一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法与流程

本发明涉及一种慢加急性肝衰竭小鼠模型诱导方法，尤其涉及一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法。

背景技术：

动物肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。

四氯化碳（ccl4）被广泛用于诱导肝损伤动物模型，ccl4代谢产生的自由基进入机体后，在肝脏经细胞色素p450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，攻击肝脏细胞膜上的磷脂分子，使得细胞膜、内质网膜发生氯烷化和脂质过氧化，损伤细胞膜、细胞器；还能与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，影响蛋白质代谢，并且破坏膜结构和功能的完整性，钙离子内流增加，影响细胞正常生理功能，最终导致肝细胞胞质中的可溶性酶渗出，细胞死亡。

据有关文献报道，刘旭华等曾应用四氯化碳和d-氨基半乳糖及脂多糖建立了慢加急性肝衰竭大鼠模型，但大鼠模型建立成本高，操作难度较小鼠大。

张慧芸等应用四氯化碳联合d-氨基半乳糖、脂多糖诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型。该模型的缺点在于造模所需肝损伤药物太多，为该疾病的后续研究造成更多干扰因素，结合临床更为常见的hbv相关慢加急性肝衰竭，多数为hbv病毒这一独立因素诱发发病。

技术实现要素：

综上所述，本发明有必要提供一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法，通过优选实验动物，优化诱导方法，获得更加稳定可靠的慢加急性肝衰竭小鼠模型。

一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法，其步骤具体如下:

a.分组方法：balb/c近交系小鼠随机平均分为模型组和对照组；

b.给药方法：将四氯化碳用橄榄油稀释至10%和50%的浓度，模型组小鼠按照5至8ml每kg体重持续腹腔注射10%四氯化碳，每周给药两次，连续给药8周；8周后按照5至8ml每kg体重给予一次腹腔注射50%四氯化碳；对照组小鼠则在相同时间腹腔注射相同剂量的橄榄油；

c.检测方法：对实验小鼠进行生化指标检测和肝脏病理学检查。

优选的，生化指标检测检测方法为：小鼠给予乙醚麻醉后，分时点进行摘眼球取血，收集的小鼠全血离心后留取上清，采用生化检测试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平。

优选的，摘眼球取血时点为0h、6h、12h、24h、48h。

优选的，肝脏病理学检查方法为：分时点收集肝脏组织标本，10%中性甲醛固定后制作石蜡切片，苏木精-伊红染色法及天狼星红染色。

优选的，收集肝脏组织标本时点为6h、12h、24h、48h。

优选的，模型组小鼠按照5ml每kg体重持续腹腔注射10%四氯化碳，每周给药两次，连续给药8周。

优选的，模型组小鼠给药8周后，按照8ml每kg体重给予一次腹腔注射50%四氯化碳。

本发明的有益效果在于：

本技术方案选用ccl4作为肝损伤药物，该药一直被广泛用于诱导肝损伤动物模型。

在动物的选择上，本技术方案采用balb/c近交系小鼠作为模型动物，其可减少因个体差异造成实验误差，且该种小鼠多可采用近交系，重复性更好。同时，balb/c近交系小鼠相对于大鼠成本更低，操作更为简便。

通过对实验小鼠进行生化指标检测和肝脏病理学检查，发现本模型符合临床慢加急性肝衰竭疾病的生存率、生化及病理改变。本模型的建立为慢加急性肝衰竭的发病机制以及寻找有效的治疗方法提供可行性依据。

相对于刘旭华等应用四氯化碳和d-氨基半乳糖及脂多糖建立慢加急性肝衰竭大鼠模型，以及慧芸应用四氯化碳联合d-氨基半乳糖、脂多糖诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的相关方法，本技术方案的动物分组和给药方法更为简单，分组更少，实验周期更短，更为易于操作。

附图说明

图1为肝组织病理改变镜下观。

a为对照组与模型组不同时间点小鼠肝脏苏木精-伊红染色镜下观（x200）；

b为对照组与模型组小鼠肝脏天狼星红染色镜下观（x100）。

图2为对照组与模型组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alt）和天冬氨酸氨基转移酶（ast）水平的比较。

图中虚线为对照组小鼠生存曲线，实线为模型组小鼠生存曲线。

具体实施方式

下面结合附图1至2及具体实施方式对本发明所述的一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法进行说明。

实施例一

一种用四氯化碳诱导慢加急性肝衰竭小鼠模型的方法，方法的步骤如下:

1）分组方法：balb/c近交系小鼠20只随机平均分为模型组和对照组；

2）给药方法：将四氯化碳用橄榄油稀释至10%和50%的浓度，模型组小鼠按照5ml每kg体重持续腹腔注射10%ccl4，每周给药两次，连续给药8周；8周后按照8ml每kg体重给予一次腹腔注射50%ccl4；对照组小鼠则在相同时间腹腔注射相同剂量的橄榄油；

3）检测方法：对实验小鼠进行生化指标检测和肝脏病理学检查。

肝脏病理学检查方法为：于6h、12h、24h、48h收集肝脏组织标本，10%中性甲醛固定后制作石蜡切片，苏木精-伊红染色法及天狼星红染色。

检测结果如附图1所示，a为对照组与模型组不同时间点小鼠肝脏苏木精-伊红染色镜下观（x200），随着疾病的进展，肝脏出血坏死面积逐渐增大。

b为对照组与模型组小鼠肝脏天狼星红染色镜下观（x100），在疾病不同的阶段，均可见肝纤维的着色以及假小叶的形成。

对照组小鼠镜下观，肝小叶结构完整，细胞形态正常，无明显炎症细胞浸润。而实验组小鼠，随着病情的进展，肝脏逐渐出现纤维化，假小叶的形成，汇管区炎症细胞的浸润，中央静脉区以及围绕着假小叶出现肝细胞大片出血、坏死，肝细胞消失，肝脏已经失去正常的肝小叶结构。随着疾病的进展，肝组织坏死面积不断扩大，24h肝脏组织细胞坏死最为显著。肝组织天狼星红染色可见明显的纤维形成，假小叶的出现，说明在疾病进展中，肝脏的出血坏死均是发生在肝硬化基础上。

生化指标检测检测方法为：小鼠给予乙醚麻醉后，于0h、6h、12h、24h、48h分别摘眼球取血，收集的小鼠全血放置约30min后，3000r/min离心5min，留取上清，采用生化检测试剂盒检测丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶水平。

检测结果如附图2所示，对照组小鼠血清酶alt、ast分别为（45±10）和（142±5）。随着病情的进展，模型组小鼠血清酶alt、ast逐渐升高，在0h（肝硬化阶段）血清转氨酶alt和ast水平均较对照组升高，分别为（1831±738）、（1129±406）。aclf组小鼠在24h血清转氨酶alt和ast水平升高更为显著，分别为(36418±4755)u/l、（31397±3985）u/l。经统计学分析，三组间两两比较，差异有统计学意义，alt与ast水平在三者间p值均<0.000，f值分别为（54.4，59）。

上述检测结果表明本模型符合临床慢加急性肝衰竭疾病的生存率、生化及病理改变。本模型的建立为慢加急性肝衰竭的发病机制以及寻找有效的治疗方法提供可行性依据。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。