳性对照药物：吲哚美辛(indometacintablets，25mg/片，临汾宝珠制药公司，批号：170203)（3）工具药：二甲苯(徐州天鸿化工有限公司，生产批号：20100508)；分析纯。实验动物、试验分组:（1）实验动物、仪器：icr小鼠，雄性，体重18-22g。150只。（由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：scxy(宁)20011-0001）。适应性饲养3天后开始实验。称量天平：电子天平(沪制00000027号),梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。（2）实验分组：1)正常组control：10只，自由饮食。按照0.2ml/10g灌胃蒸馏水。溶媒（蒸馏水或4%（4ml/l）吐温-80溶液）涂抹、观察。2)模型组sample：10只，自由饮食。按照0.2ml/10g灌胃蒸馏水；连续5天灌胃给药后行二甲苯造模。3)阳性药物组indometacin：10只，自由饮食；每天按照0.2ml/10g灌胃吲哚美辛(剂量，10mg/kg)；连续5天灌胃给药后行二甲苯造模。4)供试药品组：按照0.2ml/10g（需要配置相应的溶液进行灌胃）剂量灌胃给药，连续5天灌胃给药后行二甲苯造模。（3）实验步骤1)各组连续灌胃5天相应溶媒及药物2)第6天（于第5天晚6:00撤去饲料，留饮水）备用。3)致肿实验及取材：连续给药5d，于末次给药后30min，0.03ml二甲苯均匀涂抹每只鼠右耳两面致炎，左耳作为对照；致炎后30min颈椎脱臼处死小鼠，以8mm直径打孔器取下耳缘左、右耳片，称重，以左右、耳片重量差表示肿胀度，并计算肿胀度。4)指标判定：肿胀度=右耳耳片质量－左耳耳片质量;3.实验结果：表2显示为以肿胀度为指标的实验结果。表2实验分组例数均值(×10-3)sd(×10-4)p值control100.542.72-sample1010.0115.79△△indometacin65.1336.38**苦豆草提取物83.1512.76**苦豆草提取物：豆瓣菜提取物：榆绣线菊提取物（5：1：2）93.1818.87**苦豆草提取物：豆瓣菜提取物：榆绣线菊提取物（5：1：1）103.2025.37**苦豆碱84.6728.31**槐定碱105.1419.84**苦豆碱：槐定碱1:1103.0916.86**苦豆碱：槐定碱1:3103.2227.88**苦豆碱：槐定碱3:1103.1519.90**苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物（5:5:1:2）93.1122.17**苦豆碱、槐定碱、豆瓣菜提取物和榆绣线菊提取物（7:4:1:2）103.2719.32**注：△△与空白组（control）比较p＜0.01；**与模型组（sample）比较p＜0.01。由表2可以看出，苦豆草提取物和苦豆碱：槐定碱（1:1）对二甲苯所致小鼠耳肿胀有显著抑制作用，且苦豆碱、槐定碱和豆瓣菜提取物、榆绣线菊提取物之间确实具有一定的协同作用，也有较好的抗炎效果。但苦豆碱、槐定碱单体之间的相互协同作用效果更为明显，效果最佳。最终结果：表1数据显示结果，苦豆碱和槐定碱配比（1:1）和苦豆碱和槐定碱配比（3:1）的抑菌效果相对更好，其中，苦豆碱和槐定碱配比（3:1）效果要稍优于（1:1），但通过表2可以看出，苦豆碱和槐定碱配比（3:1）的肿胀度指标中，平均值大于苦豆碱和槐定碱配比（1:1），苦豆碱和槐定碱配比（3:1）抗炎效果弱于苦豆碱和槐定碱配比（1:1），两相权宜，发明人认为，苦豆碱和槐定碱配比（1:1）应为最优选技术方案。最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12